Synopsis A MOREIRA

Synopsis-type
Présentation projet de mémoire de DES d’Oncologie
Aurélie MOREIRA , CHU d’Amiens
TITRE
Caractérisation de la population cellulaire CD45+ infiltrant les glioblastomes
humains
PROMOTEUR EVENTUEL
COORDINATEUR EVENTUEL
Pr B.Chauffert
RATIONNEL DE L’ETUDE
Ce projet fait suite au travail réalisé par Estelle Bronsart, interne du CHU
d’Amiens, dans le cadre de son mémoire de DES d’Oncologie. Ce travail
montrait la valeur pronostique plutôt défavorable de l’infiltrat lymphocytaire
Th17 et celle plutôt favorable du marquage PDL1 dans une cohorte de 77
patients porteurs de glioblastomes (GBM) traités par chirurgie puis
radiochimiothérapie avec temozolomide selon le schéma classique de Stupp (1),
entre 2006 et 2013. Cependant, les populations cellulaires marquées par IL17 et
PDL1 étaient très peu représentées (quelques %). Une découverte inattendue a
été de constater, au contraire, un immunomarquage abondant et intense de
l’antigène CD45 dans tous les GBM analysés.
Le CD45 a un profil d’expression pan-leucocytaire. Il est impliqué dans
l’activation lymphocytaire, dans la transduction du signal naissant à partir des
TCR et dans plusieurs voies de signalisation intracellulaire. Cependant, étant
donné son caractère pan-leucocytaire, celui-ci est peu spécifique d’un type
cellulaire donné.
Le but de ce projet est donc de chercher à caractériser cette abondante population
(de quel(s) type(s) cellulaire(s) s’agit-il ? Microglie ? Macrophages ?
Lymphocytes ? Autres ?), de déterminer son rôle (cellules immunosuppressives
ou cellules bloquées dans leur activité antitumorale) et enfin d’évaluer si ce type
cellulaire peut être la cible d’une manipulation immunologique à visée
thérapeutique.
ENJEU
Enjeu thérapeutique : voie thérapeutique prometteuse
En dépit des progrès thérapeutiques réalisés grâce à des techniques chirurgicales
plus sophistiquées, des irradiations plus ciblées et des chimiothérapies mieux
adaptées, le pronostic des GBM reste sombre avec une survie médiane de l’ordre
de 15 mois. Ces résultats décevants incitent à rechercher de nouvelles stratégies
thérapeutiques, dont l’immunothérapie.
Les connaissances actuelles permettent d’affirmer que l’environnement tumoral
des cancers solides influence la croissance et la dissémination tumorales.
Certaines données suggèrent que la microglie et/ou les macrophages – et non pas
les lymphocytes- sont les principales cellules inflammatoires infiltrant les
glioblastomes (2–4).
BASES
CONCEPTUELLES
DU PROJET
1ère partie : Travaux sur la base de données établie par Estelle Bronsart dans son
mémoire de DES d’Oncologie de 2016. Les prélèvements sont disponibles sous
forme de bloc inclus en paraffine au laboratoire d’anatomo-pathologie du CHU
d’Amiens.
Valeur pronostique de l’infiltrat CD45 des glioblastomes
Etude de 20 GBM dont le pronostic de ces GBM a été variable. Nous choisirons
10 échantillons provenant de patients ayant eu la survie la plus courte et 10
échantillons de patients ayant eu la survie la plus longue. Un des objectifs du
projet est de savoir si l’infiltration monocytaire peut avoir une valeur
pronostique.
Rapports anatomopathologiques entre les cellules CD45 et les cellules
gliales :
Les cellules gliales malignes seront marquées par un anticorps anti-GFAP. Nous
essayerons de rendre compte de la structure tridimensionnelle de la tumeur en
réalisant de nombreuses coupes successives.
Les contacts éventuels entre les cellules CD45 et les cellules gliales seront
précisés pour savoir si la distribution des cellules CD45 est intra tumorale ou péri
tumorale, s’il y a contact direct entre les cellules CD45 et les cellules
gliomateuses.
2ème partie : Travaux réalisés sur des pièces d’exérèse de GBM fraichement
opérés.
Les patients atteints de GBM devront avoir donné leur accord préalablement afin
que leur tumeur soit utilisée à des fins de recherche.
Après avoir réservé les échantillons nécessaires pour le diagnostic et la mise en
biobanque, le matériel tumoral en excès sera placé dans du liquide de transport.
Caractérisation des cellules infiltrantes de glioblastome :
Il a été démontré que les différentes sous-populations de cellules inflammatoires
infiltrant les GBM peuvent être caractérisées par cytométrie en flux basée sur le
marquage en CD45 (antigène pan-leucocytaire) et CD11b (récepteur au
complément 3) (5).
