thèse - VetAgro Sup
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VETAGRO SUP CAMPUS VÉTÉRINAIRE DE LYON Année 2013 - Thèse n° L'HERPÈS VIROSE DE LA CARPE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ET ENQUÊTE DE PREVALENCE EN FRANCE THÈSE Présentée à l’UNIVERSITÉ CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 22 Novembre 2013 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par CLOVIS UZZANU Né le 2 Novembre 1987 à CHENOVE Page 2 sur 114 LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT Civilité Nom Prénom Unité pédagogique Grade M. M. Mme M. M. Mme M. Mme Mme M. M. Mme Mme M. M. M. M. M. M. M. Mme M. M. Mme M. Mme Mme M. Mme Mme Mme M. Mme M. M. M. M. Mme M. Mme M. Mme M. Mme Mme M. M. M. Mme M. Mme Mme Mme Mme M. Mme M. Mme Mme M. M. M. Mme Mme Mme Mme Mme M. M. M. Mme Mme Mme M. M. Mme M. ALOGNINOUWA ALVÈS DE OLIVEIRA ARCANGIOLI ARTOIS BARTHÉLÉMY BECKER BELLI BELLUCO BENAMOU-SMITH BENOIT BERNY BONNET-GARIN BOULOCHER BOURDOISEAU BOURGOIN BRUYÈRE BUFF BURONFOSSE CACHON CADORÉ CALLAIT-CARDINAL CAROZZO CHABANNE CHALVET-MONFRAY COMMUN DE BOYER DES ROCHES DELIGNETTE-MULLER DEMONT DESJARDINS-PESSON DJELOUADJI ESCRIOU FAU FOURNEL FRANCK FREYBURGER FRIKHA GENEVOIS GILOT-FROMONT GONTHIER GRAIN GRANCHER GRÉZEL GUÉRIN GUÉRIN -FAUBLÉE HUGONNARD JUNOT KECK KODJO LAABERKI LACHERETZ LAMBERT LE GRAND LEBLOND LEFRANC-POHL LEPAGE LOUZIER MARCHAL MIALET MICHAUD MOUNIER PÉPIN PIN PONCE PORTIER POUZOT-NEVORET PROUILLAC RÉMY ROGER SABATIER SAWAYA SÉGARD SERGENTET SONET THIÉBAULT VIGUIER VIRIEUX-WATRELOT ZENNER Théodore Laurent Marie-Anne Marc Anthony Claire Patrick Sara Agnès Etienne Philippe Jeanne-Marie Caroline Gilles Gilles Pierre Samuel Thierry Thibaut Jean-Luc Marie-Pierre Claude Luc Karine Loïc Alice Marie-Laure Pierre Isabelle Zorée Catherine Didier Corinne Michel Ludovic Ridha Jean-Pierre Emmanuelle Alain Françoise Denis Delphine Pierre Véronique Marine Stéphane Gérard Angeli Maria-Halima Antoine Véronique Dominique Agnès Anne-Cécile Olivier Vanessa Thierry Sylvie Audrey Luc Michel Didier Frédérique Karine Céline Caroline Denise Thierry Philippe Serge Émilie Delphine Juliette Jean-Jacques Éric Dorothée Lionel Pathologie du bétail Gestion des élevages Pathologie du bétail Santé Publique et Vétérinaire Anatomie Chirurgie (ACSAI) Pathologie du bétail Pathologie morphologique animaux de compagnie Pathologie morphologique animaux de compagnie Équine Biologie fonctionnelle Biologie fonctionnelle Biologie fonctionnelle Anatomie Chirurgie (ACSAI) Santé Publique et Vétérinaire Santé Publique et Vétérinaire Biotechnologies et pathologie de la reproduction Biotechnologies et pathologie de la reproduction Biologie fonctionnelle Anatomie Chirurgie (ACSAI) Pathologie médicale des animaux de compagnie Santé Publique et Vétérinaire Anatomie Chirurgie (ACSAI) Pathologie médicale des animaux de compagnie Biologie fonctionnelle Gestion des élevages Gestion des élevages Biologie fonctionnelle Santé Publique et Vétérinaire Équine Santé Publique et Vétérinaire Pathologie médicale des animaux de compagnie Anatomie Chirurgie (ACSAI) Pathologie morphologique animaux de compagnie Gestion des élevages Santé Publique et Vétérinaire Pathologie du bétail Anatomie Chirurgie (ACSAI) Biologie fonctionnelle Santé Publique et Vétérinaire Gestion des élevages Gestion des élevages Santé Publique et Vétérinaire Biotechnologies et pathologie de la reproduction Santé Publique et Vétérinaire Pathologie médicale des animaux de compagnie Anatomie Chirurgie (ACSAI) Biologie fonctionnelle Santé Publique et Vétérinaire Santé Publique et Vétérinaire Santé Publique et Vétérinaire Gestion des élevages Pathologie du bétail Santé Publique et Vétérinaire Équine Équine Biologie fonctionnelle Pathologie morphologique animaux de compagnie Santé Publique et Vétérinaire Gestion des élevages Gestion des élevages Santé Publique et Vétérinaire Pathologie morphologique animaux de compagnie Pathologie médicale des animaux de compagnie Anatomie Chirurgie (ACSAI) Anatomie Chirurgie (ACSAI) Biologie fonctionnelle Anatomie Chirurgie (ACSAI) Anatomie Chirurgie (ACSAI) Biologie fonctionnelle Anatomie Chirurgie (ACSAI) Anatomie Chirurgie (ACSAI) Santé Publique et Vétérinaire Anatomie Chirurgie (ACSAI) Biologie fonctionnelle Anatomie Chirurgie (ACSAI) Pathologie morphologique animaux de compagnie Santé Publique et Vétérinaire Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Professeur Professeur Professeur Maître de conférences Professeur Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Maître de conférences Maître de conférences Maître de conférences Stagiaire Professeur Professeur Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Professeur Professeur Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Professeur Maître de conférences Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Maître de conférences Maître de conférences Maître de conférences Professeur Professeur Maître de conférences Stagiaire Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Maître de conférences Professeur Maître de conférences Professeur Inspecteur en santé publique vétérinair Maître de conférences Stagiaire e Maître de conférences Professeur Maître de conférences Maître de conférences Maître de conférences Maître de conférences Stagiaire Maître de conférences Professeur Professeur Professeur Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Professeur Maître de conférences Contractuel Professeur Page 3 sur 114 Page 4 sur 114 Remerciements À Monsieur le Professeur Peyramond, Qui nous a fait l’honneur d’accepter la présidence de notre jury de thèse. Pour sa gentillesse et sa disponibilité. Hommages respectueux. À Madame le Professeur Calvez, Qui a bien voulu accepter d’encadrer et de corriger notre travail. Pour ses précieux conseils et sa disponibilité sans failles. Hommages respectueux. À Monsieur le Professeur Artois, Qui a accepté d’être membre de notre jury de thèse. Pour son aide précieuse à la réalisation de notre étude. Sincères remerciements. Page 5 sur 114 À ma famille À mes parents, Pour avoir toujours été la pour me soutenir quand il le fallait, pour avoir toujours cru en moi et fait de moi ce que je suis, Merci pour tout. À ma petite sœur, Malgré ton caractère plutôt affirmé et qui nous a valu de nombreuses prises de tête, je te souhaite le meilleur, j'espère que tu es heureuse et que tu t'amuses bien en Martinique. À mes grand parents, Merci pour les parties de chasse à la grive, de pêche au brochet, de cueillette aux champignons et pour les bonnes choses du jardin. À Bruno et Sandrine et mes petits cousins, Les moments passés chez vous m'ont permis de faire des coupures avec l'école véto et de manger autre chose que des pâtes! Merci pour tout. À Nadine, mon cousin et mes cousines, Dommage qu'on ne se voit pas plus souvent, je pense bien fort a vous. À tout ceux qui m'ont aidés dans la réalisation de cette thèse Au docteur Lautraite, Merci d'avoir été toujours disponible pour répondre à mes questions. Au docteur Pozet du LDA 39, Merci pour l'intérêt que vous avez porté à ce travail, pour votre disponibilité et vos conseils précieux. À messieurs Morin et Bigarre de l'Anses, Merci pour vos conseils et les informations que vous avez pu m'apporter. À monsieur Relot et madame Breyne de l'AFPPE, Merci d'avoir rendu possible la réalisation du questionnaire. Aux pisciculteurs de carpe que j'ai appelé, Merci d'avoir répondu à mes question et pour l'intérêt que vous avez porté à ce travail. À Evelyne, merci d'avoir accepté de lire et de corriger ma thèse. Page 6 sur 114 TABLE DES MATIERES TABLE DES MATIERES ....................................................................................................... 7 TABLE DES FIGURES ......................................................................................................... 10 TABLE DES TABLEAUX .................................................................................................... 11 INTRODUCTION .................................................................................................................. 13 PARTIE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................... 15 I. II. Etiologie. ...................................................................................................................................................... 16 A. La classification des Herpesviridae : le CyHV-3, un membre de la famille des Alloherpesviridae. ....... 16 B. Structure du virus : morphologie et organisation génétique. .................................................................... 19 C. Généralités : le cycle biologique des herpes virus. .................................................................................. 21 1. Infection lytique ................................................................................................................................... 21 2. Infection latente ................................................................................................................................... 22 D. Propriétés physicochimiques : survie hors de l’hôte et moyens de lutte. ................................................. 23 1. Survie dans l’environnement. .............................................................................................................. 23 2. Résistance aux agents physico-chimiques. .......................................................................................... 23 E. Propriétés antigéniques et facteurs de virulence. ..................................................................................... 25 1. Propriétés antigéniques. ....................................................................................................................... 25 2. Facteurs de virulence. .......................................................................................................................... 25 Pathologie. ................................................................................................................................................... 27 Cas général : Inoculation à température permissive. ................................................................................ 27 Réponse de l'hôte face à une infection par le CyHV3. ............................................................................. 28 1. Barrières physico-chimiques. .............................................................................................................. 28 a) Rôle de la peau. ............................................................................................................................... 28 b) Rôle de la barrière intestinale. ......................................................................................................... 29 2. Type de réaction immune mise en jeu et séroconversion. ................................................................... 30 C. Latence et portage chronique. .................................................................................................................. 32 1. Introduction et définitions préliminaires. ............................................................................................. 32 2. Le cas du CyHV-3 : infection latente ou infection chronique ? ........................................................... 33 3. Site(s) de latence. ................................................................................................................................. 34 4. Gènes impliqués dans l’état latent. ...................................................................................................... 35 A. B. III. Epidémiologie. ............................................................................................................................................ 35 A. Epidémiologie descriptive. ....................................................................................................................... 35 1. Situation mondiale. .............................................................................................................................. 35 2. Situation en Europe. ............................................................................................................................ 38 B. Epidémiologie analytique. ....................................................................................................................... 42 1. Sources de virus. .................................................................................................................................. 42 a) Sources animées. ............................................................................................................................. 42 (1) Sources établies ...................................................................................................................... 42 (2) Sources suspectées. ................................................................................................................. 44 b) Sources inanimées ........................................................................................................................... 45 2. Facteurs de réceptivité ......................................................................................................................... 45 Page 7 sur 114 a) b) Influence de la température ............................................................................................................. 45 Autres facteurs ................................................................................................................................ 46 3. Modalités de contagion ........................................................................................................................ 46 a) Contagion horizontale ..................................................................................................................... 46 b) Contagion verticale ......................................................................................................................... 47 IV. A. B. C. D. 1. 2. 3. 4. E. F. V. Méthodes de diagnostic. ......................................................................................................................... 47 Symptômes cliniques et lésions macroscopiques externes. ...................................................................... 48 Lésions histologiques et modifications hématologiques. ......................................................................... 49 Diagnostic différenciel. ............................................................................................................................ 54 Méthodes de diagnostic direct. ................................................................................................................. 57 Les techniques d’immunomarquage et d’hybridation in situ. .............................................................. 57 La technique ELISA directe (recherche de l’antigène). ....................................................................... 58 Les techniques par PCR. ...................................................................................................................... 58 a) Sensibilité et spécificité. .................................................................................................................. 59 b) Echantillons utilisables. ................................................................................................................... 61 La technique par culture, isolement et identification du virus. ............................................................ 61 Méthodes de diagnostic indirect : la méthode ELISA de recherche des anticorps anti CyHV-3. ............ 63 Interprétation : Conditions d'utilisation des tests de diagnostic. .............................................................. 64 Prophylaxie et réglementation. .................................................................................................................. 65 Réglementation sanitaire. ......................................................................................................................... 65 1. Cadre préliminaire et définitions. ........................................................................................................ 65 a) Concept de zonage et compartimentation. ....................................................................................... 67 b) Mise en place du plan d'agrément zoosanitaire obligatoire. ............................................................ 67 2. Application à l’herpès virose de la carpe. ............................................................................................ 69 a) Prophylaxie défensive. .................................................................................................................... 69 (1) Méthodes de prélèvement et échantillons à fournir. ............................................................... 70 (2) Méthodes de surveillance. ...................................................................................................... 73 b) Prophylaxie offensive. ..................................................................................................................... 75 B. Prophylaxie médicale : La vaccination. ................................................................................................... 75 A. PARTIE II : ÉTUDE EXPERIMENTALE. ........................................................................ 79 ESTIMATION DE LA PREVALENCE DE L'HERPES VIROSE DE LA CARPE, UNE ENQUETE REALISEE SUR 45 ELEVEURS D'ETANG. ................................................ 80 Résumé ................................................................................................................................................................. 80 I. Introduction ................................................................................................................................................ 80 II. A. B. C. D. E. Matériel et méthodes .................................................................................................................................. 81 Population ............................................................................................................................................... 81 Questionnaire ......................................................................................................................................... 81 Définitions ............................................................................................................................................... 82 Méthode de sondage ............................................................................................................................... 82 Analyse des données ............................................................................................................................... 82 III. Résultats ...................................................................................................................................................... 83 IV. Discussion et conclusion......................................................................................................................... 85 Page 8 sur 114 V. Remerciements ........................................................................................................................................... 87 CONCLUSION GENERALE ............................................................................................... 88 Bibliographie ....................................................................................................................................................... 89 ANNEXES ............................................................................................................................. 100 ANNEXE 1 : CYCLE DE MULTIPLICATION DES HERPES VIRUS. INFECTION PRODUCTIVE OU LYTIQUE, [20]. ................................................................................. 101 ANNEXE 2 : CYCLE DE MULTIPLICATION DES HERPES VIRUS. INFECTION LATENTE. [20] .................................................................................................................... 102 ANNEXE 3 : STRUCTURE SCHEMATIQUE TRIDIMENSIONNELLE DE LA PEAU D'UN POISSON TELEOSTEEN (POISSON OSSEUX): LE SAUMON ARGENTE (ONCORHYNCHUS KISUTCH). [132]. ........................................................................... 103 ANNEXE 4 : ZONES ET COMPARTIMENTS EN AQUACULTURE. [122]. ............ 104 ANNEXE 5 : MOUVEMENTS D’ANIMAUX AUTORISES AU SEIN DES DIFFERENTS STATUTS SANITAIRES. [122]. .............................................................. 104 ANNEXE 6 : QUESTIONNAIRE. ESTIMATION DE LA PREVALENCE DE L'HERPES CYPRIN DE TYPE 3, UNE ENQUETE REALISEE SUR 45 ELEVEURS D'ETANG. ............................................................................................................................. 105 L'HERPES VIROSE DE LA CARPE OU KHV : FICHE A L'INTENTION DES ELEVEURS. ......................................................................................................................... 