Formation en Biosécurité • Introduction • Notions de Biosécurité & Risque Biologique • Organismes visés par les mesures de sécurité (notion de classe de risque) • Evaluation du risque 8 février 2009 • Gestion du Risque Biologique • Principes de base de la biosécurité (cadre légal; permis) • Mesures de gestions du risque (Utilisations Confinées) Suzanne LORET Responsable Administratif Biosécurité FUNDP SIPPT (Déca Sci - 4467 [email protected]) o Règles communes à tous les niveaux de confinement o Equipements de confinement Introduction - 1 Introduction - 2 Biosécurité: Sécurité pour la santé humaine et pour l'environnement, en ce comprise la protection de la biodiversité, lors de l'utilisation d'organismes ou microorganismes génétiquement modifiés et lors de l'utilisation confinée d'organismes pathogènes. Secteurs d’activité concernés: o o o o o Diagnostic, Recherche & Développement (L) Thérapie génique (HR) Expérimentation Animale (A) Biotechnologie Végétale (G) Activité Industrielle (Biotech/BioAgr/Biopharm) (LS) Introduction - 3 et aussi, en connexion avec le Ministère de la Défence: Introduction - 4 et enfin, en connexion avec la Santé Publique: ... le bioterrorisme ... et gestion des infections nocosomiales ... et thanatopraxie (USA) Introduction - 6 Introduction - 5 Ne pas confondre: • « Biosécurité » et « Problème de Santé Publique » Exemple: le virus de la grippe aviaire n’est un problème de biosécurité que pour les laboratoires qui le manipulent • « Biosécurité » et « Gestion des risques cytotoxiques dus à des organismes biologiques » Exemple: toxicité de la phalloïdine, de l’hépatotoxine des fleurs d’eau (algues bleues), ... Risque Biologique Risque = Danger x Exposition où, Danger = l’ampleur de l’impact de l’événement nocif pour santé et environnement Exposition = probabilité de l’événement Introduction - 7 L’importance du danger Introduction - 8 Introduction est proportionnelle à : • l’intensité de sa nocivité - Pathogénicité/Toxicité/Allergénicité - Perturbations écologiques - Effet nocif indirect (ex. Potentialisation d’une sensibilité, inhibition d’un traitement, ...) • Cadre Théorique (Biosécurité/Risque Biologique) • Organismes visés par les mesures de sécurité (notion de classe de risque) • Evaluation du risque • la disponibilité/coût des moyens pour y remédier • au manque de contrôle de ses circonstances d’occurrence Introduction - 9 OP - 1 I. Organismes pathogènes : Organisme Toute entité biologique, y compris les 1. Pathogènes humains micro-organismes et les ATNC* et les 2. Zoopathogènes (Pathogènes pour cellules en culture, capable o de se reproduire l’homme et l’animal zoonoses) 3. Phytopathogènes et/ou o de transférer du matériel génétique *PRIONS OP - 3 OP - 2 Groupes d’organismes pathogènes Critères de classification du risque des OP • Bactéries • Virus 1. Importance de la maladie - gravité de l’infection • Levures 2. Potentiel infectieux • Champignons • Parasites o Virulence • CULTURES DE CELLULES o Dose infectieuse • PRIONS o Voie d’infection OP - 4 Voies d’infection exemples Contact cutané Champignon Via air ou aérosols Piqûres d’insectes Contact sanguin Virus de la rougeole & grippe Bactérie BRUCELLA Parasite de la malaria Virus de la fièvre jaune HIV Virus de l’hépatite B Via blessures Bactéries staphylocoques Via matériel fécal Bactérie du typhus Poliovirus OP - 5 3. Spectre de spécificité 4. Stabilité biologique 5. Disponibilité et efficacité 6. o d’une prophylaxie o d’un traitement Potentiel de survie et de dissémination o dans la collectivité o dans l’environnement OP - 6 OP - 7 3 classes de risques pour l’expérimentateur sain: de CR2 à CR4 (pas de CR1, car signifie pas de risque) 7. Pour l’animal et la plante: • Mesures de protection prévalence de l’OP dans l’environnement du travailleur de l'environnement (Caractère « exotique » de l’organisme) • présence de plantes cibles • impact économique éventuel de la maladie MAIS un organisme sans risque pour l’expérimentateur représente un risque pour l’environnement* = CR1 Mesures de protection de l'environnement *(perturbations écologiques: pollutions, atteintes de la biodiversité, ...) OP - 8 OP - 8 Les CR font référence à - des animaux immunocompétents - des plantes saines Critère de Classification du risque Classe de Risque (CR) Maladie 1 2 3 4 non oui grave grave Thérapie/ Propagation Prophylaxie / improbable oui élevée / oui oui non Niveau de risque nul faible modéré élevé Liste officielle des OP et de leur CR, disponible sur le site: http://www.fundp.ac.be/sippt/risques/agents_bio logiques.pdf OP - 9 Un organisme pathogène peut présenter une CR suivant: OP - 10 CR1 CR2 • sa localisation géographique (proximité de l’espèce cible) • son statut sanitaire (risque accru) E. coli K-12 Salmonella S. cerevisiae Herpes simplex virus • pathogènes envoie d’éradication (exemple du poliovirus: CR2CR3) • organisme de quarantaine (CR2 CR2Q) •son utilisation (diagnostic >< culture) OP - 11 CR4 CR3 Rift valley fever virus HIV Brucella spp. Mycobacterium tuberculosis OP - 12 virus Ebola OP - 13 CR des cellules en cultures OP - 14 CULTURES DE LIGNEES Sont considérées comme CR1 Sauf : CULTURES PRIMAIRES o sont considérées comme étant CR1, quand • ne sont ni d’origine humaine, ni d’origine primate, • sont « prouvées » saines (« pathogen free ») o sont considérées comme CR2, quand ne sont pas encore standardisées (proviennent de prélèvements ou d’explants) • si elles dérivent d’une culture primaire par immortalisation induite exp. (CR2) • elles