Potentialites hematopoietiques de tissus embryonnaires et adultes

/. Embryo!, exp. Morph. Vol. 33, 2, pp. 259-278, 1975
Printed in Great Britain
'
259
Potentialites hematopoietiques de tissus
embryonnaires et adultes analysees par greffe a des
poussins irradies
Par JACQUES SAMARUT ET VICTOR NIGON 1
Departement de Biologie generate et appliquee, Villeurbanne
SUMMARY
Differentiation of haemopoietic tissues from embryos and adults
injected into irradiated chickens
Irradiated chicken are injected with haemopoietic tissues from adult or 11-day-old embryos.
Development of stem cells gives rise to well-defined erythrocytic colonies on the surface of
the tibial marrow. Erythropoietic production appears to be similar from adult marrow and
embryonic blood stem cells; production from injected vitelline stem cells seems to be between
3 and 4 times higher than that of adult marrow stem cells. Results are discussed on the basis
of two hypotheses:
- existence of an extramedullary erythropoietic site in the host after vitelline cells grafting;
- development of vitelline stem cells in the host marrow with kinetic patterns different
from those of grafted adult marrow or embryonic blood stem cells.
Anyway, the 11-day-old embryo appears to contain at least two types of blood stem cells
with distinctive properties. Developmental origin, relationship and future of these different
stem cells remain to be analysed.
INTRODUCTION
Au cours du developpement embryonnaire des Vertebres, on observe une
evolution de l'activite erythropoietique caracterisee tant par la sequence des
hemoglobines produites que par la succession des organes erythropoietiques
mis en jeu. Chez le jeune embryon de poulet, la paroi du sac vitellin represente
le principal site erythropoietique. Vers la fin du developpement embryonnaire,
l'activite se concentre, au contraire, dans la moelle, ou elle se poursuit apres
l'eclosion.
Quelles sont les relations genetiques entre ces diverses lignees erythropoietiques qui se succedent au cours du developpement? Selon Moore & Owen
(1967), les cellules souches hematopoietiques du sac vitellin de l'embryon de
poulet colonisent tous les autres centres hematopoietiques de l'embryon. En
effet, Pinjection de cellules du sang ou du sac vitellin d'un embryon a un
1
Adresse cfauteurs: Departement de Biologie generate et appliquee, 43, Boulevard du
11 novembre 1918 69621 Villeurbanne, France.
i7
EMB
33
260
J. SAMARUT ET V. NIGON
embryon irradie de sexe different et possedant done des structures chromosomiques reconnaissables, permet d'identifier une colonisation de la rate, de la
moelle, de la bourse de Fabricius et du thymus par des cellules issues du greffon.
De meme, l'echange de sang etabli par parabiose entre deux embryons de sexes
differents montre une colonisation des centres hematopoietiques de chaque
embryon par les cellules provenant de l'autre embryon et transitant dans la
circulation sanguine (Moore & Owen, 1965).
Chez l'embryon de souris, les travaux de Moore & Metcalf (1970) et Metcalf &
Moore (1971) ont conduit ces auteurs a proposer un modele similaire a celui
propose pour l'embryon de poulet. Les observations de Rifkind, Chui & Epler
(1969) tendent cependant a montrer que rerythropoiese hepatique prend naissance a partir de cellules mesenchymateuses en place dans l'organe lui-meme.
Chez les Batraciens, les greffes d'ilots sanguins triploides sur des embryons
diploides ont mis en evidence l'independance genetique entre les lignees erythropoietiques de l'embryon et du tetard (Hollyfield, 1966; Deparis, 1968, 1974).
Au regard de ses contradictions vis a vis des conclusions adoptees par les
autres auteurs, la these de Moore & Owen ramenant l'origine de l'ensemble de
l'erythropoiese du poulet aux cellules du sac vitellin n'apparait pas entierement
convaincante. En effet, s'il existait chez l'embryon un organe different du sac
vitellin et susceptible de produire des cellules souches hematopoietiques, cellesci se retrouveraient sans doute egalement dans le sang circulant et partant dans
le sac vitellin. En outre, la duree des experiences faites par ces auteurs est trop
limitee pour permettre de caracteriser pleinement les aptitudes des cellules
greffees. Nous avons done repris des experiences similaires en utilisant comme
receveurs des poussins irradies et en comparant l'effet, sur ces poussins, d'injections provenant d'organes hematopoietiques de l'embryon et de l'adulte. Chez
un tel hote, la definition des parametres de l'erythropoiese peut, en effet, etre
poussee beaucoup plus loin que chez des embryons.