108 Page 9 sur 114 TABLE DES FIGURES Figure 1 : Les relations phylogénétiques entre les Alloherpesviridae (Adaptation de [13]) _ 18 Figure 2 : Morphologie des herpès virus. Représentation schématique et photographie en microscopie électronique à contraste négatif d’une particule du CyHV-3 (Adaptation de [19] et [10]). __________________________________________________________________ 20 Figure 3 : Dissémination du CyHV-3 entre 1998 et 2000 en Israël [27]. _______________ 37 Figure 4 : Contamination du milieu naturel Japonais par le CyHV-3 [28]. _____________ 38 Figure 5 : Nombre de cas d'herpès virose de la carpe en Allemagne, durant l'année 2006 et le premier semestre de l'année 2007, [87]. _______________________________________ 41 Figure 6 : Mortalité cumulative des différents croisements de cyprinidés infectés par le CyHV-3, souche E(européenne), [92]. __________________________________________ 44 Figure 7 : Lésions observées lors d’herpès virose de la carpe [102]. __________________ 49 Figure 8 : Inflammation des branchies induite par le CyHV-3 [46]. ___________________ 50 Figure 9 : Néphrite interstitielle induite par le CyHV-3 [46]. ________________________ 51 Figure 10 : Analyse histologique de la peau d’une carpe infectée par le CyHV-3 5 jours post infection, coloration AB-PAS [56]. _____________________________________________ 52 Figure 11 : Coupe de branchie réalisée sur cadavre, suite à un épisode de mortalité due au CyHV-3 dans un lac canadien. [81].____________________________________________ 53 Figure 12 : Coupe de foie réalisée sur cadavre, suite à un épisode de mortalité due au CyHV3 dans un lac canadien. [81]. _________________________________________________ 53 Figure 13 : immunofluorescence du CyHV-3 sur calque de rein [46]. _________________ 57 Figure 14 : Effet cytopathogène induit par le CyHV-3 sur des cellules KCFs à 22°C [46]. _ 62 Figure 15 : Production mondiale de l’aquaculture. [116]. __________________________ 66 Figure 16 : Production de l’aquaculture reportée en France depuis 1950, [117]. ________ 66 Figure 17 : Marqueur génétique permettant de différencier le virus vaccinal du virus pathogène sauvage, [125]. ___________________________________________________ 76 Figure 18 : Taux de mortalité après infection avec le CyHV-3 de trois groupes de poissons, [126]. ____________________________________________________________________ 77 Figure 19 : Carte des élevages ayant répondu au questionnaire. _____________________ 84 Figure 20 : Mesures de préventions mises en œuvre pour lutter contre l'introduction de l'herpes virose de la carpe dans les élevages d'étang. ______________________________ 85 Page 10 sur 114 TABLE DES TABLEAUX Tableau I : La résistance du CyHV-3 aux différents agents physicochimiques mesurée in vitro (Adaptation de [32]) ________________________________________________________ 24 Tableau II : Différences de réponse immunitaire entre 2 souches de Cyprinus carpio suite à une infection par le CyHV-3. Interprété de [60]. __________________________________ 31 Tableau III : Situation planétaire du CyHV-3 (Adapté de [80], [81]) __________________ 36 Tableau IV : Données épidémiologiques recueillies à l’aide de l’interface WAHID de l’OIE. _________________________________________________________________________ 39 Tableau V : Distribution géographique et types de sites testés positifs par ELISA en Angleterre et au Pays de Galles (Adapté de [85]). _________________________________ 40 Tableau VI : Maladies dont les signes peuvent être confondus avec l’herpès virose de la carpe. D'après un ouvrage de pathologie aquacole générale [103]. ___________________ 55 Tableau VII : Sensibilité des méthodes de diagnostic du CyHV-3 par PCR, Adapté de [70]. 60 Tableau VIII : Plan de surveillance zoo-sanitaire [122]. ____________________________ 69 Tableau IX : Conditions requises pour les inspections sanitaires des fermes, zones ou compartiments, lors de la démarche de qualification indemne d’herpès virose de la carpe. Adapté de du projet de texte de la commission européenne, [123]. ____________________ 71 Tableau X : Schéma de surveillance sanitaire, en vue de l’obtention ou du maintien de la qualification indemne d’herpès virose de la carpe, d’une ferme, zone ou compartiment. Adapté de du projet de texte de la commission européenne, [123]. ____________________ 72 Page 11 sur 114 Page 12 sur 114 INTRODUCTION L’herpès virose de la carpe, ou herpès cyprin de type 3 est une maladie récemment découverte affectant la carpe commune (Cyprinus carpio), causée par le KHV (Koï Herpes Virus), encore appelé CyHV-3 (Cyprinid Herpes Virus de type 3). La maladie est inscrite sur la liste des maladies notifiables à l’OIE depuis 2006 [1], comme maladie réputée contagieuse en France depuis le 10 novembre 2008 [2], puis classée dans les dangers sanitaires de première catégorie depuis le 22 juillet 2011 [3]. La maladie se manifeste par une mort très rapide après les premiers signes cliniques (mortalité fréquemment entre 70 et 100%), touche toutes les classes d’âge, est très contagieuse et intervient dans une eau entre 16 et 25°C. Des lésions non spécifiques sont alors observables dont la principale est une décoloration des branchies conséquente d’une nécrose branchiale plus ou moins importante. D’autres signes sont régulièrement observés, comme des pétéchies à la base des nageoires, une enophtalmie ou encore, une production de mucus accrue. La première apparition connue de la maladie dans le monde remonte à 1996 sur une population de carpes Koï d’une pisciculture de Derbyshire (Angleterre), le virus a donc été qualifié d'Herpès Virus de la carpe Koï. La présence du virus ayant été confirmée en 2004 par PCR sur des échantillons archivés suite à cet épisode de mortalités suspectes. Le virus s’est ensuite rapidement disséminé et étendu aux populations de carpes élevées pour la consommation et aux populations sauvages, grâce aux échanges commerciaux non régulés et du manque de techniques de diagnostic fiables. Par manque de connaissances sur les modalités de transmission et de dissémination du virus, il cause des épizooties majeures en Europe, avant que des mesures de lutte efficaces soient prises. Aujourd’hui cette maladie s'est répandue dans de nombreux pays du monde. L’impact économique est considérable, la carpe commune étant l’un des poissons les plus élevés à travers le monde, avec 3.7 millions de tonnes produites en 2011 [4]. Les éleveurs de carpes d’ornement sont aussi durement impactés, les spécimens adultes atteignant classiquement des prix compris entre 1000 et 7000 euros (prix en vigueur sur les sites de Page 13 sur 114 vente en ligne), parfois même plus de 100 000 dollars [5]. L'impact écologique est également à considérer lorsque des élevages contribuent à la contamination du milieu naturel. Ce travail de thèse est composé de deux parties. Une première partie, dans laquelle au travers d'une étude bibliographique nous nous attacherons à faire le point sur les connaissances actuelles concernant l’herpès virose de la carpe. Nous aborderons dans un premier temps la maladie en décrivant son étiologie, sa pathogénie, son épidémiologie et ses méthodes de diagnostic clinique et de laboratoire. Nous décrirons ensuite les moyens prophylactiques possibles pour lutter contre ce danger sanitaire de première catégorie, d’un point de vue réglementaire. Une seconde partie, dans laquelle nous tenterons de déterminer la situation épidémiologique de cette maladie en France, à travers les réponses à un questionnaire recueillies auprès de 44 pisciculteurs d’étangs. Page 14 sur 114 PARTIE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE Page 15 sur 114 I. ETIOLOGIE. A. LA CLASSIFICATION DES HERPESVIRIDAE : LE CYHV-3, UN MEMBRE DE LA FAMILLE DES ALLOHERPESVIRIDAE. La classification du CyHV-3 est basée sur sa structure en microscopie électronique qui est typique des herpès virus [6], [7] celle-ci sera détaillée dans le paragraphe I.B. Elle s'appuie également sur le séquençage des gènes codant l'hélicase, la protéine triplex intracapsomérique, l'ADN polymérase et la protéine majeure de l'enveloppe [8] ou le séquençage du génome [9]. Ces analyses démontrent des similitudes marquées avec le CyHV-1 ("Pox" Herpès virus de la carpe), le CyHV-2 (virus de la nécrose hématopoïétique du poisson rouge). À ce jour, ce virus possède le plus grand génome jamais décrit parmi les Herpès Virus (295 Kpb). Néanmoins, ses similitudes génétiques avec d’autres virus distants et le fait qu’il possède des gènes qui n’ont été décrits chez aucun membre de l’ordre des Herpès Virus à ce jour [7], n’est pas sans soulever des questions quant à son origine phylogénique. Le séquençage du génome de 48 herpes virus à travers différentes études, incluant trois herpès virus de poissons, deux de grenouilles et un d’huitre a ouvert la porte à des analyses phylogénétiques comparatives. Ces études montrent que l’ordre des Herpes virus peut être subdivisé en trois familles : les Herpesviridae pathogènes des mammifères, oiseaux et reptiles, les Alloherpesviridae, pathogènes des poissons, et enfin, les Malacoherpesviridae pathogènes des mollusques [10], [11]. La famille des Herpesviridae est divisée en trois sous-familles dénommées Alpha,Beta- et Gammaherpesvirinae. Basée initialement sur des propriétés biologiques spécifiques, cette classification a été confirmée par l’analyse de l’organisation et du génome [12]. La sous-famille des Alphaherpesvirinae regroupe des virus généralement caractérisés par un spectre d’hôtes large, une croissance rapide en culture cellulaire (moins de 24 heures). Ils ont la capacité d’établir, après une phase de multiplication primaire, des infections latentes typiques, entre autre, dans les ganglions sensoriels. Beaucoup d’herpès d’importance vétérinaire et humaine appartiennent à ce groupe (Herpès simplex de type I et varicelle chez l’homme, le virus de la maladie d’Aujesky chez le porc, celui de la rhinotrachéite chez la vache et le cheval…). Page 16 sur 114 Les membres de la sous-famille Betaherpesvirinae sont caractérisés par un cycle de multiplication lent, ils provoquent une cytomégalie des cellules infectées et peuvent persister dans les glandes exocrines, les cellules lymphoréticulaires et les reins. Les Gammaherpesvirinae possèdent un spectre d’hôtes étroit, généralement restreint à la famille ou à l’ordre auquel l’hôte naturel appartient. Le cycle de réplication est de durée variable mais siège toujours dans les cellules lymphoblastiques. Nombre d’entre eux sont impliqués dans l’oncogenèse. La famille des Alloherpesviridae peut quant à elle être subdivisée en deux taxons grâce à des analyses de la séquence en acides aminés de 5 gènes partagés [13]. L’une contenant l’herpès virus de l’anguille (AngHV1) et les Herpès virus des cyprinidés (CyHV12-3), l’autre contenant l’herpès virus du poisson chat(IcHV1) et les virus herpétiques des grenouilles (RaHV1-2), ce qui est corroboré par plusieurs autres études [9], [14], [15]. Enfin, La détection de seulement 12 gènes dans le noyau viral des Alloherpesviridae illustre la grande différence avec les Herpesviridae, chez qui 40 gènes du noyau peuvent être détectés [9]. La figure 1 présente l’arbre phylogénétique détaillant les relations entre les Alloherpesviridae, adapté de [13]. Notons que le CyHV3 y est présenté comme un virus plus proche du CyHV1 que du CyHV2, ce qui est remis en question par une étude comparative de leurs 3 génomes respectifs [9]. Ils ont tout de même de nombreuses caractéristiques partagées, comme la taille de leur génome, (291 Kpb pour le CyHV1, 290 Kpb pour le CyHV2) les 120 gènes orthologues en commun et enfin l’existence d’une zone centrale du génome (ORF 28113) dans laquelle les gènes conservés sont organisés de façon similaire [9]. Page 17 sur 114 Figure 1 : Les relations phylogénétiques entre les Alloherpesviridae (Adaptation de [13]) Notons également le fait que le CyHV-1 et 3 possèdent des gènes qui ne sont habituellement pas rencontrés chez les autres Herpès virus : le gène Thymidylate monophosphate kinase, B22R-like rencontrés chez les Poxvirus pour le CyHV3 [8], le gène JUNB-like impliqué dans l’oncogenèse pour le CyHV1 [9]. Il existe trois souches se différenciant entre elles, la souche I pour Israël, la souche U pour USA et la souche J pour Japon [16]. En effet, l'étude des différences de séquence ADN dues aux insertions ou délétions chez ces différentes souches, montrent l’existence d’une souche ancestrale J ayant donné naissance à la lignée J et la lignée U/I, qui s’est plus tard divisée en deux souches distinctes : U et I [16]. Cependant des analyses à partir du séquençage complet du génome, montrent que Page 18 sur 114 les trois souches diffèrent sur seulement un faible nombre de loci. Peu d'insertions ou délétions représentent des mutations qui perturbent les régions codantes du génome. Ces données sont cohérentes avec les données épidémiologiques concernant les souches I et U, le virus (U) ayant émergé aux USA chez les carpes Koï, suite à une exposition impliquant des poissons provenant d’Israël (I). En revanche, l'origine de l’apparition de la souche J sur les carpes communes au Japon sont moins connues [16]. B. STRUCTURE DU VIRUS : MORPHOLOGIE ET ORGANISATION GENETIQUE. Morphologiquement, le CyHV-3 présente une structure typique des Herpès virus, avec un Noyau (core) de 110 nm de diamètre, enfermé dans une capside icosaédrique puis un tégument et enfin une enveloppe, qui porte les glycoprotéines (gp) du virus. Cette structure est représentée schématiquement et en microscopie électronique ci-dessous (Figure 2). Une quarantaine de protéines structurelles ont été étudiées et à ce jour, et 18 d’entre elles ont pu être identifiées et classées par des analyses bio-informatiques, comme protéines de l’enveloppe (13), du tégument (2), de la capside (3) [17]. Le génome est quant à lui constitué d’une molécule d’ADN linéaire de 295 Kpb, elle possède deux extrémités terminales répétitive directes de 22Kpb chacune. Ces caractéristiques sont partagées par la plupart des Alloherpesviridae [10]. Le génome contient 156 ORF [16], la Quantité de gènes codants par rapport à la taille du génome est donc plus faible comparée aux autres herpes virus (le cytomégalovirus humain possède lui 226 ORF, pour un génome de 240Kpb [18]). Page 19 sur 114 Figure 2 : Morphologie des herpès virus. Représentation schématique et photographie en microscopie électronique à contraste négatif d’une particule du CyHV3 (Adaptation de [19] et [10]). Page 20 sur 114 C. GENERALITES : LE CYCLE BIOLOGIQUE DES HERPES VIRUS. 1. INFECTION LYTIQUE Les études du cycle des herpes virus sont pour la plupart basées sur les herpès simplex virus, plus précisément le HSV-1 et 2, deux virus de la sous famille des Alphaherpesvirinae. Ce sont deux virus dermo-neurotropes, responsables de l'herpes Buccal (HSV-1) et génital (HSV-2) chez l'homme. Nous nous baserons donc sur ce modèle de cycle biologique par la suite. La première étape de l’infection lytique est l’attachement du virion à la surface de la cellule, (Annexe 1 [20]), réalisé grâce à l’interaction des glycoprotéines de l’enveloppe du virion avec différents récepteurs cellulaires, tous essentiels à la fixation, comme les chaines d’héparane sulfate des protéoglycanes [21]. Suit la fusion de l’enveloppe des virions avec la membrane plasmique puis la libération de la nucléocapside et du tégument dans le cytoplasme. Les microtubules prennent en charge les capsides cytosoliques afin de les conduire jusqu’au noyau par l’intermédiaire d’une fixation aux protéines dynéines [22]. L’ADN viral se circularise avant la synthèse protéique [23] et la transcription peut alors débuter dans le noyau. La transcription se déroule ensuite en trois phases très contrôlées dans le temps, la phase α ou précoce-immédiate, la phase β ou précoce et la phase γ ou tardive. Les gènes du CyHV-3 ont été récemment classés de cette manière : gènes IE, E et L (pour imediateearly, early, late ou respectivement α, β, γ) selon que leur transcription a lieu respectivement entre 2 et 4 heures, 4 et 8 heures et 8 heures post infection [24]. La transcription des gènes α, réalisée par l’ARN polymérase II cellulaire, est activée par des protéines du tégument interagissant avec des facteurs transcriptionnels cellulaires. Les gènes α codent essentiellement des protéines de régulation. Une fois traduites dans le cytoplasme, certaines protéines α vont être importées dans le noyau où, en plus d’exercer un rétrocontrôle négatif sur leur propre expression, elles vont activer l’expression des gènes β et γ. Les gènes β atteignent leur pic d’expression dans les quatre à huit heures suivant l’infection. Ils codent essentiellement des protéines à activité enzymatique impliquées dans le métabolisme nucléotidique et la réplication de l’ADN viral. Les protéines β exercent un rétrocontrôle négatif sur leur propre expression et vont à leur tour activer l’expression des gènes γ dont le pic d’expression n’est atteint qu’une fois la réplication de l’ADN viral Page 21 sur 114 entamée. Les gènes du CyHV-3 se comportent de la même manière, à la différence que la réplication de l’ADN viral débute dès 4 à 8 heures post infection, et non après le pic de transcription des gènes tardifs [24]. Les gènes tardifs codent les protéines de structure du virus composant la capside, le tégument ainsi que l’enveloppe et exercent un rétrocontrôle négatif sur l’expression des gènes α et β. Les protéines de capside, une fois synthétisées, sont transportées dans le noyau de la cellule pour s’y assembler et encapsider l’ADN génomique synthétisé. La réplication de l’ADN viral circularisé débute au niveau des origines de réplication. Elle se déroule selon le mécanisme des «cercles roulants». Selon ce mécanisme, la réplication donne naissance à des structures intermédiaires de haut poids moléculaire appelées concatémères. Ces derniers sont de longues molécules d’ADN constituées de plusieurs unités génomiques liées bout à bout de façon covalente. Ils sont clivés, par une activité endonucléasique, en unités génomiques simples pendant l’encapsidation de l’ADN viral et sont intégrés dans des capsides néoformées selon un mécanisme d’encapsidation appelé «headful». Les nucléocapsides néoformées sont alors transportées vers la périphérie nucléaire. Leur trajet au travers de la barrière nucléocytoplasmique ainsi que l’acquisition du tégument et de l’enveloppe ne sont pas encore complètement élucidés. 2. INFECTION LATENTE La latence est un phénomène connu chez la plupart des herpès virus, mais les divers mécanismes qui permettent sont installation, son maintien ainsi que les stimuli à l’origine d’une réactivation le sont beaucoup moins. Elle requiert l’expression de certains gènes viraux comme le gène TK [25], premier gène de latence reconnu. Elle peut prendre deux formes, l'intégration du génome viral au sein de l’ADN cellulaire, ou la forme d’un épisome circulaire (Annexe 2 [20]) comme cela est décrit in vitro pour l’EBV. La transcription est généralement abolie, mais il peut néanmoins subsister un certain niveau de transcription. Enfin, les sites de latence varient selon l’herpès virus, trois ont été décrits : les sites nerveux, épithéliaux et lymphoïdes. L’état de latence peut ensuite être interrompu par divers stimuli que sont les diverses situations de stress : transport, changement des paramètres du milieu de vie, saison de reproduction, surinfection avec un autre virus, etc. Une infection lytique peut alors redémarrer. Page 22 sur 114 PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES : SURVIE HORS DE L’HOTE ET MOYENS DE LUTTE. D. Le CyHV-3 est relativement sensible à tous les agents de désinfection classiquement utilisés en aquaculture, heureusement sa survie hors de l’hôte est également courte. 