ont été transfectées avec un insert, et/ou infectées avec un OP, « à risque » CR2, CR2+ et CR3, selon: o La CR de l’OP infectieux o Le pouvoir métabolique/physiologique de le protéine exprimée OGM/MGM - 1 ORGANISMES GENTIQUEMENT MODIFIES OGM (MGM) = Organismes (micro-organismes), pouvant être pathogènes, dont le matériel génétique a été modifié d’une manière qui ne se produit pas naturellement. L’être humain, même sous thérapie génique, n’est jamais considéré comme un OGM ! OGM/MGM - 2 Définition « technique » des OGM (MGM) 1. Techniques conduisant à la production d’OGM (MGM) 1.1. Techniques de « l’ADN recombinant » 1.2. Techniques « mécaniques » d’introduction d’ADN « nu » 1.3. Fusion cellulaire/hybridation non spontanée Techniques d’ADN recombinant: exemple - 1 Techniques d’ADN recombinant: exemple-2 Transfection cellulaire Transformation Bactérienne (introduction d’un plasmide) transitoire Séquençage « CR1 » Expression « CR1 » à CR4 Introduction « d’ADN nu », exemple des animaux , transgéniques stable « CR1 » à CR2+, en fonction: -de la cellule hôte -de l’organisme donneur -du produit d’expression -du MGM résultant Production d’OGM végétaux OGM/MGM - 4 OGM/MGM - 3 2. Techniques ne conduisant PAS à la production d’OGM (MGM) 2.1. Fécondation in vitro 2.2. Processus naturels (conjugaison, translocation, transformation) 2.3. Induction polyploïde 3. Technique produisant des OGM (MGM) « exempts » 3.1. Mutagenèse chimique ou par UV 3.2. Fusion de cellules eucaryotes (hybridomes pour product° d’Ac monocl.) 3.3. Autoclonage OGM/MGM - 5 Introduction Classes de risques des OGM/MGM • Pas de liste ! • L’évaluation du risque, se fait au cas par cas Cadre Théorique (Biosécurité/Risque Biologique) Organismes visés par les mesures de sécurité (notion de classe de risque) Evaluation du risque Evaluation du risque - 2 Evaluation du risque biologique : « Méthodologie pour organiser et analyser l’information scientifique nécessaire pour estimer la probabilité et la sévérité d’un évènement nocif » En pratique : • Considérer la CR de l’OP/OGM • Identifier les facteurs de risque (effets ; échelle) • Évaluer la probabilité d’un effet • Dégager les conditions permettant de prévenir le risque ou de le limiter (précaution) = définir un niveau de confinement Evaluation du risque - 3 2. Caractéristique de l’opération (routine >< mise au point) conduite standardisée (routine) o connaissance des BPM** o mode opératoire complet o connaissance des méthodes de désinfection d’inactivation **= GMP (« Good MICROBIOLOGY pratices »), mais de GMP (« Good MANUFACTORY practices ») 1) Identification des Facteurs de risque (caractéristiques d’exposition) 1. « sensibilité » de l’expérimentateur (propagation de l’OP par inoculation >< aérosol) barrière primaire (vêtements adaptés; enceintes microbiologiques) Evaluation des risques - 4 3. Nature de l’activité (diagnostic >< culture) la culture demandera un niveau de confinement plus élevé (notion d’amplification du risque) • Conditions de culture (solide >< liquide) la culture liquide est plus risquée (éclaboussures; aérosols) • Concentration et échelle (R&D >< LS) la grande échelle nécessite des dispositifs de rétentions spécifiques Evaluation du risque - 5 4. Sensibilité de l’environnement « proche » (intra-muros) : barrière secondaire (équipement de sécurité) (Accès limité, SAS+vestiaire, dépression) Evaluation du risque - 6 5. Sensibilité de l’environnement « ouvert » (extramuros) : • Présence d’espèces sensibles • Survie de l’OP/OGM • Interactions avec autres organismes de l’environnement barrière tertiaire (filtre HEPA, gestion des déchets) Evaluation du risque - 7 2) Choix du confinement pour les OP Critère de Classification du risque Classe de Risque (CR) Maladie 1 2 non oui / improbable / oui nul faible 3 grave oui oui modéré 4 grave élevée non élevé Thérapie/ Propagation Prophylaxie Niveau de Risque 1) 2) 3) 4) Exemples de niveaux de confinement pour OP transmissibles par voie aérogène Niveau de Confinement OP R&D L3 L1 L2 Diagnostic Eradicat° L2+ L4 L4 L2+= L2 + BPM L3 Exemples aux FUNDP Evaluation du risque - 8 Pas de L4 en Belgique Etudes portants sur Brucella spp. (wt): en L3 TP de Microbiologie: en L2 Cultures de virus pathogènes animaux: en L2 Cultures de virus et bactéries pathogènes humains: en L2 NB: L2-Q = L2 pour organismes de quarantaine Virus Epstien-Barr Neisseria meinigitidis Virus de l'hépatite (B,C & V) HIV-1 & HIV-2 Mycobacterium tuberculosis Brucella spp. Confinement requis L2 L2 (diagnostic) L3 (culture; infection exp.) L2 (diagnostic) L3 (culture; infection exp.) L2 (diagnostic) L2 (diagnostic) L3 (culture; infection exp.) L3 (culture; infection exp.) Evaluation du risque - 9 2) Choix du confinement pour les OGM/MGM Evaluation du risque - 10 Critères d’évaluation des risques des OGM (MGM) Hôte du Transgène Procaryote -non-OP -OP 1. les risques liés à l’hôte (pathogénicité, toxicité) 2. les risques liés au matériel génétique introduit (insert; fonction, localisation) Eucaryote pluricell -végétal -animal Eucaryote monocell -levure -culture primaire -culture secondaire Evaluation du risque - 11 Evaluation du risque - 12 Critères d’évaluation des risques des OGM/MGM (suite) 3. les risques liés au vecteur utilisé pour introduire l’insert (stabilité, mobilisation, multiplication) – – éviter des vecteurs à large gamme d’hôte préférer des vecteurs non propagatifs Critères d’évaluation des risques des OGM/MGM 4. les risques liés à l’OGM (ou le MGM) luimême SANITAIRES : ENVIRONNEMENTAUX : - Toxicité - Survie - Pathogénicité - Multiplication - Allergénicité - Interaction avec autres organismes (vég./anim.) Exemple de choix de confinement - 1 Exemple de choix de confinement - 2 Transformation de E. Coli K12 avec le gène de la RT de HIV Critère analysé Identité Évaluation du risque Hôte E coli BL21 (K12) Souche Commercialisée, à l'innocuité avérée: pas de risque Pathologie fatale, mais risque de transmission improbable (absence du virus complet au laboratoire) Plasmide R&D : pas de risque Donneur Vecteur Insert 1 MGM HIV PUMVC1 (pUC19) Gènes HIV de la RT E. coli + gènes HIV Potentialisation du risque ? Non Pas de risque accru (par rapport à non GM) CR pour l’homme 1 Transformation de E. Coli K12 avec le génome muté de HIV Critère analysé Identité Évaluation du risque Hôte E coli BL21 (K12) Donneur HIV Souche Commercialisée, à l'innocuité avérée: pas de risque Pathologie fatale, mais risque de transmission improbable (absence du virus complet au laboratoire) Plasmide R&D : pas de risque 3 1 Vecteur 1 Insert 2 1 MGM PUMVC1 (pUC19) Génome HIV muté (Rep--) E. coli + géno HIV Hôte Donneur Vecteur Insert MGM Identité Évaluation du risque Souche pathogène naturelle: E coli "syndrôme du hambuger" O157:H7 (parfois fatal) Pathologie fatale, mais risque de transmission improbable HIV (absence du virus complet au laboratoire) PUMVC1 Plasmide R&D : pas de (pUC19) risque Gènes HIV Potentialisation du risque ? de la RT Non E. coli Potentialisation du risque ? 0157:H7 + Non gène RT CR pour l’homme 3 3 Critère analysé Hôte Donneur 1 3 3 1 Potentialisation du risque ? Oui, mais modéré 2 Risque accru (par rapport à non GM) 2 Production d’enzyme en fermenteur (Ind. Agro-alimentaire) Vecteur 1 1 Exemple de choix de confinement - 4 Exemple de choix de confinement - 3 Critère analysé CR pour l’homme Insert MGM Identité Évaluation du risque Ferment lactique: sans risque pour l'homme bactérie pathogène du C. saumon (pas de risque connu Piscicola pour l'homme) Plasmide commercialisé: pas PBR322 de risque Glycosyl Potentialisation du risque ? Hydrolase Non (-galactosidase utilisée (GH) pour la panification) B.subtilis Potentialisation du risque ? + GH Non B. subtilis CR pour l’homme 1 2 1 1 1 NIVEAU LS1 Mesures de sécurité additionnelles pour contenir une fuite du fermenteur Exemple de choix de confinement - 5 Modification d’un lentivirus défectif pour transfection Cell. stable Critère analysé Hôte Donneur Vecteur Insert MGM Identité Évaluation du risque CR pour l’homme Infectieux, mais pas réplicatif HIV Rep-- utilisé pour tranfection stable 2+ --> ONCOGENE 1 H. sapiens cDNA de lymphocytes vecteur commercialisé: pGEM3 1 innocuité avérée Potentialisation du risque ? TGF1 OUI (protéine exprimée = 2 "danger physiologique") HIV muté Potentialisation du risque ? 2+ -> 3 + TGF1 Oui VERIFIER: que le clonage n’a pas régénéré les propriétés réplicatives du virus (ELISA, WB, ...) Exemple de choix de confinement - 6 Cas des « Packaging cells », utilisés pour la production de virus défectifs (VD) Virus « vides » -incapable de se multiplier hors PC -incapables d’infecter (CR1) Virus « infectieux », mais défectif pour réplication (transfection stable) ONCOGENE (CR2+) NB : Virus défectif = Confinement Biologique Exemples de confinements « inattendus » • Phytopathogènes: X. oryzae Organismes de quarantaines CR1 pour l’expérimentateur CR4 pour l’espèce cible comestible (riz) obligation (AFSCA) de L2Q ---> L3 NB: autre règle pour espèce cible comestible animale • Zoopathogènes: BTV CR1 pour l’expérimentateur CR4 pour l’animal obligation de L2+ Exemple de choix de confinement - 7 Exemples de confinement Biologique Micro-organismes : - minimiser les capacités de survie et de reproduction (virus défectifs, souches non sporulantes,..) - Souches « atténuées » (nonvirulentes) - Vecteurs « suicides » (destruction par les produits d’expression) Exemple de choix de confinement - 8 Exemples de confinement Biologique Plantes : - Recueillir le matériel avant maturité sexuelle - « décaller » la période de floraison (par rapport à la réceptivité de plantes parentes pour le pollen) - Créer des espèces qui ne peuvent pas se reproduire Choix du confinement en LS Exemple de choix de confinement - 9 Exemples de confinement Biologique Insectes : - Choix d’espèces aptères ou stériles - Choix d’espèce dont le développement dépend d’autres organismes non présents dans l’environnement Choix du niveau de Confinement pour les Animaleries (A) Les critères sont d’application dans les laboratoires Un animal traité par un OP mais, est placé dans une animalerie de même niveau de confinement que celui du laboratoire où est produit le pathogène. • Les unités LS doivent être équipées de réservoirs de rétention • Instauration de gradients de pression atmosphérique pour concilier l’obligation industrielle (G Manufactory P = production en surpression) et celle du confinement (G Microbiology P = dépression) Exemple aux FUNDP: 1) Souris traitées par Brucella spp. (wt), en A3 (dans l’infrastructure du L3) 2) Poissons traités par A. hydrophila (CR2 pour l’homme), en A2 (accent mis sur la protection de l'environnement: désinfection des efflux d’aquariums) NB: pour des animaux « suspects » principe de quarantaine (A2-Q) Confinement en milieu hospitalier (HR) Choix du niveau de Confinement pour les Animaleries (A) Un animal génétiquement modifié (OGM) ne doit pas être placé dans une animalerie de niveau de confinement >1 si la modification génétique n’induit pas l’apparition