MATERIEL ET METHODES
Tous les animaux utilises sont de race Leghorn.
Les irradiations sont pratiquees par groupe de quatre poussins maintenus en
position accroupie dans une boite de contention en plexiglass. Ces poussins,
ages de trois semaines, recoivent 760 R le premier jour et 990 R 24 h plus tard.
Le generateur de rayons X est du type Stabilipan Siemens. Le rayonnement est
mesure a l'aide d'un dosimetre Radocon-Victoreen en placant la sonde dans
l'air au centre du volume fictif normalement occupe par un animal. Le debit
de 76 R par minute est obtenu dans les conditions suivantes: distance sourcecible 56,5 cm; filtre 0,2 mm Cu; 170 kV, 20 mA.
La preparation des cellules est effectuee sterilement. Les instruments, la
verrerie et les liquides servant a la preparation des milieux sont sterilises par
chauffage.
Tissus hematopo'ietiques injectes a des poussins irradies
261
Moelle. La moelle est obtenue a partir d'animaux considered comme adultes
et ages de deux mois et demi. Les deux tibias et les deux femurs sont preleves,
puis fendus dans le sens de la longueur. La cavite medullaire est curetee avec
des pinces a bouts recourbes et la moelle est recueillie dans du milieu TC 199 en
solution de Earle (BD Merieux) pH 7,2 tamponne a l'HEPES (Acide 7V-2Hydroxyethyl Piperazine-JV-2-Ethanesulfonique, Eurobio) additionne de penicilline (Specilline G 10000 iu/lOOml) et de streptomycine (0,01 g/lOOml). La
moelle est dissociee d'abord a l'aide de pinces fines, puis par passages repetes
dans une seringue de 10 ml sans aiguille. La suspension est filtree sur trois
couches de gaze puis centrifugee 10 min a 300 g a 4 °C. Le culot de cellules est
resuspendu et centrifuge a nouveau dans les memes conditions. La suspension
est enfin denombree au moyen d'une cellule de Malassez et la concentration des
cellules est ajustee, de telle sorte que le volume de suspension injecte ne depasse
pas 0,6 ml. La vitalite des cellules est verifiee par le test du bleu trypan: les
preparations comportent au moins 90 % de cellules vivantes.
Sac vitellin. Les oeufs sont ouverts au lleme jour d'incubation. Avant son
ouverture, la coquille est nettoyee avec un tampon de coton imbibe d'alcool.
L'embryon est recueilli, avec ses annexes, dans du serum physiologique sterile.
La paroi vitelline est decoupee en totalite puis placee dans du tampon phosphate
de Dulbecco (PBS) sans Ca 2+ ni Mg 2+ pH 7,2 additionne de penicilline (Specilline G 10000 iu/100 ml) et de streptomycine (0,01 g/100 ml). Elle est dilaceree a
l'aide de pinces fines. Le milieu est additionne de trypsine (BD-Merieux) a la
concentration finale de 0,25 %. L'ensemble, soumis a une agitation constante par
un barreau magnetique, est incube 30 min dans un bain-marie a 38 °C. En fin
d'incubation, la suspension est homogeneisee par passages repetes dans une
seringue de 10 ml sans aiguille, puis filtree sur trois couches de gaze. Elle est
ensuite lavee trois fois par centrifugations de 15 min a 300 g a 4 °C, dans une
solution PBS. La numeration et la dilution sont effectuees comme pour la
moelle. La preparation contient 90 % de cellules vivantes.
Sang d'embryon. Le sang d'embryon de 11 jours est obtenu par aspiration a
partir de veines vitellines sectionnees. Les cellules sont recuperees dans une
solution PBS sans Ca 2+ ni Mg 2+ puis centrifugees 10 min a 300 g, a 4 °C. Le
culot est lave une fois et la suspension est denombree; la concentration en
cellules est ajustee comme pour la moelle.
Greffe. La greffe est effectuee par injection dans une veine de l'aile. Les temoins
recoivent un volume de solution PBS identique au volume de suspension injecte.