1. SURVIE DANS L ’ENVIRONNEMENT . Une étude réalisée in vitro montre qu’à des températures supérieures à 15°C, le virus perd son pouvoir infectieux après trois jours d’immersion dans des eaux environnementales. Quand la même eau est stérilisée (matière organique autoclavée et eau ultrafiltrée) cette durée est étendue à 7 jours [26], ce qui laisse supposer un rôle des bactéries dans sa résistance hors de l’hôte. Cependant, in vivo, la situation semble être différente car dans ces conditions, aucune mortalité n’est décelée lorsque les poissons sont immergés 21heures après ajout du virus dans l’eau [27]. Enfin, notons que la présence d’ADN viral peut être détectée dans les eaux environnementales, 4 ans après un épisode d'Herpès virose de la carpe [28]. La détection de l'ADN du CyHV-3, si longtemps après l'épisode aigu initial, peut cependant être expliquée par la présence de vecteurs et la détection d’ADN ne signifie pas qu’il y a présence de virus infectieux dans l’eau. La température de l’eau influe aussi grandement sur le développement de la maladie. En effet, elle modifie la réponse immunitaire, mais aussi le métabolisme des poissons qui sont des poïkilothermes [29], [30] et l’expression génétique du CyHV-3 changeant donc son comportement infectieux [31]. Ces mécanismes qui ne s’expliquent pas par un effet dénaturant de la température, seront vus plus en détail dans le paragraphe II. 2. RESISTANCE AUX AGENTS PHYSICO-CHIMIQUES. La résistance aux différents agents chimiques est récapitulée dans le tableau 1 ci dessous. Page 23 sur 114 Tableau I : La résistance du CyHV-3 aux différents agents physicochimiques mesurée in vitro (Adaptation de [32]) Agent utilisé Dose préconisée / conditions d’utilisation Agents physiques Ultraviolets Température 4.0x10^3 µWs/cm2 (1) 50°C pendant 1 minute (2) A 35°C pendant 2 jours Agents chimiques Iodophore Hypochlorite sodium 200 mg/L pendant 30 secondes (1) de >400mg/L pendant Chlore actif : 3mg /L 30 secondes (2) pendant 30 secondes (3) 250 mg/L pendant 20 minutes (2) Chlore actif : > 12mg/L, 30 sec (4) Chlorure de 60 mg/L pendant 30 secondes (2) benzalkonium Alcool 30% à 15°C pendant 20 minutes 40 % pendant 30 secondes (2) pH Inactivation à pH < 3 ou pH > 11 (1) Dose minimale permettant 100% de réduction des UFP (unités formant plaques) d’une suspension virale à 10^5 UFP/mL, en présence de sérum fœtal bovin à 15% (2) Dose minimale permettant dose minimale permettant 100% de réduction des UFP (unités formant plaques) d’une suspension virale à environ 10^4 UFP/mL, en présence de sérum fœtal bovin à 15% (3) Dose permettant une réduction de 97.5 % de l’infectiosité affectée d’un facteur de sureté X10 d’une suspension virale à environ 10^4 UFP/mL, en présence de sérum fœtal bovin à 15% (4) Dose à atteindre dans une eau environnementale. Page 24 sur 114 E. PROPRIETES ANTIGENIQUES ET FACTEURS DE VIRULENCE. 1. PROPRIETES ANTIGENIQUES. Aucune protéine du CyHV-3 n’a à ce jour été formellement identifiée comme étant la plus immunogène (glycoprotéine majeure de l’enveloppe), contrairement à d’autres Herpès Virus comme le virus d’Epstein-Barr [33] ou le virus herpétique des poissons chats (IcHV-1) [34]. Cependant la protéine pORF81 est considérée comme étant probablement la glycoprotéine la plus immunogène du CyHV-3, en raison de son homologie positionnelle avec l’ORF59 de l’IcHV-1, chez qui le produit de transcription est la glycoprotéine majeure d’enveloppe. La structure supposée de pORF81, déterminée par le programme SOSUI, montre aussi une extrémité C terminale très hydrophile et donc un index antigénique élevé [35]. Ces suppositions sont remises en question par les observations réalisées in vitro. En effet, la protéine virale réagissant le plus souvent avec le sérum de poissons ayant survécu à un épisode de CyHV-3 à une taille approximative de 97 kDa, ce qui est bien loin de la taille de pORF81 (26kDa) [36]. La protéine pORF81 tout comme d’autres protéines du CyHV-3 (de l’enveloppe ou non) peut néanmoins être utilisée afin de produire des anticorps monoclonaux à des fins de diagnostic immunohistochimique [35], [37]. 2. FACTEURS DE VIRULENCE. Les facteurs de virulence du CyHV-3 ne sont pas très connus, cependant, depuis la publication de son génome, plusieurs gènes dont leurs homologues sont connus pour avoir des rôles immunomodulateurs ont été identifiés. Le plus étudié d’entre eux à ce jour est le gène ORF 134, encodant une interleukine 10 virale, gène retrouvé chez de nombreux membres de la famille des poxviridae ainsi que des herpesviridae. L’interleukine 10 est une protéine cellulaire connue pour son rôle immunomodulateur chez l’homme, aussi bien concernant l’immunité innée que l’immunité adaptative. Une expérience menée chez le poisson rouge (Carassius auratus) montre que lors d’activation de macrophages avec un lysat d’Aeromonas salmonicida, l’expression de gènes impliqués dans les phénomènes inflammatoires ou l’immunité innée : TNF α1, TNF α2, Il-1 β, CXCL-8 et Page 25 sur 114 NADPH oxydase, est très réduite en présence d’une interleukine 10 (Il 10) recombinante par rapport à une activation sans Il-10 [38].Des expériences similaires chez d’autres animaux montrent que son rôle est largement conservé dans l’évolution. Ce gène qui a probablement été acquis chez les virus par intégration d’ADN cellulaire ou transcription inverse d’ARNm, a été démontré comme étant impliqué dans l’évasion immune de certains virus, comme l’Epstein-Barr virus, un gammaherpesvirinae. Chez celui-ci, l’interleukine 10 virale est capable d’inhiber, de manière dose dépendante, l’expression des CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) de type I et II, empêchant l’activation des lymphocytes T et donc la réponse immune adaptative [39]. Le rôle du gène codant une Il 10 virale chez le CyHV-3 reste à être démontré, cependant plusieurs constatations laissent à penser qu’il aurait un rôle dans la pathogénicité du virus. Tout d’abord, sa structure tridimensionnelle est très proche de celle de l’Il 10 de la carpe [40]. Ensuite, les autres herpes virus cyprins, moins pathogènes, ne possèdent pas ce gène. Enfin, les SNP (single nucleotide polymorphism) du gène Il-10a ont été démontrés comme étant impliqués dans la résistance de différentes souches de carpes à une infection au CyHV-3 [41]. Le Gène TK (thymidine kinase), est également un gène étudié pour la production de CyHV-3 recombinants, délétés au niveau de ce gène. Ce gène est impliqué dans le métabolisme des bases pyrimidiques et code une enzyme de type phosphotransférase (le thymidine kinase). Les carpes infectées avec le mutant recombinant ont subit une mortalité moins importante, comparée à celles infectées avec le CyHV-3 « sauvage » (30% contre 80% respectivement). La mutation du gène TK n'affectant pas la croissance virale, ceci montre son rôle dans la pathogénicité du virus [42]. D’autres pistes sont à explorer et pourraient servir à l’élaboration d’un vaccin vivant délété sur les gènes impliqués dans la virulence du CyHV-3, car plusieurs autres gènes pourraient être impliqués dans l’évasion immune ou la pathogénicité virale. En effet, lorsqu’on compare la production d’interféron de type I in vitro lors d’une infection avec le Rabdoviruscarpio ou le CyHV-3, celle-ci est bien moindre lors d’infection par le CyHV-3. Ceci pourrait indiquer que le CyHV-3 est capable de diminuer la réponse immune innée, par l’intermédiaire de l’inhibition de la synthèse des interférons de type I [43]. D'autres pistes pourraient être explorées: le gène B22R like, codant pour une protéine de la famille des serpin (serine protease inhibitor), une protéine régulant l'activité du complément, pourrait avoir un Page 26 sur 114 rôle dans l’inactivation du complément chez le CyHV-3. De même, de nombreux loci chez le CyHV-3 codent un homologue du récepteur TNF (facteur de nécrose tumorale), une protéine stimulant la phase aigue de l'inflammation. Ces protéines pourraient également avoir un rôle de neutralisation du TNF comme cela est le cas concernant les poxvirus [44]. II. PATHOLOGIE. A. CAS GENERAL : INOCULATION A TEMPERATURE PERMISSIVE. La porte d’entrée du virus fut longtemps considérée comme étant les branchies des poissons grâce à plusieurs arguments, notamment le fait que de l’ADN du virus soit retrouvé de façon très précoce (24h post infection) dans cet organe et en grande quantité [45], mais également le fait que les changements histologiques les plus précoces (48h post infection), ont lieu au niveau des branchies [46]. L’intestin a également été cité comme une possible porte d’entrée [47]. L’affirmation selon laquelle les branchies seraient la porte d’entrée principale du virus est aujourd’hui réfutée, notamment grâce à une expérience récente, montrant que la peau seule peut constituer une porte d’entrée pour le virus. La détection par bioluminescence du CyHV-3 exprimant une luciférase, est plus précoce sur la peau que sur les branchies du poisson, ce qui montre le rôle de cet organe comme porte d'entrée. L’explication avancée à la détection de l’ADN du CyHV-3 dans les branchies 24h post infection a alors été que cela serait le reflet d’une dissémination systémique, secondaire à l'infection des globules blancs du sang. Hors, la bioluminescence exprimée par les cellules sanguines n'est pas visible dans cette expérience [48]. On sait aujourd’hui qu’il existerait deux portes d’entrées du virus, différentes selon le mode d’infection : la peau par bain en présence du virus ou la muqueuse parodontale pharyngée par nourrissage avec du matériel infecté [49]. Ceci refléterait la situation sur le terrain : les carpes infectées se frottent entre elles ou contre des objets dès 2 à 3 jours post infection [48] favorisant ainsi une contamination de peau à peau. Par ailleurs on sait que le virus peut se répliquer dans les intestins [49] et que des particules infectieuses sont retrouvées dans les fèces de poissons infectés [50], rendant possible une contamination oro-fécale. Plusieurs auteurs postulent ensuite pour une dissémination vers les viscères par l’intermédiaire des globules blancs, dans lesquels on peut détecter l’ADN du CyHV-3 dès 24 heures post infection, il gagnerait ainsi les organes de multiplication secondaires. D’après les Page 27 sur 114 lésions histologiques et les analyses histochimiques, les organes de dissémination secondaire seraient les reins, les branchies, le foie, les intestins et le cerveau. B. REPONSE DE L'HOTE FACE A UNE INFECTION PAR LE CYHV3. 1. BARRIERES PHYSICO -CHIMIQUES. a) Rôle de la peau. La peau des poissons, l’une des principales portes d’entrée du CyHV-3, est une structure complexe qui confère une protection mécanique, chimique et immune. Celle-ci est faite de nombreuses couches : la couche de mucus, l’épiderme, généralement moins épais que le derme qui contrairement aux mammifères est une couche métaboliquement active. L'épiderme est composé d’un épithélium stratifié et de cellules de Goblet sécrétant le mucus. Le derme est séparé de l’épiderme par une membrane basale, celui-ci porte les écailles (s’il y en a) et est composé de trois couches : le stratum spongiosum, le stratum compactum et enfin l’hypoderme (Annexe 3 : Structure schématique tridimensionnelle de la peau d'un poisson téléostéen (poisson osseux): le saumon argenté (Oncorhynchus kisutch)). Le mucus des poissons produit un certain nombre de peptides d’importance : Les AMPs pour antimicrobial peptides, qui chez les mammifères sont connus pour leur fonction dans les défenses immunitaires de la peau [51]. Citons en particulier les β-defensines, décrites chez la carpe, qui se révèlent très similaires à celles trouvées chez les mammifères [52] et les mucines composant principal de la couche de mucus, jouant le rôle de barrière chimique et de couche absorbante pour les microorganismes. De nombreux autres peptides sont impliqués dans le rôle protecteur du mucus : des enzymes comme le lysozyme, la trypsine, des immunoglobulines ou des protéines du complément [53], [54]. Enfin, les claudines, des protéines impliquées dans la formation des jonctions étanches, assurent la cohésion de l’épithélium. Chez la carpe infectée par le CyHV-3, il a été démontré que c’est le mucus qui jouait principalement le rôle de barrière [55]. En effet, son absence entraine un développement plus important du virus à la surface de la peau et il est capable d’inhiber, de manière dose dépendante, la croissance virale in vitro. Ceci laisse penser que les différents peptides antimicrobiens précédemment décrits pourraient avoir un rôle dans la protection contre le CyHV-3. Page 28 sur 114 Lors d’infection, on note une nette augmentation des niveaux d’expression de l’interleukine 1, de l’oxyde nitrique synthétase et des interférons de type 1, 72 à 120 heures post infection. Ensuite, les niveaux d'expression diminuent pour atteindre le niveau basal 336 heures post-infection. Parallèlement l’expression des β défensines 1 et 2 est diminuée et 336 heures post-infection l’expression de la mucine et des claudines est également diminuée. Une mesure de l’ARN 16S à la surface de la peau montre que son niveau est bas entre 0 et 72 heures post-infection, puis augmente ensuite indiquant une infection secondaire de la peau [56]. L’hypothèse formulée par l’auteur est que la réponse immune mise en jeu après l’infection de la peau par le CyHV-3, en particulier la production d’interleukine 1(facteur pro inflammatoire), est à l’origine d’une déstabilisation de la fonction de barrière de la peau. On peut remarquer que la diminution de production de mucine coïncide avec l’observation réalisée in vivo. La disparition du mucus protecteur environ 120 heures post-infection, ainsi que la déstabilisation de la fonction de barrière de la peau, explique l’augmentation des niveaux d’ARN 16S à la surface de la peau, reflet de l’implication de surinfections secondaires dans la pathogénie du CyHV-3. b) Rôle de la barrière intestinale. De façon similaire à ce qui est observé pour la peau des carpes infectées, le CyHV-3 entraine une augmentation marquée de l’expression de cytokines pro inflammatoires (Il-1β), de l’interféron a2 et de l’oxyde nitrique synthétase (NOS), ceci dès 3 à 5 jours post-infection. L’expression des claudines est cette fois augmentée entre 3 et 14 jours post-infection. Chez les mammifères, l’expression du gène NOS dans la perturbation de la barrière intestinale a été démontré [57]. Les niveaux élevés d’expression de la NOS observés lors d’infection du au CyHV-3 pourrait avoir les mêmes implications. L'expression augmentée de nombreuses claudines est expliquée par la compensation de l’effet délétère de l’oxyde nitrique sur la barrière intestinale [58]. Enfin, la perturbation de la barrière intestinale pourrait jouer un rôle dans la perte électrolytique observée lors d’herpes virose de la carpe [59]. Page 29 sur 114 2. TYPE DE REACTION IMMUNE MISE EN JEU ET SEROCONVERSION . Les précédentes observations réalisées in -vitro montrent que la production d’interféron de type I (IFN I) lors d’herpes virose de la carpe est réprimée [43]. Cela ne semble pas se vérifier in vivo car on observe au contraire une augmentation de l’expression de gènes impliqués dans la réponse IFN I aussi bien que de l’expression de gènes IFN I inductibles [60]. La réponse immunitaire au CyHV-3 est également différente selon la souche de carpe infectée. Deux souches de carpes ont ainsi été étudiées : la souche R3 et la souche K. La souche R3 présente un taux de mortalité 20% moins élevé que la souche K et les taux de CyHV-3 présents dans les reins sont plus bas. Les différences entre les deux souches sont présentées dans le tableau 2. Le TCR (T cellreceptor) est un récepteur impliqué dans l’activation des lymphocytes T en se liant à une cellule présentatrice d’antigène. Le CD8 est quant à lui un corécepteur assistant le lymphocyte T, le plus souvent un lymphocyte T cytotoxique, lors d’interaction avec le CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) d’une cellule présentatrice d’antigène. On remarque que la souche de carpe K exprime moins les gènes du TCR α et du CD8 β ce qui pourrait indiquer une activation moindre des lymphocytes T CD8+ chez cette souche, une activité cytotoxique moindre et donc une résistance moindre au CyHV-3. La mesure de l’expression des gènes codant les interleukines 1, 6, 10 et 12 montre qu’elle est plus importante chez la souche R3. Une expression plus importante de l'interleukine 1 est probablement le reflet d’une meilleure réaction inflammatoire, cette cytokine étant impliquée dans la réaction inflammatoire locale. De même, une meilleure activation de l’IL-12 et l’IL-6 et 10 pourrait expliquer une meilleure activation de l'immunité cellulaire (IL-12) et Humorale (IL-6 et 10). Ceci expliquerai pourquoi la souche R3 est plus résistante au CyHV-3 [60]. Page 30 sur 114 Tableau II : Différences de réponse immunitaire entre 2 souches de Cyprinus carpio suite à une infection par le CyHV-3. Interprété de [60]. Gènes ou fonctions Souche K : 76% de Souche R3 : 56% de étudiées mortalité mortalité Gènes relatifs à la réponse IFN 1 + + Activité du complément - + TCR α - + CD8 β - + IL-1 - + IL-6 - + IL-10 - + IL-12 - + (voie classique) Marqueurs cellulaires des lymphocytes T Interleukines +: augmentation de l’expression significativement plus importante par rapport à une carpe saine. +/- : Expression significativement plus, ou moins importante entre les souches K et R3. Concernant la séroconversion de carpes infectées avec le CyHV-3, on note une augmentation du taux d’anticorps anti CyHV-3 7 à 14 jours après inoculation à 24°C. Cette durée est "température dépendante" ce qui explique les différences observées entre les différentes expériences publiées. Plus la température est froide plus la durée requise pour atteindre des niveaux élevés d’anticorps est importante : après inoculation à 24°C et conservation des poissons à 14°C cette durée est étendue à 60 jours environ [61]. La cinétique de production d’anticorps montre que le taux d’anticorps augmente jusqu'à 20-40 jours post-infection pour diminuer progressivement. A 280 jours post-infection, 3 carpes sur 7 présentent un taux non détectable d’anticorps anti CyHV-3, mais restent résistantes à une seconde exposition. Une exposition au virus "sauvage", 5, 10 et 23 jours post exposition à une souche atténuée du CyHV-3, montre que le taux de mortalité observé est inversement proportionnel au titre d'anticorps anti CyHV-3. De même, une exposition au virus sauvage montre que les carpes qui survivent, présentent un taux plus élevé d'anticorps anti CyHV-3 que les carpes succombant à la maladie [61]. Page 31 sur 114 Cependant, les anticorps seuls ne sont pas protecteurs : le taux de mortalité de carpes ayant reçu du sérum contenant des anticorps anti CyHV-3, présentent une mortalité cumulative de 80%, contre 100% pour le groupe ayant reçu du sérum sans activité anti CyHV-3 [62]. Toutes ces constatations suggèrent un rôle important de l’immunité à médiation cellulaire et humorale dans la protection contre le CyHV-3. C. LATENCE ET PORTAGE CHRONIQUE. 1. INTRODUCTION ET DEFINITIONS PRELIMINAIRES. Une infection latente, est un certain type d’infection persistante, il en existe deux autres, l’infection chronique et l’infection lente. L’infection latente est différentiable des deux dernières par l’absence de virus infectieux entre deux épisodes viraux. L’infection chronique est quant à elle caractérisée par la présence continue de particules infectieuses et peut inclure une maladie chronique ou récurrente. Enfin l’infection lente est caractérisée par l’absence d’épisode aigu en début d’évolution, la maladie ainsi que la quantité de virus produit est progressive [63]. L’exploration du phénomène de latence chez les alloherpesviridae est délicate, en effet, la pathogénèse de ces virus est intimement liée à la température de l’eau. Les poissons étant des poïkilothermes, leur température corporelle varie et influe la réponse immunitaire mise en jeu ainsi que son type. Les faibles températures affectent la réponse immune adaptative moins que la réponse immune innée [64], [65], tandis que les hautes températures entrainent une augmentation de l’ensemble de la réponse immunitaire [66]. Par ailleurs, la capacité du virus à infecter une cellule permissive et croitre in vitro est elle aussi influencée par la température. L'infection est possible entre 15 et 25 degrés, optimale à 23 degrés, mais en dehors de ces températures, n’est peu ou pas possible [67]. Il est donc primordial de bénéficier d’outils de diagnostic et de recherche très sensibles, afin de détecter la présence virale et de prouver ou non la présence de particules infectieuses chez les poissons supposés infectés latents, pour faire la différence entre la latence ou d'autres types d’infections persistantes. Page 32 sur 114 2. LE CAS DU CYHV-3 : INFECTION LATENTE OU INFECTION CHRONIQUE ? La première expérience de réactivation d’une infection par le CyHV-3 date de 2005 [68]. Celle-ci montre que lorsque les poissons sont infectés à température permissive, aussitôt placés à basse température (12°C), puis mis en contact avec des carpes naïves 5 mois post infection, un épisode de mortalité massif est observé, après une hausse progressive de la température. Ce cas ne reflète pas le cas « naturel », en effet, les épisodes d’herpes virose de la carpe ont lieu au printemps lorsque la température de l’eau augmente, il démontre simplement que le virus peux persister à l’état d’infection chronique ou latente durant plusieurs mois. Lorsque des carpes ayant subi un épisode aigu d’herpès virose (entre 15 et 25°C) sont utilisées comme sources de virus pour la contamination de populations naïves, le cas est différent. Dans les conditions de l’expérience, des mortalités ne sont pas observées et la présence d’ADN n’est pas détectable. Une seconde expérience [69] montre que des carpes , ayant survécu à un ou plusieurs épisodes de mortalités dues au CyHV-3, présentent toutes de 2-60 copies de l’ADN du CyHV-3/µg d’ADN. Dans les conditions de l'expérience, aucune particule virale infectieuse n’est mise en évidence dans les leucocytes ou les branchies, même après des tests réguliers. Une RT –PCR sur l’ARN codant l’ADN polymérase et la protéine majeure de la capside montre également qu’aucune transcription de ces gènes n’a lieu dans les leucocytes de ces poissons, alors que c’est le cas lors d’infection aigue. Lors d’exposition à un régime de stress, (augmentation de la température de 12 à 23°C) ces poissons se révèlent positifs (5 sur 6 au total) par PCR sur des échantillons de fèces et de branchies alors qu’ils ne sont pas symptomatiques. Deux poissons morts au cours de l’expérience et ne montrant aucun symptôme de l’herpès virose de la carpe avaient un nombre très élevé de copies de l’ADN du CyHV-3 dans le tissu cardiaque, nerveux, branchial et rénal comparé aux autres poissons du groupe. Un effet cytopathogène est observé lors de mise en culture de ces cellules sur cellules CBBs. Ceci montre que le CyHV-3 est présent sous forme latente dans les leucocytes, qu’il est réactivé après un stress thermique et peut mener à un statut de porteur excréteur asymptomatique. La différence de résultats entre les deux expériences peut être expliquée par le fait que pour la première des deux, un test PCR à faible sensibilité a été utilisé (sensibilité de 1000 à 100 000 copies du génome) et n’est pas approprié pour la recherche de porteurs latents [70]. Page 33 sur 114 De même, une faible proportion des individus ayant subi un épisode aigu auraient des taux importants d’ADN du CyHV-3 dans leurs tissus et ré-excrètent le virus. Enfin, les individus utilisés avaient étés testés environ 200 jours post-infection, il est donc probable que leur niveau d’immunité ai été encore suffisant pour empêcher la réactivation du virus, tandis que le deuxième groupe étudié était séronégatif et provenait d’élevages ayant un historique ancien d’herpes virose de la carpe (une dizaine d’années). Ceci expliquerait les résultats différents obtenus lorsque les poissons sont exposés puis conservés à basse température : inhibition de la réponse immune adaptative. D’autres études comportant un plus grand nombre d’animaux ayant survécu à un épisode ancien (plusieurs années) seraient nécessaires, afin de déterminer la proportion de poissons effectivement porteurs latents sur ceux qui ont été exposés, ainsi que le taux de réactivation après un stress thermique similaire à celui observé dans les conditions naturelles et d’élevage. Enfin, si les poissons sont exposés à température permissive puis immédiatement placés à haute température (30-34°C), ils ne développent pas la maladie et deviennent résistants à une seconde exposition. Actuellement peu d'éléments sont connus sur la latence virale dans ces conditions. L'état de latence lorsque les poissons sont placés à haute température après infection est néanmoins probable car in vitro, le virus est préservé 30 jours à 30°C et produit un effet cytopathogène s’il est replacé à température permissive pendant cette durée [71]. 