Atrophie, croissance et fonction musculaire : l`impact des leucocytes

NICOLAS DUMONT
ATROPHIE, CROISSANCE ET FONCTION
MUSCULAIRE :
l’impact des leucocytes et de la triade RANK/RANKL/OPG.
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en physiologie-endocrinologie
pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2013
© Nicolas Dumont, 2013

Résumé
L’atrophie et les dysfonctions musculaires sont des problèmes courants et d’origines
variées. À titre d’exemple l’alitement prolongé, le SIDA, les cancers, l’hypogravité et le
vieillissement peuvent tous entraîner une perte de masse et de force musculaire. Malgré les
coûts économiques et sociaux élevés, relativement peu d’efforts ont été investis dans la
caractérisation des processus qui gouvernent l’atrophie/dysfonction musculaire et dans le
développement de traitements plus efficaces. Conséquemment, cette thèse vise à
approfondir les connaissances actuelles sur les mécanismes qui régulent
l’atrophie/dysfonction et la récupération des muscles atrophiés par sous-utilisation. Tout
d’abord, nous avons caractérisé l’impact des leucocytes impliqués lors de la remise en
charge du muscle soléaire atrophié par hypogravité. Ainsi, nous avons démontré que les
mastocytes étaient activés par la remise en charge et que leur dégranulation orchestrait le
recrutement des neutrophiles et des monocytes/macrophages. Ensuite, nos recherches ont
indiqué que l’activité des neutrophiles pouvait être régulée en fonction de leur
microenvironnement et que leur présence dans les muscles atrophiés et inflammés n’était
pas nécessairement associée à l’induction de dommages secondaires. Par la suite, nous
avons établi que la présence des macrophages était importante pour permettre la
récupération optimale de la force des muscles atrophiés. Nous avons également démontré
que l’activité myogénique des macrophages pouvait être optimisée en favorisant leur
phénotype anti-inflammatoire avec le facteur de croissance hématopoïétique
« macrophage-colony stimulating factor » (M-CSF). Finalement, nous avons caractérisé
l’impact du « receptor activator of NF-kB » (RANK) et de son ligand RANKL, une voie
signalétique impliquée dans le remodelage osseux et l’ostéoporose, sur
l’atrophie/dysfonction musculaire. Nous avons démontré qu’une déficience de RANK ou le
blocage de RANKL par l’ostéoprotégérine protègent contre la perte de force des muscles
dénervés ou dystrophiques. Ce phénomène est associé à des modifications dans
l’expression des protéines favorisant une recaptation plus efficace du calcium. De plus,
RANK participe à la reconversion des fibres rapides vers lentes durant la période de remise
charge. Globalement, nos travaux permettent de mieux comprendre les mécanismes
entourant l’atrophie, la croissance et les dysfonctions musculaires et ouvrent la voie à de
nouvelles pistes de traitement pour plusieurs maladies neuro-musculaires.

Abstract
Muscle atrophy and dysfunction are characterized by a loss of muscle mass and force,
which are commonly found in many pathologies or conditions such as AIDS, cancers,
chronic obstructive pulmonary diseases, cast immobilization, hypogravity, bed rest or
aging, to name a few. Muscle atrophy/dysfunction have also very high social and economic
costs, but very few laboratories have investigated the cellular and molecular mechanisms
behind these muscular problems. The aim of this thesis is therefore to enhance our
understanding of different mechanisms governing muscle atrophy/dysfunction and
regrowth by using different models of disuse and dystrophy. Thus, we have initially
explored the roles of different leucocytes in atrophied and reloaded soleus muscle. Firstly,
we looked at the role of mast cells and showed that the mechanical stress associated with
muscle reloading is able to stimulate mast cell degranulation, which orchestrates the
recruitment of neutrophils and monocytes/macrophages. Secondly, our experiments
revealed that neutrophil activity is adaptable and that neutrophil-induced tissue damage is
dependent on the microenvironment. In atrophied and reloaded muscles, the presence of
neutrophils is not associated with secondary damage or promotion of muscle recovery.
Thirdly, we demonstrated that the presence of macrophages is essential for optimal muscle
force recovery from atrophy. Fourthly, we showed that the macrophage-colony stimulating
factor (M-CSF) promote the myogenic activity of macrophages by stimulating their anti-
inflammatory phenotype. Finally, we investigated the impact of the receptor activator of
NF-kB (RANK) and its ligand RANKL, a signalling pathway involved in bone remodelling
and osteoporosis, on muscle atrophy and dysfunction. Our results showed that the specific
deletion of RANK in the muscle or the blockage of RANKL with osteoprotegerin increased
significantly force production in denervated and dystrophic muscles. These results were
associated with various modifications in calcium handling protein expression favouring
efficient calcium uptake. Moreover, we also demonstrated that RANK activation gives
preference to the reconversion from fast-to-slow muscle fibers following hindlimb
unloading/reloading. Overall, our results bring a better understanding of different
mechanisms related to muscle atrophy, dysfunction and regrowth and potentially open new
avenues for the treatment of several debilitating skeletal muscle conditions.