Observation des parametres hematologiqu.es. Les taux d'erythroblastes polychromatophiles et les myelogrammes sont determines sur 1000 cellules environ
a partir de frottis colores au May Griinwald Giemsa. Les numerations sont
effectuees a l'aide d'une cellule de Malassez. Les animaux sont sacrifies par
decapitation et la moelle d'un tibia est recueillie dans du liquide de Hanks ou
elle est dilaceree puis denombree. L'autre tibia est utilise pour la confection
de frottis.
17-2
262
J. SAMARUT ET V. NIGON
Pour la mesure du volume sanguin, les animaux recoivent une injection
intraveineuse de 0,3 ml d'une solution de Bleu Evans a 50 mg/100 ml. Au bout
de 5 min, le sang est recueilli apres decapitation et la densite optique du serum
est lue a 600 nm.
Comptage des colonies medullaires erythropo'ietiques chez les animaux irradies
et greffes. Les animaux sont sacrifies par decapitation. La paroi des tibias est
fendue dans le sens de la longueur au moyen d'une petite scie circulaire de
dentiste. Les os sont: ensuite maintenus dans du liquide de Hanks ou la cavite
medullaire est ouverte et la moelle recueillie integralement avec precaution.
Les colonies erythrocytaires apparaissent a la surface de la moelle sous la
forme de petites taches rouges de 0,5 mm de diametre. Le denombrement des
colonies est rendu plus aise apres fixation de la moelle et coloration des colonies.
Pour cela, le boudin de moelle est plonge dans du liquide de Carnoy pendant
une nuit a 4 °C. Le fixateur est ensuite elimine par deux lavages de 10 min dans
Pethanol a 95°. Les boudins de moelle sont plonges pendant 4 min dans une
solution de benzidine (1 g de benzidine dans 100 ml de methanol), puis dans
une solution d'eau oxygenee 110 volumes diluee 100 fois dans l'ethanol 70°,
jusqu'a l'apparition des colonies colorees en vert a la surface de la moelle.
Leur denombrement est effectue immediatement sous la loupe au grossissementx 12,5.
Mesure de rendement de la greffe. La technique utilisee est celle decrite par
Siminovitch, McCulloch & Till (1963) pour les CFU spleniques chez la souris.
Des poussins de trois semaines irradies recoivent une injection de 2 x 108
cellules de moelle adulte ou de 5 x 108 cellules de sac vitellin d'embryon de
11 jours. Deux heures apres l'injection, les animaux sont sacrifies et leurs tibias
sont immediatement preleves. La totalite de la moelle d'un tibia est injectee a un
poussin de 3 semaines irradie. Le nombre de colonies par tibia, chez les
receveurs secondaires, est determine 6 jours apres la greffe. Les nombres de
colonies observes sont corriges en tenant compte du fait que 0,05 ml de suspension reste dans le cone de l'aiguille lors de l'injection.
Le rendement de la greffe est calcule selon les modalites que Ton trouvera
page 270.
RESULTATS
I. Nature des cellules grejfees. Caracteristiques des temoins
A. Contamination de la preparation de sac vitellin par le sang circulant
La preparation effectuee a partir du sac vitellin contient des cellules de la
paroi vitelline proprement dites et des cellules apportees par le sang. Chez
l'embryon de 11 jours, le sang circulant comporte essentiellement des normocytes ainsi que des normoblastes et une faible proportion de megalocytes. On
considere que tous les erythrocytes murs appartiennent a la fraction du sang