3. SITE(S) DE LATENCE. Le CyHV-3 a été démontré comme pouvant subsister sous forme latente dans les leucocytes, ce qui est confirmé par d’autres études [72], [73], contrairement à son proche parent : le CyHV1 dont le site de latence semble être les tissus nerveux et sous cutané [74]. Le CyHV-3 semblerait avoir plus particulièrement un tropisme pour les lymphocytes B [69] et non les lymphocytes T (données non publiées). D’autres études seraient nécessaires afin de déterminer s’il n’y a pas d’autres sites de latence car l’ADN du CyHV-3 peut être retrouvé dans de nombreux tissus de carpes ayant survécu à un épisode d’herpes virose de la carpe [73]. Une contamination sanguine des échantillons n’est cependant pas impossible. Page 34 sur 114 4. GENES IMPLIQUES DANS L’ETAT LATENT. Les expériences menées sur les herpes virus humains montrent l’implication de certains gènes dans l’installation, le maintien et la levée de l’état latent [75], [76]. Cependant, chez le CyHV-3, ces gènes ne sont pour le moment pas connus. Un modèle d’infection abortive in vitro consiste à infecter des cellules à température permissive, puis de les mettre en culture à 30°C. Dans ces conditions 91 des 156 gènes sont transcrits, mais seulement deux transcrits subsistent 18 jours post infection (ORF 114-115). Ils codent deux protéines membranaires et pourraient être similaires aux protéines membranaires associées à la latence de l’EBV [31]. III. EPIDEMIOLOGIE . A. EPIDEMIOLOGIE DESCRIPTIVE. 1. SITUATION MONDIALE . Les preuves de l’existence du virus sont présentes dès 1996 en Europe. En 2004, des analyses PCR sont réalisées sur des échantillons de tissus, archivés suite à un épisode de mortalité importante en 1996 dans une pisciculture de Koï à Derbyshire (Angleterre). Ces analyses ont permis de relier cette mortalité jusqu’alors inexpliquée, à un épisode d’herpes virose de la carpe [77], [78]. Ces évènements précèdent les premières observations de la maladie en Allemagne, qui remontent à 1997 [79]. Il est probable qu’à partir de ces origines [16], les cultures intensives, le commerce international et les nombreuses exhibitions de carpes Koï (notamment les « Koïshows » à la japonaise : poissons tous mélangés), aient rapidement contribué à la dissémination de cette maladie à travers le monde. Les premières observations de la maladie aux États-Unis ont en effet eu lieu suite un « Koï show » à New York, impliquant des poissons d’Israël en 1998. Le tableau 3 montre la situation épidémiologique planétaire de l’herpès virose de la carpe en 2005 [80]. Page 35 sur 114 Tableau III : Situation planétaire du CyHV-3 (Adapté de [80], [81]) Pays Situation concernant le CyHV-3 au cours des dernières années Europe Allemagne Première épidémie en 1997. Autriche Première épidémie détectée en 2003 parmi des carpes koi d’un étang privé. Belgique Depuis 1999, on rapporte des épidémies avec plus de 90% de mortalité. Danemark Détecté en juillet 2002. France Deux suspicions en 2001, puis détection sur des carpes provenant d’Israël en 2003. Italie Détection en 2003. Luxembourg Détection en 2003. Pays-Bas Première infection en 2001. Pologne Première détection en 2003 suivie de deux épidémies en 2004. Royaumes Unis Suspicion en 1996-98-99, isolement en 2000, 36 épidémies en 2002 et confirmation en 2003. Suisse Suspicion en 2001, épidémie en 2003. Israël Premier diagnostic en 1998 sur des carpes provenant d’Europe suivi d’épidémies régulières. Asie Indonésie Détection depuis 2002. Japon Détection depuis mai 2003. Taiwan Première épidémie rapportée en 2002 suivie d’épidémies en 2003 et 2004. Thaïlande. Détection lors d’une exportation pour l’Allemagne. Afrique Afrique du Sud Deux épidémies rapportées en 2001 et 2003. Amérique du Nord USA Première épidémie en 1998. Canada Epidémies dans les lacs de l’Ontario dès 2007 et du Manitoba en 2008. Quelques rapports font état de la situation : Israël : La situation dans ce pays est nettement plus préoccupante. Observé pour la première fois en 1998 dans 2 piscicultures non loin de Hadera, le virus gagne tout le nord durant les 2 années suivantes (figure 3). En 2001 le virus s’est ainsi disséminé dans 90% des piscicultures [27]. Page 36 sur 114 Figure 3 : Dissémination du CyHV-3 entre 1998 et 2000 en Israël [27]. USA : Un rapport de juin 2004 fait état d’un épisode de mortalités liées au CyHV-3 à New York, dans la rivière Chadakoin, avec un nombre estimé de 6000 carpes adultes mortes [82]. Le virus est néanmoins considéré comme étant endémique aux US [27]. Canada : En 2007 et 2008, des estimations font état de 26000 à 50000 poissons morts, collectés sur 15 points d’eau différents dans de nombreux lacs d’Ontario et Manitoba durant la saison de reproduction des carpes [81]. Japon : Des prélèvements réalisés en 2008 sur l’eau des lacs et rivières montrent la présence de l’ADN du CyHV-3 dans au moins 95 d’entre eux (90% des points d’eau analysés), en quantité plus ou moins importante (figure 4) [28]. Page 37 sur 114 Figure 4 : Contamination du milieu naturel Japonais par le CyHV-3 [28]. 2. SITUATION EN EUROPE. La description épidémiologique de L'herpès virose de la carpe en Europe sera basée principalement sur les données du WAHID (World Animal Health Information System, rattaché à l'OIE) de 2007 jusqu’à aujourd’hui. Cette liste est présentée dans le tableau 4. Toutefois, la précision des informations relayées par ce site varie, il convient donc d'être prudent quant à l'interprétation de ces données. En effet, des informations quantitatives (nombre de foyers) sont souvent manquantes et des rapports complets sur l'origine, le lieu et l'ampleur de la contamination sont rarement présents. Page 38 sur 114 Tableau IV : Données épidémiologiques recueillies à l’aide de l’interface WAHID de l’OIE. Pays\Année 2007 2008 2009 2010 2011 Canada 0 2 1 1 2 ? ? ? 0 0 0 0 USA +… +… +… +… +0 +0 +0 +0 +0 +0 +… +… Royaume uni +… 10 +… +… 2 12 0 12 0 8 0 6 Irlande 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Allemagne 135 89 48 124 9 98 11 100 16 61 14 61 1 1 + + France Danemark +… +… +… +… Belgique Pays bas 12 17 Suède 2012 + + 0 2 0 1 0 0 1 3 0 1 0 1 +… 2 21 30 1 1 1 +? +… 0 2 14 +? 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 Italie 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Espagne 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 33 0 1 7 2 1 7 0 4 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 Pologne Rép.Tchèque 0 0 0 0 Roumanie Hongrie 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 Singapour 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 3 Malaisie 1 3 +? +? 0 + 0 0 1 3 4 0 Japon +… +… +… +… +… +… +… +… +… +… +… +… Israël +… +… +… +… +… +… +… +… +… +… +… +… Thaïlande 3 4 1 1 2 2 2 0 1 0 0 0 +… +… +… +… +… +… +… +… +… +… 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 +… +? 3 0 1 +? 0 Indonésie Chine 0 Corée du sud 10 : nombre de foyers parmi les populations sauvages 10 : nombre de foyers parmi les populations domestiques +… : Maladie présente sans données quantitatives + : maladie présente, avec données quantitatives mais nombre de foyers inconnu +0 : maladie limitée à une ou plusieurs zones +? : Infection mise en évidence, mais sans signes cliniques Page 39 sur 114 Royaume uni : Le Royaume Uni connaît sa première épidémie confirmée sur des carpes sauvages en 2003 [83], [84]. Avant cela de nombreux cas isolés sont détectés sur des sites qui importent des carpes Koï depuis de nombreux pays, incluant Israël, le Japon, la Malaisie et les USA. En 2006 des épidémies de CyHV-3 sont confirmées sur 23 sites du sud de l’Angleterre [84]. Une étude de prévalence par ELISA sur des échantillons collectés durant l’été 2007, montre que les piscicultures du Royaume Uni sont encore relativement épargnées par le problème par rapport aux étangs de pêche et de loisir, dont 31% au moins seraient positifs [85] (Tableau 5). Tableau V : Distribution géographique et types de sites testés positifs par ELISA en Angleterre et au Pays de Galles (Adapté de [85]). Nombre de Piscicultures Nombre de Pêcheries piscicultures Positives Pêcheries positives Sud-ouest 18 2 (11%) 8 3 (40%) Sud 13 1 (8%) 8 0 Thames 8 0 10 3 (30%) Anglian 17 0 14 4 (30%) Midlands 16 0 10 6 (30%) Pays de Galle 1 0 5 2 (40%) Nord-ouest 2 0 11 7 (64%) Nord est 7 0 5 1 (20%) Total 82 3 (4%) 71 26 (37%) D'après les données fournies par l'OIE [86], l'Herpès virose de la Carpe est limitée à certaine(s) zone(s) ou région(s) du Royaume Uni en décembre 2012. Allemagne : La situation de ce pays est préoccupante. Sur l'année 2006, 49 cas d'infection ont été détectés à travers tout le territoire. Du mois de janvier au mois de juin 2007, 120 cas sont signalés : figure 5 [87]. Page 40 sur 114 Figure 5 : Nombre de cas d'herpès virose de la carpe en Allemagne, durant l'année 2006 et le premier semestre de l'année 2007, [87]. Points rouges : cas d'herpès virose de la carpe . Page 41 sur 114 Ce chiffre est porté à 135 d'après les données de l'OIE, durant le premier semestre de l'année 2007. Les années suivantes, le nombre de cas recensés reste important et la plupart du temps supérieur à 40 (cf. Tableau 5). L'Allemagne est classée dans les pays où l'herpès virose de la carpe est au stade de maladie clinique manifeste, sur les populations domestiques (non limitée à certaine(s) zone(s) ou région(s) du pays) [86]. France : Les premiers cas avérés ont été détectés en 2003, sur des carpes importées d'Israël (cf. Tableau 3). Un cas a ensuite été détecté en 2007 avec isolement de la souche virale (Thierry Morin, communication personnelle). En 2011 deux nouveaux cas sont détectés. Le premier cas eut lieu dans une jardinerie de Limoges et sur les 58 poissons sensibles, 29 sont morts. L'origine de ce foyer est inconnue ou incertaine et tous les poissons ayant étés en contact avec les carpes infectées ont étés abattus [88]. Le deuxième cas a eu lieu dans un bassin chez un particulier [89]. D'après le rapport de l'OIE datant du premier semestre de l'année 2013, L'herpès virose de la carpe serait présent sur les populations sauvages de carpes en France [86]. B. EPIDEMIOLOGIE ANALYTIQUE. 1. SOURCES DE VIRUS . a) Sources animées. Les sources animées de CyHV-3 ne sont pas entièrement connues, on différenciera donc par la suite les sources établies des sources suspectées. (1) Sources établies Toute carpe ayant ou étant infectée par le virus est une source de virus. En effet la maladie est reproduite expérimentalement en mettant en contact des carpes naïves et des carpes ayant été infectées par injection intra-péritonéale, ou par contact avec une eau infectée [68]. L’ADN viral est retrouvé dans de nombreuses parties ou sécrétions corporelles [45], incluant la peau, les branchies, l’urine ou les fèces des carpes infectées [59], [50] [73]. Néanmoins, la présence de virus infectieux dans les sécrétions corporelles n’a été démontrée que pour les fèces [50]. D’autres investigations seraient nécessaires afin d’identifier la ou les possibles autres sources d’excrétion du virus. Page 42 sur 114 Par ailleurs, il a été démontré que les carpes infectées excrètent le virus sur une durée d’autant plus longue que l’infection et le développement de la maladie ont lieu à basse température. Les carpes infectées à 16, 23 ou 28°C excrètent le virus pendant 7 à 40, 1 à 14 et 3 à 14 jours post-infection, respectivement [90]. Il a été précédemment démontré que des carpes ayant un historique ancien d’herpes virose de la carpe peuvent conserver le virus sous forme latente et le réactiver longtemps après leur première exposition suite à un stress thermique, elles doivent donc être considérées comme une source de virus. Le seul vaccin existant à ce jour ne permet pas de protéger totalement les poissons, en effet, une faible proportion des carpes vaccinées (10%) demeurent sensibles au CyHV-3 [69]. Les carpes vaccinées et ayant été exposées au virus doivent donc aussi être considérées comme une source de virus. Une autre espèce de poisson, le poisson rouge (Carassius auratus auratus), peut être infectée par le CyHV-3. Chez cette espèce, le virus peut se répliquer et demeurer dans les branchies, l’intestin et le tissu nerveux. Lors d’un stress thermique, il peut transmettre le virus à des carpes naïves [91]. La présentation clinique de la maladie semble alors être différente, puisque dans les conditions de l’étude, 2 carpes sur 30 meurent après mise en contact avec un groupe de 10 poissons rouges infectés, en l’absence de signes cliniques. Seules 4 carpes sur les 30 (incluant les deux carpes mortes) se révèlent positives par PCR et RT-PCR sur des échantillons de rein, branchies et rate. Les hybrides de la carpe et du poisson rouge, cyprinus carpio X carassius auratus, s’avèrent eux partiellement résistants au CyHV-3 (40% de mortalité), tandis que les hybrides de la carpe et du carassin commun cyprinus carpio X carassius carassius, sont eux sensibles, avec un taux de mortalité proche de celui observé sur des carpes naïves : figure 6 [92]. Page 43 sur 114 Figure 6 : Mortalité cumulative des différents croisements de cyprinidés infectés par le CyHV-3, souche E(européenne), [92]. (2) Sources suspectées. L’ADN viral est retrouvé chez beaucoup d’espèces de poissons ayant cohabité avec des carpes infectées, en utilisant une méthode de PCR très sensible (PCR nichée) puis un séquençage, par exemple chez Ctenopharyngodon idella (Carpe herbivore), Leuciscus idus (Ide doré) et Ancistru ssp (Ancistrus commun) [93]. On retrouve également l’ADN viral dans les tissus d’invertébrés :Anodontacygnea (moule d’eau douce) en particulier le manteau, les glandes digestives et les branchies par PCR selon Bergmann et al., 2006. Cette présence est confirmée d'une part par répétition des analyses et d'autre part par analyse PCR détectant l’ADN codant la glycoprotéine du CyHV-3 (ORF 56). Selon le même protocole, de l’ADN est également retrouvé chez Gammarus pulex (crustacé d’eau douce) [94]. Bien qu’on ne puisse exclure la présence d’ADN adhérent à la surface de ces deux espèces, elles pourraient jouer un rôle de vecteur en accumulant passivement des particules virales. Une étude est en cours, incluant la recherche morphologique du virus dans ces organismes, ainsi qu’une expérience d’exposition à des carpes naïves, afin de déterminer si oui ou non ils peuvent jouer ce rôle. Une autre source de virus possible est constituée par les carpes ayant été vaccinées mais non exposées au virus. En effet, lors du processus de vaccination, 10 % de mortalité environ est observée, ce qui montre qu’il demeure faiblement pathogène. La possibilité de Page 44 sur 114 retour à l’état pathogène par mutation réverse de ce vaccin vivant, atténué par culture cellulaire, reste possible. Néanmoins, la société KoVax, productrice du vaccin, met en avant la présence de plus de 31 mutations de différents types dans ce virus atténué et l’absence de mutation réverse détectée depuis la commercialisation du vaccin. b) Sources inanimées Nous avons vu précédemment que les carpes infectées par le CyHV-3 excrètent le virus dans leurs fèces, celui-ci se retrouve ainsi dans les sédiments et l’eau environnementale. In vivo, il a été démontré que le virus reste infectieux entre 4 et 21 heures à 24°C. En effet, les carpes mises en contact 21 heures après ajout du virus dans l’eau ne développent pas la maladie, contrairement aux carpes mises en contact 4 heures après ajout de la suspension virale [27]. Cependant, la situation dans le milieu naturel semble être différente puisque le virus demeure infectieux pendant 3 jours, dans l’eau environnementale ou les sédiments. Il semblerait que la présence de bactéries joue un rôle négatif dans la survie du virus car dans de l’eau stérilisée le virus reste infectieux pendant 7 jours au moins. De même plus la température est élevée, moins le virus reste infectieux longtemps. En effet, le virus reste infectieux pendant 24 heures à 30°C dans de l'eau non stérilisée, ou de l'eau stérilisée avec des sédiments intacts, contre 3 jours dans les mêmes conditions à 15, 20 ou 25°C [26]. 2. FACTEURS DE RECEPTIVITE a) Influence de la température Le virus croit in vitro de façon optimale, entre 15 et 25°, avec peu ou pas de croissance à des températures inférieures, et pas de croissance à 30°C [46], [67]. In vivo, les carpes infectées entre 16 et 23°C affichent des taux de mortalité comparables, mais les mortalités sont plus étalées dans le temps pour les poissons infectés à 16°C. A 13°C les poissons infectés ne développent pas la maladie, sauf s’ils ont étés replacés à 23°C avant 64 jours post infection [67], [90]. Ceci montre bien l’influence de la température sur la réponse immunitaire adaptative, plus longue à mettre en place à basse température. A 28°C les taux de mortalité 60 jours après infection sont significativement moins importants (50%), qu’entre 16 et 23°C (80%) [90]. Enfin, des carpes exposées à 23°C pendant 3 jours puis, placées à 30°C pendant 30 jours, voient leur taux de mortalité réduits de 40% environ par rapport à des carpes naïves [95]. Page 45 sur 114 b) Autres facteurs L'âge des individus semble aussi influer sur le taux de mortalité observé. En effet les carpes juvéniles (2.5 - 6g) sont plus sensibles au virus comparées aux carpes adultes (230g), avec des taux de mortalité respectifs de 92.5% et 56% [27]. Les différentes souches de carpes présentent également une réceptivité très différente [96]. En effet le croisement entre la carpe commune domestiquée Dor-70 et les sauvages Sassan (Cyprinus carpio haemopterus) affichent un taux de mortalité de 60.7% à 23°C, contre 92% pour le croisement de carpes communes domestiques « Nasice ». De même, les carpes « Szarvas 15 », « armur », « duna » et « tata » affichent des taux de mortalité à 23°C de 100%, 89%, 88% et 79% respectivement [97]. Ces différences pourraient être expliquées par le polymorphisme dans les gènes codant l’IL-10a et le CMH de classe II. En effet l’implication des polymorphismes des gènes codant l'IL-10a et le CMH II dans la résistance au CyHV-3 a été démontrée [41], [98]. L’influence des facteurs environnementaux sur le stress induit, et la réceptivité au CyHV-3 reste à explorer. Dans la nature, les cas d’herpes virose de la carpe ont lieu au printemps, en même temps que la saison de reproduction des carpes [99], cette saison pourrait donc coïncider avec la baisse des défenses immunitaires et une plus grande réceptivité à l’Herpès virose de la carpe. 