de substances nocives dans: • • • les excréments l’air expiré la peau/les poils Exemples d’OGM aux FUNDP: 1) Souris Mage d1 -/-, pour l’étude des propriétés des protéines MAGE (O. De Backer) (A1) 2) Souris hyal 1 -/- pour l’étude des propriétés de l’hyaluronidase (B. Flamion) (A1) Confinement en serres (G) Contexte: production d’OGM végétales à des fins appliquées Le niveau de confinement est représentatif de l’échelle (local de culture R&D: G1 serres: G2) la transition vers l’espace naturel (serres: G2 champs G3) Les mesures de protection adoptées visent la prévention de la dissémination involontaire Contexte: thérapie génique Le choix du niveau de confinement obéit aux mêmes principes que ceux appliqués en animaleries. mais, Des mesures additionnelles sont prises pour protéger le patient (salle blanche,...). Gestion du Risque Biologique Principes de base de la biosécurité (cadre légal; permis) Mesures de gestions du risque (Utilisations Confinées) • Règles communes à tous les niveaux de confinement • Equipements de confinement Gestion du risque - 2 Gestion du risque - 1 Notification d’une opération confinée Principes de Base de la Biosécurité Chaque OPERATION impliquant l’utilisation 1. Evaluer le risque • d’OGM/MGM • d’OP doit faire l’objet d’un PERMIS d'environnement. • • Le notifiant (FUNDP) applique les règles d’utilisation confinées définies par la loi: http://www.biosafety.be/CU/ArrRW02_FR/ArrRW02F R_TC.html • Gestion du risque - 3 2. Soumission de la demande à l’EXPERT TECHNIQUE = SBB (Section de Biosécurité et de Biotechnologie, à l’ISP) http://www.biosafety.be/ • • • vérifie la pertinence de l’évaluation du risque par le notifiant propose un rôle de guidance dans l’élaboration d’un nouveau dossier produit les documents officiels de notification d’opérations http://www.biosafety.be/CU/EN/FormsRWEN.htm Déterminer la classe de risque Proposer un niveau de confinement, des pratiques de laboratoire (incluant méthodes de désinfection/decontamination) Démontrer que l’infrastructure est conforme (plans) Gestion du risque - 4 3. Soumission de la demande de permis à la RW Le dossier tient compte de l’intégration de l’ensemble des opérations dans un milieu donné (le centre ville de Namur; enquête publique) un permis est accordé pour la durée (5-10 ans) proposée par le SBB Mesures de gestion du risques = Equipement et pratiques de laboratoire mis en œuvre pour prévenir et gérer le risque L’équipement et les mesures spécifiques de sécurité = niveau de confinement Utilisations Confinées - 1 Gestion du Risque Biologique Principes de base de la biosécurité (cadre légal; permis) Mesures de gestions du risque (Utilisations Confinées) • Règles communes à tous les niveaux de confinement • Equipements de confinement Règles communes à tous les niveaux de confinement 1. Adopter les bonnes pratiques de laboratoire 2. Prévoir des méthodes de désinfection/décontamination 3. Prévoir des conteneurs pour le transport des OP 4. Etablir un plan de gestion des déchets Utilisations Confinées - 2 1. Les bonnes pratiques de laboratoire 1) PRENDRE CONNAISSANCE du niveau de risque biologique 2) DEFINIR UN MODE OPERATOIRE précis Utilisations Confinées - 3 3) EVITER TOUT RISQUE D’INGESTION • • • • On ne mange pas, on ne boit pas On ne stocke pas des aliments On ne s’applique pas de produits cosmétiques ou lentilles oculaires PIPETTAGE BUCCAL FORMELLEMENT INTERDIT Utilisations Confinées - 4 4) EVITER TOUT RISQUE D’INOCULATION • • • Eviter objets coupants et piquants Ne pas utiliser de vaisselle en verre Ne pas reboucher seringues Utilisations Confinées - 5 4) EVITER TOUT RISQUE D’INHALATION • Port du masque (pour OP transmis par voie aérogène) • Eviter la génération d’aérosols Utilisations Confinées - 6 Utilisations Confinées - 7 Procédures génératrices d’aérosols : Verser des liquides Chute de gouttes Pipetage Ouverture de couvercle mouillés Centrifugation sans couvercle ou vortex Anse trop chaude 5) EVITER la contamination de CONTACT = en cours de manip, NE PAS: - se gratter les cheveux - se frotter le nez, les oreilles, ... - redresser ses lunettes - .../... Utilisations Confinées - 8 Utilisations Confinées - 9 6) NE PAS SOUILLER Le local de travail et/ou les locaux voisins 2. Méthodes de désinfection & décontamination Ne pas quitter le local • avec les gants de travail • avec le tablier Appliquer la consigne « main propre en zone propre »: ne pas décrocher le téléphone ou toucher les poignées de portes avec gants souillés (désinfecter le cas échéant) • des solutions (milieux de culture) • des surfaces souillées: « bench », sol,... • de la peau, yeux, vêtements Nettoyer la zone de travail en fin de manipulation Utilisations Confinées - 10 Inactivation chimique des OP Gestion des incidents/accidents Efficacités de certains décontaminants Décontaminant Ethanol Organismes Fongiques - Hypochlorite Formaldéhyde + ++ ++ ++ + ++ + ++ + + Peroxide Combinaison + ++ + + + ++ ++ ++ ++ ++ (- hypochl, - étanol, + ammoniums quaternaires)* Bactéries Mycobactéries Spores Virus ++ ++ - +/- Inactivation par autoclavage 121°C, 20 min NB: pour Prion, NaOH 1M ou AUTOCLAVAGE 134°C 18 min Gestion en interne (FUNDP) INCIDENT : problème de manipulation qui peut entraîner une maladie ou une contamination du matériel/local (exemple: renversement dune culture d’agents pathogènes sous la hotte avec éclaboussures dans le laboratoire et sur les vêtements) ACCIDENT : problème de manipulation qui entraîne une blessure(maladie) et/ou une contamination du matériel/local (exemple: chute de l’expérimentateur avec bris du flacon de culture et mise en contact de l’agent pathogène avec une blessure ou une muqueuse respiratoire de l’expérimentateur) Utilisations Confinées - 11 Gestion des incidents/accidents Que faire si on renverse une suspension d’OP ? Si c’est un OP qui ne se transmet pas par voie aérogène: Gestion en externe (Plan d’urgence Prov.) ACCIDENT qui affecte le milieu externe de l’institution, avec risque pour la population ou l’environement) • étendre un papier absorbant sur la zone souillée • imbiber le papier de la solution de désinfection efficace • laisser agir quelques minutes • essuyer (puis rincer & sécher complètement) (exemple : explosion, innondation, ... D’un L3) NB: même traitement pour les vêtements Utilisations Confinées - 12 Que faire si on renverse une suspension d’OP sur le sol ? Si c’est un OP qui se transmet par voie aérogène: quitter le local (en y laissant vêtements et gants souillés) quelques minutes pour laisser retomber l’aérosol, puis • signaler l’interdiction d’accès au confinement • étendre un matériel absorbant sur la zone souillée NB: en L3, un « spill kit » • imbiber le matériel de la solution de désinfection efficace • laisser agir quelques minutes • essuyer (puis rincer & sécher complètement) Utilisations Confinées - 13 ) Que faire en cas de bris de tube (bouteille) de verre contenant une solution d’OP ? (en principe, le verre est proscrit !) Ne pas toucher les débris avec les mains Utilisations Confinées - 14 Que faire en cas de blessure ? LEGERE: 1. lavage 2. faire saigner par légère pression (ne jamais sucer !!!!!!) 3. appliquer le kit de premiers soins Utilisations Confinées - 15 Que faire en cas de blessure ? NECESSITANT UN MEDECIN: 1. appliquer une compresse pour limiter le saignement 2. enlever le tablier 3. sortir et fermer le local 4. (faire) signaler l’interdiction d’accès (CR2+ et CR3) NB: en L3, aide du « deuxième homme » Utilisations Confinées - 16 Que faire en cas de blessure ? NECESSITANT UN MEDECIN (suite): Utilisations Confinées - 17 Importance de la « règle des deux hommes au L3 » 1. Signaler le problème : – – – au directeur de laboratoire (organisation du rangement du confinement) au service du personnel: L. Boulanger (4042) (chercheurs au cadre ou hors-cadre, techniciens, ...) au service social des étudiants: B. Mertes (5080) (mémoires, PhD FRIA, FNRS) 2. Vous faire conduire vers l’unité de soin de votre choix En cas de malaise, le partenaire organise – l’alerte – la préparation de l’intervention d’urgence – le « rangement » du confinement Utilisations Confinées - 18 Utilisations Confinées - 19 TOUJOURS DECLARER un accident de contamination avec un OP Que faire pour obtenir la désinfection totale du laboratoire ? •Remplir le registre des accidents •Signaler au responsable de l’opération •Passer un examen médical si OP de CR3 On sature l’atmosphère en vapeurs de désinfectant (par exemple, VPH) Ce n’est possible que pour un laboratoire étanche (= L3 ou L4) Utilisations Confinées - 20 3. Conteneurs pour le transport des OP d’un laboratoire à un autre au sein du bâtiment Conteneur hermétique et décontaminable NB: la PrP infectieuse (PRION) est très résistante aux désinfectants classiques (comme le formol) et l’effet du VPH n’est pas encore totalement démontré lavage manuel de toutes les surfaces avec du NaOH Utilisations Confinées - 21 Transfert « longue distance » Utilisations Confinées - 22 4. Gestion des déchets Politique appliquée aux FUNDP décrite sur le site: http://www.fundp.ac.be/sippt/dechets/biologiques.html Utilisations Confinées - 23 Traitement des déchet « biohasard » • Liquides : suspensions de Coli K-12, Levures, milieux de culture contaminés, traités à l’eau de javel 10%, avant élimination à l’évier • Solides : tips, pipettes, flasques de culture (sans javel !), gants, papier (sacs « biohasard »; pipettes SEPAREES) • Solides tranchants & piquants : petits containers jaunes (OU grands fûts jaunes en cas de nombre élevé de pipettes pasteurs) Utilisations Confinées - 24 Conditionnement des déchets aux FUNDP P. Pasteur (verre) +lames microscopes Boîtes cultures Jetables (plast.) Pipettes culture Jetables (plast.) Utilisations Confinées - 25 Autre type de conditionnement Utilisations Confinées - 26 Ne pas faire ! Utilisations Confinées - 27 Vidange des conditionnements « gros laboratoires »: Conditionnement intermédiaire par les utilisateurs Utilisations Confinées - 28 Déchets contondants Container pourvu d’un « col enlève aiguille » Déchets animaux Placés dans les « sacs biohasard », puis congelés en attendant le passage de T. Mayenne !! Congélateur du confinement Utilisations Confinées - 30 Utilisations Confinées - 29 Déchets « combinés » Ordre des priorités : Déchets combinés Limites de la règles (exemples) : Risque radioactif Risque chimique Risque Biologique Les isotopes de faible rayonnement (3H, 14C) devraient perdre leur priorité devant les OP de CR 3 Lors de l’utilisation combinée d’OP et d’isotope de courte demi-vie (32P ou 35S), la gestion devrait se faire en 2 temps: - stockage des déchets durant la période d’expression de la radioactivité - décontamination pour l’OP Utilisations Confinées - 29 Vidange de tous les conditionnements Passage régulier de Thierry Mayenne (SIPPT; gestion de tout type de déchet) Tous les déchets « biohasard » sont autoclavés avant d’être confiés à une firme spécialisée (incinération) Utilisations Confinées - 30 Autoclaves En L1, L2: préparation de matériel stérile (protection du matériel biologique) Utilisations Confinées - 31 Le laboratoire L3 possède son propre autoclave (à double entrée): les containers jaunes sont directement remplis et scellés sur place après stérilisation Utilisations Confinées - 33 Utilisations Confinées - 32 Déchets sans rapport direct avec la biosécurité: gel d’agarose et tampon d’électrophorèse contaminés par du Bromure d’Ethidium (BrE) BrE = cancérigène (Risque chimique par contact) Utilisations Confinées - 34 Recommandations d’utilisation du BrE 1. Port de gants ! 