Ainsi, quatre populations cellulaires peuvent être distinguées :
- CD45-/CD11b – (cellules non inflammatoires)
- CD45+/CD11b- (lymphocytes)
- CD45dim/CD11b+ (microglie)
- CD45bright/CD11b+ (monocytes/macrophages d’origine sanguine)
Nous allons donc utiliser la technique par cytométrie en flux sur du matériel de
GBM fraîchement opérés pour permettre la caractérisation cellulaire de cet
important infiltrat marqué en CD45 (6). L’immunohistochimie permet également
d’approfondir la caractérisation avec le marquage en CD3/CD4/CD8. Le CD3 est
utilisé pour identifier les lymphocytes T. CD4 et CD8 permettent de distinguer
les lymphocytes T helper (CD4) des lymphocytes T cytotoxiques (CD8).
Activation des cellules CD45 :
L’hypothèse du projet est que les cellules CD45 sont essentiellement des cellules
de type monocyte/macrophage (MM) ou des cellules de la microglie (MG), ce
qui devra être confirmé par les expériences précédentes.
Si tel est le cas, on sait que les cellules MM et MG peuvent être activées pour
être cytotoxiques vis-à-vis des cellules tumorales.
Cette question sera abordée par une technique de culture à court terme de
fragments de GBM humains
Pour l’activation de ces cellules, le matériel tumoral en excès récupéré sera coupé
en coupe épaisse de 300 µ par un Vibratome et mis dans des plaques de culture à
37°C avec du milieu nutritif complet en atmosphère contrôlée.
1) Une activation directe de ces cellules sera réalisée via :
des cytokines activatrices (IFNγ, LPS) qui seront ajoutées ou non dans le milieu
de culture à H0.
Des échantillons de milieu de culture seront prélevés à H0,H1, H3, H6 et H24.
Les cytokines témoins de l’activation des cellules MM et MG seront dosées : IL1β, TNFα, IL-6, NO.
2) Une activation indirecte sera réalisée via l’ajout d’un inhibiteur de TGFβ
En effet, il nous a paru que le TGF-β jouait un rôle prépondérant dans les
mécanismes immunosuppresseurs développés au sein des GBM.
Le TGFβ1 est un régulateur négatif de l’inflammation dans le SNC.
La microglie ne produit que cette isoforme 1 notamment après activation par le
TNFα ou IL-1. Sur la microglie, le TGF-β a pour action générale d’inhiber sa
fonction immunitaire, il peut ainsi inhiber l’expression de CMH II et des
molécules costimulatrices induites par des stimuli inflammatoires à leur surface,
inhiber la production de radicaux oxygénés par la microglie,bloquer la
prolifération.
L’environnement des cellules microgliales est primordial et la fonction de cellule
présentatrice d’antigène peut être modulée positivement par l’IFN-γ, le TNF-α, le
LPS et négativement par le TGF-β.
De même, les lymphocytes T régulateurs sont capables de bloquer l’activité des
lymphocytes T CD8+ en inhibant leur fonction cytotoxique par un mécanisme
TGF-β dépendant.
Ainsi, le TGF-β normalement présent dans le parenchyme nerveux, va être
sécrété en grande quantité par les gliomes et va être capable de bloquer
l’activation des cellules présentatrices d’antigène, des lymphocytes T mais aussi
la sécrétion des facteurs inflammatoires tels que l’IFN-γ (7,8). Tout comme IL10, il peut contribuer à augmenter le pool de cellules suppressives en favorisant
la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T régulateurs.
Afin de réactiver le système immunitaire, il est aussi possible de lever les
différents points d’immunosuppression ou de tolérance immunitaire existant
localement (9) et pour contrebalancer la production de cellules suppressives
(10,11).
DUREE PREVISIBLE
DE L'ETUDE
24 mois
CALENDRIER
PREVISIONNEL AVEC DATE
DE DEBUT ET DE FIN
TUTEUR
Année recherche à partir du 1 Novembre 2017 pour la 1ère partie .
Année recherche + 1 année pour les cultures à partir d échantillons de GB opérés
Pr B. CHAUFFERT
FINANCEMENT
1- Année Recherche pendant 12 mois
2- Demande de subvention à Ligue contre le Cancer et à l’ARTC
(Association pour la Recherche sur les Tumeurs Cérébrales )
ASPECTS
REGLEMENTAIRES
CPP
ANSM
CNIL
1- Pour l’étude rétrospective, les patients étant tous décédés, un dossier
sera déposé devant le CEREES (en effet CPP et ANSM ne sont pas
demandés par la loi Jardé)
2- Selon la loi Jardé , un dossier CPP sera déposé pour l’étude prospective,
non interventionnelle, qui utilisera les surplus tumoraux après les
prélèvements nécessaires au diagnostic et à la biobanque. Une
information écrite sera remise aux patients qui pourront être informés
s’ils le souhaitent, des résultats obtenus.