3. MODALITES DE CONTAGION a) Contagion horizontale La contagion horizontale est certaine et facile à reproduire par cohabitation avec des poissons infectés. Nous avons vu que les carpes peuvent être infectées par immersion dans une suspension virale et que dans ces conditions, la peau est la principale porte d’entrée du virus [48]. Les carpes peuvent être également infectées par ingestion d'aliment dans lequel a été incorporé le CyHV-3, dans ces conditions, c’est la muqueuse parodontale qui joue le rôle de porte d’entrée [49]. Seule l’excrétion du virus dans les selles a été démontrée [50]. Le virus se retrouve ainsi dans l’eau et les sédiments de l’environnement et peut être ingéré, le fait que la carpe est un animal fouilleur en fait l’une des principales modalités de contagion indirecte. Page 46 sur 114 La contagion directe reste quant à elle à démontrer, mais elle pourrait être une modalité importante de contagion étant donné le caractère très peu résistant du virus dans le milieu naturel. Le fait que les carpes étant infectées ont pour habitude de se frotter contre des objets ou leurs congénères, en particulier lors de la saison de reproduction, pourrait favoriser ce mode de transmission. b) Contagion verticale La transmission verticale du virus n’a jamais été démontrée, mais elle est suspectée, comme cela est le cas pour d’autres virus proches du CyHV-3. Une expérience menée sur le CyHV-2 (agent de la nécrose hématopoïétique du poisson rouge), montre qu’à partir d’œufs désinfectés (100 ppm iodophore pendant 15 minutes) provenant de géniteurs infectés, les alevins se révèlent positifs par PCR, ce qui démontre la transmission verticale du génome du virus [100]. Il convient toutefois de prendre des précautions quant à cette affirmation, ce cas de transmission ayant eu lieu dans une ferme n’ayant pas une extrême rigueur dans les pratiques de biosécurité. La contagion verticale a également été démontrée pour le génome du CCV (agent de l’herpès du poisson chat) [101], chez lequel on retrouve l’ADN viral parmi les descendants de poissons positifs. Le fait que cette transmission supposée soit le fruit d’une véritable contagion verticale, ou d’une transmission de surface, n’est cependant pas clair dans ce cas. Des expériences prouvant la transmission du virus d’individus porteurs latents à leur descendance, avec désinfection préalable de la surface des œufs (élimination de la contamination par contact), et filtration UV (élimination des virus dans l'eau) seraient nécessaires, afin de prouver l’existence de cette modalité de transmission. IV. METHODES DE DIAGNOSTIC. Le diagnostic de l’herpès virose de la carpe, est tout d’abord clinique par l’observation des signes macroscopiques externes, autoptique par examen des lésions macroscopiques. Suivent les examens microscopiques, en particulier des branchies. Ces méthodes permettent de suspecter un cas d’herpes virose de la carpe et sont facilement réalisables sur le terrain. On verra dans un premier temps les signes cliniques et macroscopiques externes habituellement Page 47 sur 114 rencontrés, puis les diagnostic différentiel de cette maladie, incluant les signes macroscopiques, microscopiques ou épidémiologiques, puis les tests de diagnostic utilisables afin de confirmer une infection. A. SYMPTOMES CLINIQUES ET LESIONS MACROSCOPIQUES EXTERNES. Les premiers signes cliniques apparaissent seulement 1 à 3 jours post-infection. Ceuxci sont non spécifiques et incluent un état léthargique, une perte d’appétit, une position statique à la surface, nageoires pliées [102] mais également une sécrétion de mucus accrue dans les premières 24 heures post-infection. Cette sécrétion s’amenuise après 72 heures et la peau prend alors un aspect rugueux [56]. Dès le 3ième jour post-infection, une nécrose des branchies peut être visible [47]. D’autres signes sont habituellement rencontrés selon le stade de la maladie, comme des pétéchies et ecchymoses sur les nageoires, voir sur l’ensemble du corps [81]. Une énophtalmie peut être visible à un stade avancé de la maladie avec parfois des signes d’atteinte neurologique en stade final : désorientation, perte d’équilibre [102]. La figure 7 présente l’ensemble des lésions macroscopiques habituellement rencontrées. A 23°C, les mortalités débutent généralement à partir du 5ième jour, pour être maximales vers le 15ième jour et le taux de mortalité semble être plus élevé chez les jeunes que chez les adultes (60% pour les adultes contre 90% pour les plus jeunes [27]). Ces données varient néanmoins beaucoup suivant la température de l’eau, le fait qu’il s’agisse d’une première exposition ou non, ou même selon la souche de carpe utilisée dans l'étude. En effet, le début des mortalités post exposition à 18°C ou chez les poissons déjà exposés, est habituellement rencontré vers le 20ième jour post-infection et la mortalité est alors moins importante [67], [68]. De même, certains croisements de carpes n’affichent qu’un taux de mortalité de 30% [96]. Enfin à des températures inférieures à 13°C ou supérieures à 28°C aucune mortalité n'est observée [68]. Page 48 sur 114 Figure 7 : Lésions observées lors d’herpès virose de la carpe [102]. A : Nécrose sévère des branchies, B : Hyperhémie de la nageoire caudale, C : Lésions herpétiques de la peau et érosion des nageoires. B. LESIONS HISTOLOGIQUES ET MODIFICATIONS HEMATOLOGIQUES. Le CyHV-3 a également été nommé CNGV par certains auteurs, (pour Carp interstitial Nephritis and Gill necrosis Virus), ce qui traduit bien les lésions principales dont il est responsable. Deux études font état des lésions typiquement observées : [46], [47]. Ces auteurs montrent que des changements sont visibles dans les branchies et les reins dès le 2 ième jour post-infection. Sur les branchies on note une perte des lamelles branchiales avec un infiltrat cellulaire inflammatoire mixte à 2 jours post-infection. A 6 jours post-infection, un effacement complet de l’architecture branchiale est visible, ainsi qu'une inflammation sévère s’accompagnant d’une congestion du sinus veineux central (figure 8). Les lésions histologiques sont encore plus remarquables au niveau de l’arc branchial, incluant une congestion veineuse, une inflammation du tissu épithélial et une diminution de la taille des branchiospines. Ces changements sont dus au CyHV-3, en effet, le nombre de microorganismes n’augmente à la surface des branchies qu’à partir du 8-10ième jour, quand l’épithélium commence à desquamer, ce qui suggère que les lésions primaires entrainent une prédisposition aux infections secondaires. Page 49 sur 114 Figure 8 : Inflammation des branchies induite par le CyHV-3 [46]. (A à C) échelle : 200 µm, filaments branchiaux, (A) branchies normales, (B) infiltration inflammatoire de la plupart des lamelles branchiales, (D) 6 jours post infection. (D à F) branchiospines, (E) Diminution de la hauteur des branchiospines, inflammationsubépithéliale et congestion veineuse, (F) desquamation de l’épithélium (en haut à gauche). En parallèle, au niveau des reins, une légère inflammation péritubulaire est visible à partir de J2, un infiltrat inflammatoire interstitiel sévère à J6 accompagné de grandes cellules avec corps d’inclusions intranucléaires et cytoplasme « mousseux », semblables à ce qui est observé sur les cellules infectées in vitro. Une congestion veineuse, est également visible et à J8 on note une dégénérescence de l’épithélium tubulaire avec des lymphocytes intraépithéliaux (figure 9). La peau présente également des lésions, avec un nombre de cellules à mucus à 5 jours post-infection très réduit par rapport à une peau saine. Ces cellules sont également beaucoup plus petites [56], (figure 10). Ceci corrobore les observations cliniques réalisées, qui montrent une production de mucus très augmentée à partir du 1er jour post-infection, suivie rapidement par une diminution, donnant un aspect rugueux et mat à la peau. Dans le sang une anémie normocytaire, normochrome arégénérative, une leucocytose granulocytaire et monocytaire ainsi qu’une lymphocytopénie accompagnée d’une trombocytopénie est observée [59]. Page 50 sur 114 Figure 9 : Néphrite interstitielle induite par le CyHV-3 [46]. (A à E) échelle : 100 µm, (F à I) : 40 µm, (F) inflammation des tubules rénaux, (G) vacuolisation dans un globule blanc, (H) Effet cytopathique sur une cellule épithéliale, (I) inclusion intranucléaire dans une cellule inflammatoire. Page 51 sur 114 Figure 10 : Analyse histologique de la peau d’une carpe infectée par le CyHV-3 5 jours post infection, coloration AB-PAS [56]. Echelle : 25 µm, On note une quasi disparition des cellules a mucus et une diminution de leur taille (en bleu) 5 jours post-infection D’autres organes sont moins touchés, le foie montre une infiltration inflammatoire légère, localisée au parenchyme et le cerveau, une inflammation méningée et paraméningée focale. Des examens sur cadavres récoltés lors d’un épisode de mortalité dans les lacs canadiens d’Ontario et Manitoba, montrent les lésions observées sur le terrain. Celles-ci incluent la présence de macrophages intra-lamellaires sur les branchies (figure 11), qui sont retrouvés également dans la lamina propria et la muqueuse de l’intestin. De nombreux poissons présentent des tapis de bactéries filamenteuses sur les branchies (Flavobacterium columnare) et la présence de Trichodina est courante. On peut noter une vascularite fibrineuse dans les veinules hépatiques ou spléniques avec nécrose de l’endothélium des capillaires sinusoïdes (Figure 12), ce qui coïncide avec les lésions de congestion précédemment rapportées. Enfin de nombreux cadavres présentaient de multiples foyers histiocytaires et lymphocytaires dans le myocarde ventriculaire. Page 52 sur 114 Figure 11 : Coupe de branchie réalisée sur cadavre, suite à un épisode de mortalité due au CyHV-3 dans un lac canadien. [81]. Echelle : 25µm, On note de l’autolyse (ou de la nécrose épithéliale), de gros macrophages remplis de débris nécrotiques et éosinophiles (flèches). Figure 12 : Coupe de foie réalisée sur cadavre, suite à un épisode de mortalité due au CyHV-3 dans un lac canadien. [81]. Echelle : 25µm, veinule hépatique avec un endothélium nécrotique et fibrineux (flèche), entouré de macrophages et autres leucocytes, la lumière du vaisseau est de taille augmentée. Page 53 sur 114 C. DIAGNOSTIC DIFFERENCIEL. L’objectif n’est pas ici de détailler une liste exhaustive des maladies qui peuvent être confondues avec l’herpès virose de la carpe et les éléments épidémiologiques, autoptiques ou microscopiques qui permettent d’infirmer ou de suspecter fortement la maladie. En effet, un certain nombre de signes sont typiques d’un cas d’herpès virose de la carpe (Mortalité massive entre 18 et 24°C, nécrose des branchies, pétéchies et ecchymoses sur les nageoires), mais il convient d’être très prudent quant à ces affirmations. En effet les signes des maladies des poissons peuvent varier suivant le contexte, plus encore que chez d’autres animaux. Les grandes épidémies dans le milieu naturel, se déroulent en effet sur un ou deux ans mais ensuite, la maladie peut passer inaperçue, avec des mortalités très faibles et parfois, sans signes cliniques [69]. De même, les mortalités sont faibles et très étalées dans le temps à basse température. Un printemps long avec des températures de l’eau qui restent dans les limites permissives pour le développement de la maladie peut donc modifier les signes cliniques et épidémiologiques de l’herpès virose de la carpe. Enfin, les signes cliniques des différentes maladies peuvent être modifiés en fonction de la présence d’autres pathogènes dans l’eau, notamment lors de surinfections [56]. On peut également imaginer que la présence conjointe du virus de la virémie printanière (virus très présent en Europe) et de l’herpès virose de la carpe, entrainerai une mortalité débutant à basse température, ne permettant pas sur cette seule base d’éliminer avec certitude un cas d’herpès virose de la carpe. On se contentera donc d’établir une liste de maladies qui peuvent être confondues avec l’herpès virose de la carpe, en se basant sur les signes épidémiologiques, macroscopiques ou microscopiques similaires à cette maladie. Cette liste est présentée dans le tableau 6. Page 54 sur 114 Tableau VI : Maladies dont les signes peuvent être confondus avec l’herpès virose de la carpe. D'après un ouvrage de pathologie aquacole générale [103]. Maladie-Etiologie Costiase necator Données épidémiologiques Ichthyobodo Développement de 2 à 30°C Mort des jeunes / mal nourris (immunodéprimés / naïfs) De 40 à 73% de mortalité Spécificité d’hôte large - Page 55 sur 114 Trichodinose - Trichodina Affecte plutôt les jeunes au printemps après un stress perforata d’hiver. Spécificité d’hôte : Cyprinus.carpio, Carrassius.carrassius. Chilodonellose - Spécificité d’hote large Chilodonella piscicola Développement de 4 à 20°C Myxobolose dispar - Myxobolus Spécificité Cyprinuscarpio Thelohanellose Thelohanellus hovorkai - Signes macroscopiques Signes microscopiques similaires au CyHV3 similaires au CyHV3 Production de importante Nécrose branchiale Irritation de la peau mucus Hyperplasie et fusion des lamelles Diminution des cellules de Goblet Production de mucus importante Détachement de l’épithélium Nageoires effilochées Production de Mucus importante, débris de mucus et abrasion de la peau. d’hôte : Nécrose et inflammation des Fusion des branchies branchiales Température entre 15 – 25°C Pétéchies et hémorragies sur la peau Exfoliation de l’épithélium Page 55 sur 114 lamelles Tableau VI : suite. Maladie-Etiologie Données épidémiologiques Virémie printanière - SVC Provoque 30 à 70% mortalité Aigue entre 15 et 17 °C Signes macroscopiques Signes microscopiques similaires au CyHV3 similaires au CyHV3 de Pétéchies sur la peau et les branchies. Pâleur des branchies de Température Hémorragies de la peau, de la Dégénérescence des tubules Aeromonose - Aeromonas Montée (température optimale de base des nageoires et des rénaux hygrophila croissance : 28°C) branchies aux stades avancés Spécificité d’hôte large Page 56 sur 114 Yersiniose - Yersinia ruckeri Montée de Température (Pic Similaires a Aeromonas entre 15 et 18°C) (typiques des septicémies a Spécificité d’hôte large germes Gram négatifs) Jusqu’à 70% de mortalité Edwardsiella septicaemias Transmission facilitée entre Typiques des septicémies a 20 et 30°C germes Gram négatifs Flavobactériose Flavobactérium branchiophila printanière Cellules filamenteuses au Hyperplasie branchiale – Maladie Jusqu’à 70% de mortalité en niveau des branchies fonction des conditions nécrose branchiale sévère d’élevage Page 56 sur 114 D. METHODES DE DIAGNOSTIC DIRECT. Les méthodes de diagnostic sont dominées par les techniques de PCR, mais d’autres techniques existent, comme la recherche par immunofluorescence des antigènes viraux, l’hybridation in situ ou la technique ELISA. On tentera donc par la suite d’identifier leurs avantages et inconvénients respectifs. 1. LES TECHNIQUES D ’IMMUNOMARQUAGE ET D’HYBRIDATION IN SITU . Le CyHV-3 a été identifié par immunofluorescence sur des calques de foie, rein et cerveau, la fluorescence la plus importante étant obtenue sur les calques de rein (figure 13), et ceci, dès 1 jour post-infection [46]. Dans cette même étude est également décrite une technique d’immunomarquage par la peroxydase sur des coupes tissulaires de rein. Des protocoles de séparation des leucocytes en vue d’un immunomarquage ou d’une hybridation in situ existent [93], ce qui en fait des techniques intéressantes puis qu’alors non létales, néanmoins, il n’existe pas d’études comparant ces méthodes aux autres méthodes ayant fait leurs preuves, comme les méthodes par PCR. Ces techniques doivent par ailleurs être interprétées avec prudence car des réactions croisées avec d’autres virus proches ou des protéines de l’hôte existent [46]. Figure 13 : immunofluorescence du CyHV-3 sur calque de rein [46]. A gauche : carpe infectée, à droite : carpe naïve Page 57 sur 114 2. LA TECHNIQUE ELISA DIRECTE (RECHERCHE DE L ’ANTIGENE). Des méthodes basées sur la technique ELISA sont en développement dans beaucoup de laboratoires [104]. Actuellement, une méthode a été publiée, développée en Israël, pour la détection du virus dans des échantillons de fèces de poissons [50]. Le virus est dans ces conditions détecté sur des échantillons prélevés 6 à 8 jours post-infection et aucune réaction croisée, avec les protéines de la carpe ou le CyHV-1 n’est notée. Cette technique peut être couplée à une réaction colorée (immunomarquage) et utilisée sur le terrain sous la forme d’un outil de type SNAP test, ceci en fait un outil précieux, bien que non disponible actuellement. 3. LES TECHNIQUES PAR PCR. Les techniques de PCR publiées sont nombreuses et varient selon la technique employée. On distingue entre autres les techniques de PCR nichées, plus spécifiques car employant deux couples d’amorces, les techniques de PCR en temps réel, qui permettent la quantification de l’ADN amplifié, les techniques LAMP (loop mediated isothermal amplification) qui ne nécessitent pas de thermocycleur (donc moins coûteuses et plus rapides) et les techniques conventionnelles. La PCR conventionnelle est largement utilisée pour la détection du CyHV-3. Les plus utilisées sont la PCR selon Yuasa, et al. 2005, ciblant la région SphI-5 du CyHV-3 [105] ainsi que la PCR ciblant le gène de la thymidine kinase [106], deux méthodes approuvées par l’OIE [107]. La PCR Nichée permet d’augmenter la sensibilité du test jusqu’à une limite de détection de 1 à 5 copies du génome du CyHV-3, ce qui en fait l’une des méthodes les plus sensibles. En revanche, elle nécessite l’ouverture des tubes pendant et après la réaction de PCR, ce qui entraine un risque de contamination croisée [107]. En effet, La PCR nichée est une méthode d’amplification au cours de laquelle le produit issu d’une première PCR est de nouveau amplifié à l’aide d’un second couple d’amorces, il faut donc ouvrir les tubes après la première PCR pour introduire le second couple d'amorces afin de réaliser la seconde. La PCR en temps réel présente quand a elle bien des avantages : une excellente sensibilité (limite de détection : 1-5 copies du génome), il n’y a pas besoin d’ouvrir les tubes de réaction, ce qui limite les contaminations croisées et les contaminations sont la plupart du temps contrôlées par l’inclusion du système dUTP – uracile glycosylase. En revanche, le coût Page 58 sur 114 du matériel nécessaire est important [107]. Une seule étude a été publiée sur cette technique [45], (amorces KHV-86f) mais elle est la plus utilisée des méthodes de PCR, dans le cadre du diagnostic de l’herpès virose de la carpe. a) Sensibilité et spécificité. Une étude comparative, dans des conditions standardisées, incluant plusieurs méthodes (publiées ou non), montre que la sensibilité des techniques existantes est très variable et que certaines méthodes ne sont pas appropriées pour la recherche des porteurs latents [70]. La spécificité est quant à elle la plupart du temps excellente et comparable. Si l’on se base sur le fait qu’un équivalent génomique correspond à un virion, qu’en moyenne il y a 2 à 60 copies du génome du CyHV-3/ µg d’ADN leucocytaire total chez les porteurs latents [69] et que l’extrait total d’ADN est de 0.5 µg, seules 3 des techniques décrites dans cette étude sont adaptées à la détection de ces poissons. La sensibilité de différentes techniques PCR est présentée dans le tableau 7. Dans tous les cas, la quantité d’ADN génomique extraite varie en fonction de l’état d’autolyse du poisson. Dans ces conditions, les méthodes basées sur l’utilisation de la silice doivent être préférées à celles basées sur l’utilisation de sels, qui produit des résultats moins homogènes et un ADN de moins bonne qualité. De même le choix de l’ADN polymérase influe sur la sensibilité des différentes PCR, avec une sensibilité plus importante obtenue avec la « PlatiniumTaq polymérase » qu’avec la « Taq polymérase », [108]. L’échantillonnage affecte également la sensibilité, si le taux d’ADN viral est proche de la limite de détection, une analyse sur un mélange de plusieurs individus provoque une dilution, faisant passer le taux d’ADN du CyHV-3 en dessous des limites de détection. Une expérience récente a montré que lors d’un test individuel par la méthode de PCR en temps réel [45], sur 10 carpes exposées au virus 6 d’entre elles étaient positives. Lorsque deux groupes de 5 carpes sont réalisés, les résultats se révèlent négatifs [70]. Ceci entraine que lors de cas subcliniques, les analyses doivent impérativement être réalisées individuellement. On note que la technique PCR ciblant le gène de la thymidine kinase n’a pas permis de détecter le CyHV-3 sur des échantillons pris sur le terrain après un épisode d’herpes virose de la carpe en Allemagne. Ceci montre que de nouveaux variants peuvent être difficiles à détecter avec ce couple d'amorces, [70]. Page 59 sur 114 Tableau VII : Sensibilité des méthodes de diagnostic du CyHV-3 par PCR, Adapté de [70]. PCR PCR en temps réel [45] Equivalents génomiques Détection chez 3 koï nécessaires pour un ayant survécu à résultat positif épisode de CyHV-3 1-5 2/3 : leucocytes, écouvillons