circulant. Soient a le pourcentage de ces cellules dans le sang et b leur pourcentage dans la preparation de sac vitellin. La contamination de celle-ci par les
Tissus hematopo'ietiques
injectes a des poussins irradies
263
Tableau 1. Contamination des cellules de sac vitellin
par des cellules du sang embryonnaire
Sang
circulant
d'embryon
de 11
jours
(valeurs
moyennes
obtenues
a partir
de trois
embryons)
Normocytes
Megalocytes
Normocytes
Megalocytes
Sac vitellin
A
Preparation I
Preparation II
A
Degre de
Degre de
contaminacontamination par les
tion par les
Cellules
cellules
cellules
Cellules
dans la
issues
issues
dans la
preparation du sang preparation du sang
39,0
32,0
28,9
2,1
74,0
6,6
23,5
1,9
13,8
11,2
33,0
30,0
12,4
Tableau 2. Composition cellulaire de la moelle chez les animaux
te'moins et chez les animaux greffes
Animaux temoins
Animaux irradies et greffes avec
A
Cellules erythrocytaires
Erythrocytes murs
Erythroblastes polychromatophiles
Proerythroblastes et
erythroblastes basophiles
Cellules granulocytaires
Cellules lymphocytaires
et monocytaires
Cellules thrombocytaires
Nombre total de cellules
Sang
Moelle de
Sac
vitellin d'embryon 2,5 mois
8 x 108 cell 8xl0 8 cell 8xl0 8 cell
—
24,0x10'
9,1 x 107
3,0x10'
—
9,2x10'
5,5x10'
—
12,6x10'
irradies
25,0 x 10'
13,1x10'
10,2x10'
Irradies
non
greffes
4,4 xlO7
4,2x10'
0,2x10'
1,7x10'
0
0,6x10'
—
2,2 x 10'
5,0x10'
0,4x10'
0
0,1 x 10'
0,5 x 10'
0,2 x 10'
—
—
0,7 x 10'
1,2x10'
0,1 x 10'
—
0,2 x 10'
9,9 x 10'
2,2x10'
26,1x10'
Non
0,2 x 10'
30,6 x 10'
0
4,5 x 10'
Tous les animaux sont ages de 3 semaines apres l'eclosion. Les animaux irradies (greffes ou
non) sont etudies 6 jours apres l'irradiation. Le nombre d'animaux etudies est de 5 pour chaque
modalite de traitement. Les chiffres correspondent a la population cellulaire par tibia.
Les valeurs presentees pour les animaux greffes sont celles de la population cellulaire issue
du greffon, calculees en deduisant des chiffres totaux les nombres de cellules qui subsistent
dans la moelle des animaux irradies non greffes.
Les diverses valeurs du tableau ont ete calculees en multipliant la frequence des divers types
cellulaires, determined d'apres les myelogrammes, par le nombre total de cellules recuperees
par tibia. Ce mode de calcul ne tient pas compte de la proportion de cellules detruites au
cours de la dilaceration de la moelle. On peut estimer que ce taux de destruction est identique
pour toutes les moelles etudiees.
l,6xlG 6 ±
0,6 xlO 6
10,0±l,3
16,0xl0 9 ±
6,8 x 109
0
0
2,7xlO 6 ±
0,2 xlO 6
10,5 ±2,1
28,4xlO9±
3,2 x 108
5,5
1,56 xlO9
2,3xlO 6 ±
0,5 xlO6
9,8
22,6 x 10"
0,02
0,02
0,02
2,5xlO 6 ±
0,5 xlO 6
10,3 ± 2 0
25,8xlO 9 ±
6,0 x 109
2,5
0,65 x 109
0,06
0
0,20
2,6xlO 6 ±
0,4 x 106
8,5 ±2,5
22,2xlO9±
4,2 xlO9
2,7
0,60 xlO9
0,05
0,04
0,22
0,20
Moelle de
2,5 mois
8 x 108 cell
0
0,14
Sang
d'embryon
8 x 108 cell
0,88
Sac
vitellin
8 xlO 8 cell
0,60
0
0,43
Irradies
non
greffes
Animaux irradies et greffes avec
0,2
0,05 x 109
Tous les animaux sont ages de 3 semaines apres 1'eclosion. Les animaux irradies (greffes ou non) sont etudies 6 jours apres l'irradiation. Pour
chaque traitement, 5 animaux ont ete etudies.
La valeur du volume sanguin apres greffe de sang d'embryon a ete calculee en considerant que le volume sanguin n'etait pas modifie par le type de
traitement. Elle a ete estimee par la moyenne des mesures obtenues chez tous les animaux irradies.