2. En « zone réservée » 3. Ne jamais mettre dans l’agarose « fumant » vapeur + BrE (risque d’inhalation) BrE = Agent mutagène (intercalaire) Détection en fluorescence Gestion des déchets BrE: conteneurs spécifiques (ne jamais autoclaver) 1. Solides 2. Liquides (Tp électrophorèse) Utilisations Confinées - 35 Possibilité de décontamination des tampons d’électrophorèse Gestion du Risque Biologique Principes de base de la biosécurité (cadre légal; permis) Mesures de gestions du risque (Utilisations Confinées) • Règles communes à tous les niveaux de confinement • Equipements de confinement Equipements de confinement - 2 Equipements de confinement - 1 Les enceintes de sécurité microbiologique (ESM) 1. Les enceintes de sécurité microbiologique (ESM) 2. Comparaison des équipements et pratiques dans les L1 à L4 Protection Classe d'ESM Classe I Hotte aspirante Matériel biologique manipulé Confinement Manipulateur Environnement Non Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui A Classe II L2/L3 B Classe III "Boîte à Gants" L1 recommandé L2+/L3 L4 ESM -1 « clean bench » modèle 1 : n’est pas un ESM ESM -2 Exemples de CB aux FUNDP E: extracteur « vers labo » C: filtre HEPA A: ouverture (large !) • Protection de l’échantillon/l’environnement • Pas de protection de l’expérimentateur « théoriquement » adapté pour « cultures OP-free » ESM - 3 « clean bench » modèle 2: n’est pas un EMS D: extracteur « vers labo » C: filtre HEPA B: paroi vitrée A: ouverture • Protection de l’échantillon/environnement • Pas de protection de l’expérimentateur « théoriquement » adapté pour « cultures OP-free » ESM - 4 L’ESM de classe I ou « hotte aspirante » Extracteur « vers l’ext. » A: ouverture B: paroi vitrée C: filtre HEPA D: air souillé extrait • Protection de l’expérimentateur /environnement • Pas de protection de l’échantillon Application: solvants; dosages/fixations sur cultures ESM -5 L’ESM de classe II ou « hotte à flux laminaire vertical » - Type A Extracteur « vers l’ext. » A: ouverture B: paroi vitrée C: filtre HEPA D: air souillé extrait = en Surpression (risque de fuite) Protection de l’expérimentateur l’environnement l’échantillon ESM -6 L’ESM de classe II ou « hotte à flux laminaire vertical » - Type B Extracteur « vers l’ext. » A: ouverture B: paroi vitrée CE: filtre HEPA D: air souillé extrait = dépression (pas de risque de fuite) Protection de l’expérimentateur l’environnement (+) l’échantillon ESM - 7 ESM de type II aux FUNDP Modèle ancien (pas de vitre de protection) ! parfois « déclassées » SE RENSEIGNER !! ESM - 8 ESM de type II aux FUNDP Modèle récent, pourvu d’une vitre (le plus fréquent dans les salles de culture) ESM - 10 ESM - 9 L’ESM de classe III ou « boîte à gants » Circulation « fermée » Extraction à l’ext. A: orifices pour gants B: paroi vitrée CD: filtre HEPA Hotte étanche Pour L4 ESM - 11 EVITER DE PERTURBER LE FLUX LAMINAIRE en: 1. Obstruant les grilles d’aération avec papier (protocole) et autre matériel 2. Allumant un bec Bunsen 3. « montant » des palissades de boites et flasques de culture sur le fond de la hotte 4. Créant des courants d’air dans le local (fenêtres & portes closes) Les bonnes pratiques de travail en ESM 1. ESM adapté à l’opération (par ex., IIA pour culture et diagnostic d’OP; IIB pour culture à risque en L2+) 2. Placer tout le matériel nécessaire à l’opération avant de commencer 3. Veiller à laisser les grilles d'aération libres et manipuler au centre de la zone de travail ESM - 12 ESM - 13 Minimiser la contamination d’un L2+/L3: ESM - 14 Neutralisation des efflux de culture d’OP CR3 : • En ne sortant pas de l’enceinte des pipettes infectées par des OP avant de les avoir rincées dans une solution de désinfection • En éliminant les gants souillés avant de toucher du matériel en dehors de l’enceinte A: flacon de neutralisation (+ Javel 10% final) B: flacon de sécurité (trop-plein + Javel) C: filtre HEPA D: conduit d’aspiration en L2/L2+ élimination de A et B à l’évier (en L3 pas de Javel, mais incidine) ESM - 15 Traitement des milieux de culture CR1/2 Description des Confinements 1. Récolte des milieux par aspiration vers un flacon 2. Le Flacon de stockage est éliminé chaque jour APRES AJOUT d’un neutralisateur (Javel 10% fin.) Laboratoires (série L) Animaleries (série A) Confinements - 2 Caractéristiques des Confinements - 1 L1 L1 • Espace confiné (limité) • Facultatif: ESM I et/ou « clean bench » • Inactivation chimique des déchets biologiques (cultures de Coli K-12/S. Cerevisiae) • Un autoclave doit être accessible sur le site • Co-existence de plusieurs types d’activités Confinements - 3 L2 • doit posséder une EMS de type I ou II • le sigle « biohasard » doit être affiché sur les portes d’accès • Le tablier de laboratoire ne quitte pas le local • Les portes doivent être équipées d’un système de fermeture automatique et doivent pouvoir être verrouillées en dehors des périodes d’utilisation • une affiche apposée sur les portes d’accès doit mentionner; les