un 3/3 branchiaux ou échantillons tissulaires PCRconventionnelle [109] 10 4-5 0/3 PCR [110] 1-5 2/3 PCR conventionnelle, amorcegene 10 1-2 0/3 10 1-2 ND 3-4 ND amorce 10 2-3 ND thymidine kinase [106] PCR nichée Bercovier (non publiée) PCR conventionnelle, amorce Sph 1-5 10 [105] PCR conventionnelle, Glycoprotéine majeure de l’enveloppe (non publié) PCR conventionnelle, amorces 10 3-4 ND dégénérées (CEFAS, non publié) PCR nichée après conventionnelle sur 10 2-3 amorces dégénérées (CEFAS 0/3 non publié) Loopamp® (Eikem) 10 1-2 ND Duplex PCR (AFSSA) 10 2-3 ND PCR semi nichée [70] 1-5 2/3 : leucocytes, écouvillons 3/3 branchiaux ou échantillons tissulaires En rouge : haute sensibilité (adapté à la détection des porteurs latents ou asymptomatiques), en bleu : sensibilité moyenne, en noir : faible sensibilité, ND : non déterminé. La spécificité de ces différentes techniques PCR, testée sur les alloherpesviridae des poissons (CyHV-1, 2 ; IcHV-1 ; AngHV-1) ne montre aucune réaction croisée avec les techniques de PCR présentées, à l’exception de la PCR avec amorces dégénérées, qui détecte l’ADN du CyHV-1 et 2. Des faux positifs sont néanmoins possibles lors de réactions croisées, intervenant lors de la manipulation des échantillons. Le dernier essai entre laboratoires, Page 60 sur 114 organisé par le centre de l’environnement, piscicultures et sciences de l’aquaculture (CEFAS), montre que les problèmes de faux positifs existent dans un nombre considérable de laboratoires [107]. b) Echantillons utilisables. Lors d’infections cliniques, des taux importants d’ADN du virus sont retrouvés dans les branchies, les reins et la rate des poissons, mais également dans le foie, le mucus, le cerveau et l’intestin [45]. L’OIE recommande à ce titre l’utilisation des échantillons de branchies, rate ou rein [104]. Lors d’infection subclinique ou latente, la concentration d’ADN la plus importante semble être obtenue dans les leucocytes [107], dans ce cas, un prélèvement sanguin suivi d’une séparation des leucocytes du sang est indiquée. D’autres données sont nécessaires afin d’évaluer la sensibilité des analyses sur l’ADN leucocytaire, ce qui permettrait l’utilisation de ce prélèvement non létal à plus grande échelle. La technique PCR n’est pas seulement applicable à la détection du virus chez les poissons et les différents porteurs suspectés, des protocoles ont également étés publié pour l’extraction d’ADN puis la recherche et la quantification du virus dans l’eau et les sédiments [111], [112], [113], [114].Cette méthode permet de détecter 60 copies d’ADN du CyHV-3.L-1. Les études montent que l’ADN est rapidement dégradé dans les eaux environnementales et qu’il est présent dans les sédiments à concentration bien plus importante que dans l’eau (quelques dizaines à un millier de fois plus concentré). Ceci suggère que la matière organique joue un rôle dans la conservation de l’ADN viral [28], [113]. La concentration d’ADN viral s’avère non corrélée à un épisode d’herpès virose de la carpe, en effet, un nombre plus élevé de copie du génome viral peut être trouvée plusieurs années après un épisode, ce qui suggère la présence de porteurs-excréteurs sains [28]. En raison de la bonne sensibilité de cette méthode, elle pourrait être utilisée pour évaluer la contamination de l’environnement par le CyHV-3. 4. LA TECHNIQUE PAR CULTURE, ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DU VIRUS. Le CyHV-3 est classiquement cultivé sur cellules dérivées de cellules de nageoires de Koï (Koi fin cells ou KFCs), cérébrales de carpes communes (C.carpio carp brain cells ou Page 61 sur 114 CCBs) et branchiales (C.carpio carp gill cells). D’autres cellules sont utilisables comme les cellules de nageoires de carpe commune ou encore les cellules branchiales du poisson rouge tandis que d’autres ne semblent pas permissives, telles que les cellules CHSE-214 (Chinook salmon embryo), RTG-2 (Rainbow trout gonad) ou CCO (Channel catfish ovary) [102]. Sur des cellules KFCs incubées à température permissive en présence du virus, l’effet cytopathogène est observé en 3 à 5 jours post-infection. Il se manifeste par l’apparition de nombreuses vacuoles endoplasmiques ainsi que l’augmentation de la taille des cellules infectées. Les cellules deviennent ensuite rondes et se détachent du substrat, des plaques sont alors visibles sur le tapis cellulaire 4 à 6 jours post-infection : figure 14 [46]. L’effet cytopathogène observé est dépendant de la température, en effet, les plaques formées après infection de cellules CCBs à température permissive disparaissent après incubation 3 jours à 30°C et réapparaissent si ces cellules sont placées à températures permissives 7 jours plus tard [71]. Figure 14 : Effet cytopathogène induit par le CyHV-3 sur des cellules KCFs à 22°C [46]. Le carré central montre une vacuolisation intense et des cellules de taille plus importantes que les cellules non infectées (en haut à gauche). La technique par isolement et identification du virus est la seule technique permettant d’obtenir un diagnostic de certitude, cependant, elle présente de nombreux désavantages. Cette technique manque de sensibilité par rapport aux techniques par PCR, en effet, elle ne Page 62 sur 114 permet pas de détecter les porteurs latents ou subcliniques [109], [78]. Par ailleurs elle nécessite un matériel et des techniques qui peuvent être difficiles à appréhender, prend beaucoup de temps (10-12 jours pour l’isolation, 5-8 jours pour l’identification [78]) et coûte cher. Les échantillons tissulaires doivent être réalisés dans des conditions stériles, immédiatement après la mort du poisson, et transmis au plus vite au laboratoire, sous couvert du froid [108] . Enfin, la présence du virus doit être confirmée après sa culture par PCR, car un pseudo effet cytopathogène peut être observé sur les cultures cellulaires jouant le rôle de témoin négatif [78]. Ces observations montrent que ce n’est pas une méthode de diagnostic appropriée dans le cadre de la lutte contre l’herpès virose de la carpe, cependant elle est utile dans le cadre de la recherche car elle constitue le seul argument démontrant la latence du virus, sa réactivation et son excrétion dans des conditions de stress thermique [69]. E. METHODES DE DIAGNOSTIC INDIRECT : LA METHODE ELISA DE RECHERCHE DES ANTICORPS ANTI CYHV-3. Comme nous l’avons vu précédemment, la réaction immune après exposition au CyHV-3 a un rôle important, avec intervention de l’immunité non spécifique et de l’immunité spécifique cellulaire et humorale. Plusieurs méthodes ont déjà été décrites [95], [68], [36], [62]. Quand les conditions sont optimales, le taux d’anticorps est augmenté à partir de 7 à 14 jours après inoculation du CyHV-3 par injection, comme vu dans le paragraphe II.B.2. Cette durée est portée à 3 semaines lors d’infection par cohabitation [95]. Les anticorps sont alors détectables, même à forte dilution [36]. Cette étude montre par ailleurs que pour les carpes ayant subit un épisode d’herpès virose de la carpe 6 semaines avant prélèvement sanguin, le taux de séropositivité est de 100%. Un an après l’exposition, le taux de séropositivité est toujours élevé avec seulement 1 poisson sur 17 ayant un taux d’anticorps non détectable (soit 6% environ), les autres montrant une réactivité entre 40 et 90% (résultat en pourcentage du témoin positif). Il existe des réactions croisées avec le CyHV-1, particulièrement élevées à des dilutions de 1 : 20 – 1 : 400, atteignant plus de 80% de réactivité. Néanmoins, les réactions croisées sont réduites ou éliminées à partir de la dilution 1 : 2500 [36]. Page 63 sur 114 La méthode ELISA est donc très utile dans la mesure où elle permet la détection des porteurs subcliniques, là ou les techniques par PCR les plus sensibles peuvent rendre un résultat négatif. Néanmoins, le taux de séropositivité à 1 an et plus après exposition n’est pas bien connu, ce qui peut compliquer le choix de la taille de l’échantillon ainsi que l’interprétation du test dans ces cas. F. INTERPRETATION : CONDITIONS D'UTILISATION DES TESTS DE DIAGNOSTIC. L'observation des signes macroscopiques et microscopiques est une bonne méthode pour suspecter un cas d'herpès virose. Cependant, les signes habituellement rencontrés ne sont pas spécifiques, ce test est donc inutilisable pour certifier une infection due au CyHV-3. Ces méthodes ne sont pas utilisables sur les larves et les post larves en raison de leur petite taille. Les techniques ELISA de diagnostic direct, ainsi que l'hybridation in-situ sont des techniques qui peuvent être non létales. Elles semblent donner de très bons résultats et une bonne spécificité, en particulier la technique ELISA de recherche du virus dans les selles [50]. Pour ces raisons, ces tests sont une bonne méthode pour suspecter ou confirmer un cas d'herpès virose de la carpe. En revanche, ils sont difficilement applicables sur des poissons très jeunes (Larves et post larves). L'isolement suivi de l'identification du virus est une méthode coûteuse, longue, peu sensible et présentant de nombreux obstacles techniques ce qui limite son application pratique. En raison de la possible existence d'un pseudo effet cytopathogène sur les cultures cellulaires jouant le rôle de témoin négatif, ce test ne peut être effectué que pour obtenir un diagnostic présomptif. La PCR est quant à elle une méthode considérée comme la référence en matière de diagnostic de laboratoire de l'herpès virose de la carpe . En effet, nombre de techniques par PCR ont prouvé leurs résultats, y compris dans la recherche des porteurs latents. C'est également une technique très sensible et spécifique. En raison des contaminations croisées qui peuvent être importantes avec les techniques de PCR nichées, les techniques de PCR classiques ont un avantage certain. D'autant que les sensibilités sont comparables entre les deux techniques. La PCR est donc une méthode adaptée pour obtenir un diagnostic de certitude. Le fait qu'elle permette la détection des porteurs latents en fait également une Page 64 sur 114 méthode à privilégier pour la surveillance ciblée des exploitations. La détection des porteurs latents restant tout de même difficile [70], il convient dans le cadre de la surveillance ciblée de multiplier les analyses sur un nombre suffisant d'individus (cf. V. A. 2.). L'échantillonnage groupé doit être évité sur des poissons supposés porteurs latents en raison du très faible taux de copies du génome du CyHV-3 présentes chez ces individus. Les techniques ELISA ont montrées de très bons résultats, y compris concernant la recherche d'une exposition au CyHV-3 ayant eu lieu un an avant le test. Les anticorps antiCyHV-3 sont détectables chez la plupart des carpes ayant été exposées au virus 6 semaines avant le test. Il existe des réactions croisées avec le virus du CyHV-1 qui sont fortement réduites à des dilutions fortes (à partir de la dilution 1 : 2500). Néanmoins, les individus utilisés dans les études portants sur les méthodes ELISA sont peu nombreux, à cause du fort taux de mortalité engendré après un épisode d'herpès virose de la carpe .Le taux de séronégativité est de 5.88% [IC : 0.15% ; 28.7%] un an après exposition [36], ce qui montre un manque de données concernant ces méthodes. Par ailleurs, les données concernant le taux de séropositivité des individus ayant étés exposés plusieurs années avant le test n'est pas connu. Enfin, cette méthode nécessite un prélèvement sanguin ce qui n'est pas possible avec des individus de petite taille (larves et post larves). L'ELISA est donc une bonne méthode pour le diagnostic de présomption, de certitude et pour la surveillance ciblée sur les adultes qui a l'avantage de pouvoir ne pas être létale. V. PROPHYLAXIE ET REGLEMENTATION. A. REGLEMENTATION SANITAIRE. 1. CADRE PRELIMINAIRE ET DEFINITIONS. La production aquacole mondiale ne cesse d’augmenter depuis les années 90 (figure 15), alors que la France ne parvient pas à augmenter ses productions (figure 16), qui stagnent puis diminuent à partir de 1995. Le secteur Aquacole en France est en crise, avec une production de salmonidés qui chute de 20% entre 1997 et 2007, accompagnée par une fermeture de 27% des sites et une perte de 35% des emplois dans le secteur de la salmoniculture [115]. Page 65 sur 114 Figure 15 : Production mondiale de l’aquaculture. [116]. Figure 16 : Production de l’aquaculture reportée en France depuis 1950, [117]. En 2006, la réglementation sanitaire évolue afin de faire face à la crise Française dans ce secteur. Elle est aujourd’hui basée sur la directive 2006-88 du conseil de l’Union Européenne, ayant pour objectif l’uniformisation de la réglementation au sein de l’UE, pour faciliter les échanges, moderniser les moyens de lutte sanitaire et d’inciter à l’amélioration de la qualité sanitaire des élevages. Elle a pour conséquence la mise en place de zones et compartiments, ainsi qu’un système de qualification et certification sanitaire appliqué à une liste de maladies réglementées, soit parce qu'elles constituent un risque économique, soit parce qu'elles constituent un risque pour la santé humaine. Page 66 sur 114 a) Concept de zonage et compartimentation. Ces concepts définissent, au sein d'un territoire, des sous-populations caractérisées par un statut sanitaire distinct, dans un but prophylactique ou pour favoriser les échanges internationaux. Le zonage s'applique à des sous-populations définies sur des critères géographiques en s'appuyant sur des barrières géographiques naturelles, artificielles ou réglementaires. Une application spécifique de ce concept est l'établissement d'une zone de confinement unique lors de survenue de foyers de maladie, englobant tout les cas signalés, afin de réduire au maximum les répercutions sur le territoire national ou dans la zone [118], [119]. La compartimentation quant à elle, repousse la frontière du risque, au delà de l'interface géographique et prend en compte tous les facteurs épidémiologiques qui peuvent contribuer à créer une séparation réelle entre les sous populations. En effet elle est essentiellement fondée sur des critères de sécurité biologique tels que les pratiques de gestion et d'élevage, permettant d'obtenir le cloisonnement fonctionnel d'une sous population par rapport aux autres populations domestiques ou sauvages [118], [119]. Ainsi, le confinement des animaux dans un pays ou une zone infectée peut être associé à des mesures de biosécurité et à des pratiques d'élevage permettant d'obtenir un risque négligeable par rapport aux maladies ou aux agents pathogènes [118]. L'illustration de ces concepts en aquaculture est présentée en annexe 4. b) Mise en place du plan d'agrément zoosanitaire obligatoire. La note de service du 13 avril 2011 [120], explique les modalités d’application et de mise en place de l’agrément zoo sanitaire obligatoire, pour toutes les fermes aquacoles (les établissements sont soumis à l’agrément zoo-sanitaire dès lors qu’ils détiennent et mettent sur le marché des poissons) à l’exception des fermes conchylicoles : Définition du statut sanitaire des zones et compartiments (Annexe 4), les catégories sanitaires sont ainsi divisées en 5 : I (indemne), II (en cours de qualification), III Page 67 sur 114 (indéterminé), IV (en cours d’éradication), V (infecté), desquelles dépendent les mouvements d’animaux autorisés au sein de l’exploitation (Annexe 5). Définition d’un niveau de risque (faible, moyen ou élevé), spécifique à chaque établissement basé sur la décision de 2008 [121], dépendant : - De la propagation directe de la maladie par voie aquatique - Des mouvements d’animaux d’aquaculture - Du type de production des espèces détenues - Du système de biosécurité (formation du personnel comprise) - De la densité des exploitations dans la zone - De la présence, à proximité de la ferme aquacole d’exploitations d’un statut sanitaire inférieur - Du bilan sanitaire de l’exploitation concernée et des autres exploitations situées dans la zone - De la présence d’agents pathogènes chez les animaux aquatiques sauvages dans la zone entourant l’exploitation - Du risque posé par les activités humaines à proximité de l’exploitation - Des prédateurs ou des oiseaux ayant accès à l’exploitation Mise en place d’un plan de surveillance zoo-sanitaire, dépendant du statut sanitaire de l’exploitation et du niveau de risque : Tableau 8 [122]. On distingue différents niveaux de surveillance à différentes fréquences. La surveillance passive, qui consiste essentiellement en la maîtrise des introductions au sein de l’exploitation, la tenue d’un registre d’élevage et la mise en place d’un réseau d’alerte en cas de suspicion de la maladie. La surveillance active consistant, en plus des mesures précédemment décrites, en des inspections sanitaires périodiques. Dans le cas de la surveillance active, des échantillons sont analysés en cas de suspicion lors des inspections périodiques. La surveillance ciblée requiert en plus des inspections sanitaires, des analyses systématiques pour la recherche des dangers sanitaires de première catégorie. Page 68 sur 114 Une fois ces mesures mises en place (tenue d’un registre, application des bonnes pratiques sanitaires, analyse des risques et mise en place du plan de surveillance), un agrément conditionnel est délivré pour une période de 3 mois. Il devient définitif suite à une visite d’inspection validant l’application des mesures. Tableau VIII : Plan de surveillance zoo-sanitaire [122]. 2. APPLICATION A L’HERPES VIROSE DE LA CARPE. Il n’y a pas de méthodes de surveillance et diagnostic du CyHV-3 officiellement validées. Ceci pose de nombreux problèmes pratiques, tant pour les éleveurs que pour les vétérinaires chargés de la surveillance sanitaire de cette maladie. La suite de ce chapitre sera donc basé sur un projet de texte de la commission européenne [123]. a) Prophylaxie défensive. Il s’agit d’un ensemble de méthodes, visant à isoler les populations indemnes afin d'éviter l’exposition à une population infectée. Elle consiste donc en l’obtention de la certification indemne et l'établissement de règles d’échange établies, en fonction du statut sanitaire de l’exploitation concernant l’herpès virose de la carpe. Elle est également basée sur des mesures d’isolement des fermes infectées. Page 69 sur 114 Les mesures préconisées pour l’obtention et le maintien du statut sanitaire indemne sont récapitulées dans les tableaux 9 et 10, adaptés du projet de texte de la commission européenne [123]. (1) Méthodes de prélèvement et échantillons à fournir. Le manuel des méthodes de prélèvement et de diagnostic de l’herpès virose de la carpe [124] précise la marche à suivre pour les analyses requises. Les inspections de laboratoire nécessitent la PCR, considérée comme méthode de référence, pour la confirmation de l’herpès virose de la carpe. Les poissons à prélever doivent avoir été maintenus à température permissive pendant deux à trois semaines, et si possible apportés vivants au laboratoire. Dans le cas contraire, il est possible d’envoyer les poissons à conditions qu'ils soient séparés dans des conteneurs aseptiques et maintenu au froid (températures négatives). Des organes, soit congelés soit préservés dans de l’éthanol à 80% peuvent également être envoyés pour analyse. Les échantillons à fournir sont alors des échantillons de branchies, rein, encéphale et intestin [123]. Un échantillon groupé peut être réalisé sur plus de 5 poissons, mais seulement en phase aigüe de la maladie. Dans le cas d’une surveillance sanitaire, un échantillon groupé Page 70 sur 114 n'est pas recommandé [123]. Tableau IX : Conditions requises pour les inspections sanitaires des fermes, zones ou compartiments, lors de la démarche de qualification indemne d’herpès virose de la carpe. Adapté de du projet de texte de la commission européenne, [123]. Type d’exploitation Conditions des inspections sanitaires T°C de Espèce Type de poisson Intervalle entre 2 l’eau Fermes en nombre 18-25°C visites C.carpio - Poissons anormaux ou fraichement morts, si non suffisant ou la surveillance présents poissons de toutes les classes d’âge ciblée est applicable (représentés proportionnellement) - Poissons de toutes les sources d’eau Page 71 sur 114 Fermes en nombre 18-25°C C.carpio Idem surveillance ciblée et : 4 insuffisant / milieu naturel (surveillance applicable) ciblée non mois, si - Points d’échantillonnage à choisir de façon à impossible le plus détecter au moins 1 point positif si 10% des points grand de la zone ou du compartiment sont positifs, avec possible intervalle de confiance à 95% - Points différents d’échantillonnage écosystèmes compartiment Page 71 sur 114 de représentatif la zone ou des du intervalle Tableau X : Schéma de surveillance sanitaire, en vue de l’obtention ou du maintien de la qualification indemne d’herpès virose de la carpe, d’une ferme, zone ou compartiment. Adapté de du projet de texte de la commission européenne, [123]. Type d’exploitation Schéma de surveillance sanitaire durant la Schéma de surveillance sanitaire dans le but de période de 4 ans précédent la qualification maintenir la qualification indemne d’herpès indemne d’herpès virose de la