Applica on de la métabolomique dans le suivi de la
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Applica'ondelamétabolomiquedanslesuividelatransplanta'onrénale ÉricBonneau1,NicolasTétreault2,RobertRobitaille1,AnneBoucher3etVincentDeGuire1. 1Servicedeslaboratoiresdebiochimie,CIUSSSdel’Est-de-l’Île-de-Montréal,HôpitalMaisonneuve-Rosemont,5415,boulevarddel’AssompOon,Montréal,Québec,H1T2M4 2BironGroupeSanté,4105-F,boulevardMaSe,Brossard,Québec,Canada,J4Y2P4 3Servicedenéphrologie,CIUSSSdel’Est-de-l’Île-de-Montréal,HôpitalMaisonneuve-Rosemont,5415,boulevarddel’AssompOon,Montréal,Québec,H1T2M4 Introduc'on Tableau2.SommairedesmétabolitesidenOfiéspar métabolomiquesetassociésàdescomplicaOonsde transplantaOon.AdaptédeBonneauetal. La transplantaOon d’organes est un traitement de choixpourplusieursmaladiesdestadesavancés,en parOculier l’insuffisance rénale chronique. Il s’agit cependant d’un processus qui comporte plusieurs risquesdecomplicaOonsimportantes: • Rejetdugreffon • DélaidereprisedefoncOon • Dommagesischémiquesdel’organe • Toxicitédesimmunosuppresseurs Les ouOls actuels du suivi post-opératoire sont généralement peu spécifiques (dosage de la créaOnine en transplantaOon rénale) ou encore très invasifs (biopsie). Des biomarqueurs non-invasives, sensibles et spécifiques sont donc pour la détecOon précoce des complicaOons menant à la dysfoncOon dugreffonsontencorerequises. La métabolomique est une science à haut-débit qui vise à caractériser le métabolome, soit la collecOon de tous les composés de peOts poids moléculaire produitsparlesvoiesmétabolique(Figure1).Ils’agit donc d’une approche appropriée pour l’étude des maladies complexes et mulOfactorielles comme les maladies rénales, l’oncologie, les maladies c a r d i o v a s c u l a i r e s e t p l u s r é c e m m e n t , l a transplantaOon d’organes. La métabolomique permet soit de suivre un profil de plusieurs métabolites ou d’idenOfier des biomarqueurs dont les concentraOons varient en foncOon de l’état pathophysiologiquedupaOentoud’untraitement. Nous avons cherché à savoir si les approches de métabolomiques seraient applicables dans les laboratoires cliniques du système de santé du Québec. De plus, nous avons étudié la liSérature pour idenOfier des biomarqueurs qui pourraient représenter des cibles de développement à court terme. Matrice Métabolites Rein Dommageischémique Urine TMAO,DMA,acétate,lactate,citrate Plasma TMAO,allantoïne,inosine,hypoxanthine,glucose,lactate,lipides, adénine,guanosine,urate,polyols,prostaglandines,kynurenine, citrulline Dommageischémique Dommageischémique Tissu Rejet Urine Rejet Sérum Délaireprisedefonction Délaireprisedefonction Tox.Immunosuppresseurs Urine PM Urine ATP Kynurenine,phosphatidylcholines,proline,dérivésd’acides aminés Acidesaminés,carbohydrates,lipides,métabolitesdelaflore intestinale,métabolitescataboliques,kynurenine TMAO,creatine,creatinine,hippurate,mannitol,acétate Glutathion,glucose,leucine,inosine,gluconate Glucose,TMAO,citrate,lactate,15-F2t-isoprostane,hippurate, inositol,créatinine,succinate,α-ketoglutarate,créatine,TMA, taurine Tox.immunosuppresseurs Plasma Créatinine,TMAO,glutathion Tox.immunosuppresseurs Sérum Lipides,glucose,hypoxanthine,lactate,succinate,taurine Foie Dommageischémique ADMA Dommageischémique Sérum Acidesgras,carbohydrates Dommageischémique Tissue