Avant-Propos
La présente thèse comporte quatre articles dans lesquels je suis le premier auteur et qui ont
été publiés ou acceptés dans des revues scientifiques révisées par les pairs. Ces articles sont
présentés en ordre logique et chronologique dans les chapitres 2 à 5. Le premier a été publié
en juillet 2007 dans le « Journal of Applied Physiology ». Le second a été publié dans l’
« American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology »
en décembre 2008. Le troisième article a été publié en mai 2010 dans l’ « American
Journal of Pathology », tout comme le sera le quatrième qui vient d’être accepté en octobre
2012 et qui sera publié officiellement en février 2013. Brièvement, ces articles visaient à
définir le rôle des mastocytes, des neutrophiles et des macrophages dans la récupération des
muscles atrophiés par hypogravité. Dans ces quatre articles j’ai été responsable de la mise
au point de la plupart des protocoles, des expérimentations, de l’analyse des résultats et de
la rédaction des articles. Mon directeur de recherche, le Dr. Jérôme Frenette, est l’auteur de
correspondance sur tous ces articles et il a supervisé et contribué à l’élaboration des
objectifs, à la conception du devis expérimental et à la rédaction des articles. Mon co-
directeur de recherche, le Dr. Claude H. Côté, a également révisé chacun de ces manuscrits
et a apporté une contribution intellectuelle et une expertise particulièrement significative
dans le premier article sur lequel il est co-auteur. Dans ce premier article, Mme Katherine
Lepage, une stagiaire d’été, a également apporté une contribution importante dans la
collecte et l’analyse des données. Finalement, le deuxième article publié en décembre 2008
comporte également un co-auteur, M. Patrice Bouchard, qui a participé à l’élaboration de
certains protocoles, à la collecte de données et à la rédaction d’une section de l’article. Les
articles publiés sont présentés dans leur forme originale sans modification.
Un cinquième article dont je suis le premier auteur est en préparation et est présenté dans le
chapitre 6. Cet article porte sur la triade de protéines RANK/RANKL/OPG qui est bien
connue pour son rôle dans la dégradation osseuse, mais dont le rôle dans le tissu musculaire
est complètement méconnu. Bien que l’article présenté soit suffisamment avancé pour
pouvoir comprendre le phénomène observé et discuter de ses implications, il est tout de
même encore incomplet et il est encore nécessaire d’ajouter des expérimentations
complémentaires et d’augmenter le nombre d’animaux afin de valider les tendances

v
observées. Cependant, considérant les aspects innovateurs, les résultats éloquents et le
potentiel thérapeutique des découvertes présentées dans cet article nous travaillons à le
soumettre à la revue « Nature » vers le début de l’année 2013. Le choix de la revue
« Nature » amène aussi une présentation différente de l’article qui comporte ainsi plusieurs
figures chargées et un texte concis et dense. Dans cet article, je suis également le premier
auteur et j’ai été responsable d’une partie importante de la mise au point des protocoles, de
la collecte des données et de l’analyse des résultats. De plus, en étroite collaboration avec le
Dr. Jérôme Frenette, nous avons développé les objectifs et les hypothèses en plus de rédiger
l’article. Cependant, un travail d’une telle amplitude a nécessité la collaboration de
nombreux autres co-auteurs. M. Sébastien Dufresne, étudiant au doctorat, ainsi que les
assistants de recherche, M. Patrice Bouchard et Mme Éliane Lavergne, ont apporté une
contribution essentielle et importante dans le génotypage, dans la mise au point des
protocoles et dans la collecte de données. Des collaborations externes ont également été
nécessaires. Le Dr. Josef Penninger a apporté une contribution intellectuelle au projet et
nous a fourni les souris modifiées génétiquement. Son associé de recherche, Renu Sarao, a
aidé à la mesure de l’expression de RANK/RANKL/OPG dans le muscle squelettique.
Finalement, les Drs. Charles Godbout et Paul Pape apportent leurs expertises respectives
pour les mesures du calcium.
En plus des articles présentés dans cette thèse, j’ai également eu la possibilité de collaborer
sur d’autres projets qui ont mené ou vont mener à d’autres publications en tant que co-
auteur. J’ai ainsi réalisé la collecte et l’analyse de données de la section fonctionnelle, ainsi
que la rédaction partielle de cette section dans trois études portant sur la dystrophie de
Duchenne. Ces études ont été réalisées dans le laboratoire du Dr. Jacques Tremblay. Les
deux premières ont été publiées en janvier 2010 dans « Cell Transplantation » et en
décembre 2010 dans « Molecular Therapy », alors que la dernière vient d’être récemment
soumise dans ce même journal.
Les abréviations utilisées dans le texte sont définies lors de leur première apparition et sont
également regroupées dans une liste sous-jacente. Les termes scientifiques anglais ont été
généralement utilisés afin de faire le parallèle plus facilement avec la littérature.