coordonnées du responsable des opérations • on réalise les centrifugations dans la zone confinée • un autoclave doit être disponible dans le bâtiment Confinements - 4 L2+ diagnostic d’OP de CR3; cultures de virus transformants • • • • Accès contrôlé Port de gants obligatoire Pipettes désinfectées avant de quitter l’ESM Centrifugations en godets fermés; ouverture des godets sous hotte • « Rien ne sort », sauf sous forme de déchets Recommandé aussi: Évier à commande NON manuelle Contrôle strict des animaux potentiellement vecteurs des OP SAS; dépression Un autoclave dans le local L2 Confinements - 5 Confinements - 6 L3 - Caractéristique Générales: • Local en dépression (tout l’air passe par un filtre HEPA avant extraction); 2 SAS d’accès; vitres de surveillance • Autonomie électrique (10 h) • Autonomie technique (centri, spectro,PC, Fax, ...) • Éviers à commande NON manuelle; ne sont pas raccordés aux égouts • Un autoclave à double-entrée dans le local • Local qui peut-être rendu étanche, en cas de nécessité (désinfection par vapeur de formol) Affichage porte Centrifugation « aerosol free » Caractéristiques des Confinements - 7 Caractéristiques des Confinements - 8 L3 - Mesures de sécurité spécifiques: L3 - Mesures spécifiques: • Rien ne sort du L3 sans inactivation/désinfection préalable • Accès contrôlé (clé) • Formation des utilisateurs • Pas de vêtements de ville exposés (port d’une combinaison) • Port de charlotte, gants (2), masque et lunettes de protection OBLIGATOIRE • Procédures d’entrée/sortie (conduites standardisées lors du passage dans les SAS) • Mesure de sécurité en cas de malaise: « Règle des deux hommes » • Contrôle médical obligatoire régulier Confinements - 9 L3 Confinements - 10 L3 aux FUNDP (URBM) Entrée: 2 SAS en enfilade Gants en « manchon » Confinements - 11 SAS 1 Dépôt des Vêtements de ville Confinements - 12 SAS 2 matériel de protection individuelle Confinements - 14 Confinements - 13 Consignes d’entrée/sortie Salle commune du L3 Confinements - 15 Cabinets de travail et A3 Confinements - 16 L3 - LS (production) Confinements - 17 Confinements - 18 L4 Mesures L3, + • Conditions d’accès étendues au bâtiment • Port d’un scaphandre pourvu d’un respirateur • ESM de type III Spécificité du Confinement animal Bio-Exclusion Bio-Confinement Sécurité du Personnel Nature du « biorisque » • L’animal comme réservoir naturel d’OP (animaux malades/portage sain) • L’animal traité par pathogènes (utilisation volontaire d’OP) • L’animal traité par des OGM (utilisation volontaire d’OGM) • L’animal OGM Niveau de « biorisque » (NBR) & niveau confinement (NC) NBR Elevé Barrières de protection Modéré Faible Nul NC AB A2 A3 A4 Exceptions à la relation NBR-NC • Nature de l’expérimentation : NC diagnostic (A2) < NC infection exp. (A3) • Contagiosité des animaux traités : OP expiré (A3-A4) > OP dans les selles/urines (A2-A4) > OP dans les organes (A2) • Echelle (nombre d’animaux traités) • Efficacité du confinement animal (gros animaux > petits > aviens > insectes) Gestion des déchets Pratiques et équipements dans les différents niveaux de confinement AB (ou A1) : pas de risque biologique, MAIS, 1) pour respecter la Bioexclusion: • Accès limité • Vêtements protecteurs et gants 2) pour respecter l’environnement: programme de gestion des déchets NB = aussi mesures de protection envers pathogènes « silencieux » (portage sain ou maladie « naturelle » en incubation) Pratiques et équipements dans les différents niveaux de confinement A2 (ABSL2) : mêmes pratiques que pour A1, et: – Sigle « biohasard » sur la porte – ESM (type 1 ou 2) pour les activités qui génèrent aérosol (dissection, pipetage de solutions infectées, ouverture de tubes de centrifugeuses, ...) – DECONTAMINATION (autoclavage dans l’institut) des déchets (animaux, litière, cages, tubes, seringues, ...) Pratiques et équipements dans les différents niveaux de confinement A3 (ABSL3) : mêmes pratiques que pour A2, et: – – – – – ACCES REGLEMENTE (« clé » perso) Examen médical & Formation spécifique Suivi médical régulier Procédures d’entrée (et sortie) standardisées (2 SAS) Vêtements de villes interdits; protection individuelle accrue (2 paires de gants; masque; lunettes; charlotte) – Pression négative; air filtré sur HEPA – RIEN NE SORT de l’A3 (ou décontamination) – DECONTAMINATION sur place (autoclave à doubleentrée) des déchets (animaux, litière, cages, tubes, seringues, ...) A3 suite – Eviers à commande non manuelle; pas de raccord à l’égout – « spill kit » obligatoire – ESM (de type 2) pour les activités qui génèrent aérosol (dissection, pipetage de solutions infectées, ouverture de tubes de centrifugeuses, ...) – « Règle des deux hommes » (en cas d’accident) – Surveillance externe possible (parois vitrées) – Animaux dans ISOLATEURS Cages des isolateurs (circulation d’air filtré sur HEPA) Exemples d’A3 Isolateurs Petits animaux Protection individuelle (chaussures rigides et décontaminables) Manipulation des animaux en A3 (sous ESM type 2) A4 (ABSL4) Mêmes pratiques que pour A3, et: – ACCES DU SITE/BÂTIMENT REGLEMENTE – ESM (de type 2 ou 3 « BOITE A GANTS ») pour les activités qui génèrent aérosol (dissection, pipetage de solutions infectées, ouverture de tubes de centrifugeuses, ...) – Port d’un scaphandre pressurisé – Douche obligatoire à l’entrée et la sortie Exemple d’A4 Principe de flux (A2-4) Animaux "Monster Island" New York’s Plum Island is a level-4 bioresearch facility. What exactly is going on there? Staff: 200 « navetteurs » Recherches en