Urée,acidesbiliaires,acidehomovanillique,méthionine, glutathionréduit,formate,orthophosphate,ADP,lactate, pyruvate,glycérol,fumarate,succinate Rejet Bile Acidebiliaireconjuguéàlataurine Délaireprisedefonction Tissue Acidesbiliaires,xanthine,acideurique,kynurenine,3nitrotyrosine,acide4-hydroxy-3-methoxymandélique Urine Nitrate Plasma Lipides,lipoprotéines,proline,glycine,sérine,phénylalanine, isocitrate Coeur Rejet Rejet Rejet RMN Échan'llon Poumon Dommageischémique Dommageischémique MS PM Tissue Tissue Lactate,urée,acidesbiliaires Tableau1.AvantagesetlimitaOonsdesapprochespar RMNetMSenmétabolomique.AdaptédeBonneauetal. RMN MS Aspectsexpérimentaux Réglagespourbiofluides 1D1Hand1D31P GC/LC/CE-MS 2DCPMG ESI-Q-TOF 2DHSQC ESI-Q-orbitrap 2DCOSY MALDI-TOF Maladiesrénales chroniques LakynurenineetleglutathionontétéidenOfiésdans les études de transplantaOon rénal, hépaOque et pulmonaire. La kynurenine aurait un rôle immunomodulateuretseraitdiminuédanslescasde rejetrénalaigu.Leglutathionreprésentequantàlui la capacité de l’organe à se défendre contre les espècesoxygénéesréacOves.Leglutathionpeutêtre uOlisécommeunbiomarqueurdontlaconcentraOon diminueencasdedommageischémiquedel’organe. Phénylalanine,tyrosine,acidesgras Liquidede Glutathion,uracil préservation Tableau3.UOlitédudosageduTMAOpourlediagnosOcetle suivithérapeuOquedespaOentsavecaSeintesrénalesou transplantaOonrénale.AdaptédeBonneauetal. Transplantationrénale En transplantaOon rénale, le biomarqueur le plus commun correspond au triméthylamine-N-oxyde (TMAO). Le TMAO est un marqueur de dommages médullaire rénal et de stress oxydaOf intensif. Des niveaux augmentés de TMAO dans l’urine et le plasmadepaOentsgreffésestassociéàdudommage ischémique, de la toxicité aux immunosuppresseurs etaudélaidereprisedefoncOon. Phosphocréatine,ATP,N-acetylaspartate,myo-inositol,créatine 2015 Condition Normal Figure2.ApplicaOonsdelaspectrométriedemasseet delaRMNenmétabolomique.AdaptédeBingoletal. UnemulOtudedemétabolitesontétéidenOfiésdans des études de métabolomiques effectuées lors de transplantaOon rénale, cardiaque, hépaOque et pulmonaire, permeSant de définir plusieurs complicaOonspost-greffe(Tableau2): • Dommagesischémiques • Rejetdugreffon • DélaidereprisedefoncOon • Toxicitédesimmunosuppresseurs Dommageischémique Figure1.Approches«omics»etleurlienavecles processuscellulaires.AdaptédeGoldsmithetal. Plasma Considéra'onstechniques La métabolomique repose typiquement sur la résonance magnéOque nucléaire (RMN) et la spectrométriedemassequisontdeuxméthodesqui permeSent le dosage de plusieurs centaines de composés lors d’une seule expérience (Figure 2). Chaque méthode possède des avantages et des inconvénients(Tableau1). La spectrométrie de masse est la méthode la plus adaptée pour le milieu clinique de par la taille des appareils et des coûts associés. En métabolomique, lesapprocheslespluscourantessebasentsurleMS e t l e M S / M S c o u p l é à d e s m é t h o d e s chromatographiques, principalement en phase gazeuse (GC) et liquide (LC) qui sont des appareils déjà couramment uOlisés et disponibles dans les grandscentresquébécois. La métabolomique est aussi une approche permeSant de faire des analyses sur un nombre impressionnantdematricesdifférentes: • Sang(sérumetplasma) • Urine • LCR • Bile • Salive • LiquidedeconservaOond’organes • Tissus(biopsie) • Etc... Complication Signification Protectiondesprotéinesetdesacidesnucléiques contrelesaltérationsstructuralescauséespar