carpe d’une virose de la carpe dans une exploitation exploitation Fermes nombre Nombre en suffisant ou la d’inspection surveillance ciblée est cliniques par an Page 72 sur 114 applicable 2 Fermes insuffisant naturel nombre Nombre en / milieu d’inspection (surveillance cliniques par an Nombre d’examens Nombre de poissons de Niveau dans risque 2 d’examens Nombre de de poissons dans laboratoire par l’échantillon (1) laboratoire par l’échantillon (1) an an 2 Nombre d’examens 30 Nombre de poissons laboratoire par l’échantillon Elevé 1 30 Moyen 1 tous les 2 ans 30 Bas 1 tous les 4 ans 30 Nombre Nombre de de poissons dans de Nombre dans d’inspection cliniques par an an ciblée non applicable) de Nombre 2 d’examens laboratoire par l’échantillon an 30 (1) : un échantillon groupé de 2 individus au maximum est autorisé Page 72 sur 114 2 2 30 L’application pratique des prélèvements de laboratoire peut être critiquée. En effet, tels qu’ils sont conseillés, ils sous entendent un prélèvement létal et les carpes d’ornement dépassent pour certaines allègrement un prix de 3000 euros. Le prélèvement sanguin, suivi d’analyses PCR sur les leucocytes, est une procédure permettant de détecter les porteurs latents. Le principal site de latence suspecté est par ailleurs les leucocytes du sang [107], il pourrait donc être intéressant définir le prélèvement sanguin comme méthode valide dans le cas des exploitations élevant des carpes Koï. En accord avec le manuel pour les tests diagnostiques des animaux aquatiques [104], les méthodes conseillées pour les analyses de laboratoire dans le cadre de la surveillance de l'Herpès virose de la carpe, sont la PCR selon Gilad et al., 2004 [45], selon Bercovier et al., 2005 [106] et selon Yuasa et al., 2005 (non inclus dans la bibliographie ). Les méthodes conseillées pour l’extraction de l’ADN ainsi que le déroulement de la PCR sont regroupées dans le manuel des méthodes de prélèvement et de diagnostic de l’herpès virose de la carpe [124]. (2) Méthodes de surveillance. On distingue 2 cas: - Les exploitations faisant l’objet d’une surveillance spécifique dans le cas de la mise sous APPDI d’une exploitation voisine, ou les exploitations au statut sanitaire indéterminé. - Les exploitations indemnes qui doivent se soumettre à un plan de surveillance sanitaire pour conserver ce statut. Les inspections cliniques doivent entrainer la recherche de signes post mortem compatibles avec l’herpès virose de la carpe sur les animaux présentant ou non des signes cliniques de la maladie, comme décrit dans le manuel de l’OIE. D'après le projet de texte de la commission européenne [123], la confirmation d’une infection a lieu lorsque des signes en faveur de l’herpès virose de la carpe sont présents ou que le contexte épidémiologique montre une possible contamination (présence d’exploitations, suspectes ou infectées d’herpès virose de la carpe), conjointement à une analyse PCR positive. Une fois la confirmation effective, l’exploitation est mise sous APPDI (Arrêté préfectoral portant déclaration d’infection) et une zone d’endiguement comprenant deux zones : la zone de protection et la zone de surveillance. Page 73 sur 114 La zone d’endiguement doit avoir été définie grâce à une enquête épidémiologique au cas par cas, prenant en considération les facteurs influençant les risques de dissémination de l’herpès virose de la carpe d’exploitation en exploitation ainsi que dans le milieu naturel. Ceux-ci comprennent généralement la densité et le taux d’infection de l’exploitation sous APPDI, la distance avec les exploitations voisines et la densité de celles-ci, les espèces qui y sont maintenues, les pratiques d’élevage en vigueur dans l’établissement considéré, les conditions hydrodynamiques ainsi que d’autres facteurs significatifs établis en accord avec l’article 29 de la directive 2006/88/CE. La zone de protection correspond à la totalité de l’eau du bassin versant de la ferme sous APPDI. Dans le cas d’étendues d’eau extensives, il est possible de limiter cette zone à une partie du bassin versant, dans la mesure où cela ne nuit pas à la prévention de l’expansion de la maladie. La zone de surveillance doit-elle être contenir la zone de protection, qui fait l’objet de mesures spécifiques, qui seront détaillées dans la partie V.A.2.b). Dans la zone de surveillance, les exploitations perdent automatiquement le statut indemne et on distingue 2 cas : Les exploitations où la surveillance ciblée est applicable ou non, doivent se soumettre à un schéma de surveillance sanitaire de 4ans, décrit dans le tableau 10. Si aucun cas n’a été détecté, elles retrouvent le statut indemne. Les exploitations indépendantes du statut sanitaire des eaux environnantes retrouvent leur statut indemne à partir du moment où l’enquête épidémiologique réalisée en accord avec l’article 29 de la directive 2006/88/CE, conclue à une absence de contamination des autres fermes ou du milieu naturel. Le schéma de surveillance sanitaire de 4 ans est également applicable aux exploitations dont le statut sanitaire est indéterminé, en vue d’obtenir le statut indemne, qu’elles soient dépendantes ou non du statut des eaux environnantes. Une fois la qualification indemne obtenue, la surveillance sanitaire est moins lourde dans le cas des exploitations où une surveillance ciblée est applicable. En fonction du niveau de risque, les examens cliniques et de laboratoire requis sont de un par an à un tous les 4 ans. Page 74 sur 114 Les autres exploitations doivent elles se soumettre à des visites et analyses 2 fois par an (tableau 10). b) Prophylaxie offensive. C’est l’ensemble des méthodes de lutte mises en place, une fois l’infection due au CyHV-3 confirmée, pour une exploitation donnée, une zone ou un compartiment. Cela concerne toutes les exploitations à l’intérieur de la zone de protection, qui doivent procéder à l’abattage du cheptel, la mise à sec, puis le nettoyage et la désinfection de l’exploitation. A ce titre, le projet de texte de la commission européenne ne spécifie pas si les espèces autres que Cyprinus carpio au sein de l’exploitation doivent faire l’objet de cette mesure. Cependant le développement du virus a été prouvé chez carassius auratus, carassius carassius, leurs hybrides avec la carpe et d’autres espèces sont suspectées de jouer le rôle de porteurs sains (cf. III.B.1.a).(1) et (2)). Les mesures mises en place suite à une confirmation d'herpès virose en France, ont donc consisté en l’élimination de tous les poissons. Les méthodes utilisables pour le nettoyage et la désinfection, ne sont pas spécifiées dans ce projet de texte. La durée minimale du vide sanitaire d’une exploitation sous APPDI a été fixée à 6 semaines. Cependant, la durée du vide sanitaire peut être revu au cas par cas pour les autres exploitations de la zone de protection, il est néanmoins recommandé un vide sanitaire synchronisé de 3 semaines. Enfin, il est possible de demander un vide sanitaire pour les exploitations situées dans la zone de surveillance. Le repeuplement de l’exploitation peut ensuite avoir lieu, uniquement avec des poissons reconnus indemnes d’herpès virose de la carpe. La qualification indemne peut ensuite être retrouvée à l’issue d’une période de surveillance sanitaire de 4 ans à moins que les exploitations soient indépendantes du statut sanitaire des eaux environnantes (cf. V.A.2.a).(2)). B. PROPHYLAXIE MEDICALE : LA VACCINATION. Actuellement, un seul vaccin a vu le jour, en Israël, où cette maladie cause des ravages. Il s’agit d’un vaccin vivant atténué par plusieurs passages sur culture cellulaire puis irradiation UV. La firme qui commercialise ce vaccin affirme qu’il ne peut ni infecter d’autres Page 75 sur 114 espèces que la carpe, ni être transmis de poissons à poissons, bien qu’il n’existe aucune donnée publiée permettant de l’attester. Celui-ci peut être différencié du virus « sauvage » par PCR, en utilisant un marqueur spécifique (gène Mut1 : figure 17). Figure 17 : Marqueur génétique permettant de différencier le virus vaccinal du virus pathogène sauvage, [125]. Mut 1 : marqueur génétique, TK : gène thymidine kinase (contrôle positif), MW : marqueur de taille, WT : virus sauvage, KV3 : virus vaccinal. Il demeure faiblement pathogène, avec 10% de mortalité après vaccination de poissons en bonne santé. Actuellement, une des craintes qui font que ce vaccin n’est pas largement commercialisé est un possible retour à l’état pathogène, bien qu’en 8 ans d’utilisation en Israël aucune alerte allant dans ce sens n’ait été formulée. En revanche, il ne permet de protéger que 80 % des carpes [125]. Il est donc indéniable qu’une population de carpes vaccinées et ayant été exposées au virus sauvage constituent un danger épidémiologique dans la mesure où l’on sait que ce virus peut demeurer à l’état latent chez la carpe (cf II.C.2) D’autres types de vaccins risquent d’être commercialisés dans un futur proche. Il s’agit de vaccins contenants un vecteur d’expression, auquel une séquence ADN codant un peptide immunogène du CyHV-3 est intégrée. Une fois injecté, les cellules de la carpe synthétisent le peptide d'intérêt, ce qui conduit à leur immunisation. Un brevet concernant un tel vaccin, a été déposé aux USA en 2011 et il montre des résultats prometteurs (figure 18). Page 76 sur 114 Figure 18 : Taux de mortalité après infection avec le CyHV-3 de trois groupes de poissons, [126]. Groupe 1 : poissons non vaccinés, groupe 2 : poissons vaccinés avec un vaccin recombinant codant une protéine membranaire du CyHV-3, groupe 3 : poissons vaccinés avec un vaccin recombinant codant une glycoprotéine du CyHV-3. Bien que des données précises sur ce vaccin ne soient pas encore publiées ces vaccins possèdent deux avantages majeurs: - Possibilité de déterminer les poissons vaccinés des animaux infectés, la protéine du vaccin étant unique et connue. - Sûreté plus importante, en effet, le vaccin ne contient pas de virus vivants ou est inclus dans un vecteur ayant les propriétés souhaitées d’innocuité. Cependant trois principales raisons font que la vaccination n'est pas autorisée en France. Tout d'abord, Les animaux vaccinés et ayant étés exposés au virus du CyHV-3 sauvage peuvent constituer des porteurs latents. Ensuite, des données précises manquent, comme on a pu le voir avec le vaccin vivant atténué. Enfin le virus n'est détecté que ponctuellement en France. Dans une logique d'éradication de la maladie, une vaccination en masse pourrait gêner la détection de la maladie par l'observation des mortalités. Malgré l'interdiction de la vaccination, on déplore que l'importation de carpes vaccinées soit toujours possible en France (Armand Lautraite, communication personnelle). Page 77 sur 114 Page 78 sur 114 PARTIE II : ÉTUDE EXPERIMENTALE. Page 79 sur 114 ESTIMATION DE LA PREVALENCE DE L'HERPES VIROSE DE LA CARPE, UNE ENQUETE REALISEE SUR 45 ELEVEURS D'ETANG. RESUME L'impact du CyHV-3 en France semble être faible, le but de cette enquête est donc de déterminer si ce fait se vérifie sur un échantillon de 45 éleveurs d'étang. Nous avons également enquêté sur les méthodes de prévention appliquées et le niveau de connaissance générale de ces éleveurs par rapport au risque d'introduction du CyHV-3 afin de tenter de dégager les raisons du faible nombre de cas d'herpès virose de la carpe en France. On détecte 4 cas suspects d'herpès virose de la carpe sur 45. Ce qui contraste avec les chiffres officiels et la situation dans les autres pays d'Europe. Seulement 6% des éleveurs déclarent ne pas connaitre cette maladie, ce qui montre qu'ils ne sont pas étrangers à ce problème. Un quart d'entre eux n'introduisent pas de poissons dans leur élevage ce qui limite les problèmes de maladies contagieuses. Moins de un quart déclarent ne pas appliquer de mesures de prévention particulières pour lutter contre cette maladie. Enfin environ 50% des éleveurs appliquent des mesures de préventions autre que celles citées et 50% ne s'estiment pas assez informés sur le CyHV-3, ce qui montre une certaine désorganisation de la filière face à ce risque. I. INTRODUCTION Le CyHV-3 est un virus hautement pathogène affectant la carpe (Cyprinus carpio), il entraine des mortalités très élevées parmi les populations de carpes sauvages et d'élevage [81], [85]. L'impact économique est parfois très important, la perte qu'il cause chaque année en Israël est estimé à 3 millions de dollars [27]. Génétiquement le virus a été identifié comme un membre de la famille des Alloherpesviridae [9]. Le virus a été nommé CyHV-3 en raison des similitudes qu'il partage avec virus de l'herpès cyprin de type 1 et 2 [8]. La maladie associée au CyHV-3 a été pour la première fois décrite en Israël et aux USA en 1998 [127] mais des analyses sur échantillons de tissus archivés réalisées en 2004 suggèrent que le Page 80 sur 114 virus était présent dès 1996 en Angleterre [78]. Depuis la première isolation du virus, le CyHV-3 a progressivement gagné d'autres pays et a maintenant une distribution mondiale [80]. Les pays d'Europe sont pour certains très touchés, comme la Slovénie et la Belgique dans lesquels cette maladie est considérée comme endémique [128]. L'Angleterre et l'Allemagne sont également touchées, avec respectivement 36% des pêcheries testées positives [85] et 120 cas d'infections en 2007 [87]. Il semblerait que le virus ne soit pas encore installé en France chez les producteurs [129], mais un cas a néanmoins été détecté parmi les populations sauvages [130]. En raison du statut sanitaire de cette maladie en France (Danger sanitaire de première catégorie) et du cout engendré par la destruction du stock de poissons en cas de confirmation d'infection, il est possible que des cas de mortalités importantes ne soient pas toujours déclarés. Nous tenterons donc à travers ce questionnaire destiné aux éleveurs d'étang de remplir deux objectifs. Le premier est d'estimer la situation épidémiologique de l'herpès virose de la carpe dans les piscicultures d'étang en France et le second est de déterminer les méthodes de lutte mises en place par les éleveurs pour lutter contre cette maladie. II. MATERIEL ET METHODES A. POPULATION L'échantillon sondé est constitué de 76 pisciculteurs d'étang, grâce à une liste des pisciculteurs d'étang recensés sur le territoire national. Les piscicultures sondées sont représentées par les pisciculteurs d'étang auxquels ont été retranchés les pisciculteurs ne faisant pas de carpe (15 sur 107), ceux dont l'activité est incompatible avec le questionnaire (6 sur 107), par exemple les ateliers de transformation et ceux dont le numéro de téléphone n'est plus attribué (10 sur 107). B. QUESTIONNAIRE Le questionnaire, reporté en annexe 7 a été construit afin de remplir plusieurs objectifs. Le premier est d'estimer la prévalence de l'herpès virose de la carpe et le second est de déterminer la technicité des éleveurs face au risque d'introduction de cette maladie dans leurs élevages. Pour détecter les cas suspects d'herpès virose de la carpe, les éleveurs sont interrogés sur la présence de mortalités importantes (40% de la population totale d'un bassin ou d'un lot de poissons isolés) touchant toutes les classes d'âge, dans une eau entre 15 et 29°. Ce taux de mortalité est plus faible que celui qui est habituellement rencontré et à été choisi pour augmenter la sensibilité du questionnaire. En effet, le taux de mortalité habituellement rencontré en conditions expérimentales est proche de 70%, cependant il peut varier en fonction de la température [90] et de la souche de carpe utilisée dans l'expérience [96]. Ainsi, certaines souches de carpes peuvent ne présenter qu'un taux de mortalité de 30% au cours d'un épisode d'herpès virose de la carpe [96]. Afin d'augmenter en Page 81 sur 114 spécificité les éleveurs ont été également interrogés sur la connaissance de l'origine des mortalités pouvant avoir lieu dans ces conditions : maladie bactérienne, virémie printanière de la carpe, pollution chimique ou manque d'oxygène. Afin d'identifier un ou plusieurs facteurs de risque d'introduction d'herpès virose de la carpe suite à l'épisode de mortalité massive, les éleveurs ont étés interrogés sur leur participation à une exposition de carpe, l'introduction de poissons, l'élévation de la température de l'eau ou un évènement autre ne rentrant pas dans les trois catégories précédentes. Afin de connaitre la technicité des éleveurs face au risque d'introduction de l'herpès virose de la carpe dans leurs élevages, les questions portent sur la connaissance générale de la maladie (risque associé et mesures de prévention spécifiques à mettre en place pour éviter la contamination de l'élevage), les mesures de prévention mises en place par les éleveurs ou les facteurs ayant pu entrainer ou favoriser un épisode de mortalité. C. DEFINITIONS Le numérateur de cette étude de prévalence est défini comme la présence de mortalités importantes (40% de la population totale d'un bassin ou d'un lot de poissons isolés) touchant toutes les classes d'âge, dans une eau entre 15 et 29°C, sur une durée de 1 an à compter de la réception du questionnaire. Un cas suspect d'herpès virose de la carpe est défini comme un cas de mortalités importantes remplissant les conditions décrites dans le numérateur. Un cas probable d'herpès virose de la carpe est défini comme un cas de mortalités importantes remplissant les conditions décrites dans le numérateur, sans cause mise en évidence et avec au moins un facteur de risque identifié. Un cas certain d'herpès virose de la carpe est défini comme un cas de mortalités importantes remplissant les conditions décrites dans le numérateur et ayant été confirmé positif vis a vis du CyHV3 par PCR dans un laboratoire départemental d'analyse départemental agréé. D. METHODE DE SONDAGE Les questionnaires ont étés envoyés par voie postale afin que les éleveurs disposent d'un support papier, puis les réponses ont étés recueillies par téléphone pour maximiser le taux de réponse. Les horaires de sondage ont été choisis dans les heures habituellement non travaillées, entre midi et deux heures et en fin d'après midi à partir de 17 heures et jusqu'a 20 heures. Les éleveurs ne répondant pas plus de 5 fois aux appels ont été considérés comme n'ayant pas répondu au questionnaire. E. ANALYSE DES DONNEES Page 82 sur 114 Les données recueillies ont été introduites au fur et à mesure dans un tableur Excel (Microsoft Corporation, Seattle, USA). Les graphiques présentés sont construits sous Excel et présentés avec un intervalle de confiance à 95 %, obtenu grâce à la loi binomiale. Si les intervalles de confiances ne recoupent pas la valeur comparée, la différence obtenue est considérée comme statistiquement significative (p ≤ 0.05). Les valeurs des intervalles de confiance ont été arrondis au chiffre entier le plus proche. Un test du χ2 d'ajustement a été réalisé autour d'une valeur théorique exprimée en pourcentage sur les résultats présentés dans la figure 21. Une étoile (*) de la couleur de la valeur théorique comparée est indiquée quand le test indique une différente significative (p≤0.05). III. RESULTATS Les réponses aux questionnaire portent sur des mortalités ayant eu lieu au maximum un an avant la réception du questionnaire, soit de juillet 2012 à juillet 2013. La figure 19 présente la carte des élevages ayant répondu au questionnaire. On peux voir que la majorité des élevages se trouvent dans les régions suivantes : Centre, Limousin, Franche -Comté, Alsace, Lorraine et Pays de la Loire. Le taux de réponse obtenu a été de 45 piscicultures sur 76, soit 59% environ. Estimation de la prévalence de l'herpès virose de la carpe chez les éleveurs d'étang : Les épisodes de mortalité massive (cas suspects) sur un an, représentent 9% soit 4 éleveurs sur 45 [IC. 2.48%; 21.22]. Un seul éleveur correspond à un cas probable d'herpès virose de la carpe Koi. Les trois autres sont des cas suspects, car une cause à été identifiée par les éleveurs : maladie infectieuse bactérienne, virémie printanière et manque d'oxygène, Ichtyophtiriose. Aucun cas certain d'herpès virose de la carpe n'a été rapporté. Niveau de technicité des éleveurs par rapport à l'herpès virose de la carpe : Les résultats obtenus montrent que parmi les éleveurs d'étang, la majorité d'entre eux ont déjà entendu parler de l'herpès virose de la carpe, en effet 94% d'entre eux ont répondu positivement à la première question [IC. 82%; 98%]. Page 83 sur 114 Figure 19 : Carte des élevages ayant répondu au questionnaire. Concernant les mesures de prévention mises en œuvre pour éviter la contamination de l'élevage, on ne distingue pas de mesure de prévention majoritaire. En effet, l'application de méthodes de préventions autres que celles citées (Figure 20), représente 57% des suffrages. (non significativement différent de 50%). Parmi ces mesures de prévention qui ne rentrent pas dans les 4 autres catégories, deux grandes tendances sont distinguées : - Des mesures concernant le choix du fournisseur (limitation du nombre de fournisseurs à un ou deux avec qui se lie une relation de confiance) avec 6 réponses sur 42. - Des mesures concernant l'introduction des poissons (limitation des introductions de poissons) avec 8 réponses sur 42. 