Agriculture - bioterrorisme - Epidémies animales 3 types de flux Matériel Personnel 4 barrières: Site Bâtiment Confinement Héberg/Exp Conséquences des flux : Direction des flux dans le confinement (A2-A4) couloirs propres et sales Sortie staff : Entrée staff : SAS 1 « sâle » SAS 1 « sâle » SAS 2 « propre » Objectif « double » : 1) Garantir la santé animale (Bio-exclusion) 2) Empêcher la contamination (Biosécurité) -du personnel de l’animalerie -des chercheurs -de l’environnement (immédiat/externe) SAS 2 « propre » Déchets décontaminés Maintien des zones propres: gradients de pression Décontamination du matériel, protection des animaux et du personnel Filter « rien ne sort » des zones en dépression (zone contaminées) Autoclaved cages with bedding Filtrated and acidified water Air: Hepa filters Steam Fogger Irradiated diets Siphon Locker room Tous les déchets solides décontaminés sont incinérés Pathologies acquises en Animalerie Déccontamination des locaux: « Fogger » •Vecteur = rongeur (1) Pathologie Pulvérisateur (Conduroxid 5 Solution at 0.1%) Contrôle de décontamination (comptage de colonies bact en boîte) Agent toxoplasmose HSP (hantavirus pulmonary syndrome) parasites virus Vecteur T. Gondi Rongeurs (infection nat. et expéri-mentale) Hantavirus Rongeurs (infection nat. et expéri-mentale) Chevaux naturellement infectés (Australie) Voie de contagion Prophy/ Thérapie féces liquide intrapéritonéal aérosol tissus urine, feces peau (sueur) sang vaccin bactérie B. anthracis coqueluche bactérie B. Pertussis Rongeurs (IE) voie aérienne Rongeurs (infection expérimentale) Rongeurs (infection expérimentale) Rongeurs (infection expérimentale) sang liquides inters. aérosols déjections sang Brucellose bactérie Brucella sp. Tularémie (pseudo-peste) bactérie F. tularensis Leptospirose (icterrohemorrhagique) bactérie L. interrogans Listeriose (septic., encéphalite, bactérie méningite, inf. Intra-utérine, ...) Rongeurs L. monocytogenes (infection expérimentale) Peste Y. pestis bactérie Rongeurs (infection expérimentale) Prophy/ Thérapie Confin. A NOTER bioterrorisme/p ermis special vaccin (pas recom.) A2 (infection) A3 (culture) A2 (infection) A3 (culture) antibiothérapie A3 (infection) A3 (culture) A2 (infection) vaccin A3 (culture) urine sang tissus feces sang vaccin A2 A2 Danger pour les femmes enceintes A3 bioterrorisme/p ermis special morsures vaccin Pathologies acquises en Animalerie Vecteur = rongeur (3) Pathologie Espèce Voie de contagion anthrax Vecteur = rongeur (2) Agent Vecteur Rongeurs (infection expé- Pathologies acquises en Animalerie Pathologie Espèce Agent Voie de contagion Espèce Vecteur Virus hepatite B (C) Rongeurs (infection expérimentale) et sang Primates (infect. Nat) lymphocytic choriomeningitis virus (LMC) Rongeurs (infection expérimentale) et Primates nat. infectés (macaques) Virus du sida Rongeurs (infection expérimentale) et sang Primates nat. infectés (macaques) Prophy/ Thérapie Confin. A NOTER A2 infection Confin. A2 (diagn.) vaccin A3 (culture) A2 (infection) A NOTER Danger pour les femmes enceintes Hépatite B (C) virus l'infection par le VHB permet l'infection par le VHC (atténué) vaccin A3 culture Méningite LMC virus A3 (culture) SIDA virus CDJ var (maladie protéine prion pathogène à prion) sang liquide cérébro pas tissus, sécrétions nasoph. (aérosols) Souris transgéniques homogénats de (infection expéri- SNC mentale) A3 A2 infection PAS de vaccin A3 culture pas A3 Les souris "nude" pourraient être porteuses saines Pathologies acquises en Animalerie Pathologies acquises en Animalerie Vecteur = primate Vecteur = bétail Pathologie Pathologie Tuberculose Agent bactérie Encéphalite virale virus Espèce Vecteur M. tuberculosis Primates (infection nat. et expérimentale) H. Simiae Primates nat. infectés (macaques) Voie de contagion Prophy/ Thérapie Confin. urine tissus A2 (diagn.) aérosols sang tissus urine A3 (culture) A2 infection A NOTER très résistant dans l'environnement Agent Espèce Syndrôme d'urémie hémolytique bactérie Bovins (portage E. coli (0157:H7) sain) Rongeurs (IE) coccidioidomycose champignon C. immitis Pathologie Agent Influenza aviaire virus Influenzavirus (souches H5 et H7) Trachrome (kératoconjonctivite) bactérie C. psittaci Voie de contagion matières fécales sécrétions Poulets et dindons respiatoires nat. infectés Oiseaux infectés déjections tissus secr. nasales A NOTER A2 sang "nécropsie" A2 (diagn.) A3 (culture) Voie de contagion Vecteur plasmodium insectes vecteurs mouche tsé-tsé, anophène piqûres d'insecte ou triatome vecteur, sang de (étude en bétail infecté laboratoires) Bétail malade (Afrique) parasites Prophy/ Thérapie Confin. A NOTER A3 insecte vect confinement "biologique": études de A2 (diagnostic formes bétail) atténuées COMMISSION DE BIOSECURITE Président: JJ Letesson Responsable Administratif: S. Loret Responsable en Prévention: B. Delwiche Vecteur = oiseaux Vecteur Confin. Vos interlocuteurs Pathologies acquises en Animalerie Espèce Prophy/ Thérapie féces Espèce Trypanosma Agent Chevaux (nat. Infectés) Voie de contagion Vecteur = insecte A3 culture A3 animal avec lésion buccale palludisme maladies du sommeil et maladie de Chagas Pathologie Vecteur Prophy/ Thérapie Confin. A NOTER A3 virus très résistant dans matières fécales et eau A2 Représentants de chaque UR concernée: URBM: C. Didembourg URBC: M. Raes URPHYM: C. Lambert CELL & TISS: Y. Poumay PHARMACIE: L. Pochet CHIMIE: J. Wouters Site Internet Biosécurité http://www.fundp.ac.be/universite/services/sippt/biosec/