Antibiogramme par la méthode de diffusion en milieu gélosé

D’après Comité de l’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie – Janvier 2004 –
© Louise Michel
Antibiogramme par la méthode de diffusion en milieu gélosé
Préparer une suspension
inoculum.
Isolement (18-24 h; milieu non sélectif)
Dilution de la suspension
inoculum.
Ensemencement avec un écouvillon
introduit dans la suspension inoculum diluée.
Dépôt des disques
Incubation et lecture
(Catégorie clinique et CMI estimée)
Diamètre en mm
D d
c C
Concentrations en µg.cm-3
Sigle
Famille
Nom de
l’antibiotique
Concentrations
critiques (µg.cm-3)
Diamètres
critiques (mm)
Diamètre lu
en mm
Catégorie clinique
CMI estimée
en µg.cm-3
… … … c C D d … … …
1. A partir d’une culture pure (18-24 heures sur milieu non sélectif
adapté aux exigences de la souche), préparer une suspension
inoculum en eau physiologique (ou bouillon Mueller-Hinton)
équivalente au standard Mc Farland 0,5 (1)(~ 108UFC / cm3).
(1) Suspension au standard 3 McF (~ 109UFC / cm3) pour Helicobacter
pylori ; Suspension au standard 1 McF en bouillon Brucella ou Schaedler pour
les anaérobies.
2.
Bactéries Dilution en bouillon Mueller-Hinton
(ou eau distillée stérile)
Enterobacteriaceae, Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter spp.,
Stenotrophomonas maltophilia,
Burkholderia cepacia, Staphylococcus
spp., Enterococcus spp.
Campylobacter spp.(2)
dilution au 1/100 de la suspension
inoculum à 0,5 McF (~ 106UFC / cm3).
[0,1 cm3dans 10 cm3ou bien encore
deux gouttes de pipette Pasteur dans 10
cm3]
Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus spp.,
Haemophilus influenzae.
dilution au 1/10 de la suspension
inoculum à 0,5 McF (~ 107UFC / cm3)
[1 cm3dans 9 cm3ou bien encore 20
gouttes de pipette Pasteur dans 9 cm3].
Neisseria meningitidis (3)
Neisseria gonorrhoea (3)
Helicobacter pylori(1)
Anaérobies(1)
Pas de dilution de la suspension
inoculum (0,5 ; 1ou 3 McF).
(2) Suspension inoculum faite en bouillon Brucella ou eau physiologique.
(3) Suspension inoculum faite en tampon phosphate M/15 pH 7.
3. Avec un écouvillon essoré, ensemencer toute la surface du milieu
en stries serrées (successivement 3 orientations décalées de 60°).
Bactéries Milieu
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa,
Acinetobacter spp., S. maltophilia, B.
cepacia, Staphylococcus spp.,
Enterococcus spp., N. meningitidis
Gélose Mueller-Hinton
(4 mm d’épaisseur)
Streptococcus pneumoniae(4),
Streptococcus spp(4).
Campylobacter spp(5)
Helicobacter pylori(6)
Gélose Mueller-Hinton + sang
(4) 5% sang de mouton ou 5% de sang
hémolysé de cheval avec le cotrimoxazole ;(5)
5% de sang de mouton ou de cheval ; (6) 10%
sang de cheval
Haemophilus influenzae,
Neisseria gonorrhoeae.
Gélose Chocolat PolyVitex®
(ou milieu HTM pour H. influenzae)
Anaérobies Gélose Willkins Chalgren ou
Brucella + 5% sang
4. Déposer les disques (maximum 6 pour une boite de 90 mm) à la
surface de la gélose en les appliquant délicatement à la pince stérile.
Remarque : Pour Nesseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae déposer
les disques à une distance de 60 mm de centre à centre pour éviter le
chevauchement des zones d’inhibition.
5.
Bactéries Lecture après ….
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa,
Acinetobacter spp., S. maltophilia,
B cepacia, Staphylococcus spp.,
Enterococcus spp., H. influenzae.
Incubation en aérobiose
18-24 h à 37°C
Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus spp., N. meningitidis.
Incubation en atmosphère contenant
5 % CO218-24 h à 37°C
Neisseria gonorrhoeae.
Incubation en atmosphère contenant
5 % CO218-24 h à 37°C
(36-40 h si croissance insuffisante)
Campylobacter spp 18-24 h à 37°C en microaérobiose
(ou anaérobiose selon les souches)
Helicobacter pylori 18-24 h à 37°C en microaérobiose
Anaérobies 48 h à 37°C en anaérobiose
R
I
S
3
ème
temps
1
er
temps
2
ème
temps
A
B
C
A
B
C
Orientation
des stries
A
B
C
Orientation
des stries
Orientation
des stries