28% des personnes interrogées affirment ne pas introduire de nouveaux poissons et assurent le renouvellement grâce à leurs propres géniteurs (significativement différent de 50%). De même, 28% affirment n'introduire que des carpes indemnes vis à vis du CyHV-3. Page 84 sur 114 Moins d'un quart des personnes interrogées réalisent une quarantaine ou sont en court d'obtention de la certification indemne. Enfin, moins d'un quart des personnes interrogées ne réalisent aucune mesure de prévention dans leur établissement (significativement différent de 25%). Parmi les personnes qui ne s'estiment pas assez informées par rapport a cette maladie (44%, non significativement différent de 50%), les informations manquantes majoritaires ne peuvent pas être déterminées car les fréquences relevées ne sont pas statistiquement différentes de 50%. Figure 20 : Mesures de préventions mises en œuvre pour lutter contre l'introduction de l'herpes virose de la carpe dans les élevages d'étang. La barre d'erreur indique l'intervalle de confiance à 95% calculé avec la loi binomiale, l'étoile (*) indique une différence statistiquement significative à la valeur théorique de la couleur correspondante. IV. DISCUSSION ET CONCLUSION. Il a été choisi de questionner les éleveurs d'étang pour plusieurs raisons. Ceux qui élèvent des carpes communes et les commercialisent pour le repeuplement du milieu naturel mettent, en cas Page 85 sur 114 d'herpès virose avérée dans un élevage, les populations sauvages en danger. Les éleveurs de carpes l'ornement approvisionnent les sites de vente, à partir d'une exploitation contaminée le virus peut donc être disséminé dans de nombreux endroits. Nous avons mis en évidence grâce a ce questionnaire 4 cas suspects d'herpès virose de la carpe. Ils représentent après analyse statistique entre 2.48% et 21.22%. D'autre part, un seul cas probable d'herpès virose de la carpe a été identifié [IC. 0.06%; 11.77%] Il s'agissait d'un cas de mortalité d'origine inconnue, ayant eu lieu lorsque les eaux se réchauffaient au printemps. Les chiffres officiels, qui représentent 6 cas d'herpès virose de la carpe avérés entre 2001 et aujourd'hui ainsi que la prévalence de cette maladie dans certains pays d'Europe (cf. III.A.2.) contrastent avec les résultats obtenus. En effet ces chiffres concernent en majorité des poissons d'importation, de jardinerie, mais un cas en milieu naturel a toutefois été détecté [130], ce qui représente un nombre important d'exploitation pour peu de cas avérés. Il y a probablement plusieurs raisons à ce fait. Tout d'abord, il est possible que des cas de mortalités ne soient pas déclarés en raison du coût financier que cela représente. En effet, cela implique la destruction du stock de poissons de l'élevage, ce qui représente une perte importante dans un élevage, particulièrement l'élevage des carpes Koï, qui atteignent des prix compris entre 1000 et 7000 euros à l'âge adulte (prix en vigueur sur les sites de vente en ligne). Ensuite, aucune mesure de prophylaxie appliquée par les éleveurs d'étang n'est majoritaire et 50% d'éleveurs environ ne s'estiment pas assez informés par rapport a cette maladie. Nous pensons donc que la lutte contre cette maladie est désorganisée, due à un défaut d'information des risques engendrés par l'herpès virose de la carpe et un défaut de confirmation d'infection suite à un épisode de mortalité. Un biais d'information a été constaté concernant la question 1, sous question " Introduction de carpes indemnes KHV", en effet, une part non négligeable d'éleveurs ont confiés se fournir en carpes de Brenne, laquelle est une région indemne. Ceci est en réalité faux, car il n'existe aucune région reconnue indemne d'herpès virose de la carpe en France. Un certain nombre de piscicultures de Brenne sont en revanche considérées indemnes de NHI (nécrose hématopoïétique infectieuse et SHV (septicémie hémorragique virale) deux maladies réglementées affectant pour l'une les salmonidés, pour l'autre les salmonidés, le brochet, le black bass et quelques espèces marines [131]. Une autre part de ce biais peut être constitué par le qualificatif "biosecure", en effet, un certain nombre de carpes vaccinées contre le CyHV-3 sont commercialisées sous ce qualificatif et il est facile de faire la confusion avec le qualifiant "indemne d'herpès virose de la carpe Koi" (Armand Lautraite, communication personnelle). Ce biais est en revanche absent pour l'obtention de la qualification indemne car cela nécessite un suivi vétérinaire. Il ne peut cependant s'agir que d'une démarche ou d'un Page 86 sur 114 projet, car aujourd'hui, comme cité si dessus, aucune marche à suivre officielle n'a été publiée, seuls des projets de texte existent [123]. Les résultats obtenus dans ce questionnaire montrent qu'il est indispensable d'avoir une meilleure organisation des différents acteurs intervenant dans le cadre de la lutte contre l'herpès de la carpe, dans le but d'éviter l'introduction de la maladie dans un élevage, d'identifier les élevages infectés par le virus et de certifier indemne les autres. Les éleveurs doivent donc se réunir avec les vétérinaires pour définir les mesures à appliquer dans le cadre de la lutte contre cette maladie, tant qu'il en est encore temps. Par ailleurs il est indispensable qu'une marche à suivre officielle soit publiée pour l'obtention de la certification indemne d'herpès virose de la carpe et que des aides soient accordées pour permettre une meilleure déclaration des cas de mortalité. Une étude supplémentaire, cette fois en sondant les animaleries, pourrait être pertinente afin de déterminer dans quelle proportion celles ci sont touchées, le type de poisson importé (vacciné ou non) et le risque épidémiologique associé à la présence de la maladie dans ces établissements. V. REMERCIEMENTS Je remercie Emmanuelle Breyne de l'AFPPE pour m' avoir gentiment fourni la liste des pisciculteurs d'Etang sur laquelle j'ai pu travailler. Je remercie le professeur Chalvet-Monfray (Maitre de conférences en bio statistiques à Vetagro-sup), pour avoir participé à l'analyse statistique des données. Je remercie également les professeurs Artois (Professeur d'épidémiologie à Vetagro-sup) et Calvez (Maitre de conférences en pathologie aquacole à Oniris), pour m'avoir aidé à la conception du questionnaire ainsi qu'à la rédaction ce cet article. Page 87 sur 114 CONCLUSION GENERALE Le virus de l'herpès virose de la carpe, est un membre de la famille des Alloherpesviridae affectant la carpe (Cyprinus carpio). Morphologiquement, le CyHV-3 présente toutes les caractéristiques d'un virus de l'herpès. En effet, ce virus possède un ADN bicaténaire linéaire contenu dans une capside icosaédrique, entourée d'un tégument protéique et enfin d'une enveloppe dérivée de la membrane des cellules de l'hôte, pour une taille de 170 à 230 nm. Comme tous les Herpès virus, le CyHV-3 peut demeurer à l'état latent chez son hôte et être réactivé suite à l'intervention de facteurs environnementaux, tels qu'une montée brusque de la température. Cependant, les gènes intervenants dans la latence du CyHV-3 sont peu étudiés et à ce jour inconnus. Comme la plupart des virus enveloppés, il est très peu résistant dans le milieu extérieur, ne résistant pas à plus de 4 à 21 heures dans l'eau. Il est également sensible à la plupart des agents physicochimiques utilisés pour le nettoyage et la désinfection en aquaculture. L'herpès virose de la carpe est une maladie provoquant une forte mortalité, le diagnostic aussi bien clinique que de laboratoire est difficile et aucune mesure thérapeutique ne permet de lutter contre celle ci. D'autres espèces peuvent jouer le rôle de vecteurs de l'herpès virose de la carpe, notamment le carassin commun et le poisson rouge. Ces constats font que cet agent pathogène est actuellement très surveillé et inscrit sur la liste des dangers sanitaires de première catégorie. Une enquête de prévalence sur 45 pisciculteurs d'étang m'a permis de déterminer que la plupart n'ignorent pas l'existence de cette maladie mais que la moitié aimerait plus d'information sur le sujet. Le pourcentage de cas possibles d'herpès virose de la carpe sur une durée de un an est situé après analyse statistique entre 2.48% et 21.22%, ce qui montre que l'importance de cette maladie est à reconsidérer et que les chiffres officiels (5 cas au total entre 2003 et aujourd'hui) sont probablement sous estimés. Le développement de l'aquaculture de poissons d'ornement, principalement porté par les carpes Koï, et l'engouement de certains pays pour cette espèce ont entrainés un prix de vente très élevé pour ces poissons. Le risque commercial en cas d'introduction de l'herpès virus est important et les mesures de destruction des stocks en cas de confirmation de la présence de cet agent sont certainement un frein à la déclaration des cas cliniques. La mise en place de mesures de dédommagement et d'aide à l'obtention du statut sanitaire indemne pourrait permettre d'avoir une meilleure déclaration des cas cliniques et de réduire le risque d'apparition et de diffusion du virus. Ces mesures permettraient également d'avoir une image plus fidèle de l'état sanitaire réel de la France vis à vis de cette maladie. Page 88 sur 114 Bibliographie 1 [Anonymous]. Code sanitaire pour les animaux aquatiques. 2012. 2 Code rural, Article D223-21. [Internet]. 2008 [cited 2013 mai 26]. Available from: http://www.legifrance.gouv.fr/affichCodeArticle.do;jsessionid=5D696899A4017D49A139B2 39DE785DEF.tpdjo05v_3?idArticle=LEGIARTI000019748080&cidTexte=LEGITEXT00000 6071367&categorieLien=id&dateTexte=20090121. 3 Arrêté du 29 juillet 2013 relatif à la définition des dangers sanitaires de première et deuxième catégorie pour les espèces animales. [Internet]. 2013 [cited 2013 mai 26]. Available from: http://www.legifrance.gouv.fr/affichTexte.do;jsessionid=?cidTexte=JORFTEXT00002783175 0&dateTexte=&oldAction=dernierJO&categorieLien=id. 4 Global aquaculture production of Cyprinus carpio. [Internet]. 2011 [cited 2013 juin 5]. 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[20] Page 102 sur 114 ANNEXE 3 : STRUCTURE SCHEMATIQUE TRIDIMENSIONNELLE DE LA PEAU D'UN POISSON TELEOSTEEN (POISSON OSSEUX): LE SAUMON ARGENTE (ONCORHYNCHUS KISUTCH). [132]. Page 103 sur 114 ANNEXE 4 : ZONES ET COMPARTIMENTS EN AQUACULTURE. [122]. ANNEXE 5 : MOUVEMENTS D’ANIMAUX AUTORISES AU SEIN DES DIFFERENTS STATUTS SANITAIRES. [122]. Flèche rouge : mouvement d’animaux d’aquaculture, CS : certificat sanitaire. Page 104 sur 114 ANNEXE 6 : QUESTIONNAIRE. ESTIMATION DE LA PREVALENCE DE L'HERPES CYPRIN DE TYPE 3, UNE ENQUETE REALISEE SUR 45 ELEVEURS D'ETANG. Questionnaire sur l’herpès virose de la carpe Koï Bonjour, Ce questionnaire vous est adressé afin de recueillir des données épidémiologiques sur une maladie virale de la carpe (l’herpès virose de la carpe koi ou KHV) et qui interviendront dans la réalisation de ma thèse d’exercice vétérinaire. Vous recevrez mon appel prochainement pour procéder au recueil des réponses, veillez donc à bien conserver le questionnaire. Cette thèse a pour objectif de faire état des connaissances actuelles sur cette maladie dans de nombreux domaines (épidémiologie, prophylaxie, problématiques à venir…) et est destinée à informer aussi bien les éleveurs que les vétérinaires. Compte tenu du statut réglementé de cette maladie, toutes les données recueillies seront strictement confidentielles, connues de moi seul et il ne figurera aucune référence permettant de vous identifier dans l’ouvrage. Merci d’avance pour toute l’aide que vous m’apporterez et n’hésitez pas à me laisser votre Mail lors de mon appel de façon à ce que je vous envoie une copie de la thèse quand elle sera finalisée. Cordialement, Clovis UZZANU. Tournez SVP 1/3 Page 105 sur 114 Date : Votre Nom : Votre Prénom : Adresse mail : Tel : Localisation de l’élevage ou du point d’eau : - Question 1 : Avez-vous déjà entendu parler de cette maladie ? Si oui, quelles mesures de prévention avez-vous mis en œuvre afin d’éviter la contamination de votre élevage? Non Oui Mesures de prévention : Oui (cochez) Non Quarantaine entre 15 et 25°C Introduction de carpes indemnes KHV Obtention de la certification indemne KHV Pas d’introduction de nouveaux animaux Aucune Autre (Précisez ci-dessous) Précisez : - Question 2 : Vous estimez vous assez informé par rapport à cette maladie ? Si non, quelles informations vous semblent manquantes ? Oui Non Informations manquantes : Oui Non (cochez) Mesures de prévention spécifiques Risque associé à la présence de la maladie Conséquences d’une déclaration d’infection Tournez SVP Page 106 sur 114 - 2/3 Question 3 : Sur une période de un an à compter d’aujourd’hui, avez-vous eu des épisodes de mortalité importante (>40%) dans votre élevage, touchant toutes les classes d’âge, dans une eau entre 15 et 29°C ? Si oui, quand ? Une cause a-t-elle été identifiée et laquelle ? Oui, date : Cause des mortalités : Oui Non (cochez) (cochez) Inconnue Maladie infectieuse bactérienne Virémie printanière de la carpe Pollution chimique Manque d’oxygène Autre (précisez ci-dessous) Précisez : Non - Question 4 : Ces épisodes de mortalité font ils suite à un évènement particulier ? Oui Précisez-le (s)quel (s): Oui (cochez) Non Participation à une exposition de carpes Introduction de poissons Elévation de la température de l’eau Autre (précisez ci-dessous) Précisez : Non 3/3 Page 107 sur 114 L'HERPES VIROSE DE LA CARPE OU KHV : FICHE A L'INTENTION DES ELEVEURS. Une maladie mortelle et très contagieuse. - Apparue pour la première fois en Angleterre en 1996, la maladie gagne rapidement de nombreux pays à la suite d'échanges commerciaux non régulés ou d'expositions de carpes Koï. Actuellement, au moins 18 pays d'Europe ont déjà étés touchés par la maladie. - L'herpès virose de la carpe se manifeste entre 15 et 29°C, n'affecte que les cyprinidés de l'espèce Cyprinus carpio et est caractérisée par un taux de mortalité entre 30 et 100%, généralement supérieur à 70%. - La contagion est très importante, en effet, le virus demeure infectieux pendant 3 jours dans les sédiments ou l'eau. - Le virus peut demeurer sous forme latente chez la carpe, ne pas provoquer de maladie pendant plusieurs années et être réactivé à la suite d'une augmentation de la température de l'eau. Des symptômes non spécifiques retrouvés dans de nombreuses affections. - Maladie se manifestant le plus souvent par une nécrose branchiale (A), des irritations sur la peau et les nageoires (B) et une sécrétion abondante de mucus (C). Michel, et al. 2010 Michel, et al. 2010 Anses - Seule une analyse de laboratoire peut confirmer une infection due à l'herpès virose de la carpe, car ces symptômes sont pour certains rencontrés avec d'autres affections parasitaires ou bactériennes, comme la costiase ou la flavobactériose branchiale. Transmission de la maladie. - Indirecte par les sédiments, l'eau, ou du matériel contaminé (résistance du virus de trois jours dans l'environnement). - Directe par les carpes infectées, qui peuvent être d'apparence saines (porteurs latents) mais aussi d'autres cyprinidés comme les poissons rouges et leurs hybrides avec la carpe. - La transmission par l'intermédiaire des œufs de poissons infectés est suspectée. Page 108 sur 114 Situation épidémiologique en France et dans le monde. - En France : 6 cas recensés depuis 2001, dont un cas en milieu naturel, des cas sur des Koï importées d'Israël et un cas dans une animalerie. - En Europe et dans le monde : 30% Des étangs de pêche positifs au Royaume Uni, 120 cas en Allemagne en 2007, 61 en 2012, 90 % des piscicultures touchées en 2001 en Israël, endémique en Slovénie et Belgique. - Situation difficile a déterminer avec précision dans certains pays, notamment asiatiques. Réglementation. - Maladie classée danger sanitaire de première catégorie : déclaration des cas obligatoire, destruction des stocks en cas d'infection, puis nettoyage et désinfection, vaccination interdite. - Aucune mesure définie officiellement pour l'obtention de la certification indemne d'herpès virose de la carpe en France aucune zone considérée indemne vis à vis de cette maladie. Mesures de prévention et de lutte. - Prévention de l'introduction : Séparer les différents circuits de l'élevage comme les circuits de production et d'importation, de production de Koï et de carpe commune. Privilégier un ou deux fournisseurs pour l'approvisionnement en poissons de l'élevage. Eviter les importations en provenance de pays ou l'herpès virose de la carpe est régulièrement détectée. Lors d'exposition de carpes Koï, privilégier un poisson par bassin plutôt que de mélanger tout les poissons - Analyse en cas de suspicion : En cas de mortalités inexpliquées, il est important d'adresser un prélèvement pour analyse de laboratoire, (voir à la fin de ce document pour les détails techniques). Perspectives. - Un brevet concernant un vaccin recombinant, plus sûr qu'un vaccin contenant une souche virale atténuée, à été déposé aux Etats Unis en 2011. Il n'est pas encore commercialisé et son autorisation en Europe est incertaine. - Un projet de texte réglementaire, concernant les mesures à mettre en œuvre pour l'obtention de la certification indemne d'herpès virose de la carpe en Europe à été publié, il est présenté en détail dans la partie A.2 de ce document et pourrai être adapté prochainement. Page 109 sur 114 Méthode de prélèvement et conditionnement pour l'envoi. Poissons vivants : Enfermer les poissons dans un sac plastique contenant environ 1/3 d’eau d’origine surmontée de 2/3 d’oxygène (1/10ième de biomasse maximum), fermer de façon étanche le sac avec des élastiques. Déposer ce sac dans une boite isotherme avec des poches de glace. Les dimensions du conditionnement sont proportionnées à celles des poissons. Eau d’origine : 1/3 du volume total Poissons morts et organes : Les sujets morts sont placés dans un sac en plastique, les organes sont réunis dans un pot à prélèvement stérile (voir ci dessous). Ces prélèvements sont placés dans un emballage isotherme avec des poches de glace. - Mode opératoire pour le prélèvement des organes : 1) Préparation des sujets : installer les sujets d’un même échantillon sur le coté droit, à proximité d’un bec bunzen enlever la boite crânienne à l’aide d’un sécateur ou de gros ciseaux enlever le flanc gauche à l’aide de ciseaux et de pinces en incisant ventralement depuis les nageoires pectorales jusqu'à l’anus, puis le long de la ligne médiane. (voir schéma ci-dessous) 2) Prélèvement des organes : Avec des instruments stériles (pince et ciseaux) effectuer des prélèvements de rein, de branchies, d’encéphale et d'intestin d’environ 0.5 cm3 à 1 cm3 que l’on dépose dans un flacon stérile. Si plusieurs échantillons, identifier chaque flacon avec une étiquette. 3) Réfrigérer les flacons contenant le mélange d’organes le plus rapidement possible et les expédier dans des boites isothermes avec des poches de glace par transporteur express avec une garantie d’acheminement sous moins de 24 heures. Page 110 sur 114 Conditionnement et envoi: - Les prélèvements, quelque soit leur nature (sujets vivants ou mourants, cadavres ou organes réfrigérés) sont apportés au laboratoire dans les plus brefs délais, ou peuvent être expédiés par un transport express (délai de 24h). - La température du colis doit rester entre 4 et 10 °C (tolérance jusqu’à 14°C) durant tout le transport. Pour plus d'informations: LDA39 : Téléphone: standard au 03.84.73.73.40 Fax : 03 84 37 12 14 Mail: [email protected]; [email protected]. Page 111 sur 114 Page 112 sur 114 Page 113 sur 114 UZZANU Clovis TITRE : L'HERPÈS VIROSE DE LA CARPE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ET ENQUÊTE DE PREVALENCE EN FRANCE Thèse d’État de Doctorat Vétérinaire : Lyon, 22 novembre 2013 RÉSUMÉ : L'herpès virose de la carpe est une maladie très contagieuse et le plus souvent mortelle. Inscrite sur la liste des dangers sanitaires de première catégorie en France, son impact économique est considérable, la carpe étant l’un des poissons les plus élevés à travers le monde pour sa chair ou à visée ornementale. Ce travail de thèse est composé de deux parties. Une première partie, dans laquelle au travers d'une étude bibliographique nous nous attacherons à faire le point sur les connaissances actuelles concernant l’herpès virose de la carpe. Nous aborderons la maladie en décrivant son étiologie, sa pathogénie, son épidémiologie et ses méthodes de diagnostic clinique et de laboratoire. Nous décrirons ensuite les moyens prophylactiques à disposition, d’un point de vue réglementaire. Une seconde partie, dans laquelle nous tenterons de déterminer la situation épidémiologique de cette maladie en France, à travers les réponses à un questionnaire recueillies sur 44 pisciculteurs d’étangs. MOTS CLÉS : • • • Herpès Carpe Virus JURY : Président : 1er Assesseur : 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Dominique PEYRAMOND Monsieur le Professeur Ségolène CALVEZ Monsieur le Professeur Marc ARTOIS DATE DE SOUTENANCE : Le 22 novembre 2013 ADRESSE DE L’AUTEUR : 100 ruelle au beau 21121 AHUY Page 114 sur 114
