Antibiogramme par la méthode de diffusion en milieu gélosé

D’après Comité de l’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie – Janvier 2004 –
Antibiogramme par la méthode de diffusion en milieu gélosé
Préparer
inoculum.
une
1. A partir d’une culture pure (18-24 heures sur milieu non sélectif
adapté aux exigences de la souche), préparer une suspension
inoculum en eau physiologique (ou bouillon Mueller-Hinton)
équivalente au standard Mc Farland 0,5 (1)(~ 108 UFC / cm3 ).
(1) Suspension au standard 3 McF (~ 109 UFC / cm3) pour Helicobacter
pylori ; Suspension au standard 1 McF en bouillon Brucella ou Schaedler pour
les anaérobies.
suspension
Isolement (18-24 h ; milieu non sélectif)
2.
Dilution
de
inoculum.
la
suspension
Bactéries
Enterobacteriaceae, Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter spp.,
Stenotrophomonas maltophilia,
Burkholderia cepacia, Staphylococcus
spp., Enterococcus spp.
Campylobacter spp.(2)
Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus spp.,
Haemophilus influenzae.
Ensemencement avec un écouvillon
introduit dans la suspension inoculum diluée.
er
1 temps
Neisseria meningitidis (3)
Neisseria gonorrhoea (3)
Helicobacter pylori(1)
Anaérobies(1)
A
2ème temps
C
Bactéries
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa,
Acinetobacter spp., S. maltophilia, B.
cepacia, Staphylococcus spp.,
Enterococcus spp., N. meningitidis
A
Orientation
des stries
Orientation
des stries
B
C
B
Dépôt des disques
C
Streptococcus pneumoniae(4),
Streptococcus spp(4).
Campylobacter spp(5)
Helicobacter pylori(6)
Haemophilus influenzae,
Neisseria gonorrhoeae.
Anaérobies
(Catégorie clinique et CMI estimée)
Diamètre en mm
D
d
I
CMI estimée
en µg.cm-3
Concentrations
critiques (µg.cm-3)
C D d
Catégorie clinique
Nom de
l’antibiotique
c
Diamètre lu
en mm
Famille
…
Diamètres
critiques (mm)
Sigle
…
Gélose Mueller-Hinton
(4 mm d’épaisseur)
Gélose Mueller-Hinton + sang
(4) 5% sang de mouton ou 5% de sang
hémolysé de cheval avec le cotrimoxazole ;(5)
5% de sang de mouton ou de cheval ; (6) 10%
sang de cheval
Gélose Chocolat PolyVitex®
(ou milieu HTM pour H. influenzae)
Gélose Willkins Chalgren ou
Brucella + 5% sang
5.
R
c
C
Concentrations en µg.cm-3
…
Milieu
4. Déposer les disques (maximum 6 pour une boite de 90 mm) à la
surface de la gélose en les appliquant délicatement à la pince stérile.
Remarque : Pour Nesseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae déposer
les disques à une distance de 60 mm de centre à centre pour éviter le
chevauchement des zones d’inhibition.
Incubation et lecture
S
Pas de dilution de la suspension
inoculum (0,5 ; 1 ou 3 McF).
3. Avec un écouvillon essoré, ensemencer toute la surface du milieu
en stries serrées (successivement 3 orientations décalées de 60°).
3ème temps
A
[0,1 cm3 dans 10 cm3 ou bien encore
deux gouttes de pipette Pasteur dans 10
cm3]
dilution au 1/10 de la suspension
inoculum à 0,5 McF (~ 107 UFC / cm3)
[1 cm3 dans 9 cm3 ou bien encore 20
gouttes de pipette Pasteur dans 9 cm3].
(2) Suspension inoculum faite en bouillon Brucella ou eau physiologique.
(3) Suspension inoculum faite en tampon phosphate M/15 pH 7.
Orientation
des stries
B
Dilution en bouillon Mueller-Hinton
(ou eau distillée stérile)
dilution au 1/100 de la suspension
inoculum à 0,5 McF (~ 106 UFC / cm3).
…
…
…
Bactéries
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa,
Acinetobacter spp., S. maltophilia,
B cepacia, Staphylococcus spp.,
Enterococcus spp., H. influenzae.
Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus spp., N. meningitidis.
Neisseria gonorrhoeae.
Campylobacter spp
Helicobacter pylori
Anaérobies
Lecture après ….
Incubation en aérobiose
18-24 h à 37°C
Incubation en atmosphère contenant
5 % CO2 18-24 h à 37°C
Incubation en atmosphère contenant
5 % CO2 18-24 h à 37°C
(36-40 h si croissance insuffisante)
18-24 h à 37°C en microaérobiose
(ou anaérobiose selon les souches)
18-24 h à 37°C en microaérobiose
48 h à 37°C en anaérobiose
© Louise Michel