l’acideurique Marqueurdedommagemédullairerénal Marqueurd’intensificationdustressoxydatif Associéàaudommageischémiquerénal Associéàlatoxicitédesimmunosuppresseurs Associéàundélaidereprisedefonction Corrélationinverseentrelaconcentrationde TMAOetleDFGe Risquedecomplicationscardiaques NiveaudeTMAO Normal Augmenté Augmenté HRMAS MALDI-TOF Réglagespourétudesinvivo PossibleavecMRS Non Détectionmoyennede <200 500+ Équipement Coûtdel’équipement Trèsélevé Modéréàélevé Coûtdemaintenance Élevé Modéré Analysesautomatisées Oui Oui Tempsexpérimental 5minutespour1D Jusqu’à60minutessicombiné Jusqu’à60minutespour2D àdelachromatographie Avantagesgénéraux Non-destructible Applicationslarges Intrinsèquementquantitatif Trèssensible(pg-ng) Préparationminimale Hauterésolution Robusteetreproductible Détectionélevéede Utilisablesurtouttypede métabolites biofluide Peutêtrecoupléàdes métabolites méthodesdeséparation Limitationsgénérales Résolutionmodéréeàcausede Méthodedestructive lasuperpositiondepics Reproductibilitémodéréepour Faiblesensibilité(μg) lesbiofluidesavecdessels Détectionbassedemétabolites Biaisdedétection(modepositif Trèsdispendieux ounégatif) Tableau4.ConsOtuOondelabanqued’échanOllonsde liquidedeconservaOondetransplantaOonrénaleàl’HMR Nombred’échantillons(N) Genre Homme Femme Tempsd’ischémiemoyen Typededonneur Décèscardiocirculatoire Décèsneurologique Donneurvolontairevivant Inconnu Reprisedefonction Immédiat Lent Inconnue Nécrose Nécrosetubulaireaigue Inconnu Informationsurlabanqued’échantillons 169 108 61 11heureset3minutes 51 85 16 17 100 24 17 28 17 DosageduTMAOdansleliquidede conserva'onrénal La présence de TMAO est associé à plusieurs condiOons physiologiques et pathophysiologiques (Tableau 3). Le département de néphrologie de l’HMR possède une banque d’échanOllon de liquide de conservaOon de reins (Tableau 4). Le dosage du TMAO dans ces échanOllons pourrait permeSre d’évaluerledommageischémiquedel’organeavant transplantaOon et d’assurer au paOent un suivi plus étroitouencoreuntraitementauN-acétylcystéine. Ainsi, nous avons iniOé à l’HMR le développement d’uneapprochededosageduTMAOparLC-MS/MS. Le TMAO sera dosé suite à une séparaOon sur une colonne HILIC, ionisé par ESI et détecté en mode posiOf sans besoin d’extracOon au préalable. La phase mobile est consOtuée eau/acide formique 0.1%(phaseA)etd’acétonitrile(phaseB). 2DTOCSY Réglagespourbiopsie Métabolomiqueentransplanta'on Conclusion La métabolomique représente une approche promeSeuse pour l’idenOficaOon de nouveaux biomarqueursdanslecontextedelatransplantaOon. La métabolomique peut être uOlisé dans les milieux cliniquesauQuébec,nerequérantquedesappareils de spectrométrie de masse et pourrait permeSre d’idenOfier un grand nombre de nouveaux biomarqueurs.Ils’agitd’uneapprocheparfaitepour lesmaladiescomplexesetmulOfactoriellescommela t r a n s p l a n t a O o n m a i s a u s s i l e s m a l a d i e s cardiovasculairesetl’oncologie. Référence • Goldsmithetal.Metabonomics:ausefultoolforthefuturesurgeon.J SurgRes,160(1):122-132,2010. • Bingoletal.Twoelephantsintheroom:newhybridnuclearmagneOc resonance and mass spectrometry approaches for metabolomics. CurrentOpinioninClinicalNutriOon&MetabolicCare,18(5):471-477, 2015. • Bonneauetal.Metabolomics:PerspecOvesonpotenOalbiomarkersin organ transplantaOon and immunosuppressant toxicity. Clin Biochem, 49(4-5):377-384,2016