% d'erythroblastes polychromatophiles
Nombre de polychromatophiles sanguins
Volume sanguin en ml
Nombre total de cellules erythrocytaires
Dans le sang circulant
Cellules erythrocytaires par mm3
Dans la moelle
% de cellules en mitose
Proerythroblastes + erythroblastes basophiles
Erythrocytes murs
Cellules granulocytaires
Cellules erythrocytaires
Cellules lymphocytaires et monocytaires
Cellules erythrocytaires
Non
irradies
Animaux temoins
Tableau 3. Effets de la greffe sur divers parametres hematologiques
to
O
O
H
W
H
p
OS
Tissus hematopo'ietiques injectes a des poussins irradies
6 /
30 -
JB
265
20 •
/
/
10
;
*
—
\
-
5
8
10
Nombre de cellules grefleesx 10"8
12
Fig. 1. Effets de la greffe sur la population de cellules medullaires. Des poussins
de 3 semaines sont irradies puis regoivent une injection de cellules. Apres 6 jours,
les animaux sont sacrifices et le nombre de cellules medullaires est compte dans un
tibia. Chaque point represente la moyenne plus ou moins l'intervalle de confiance
au seuil 5%. 5 repetitions au moins ont ete effectuees dans chaque cas; certaines
ont comporte un nombre de repetitions plus eleve, indique au-dessus des points
correspondants. #
# , Injection de cellules de moelle prelevees sur des animaux
de 2,5 mois. Coefficient de regression b = 0,33 + 0,05; O
O, injection de
cellules de sang d'embryons de 11 jours. Coefficient de regression b = 0,03 ±0,02;
•*•
^ injection de cellules de sac vitellin d'embryons de 11 jours. Coefficient
de regression b = 0,10 ± 0,04. Pour calculer le nombre de cellules vitellines greffees,
on a compte que celles-ci representent 65% de la population cellulaire injectee.
Aucune correction n'a ete apportee, dans ce cas, pour tenir compte d'une participation eventuelle a la regeneration medullaire des cellules de sang circulant injectees
simultanement.
cellules du sang sera exprimee en pourcentage par le rapport: 100b Ia. Les
resultats sont portes dans le Tableau 1. En moyenne, on observe 3 5 % de
cellules non vitellines, chiffre qui sera applique dans la suite pour corriger les
comptages de cellules vitellines.
B. Parametres hematologiques des animaux temoins irradies et non irradies
(Tableaux 2 et 3)
Les etudes ont ete faites sur des animaux irradies 6 jours auparavant et sur
les temoins non irradies d'age equivalent.
Au 6eme jour apres la seconde irradiation, les animaux non grerfes presentent
266
J. SAMARUT ET V. NIGON
Fig. 2. Colonies erythrocytaires observees sur la moelle 6 jours apres la greffe.
(A) Boudin de moelle fixe et colore montrant les colonies erythrocytaires (grossissement x 30). (B) Frottis effectue au niveau d'une colonie medullaire erythrocytaire
(grossissement x 600).
tous les symptomes de l'aplasie. La moelle est peuplee essentiellement d'erythrocytes murs. On y trouve quelques erythroblastes polychromatophiles ages et
quelques leucocytes presentant de nombreux signes de degenerescence (aspects
pycnotiques; presence d'extrusions cytoplasmiques). Le sang peripherique ne
contient aucun erythroblaste polychromatophile; la chromatine des erythrocytes presente un aspect particulierement condense.
Sur la moelle des animaux irradies non greffes, on n'observe en general, par
tibia, qu'une seule colonie erythrocytaire, au maximum deux colonies.
II. Les effets de la greffe
La greffe est effectuee dans les 4 heures qui suivent la seconde irradiation et
les animaux sont etudies 6 jours plus tard. Les doses d'irradiation utilisees
fournissent un taux de mortalite de 80 % au 8eme jour pour les animaux ne
recevant pas de greffe ulterieure. Pour les animaux recevant 8 x 1C8 cellules de
moelle adulte ou de sac vitellin, ce taux est abaisse a moins de 40 %.
A. Nombre des cellules medullaires (Fig. 1)
La population cellulaire de la moelle presente une relation lineaire avec la
dose de cellules injectees, pour une meme origine des cellules greffees. Si Ton
tient compte des cellules medullaires qui subsistent chez les animaux irradies
non greffes, la regeneration apparait trois fois plus importante apres greffe d'un
Tissus hematopo'ietiques injectes a des poussins irradies
0
267
2
4
6
Nombre de cellules injectees x 10~7
Fig. 3. Effets de la greffe sur le nombre de colonies erythrocytaires medullaires.
Des poussins de 3 semaines sont irradies puis recoivent une injection de cellules.
Apres 6 jours, les animaux sont sacrifies et le nombre de colonies medullaires est
compte a la surface de la moelle d'un tibia. Chaque point represente la moyenne plus
on moins l'intervalle de confiance au seuil 5 %. Chaque mesure a ete repetee 5 fois
au moins; dans les cas ou un nombre plus eleve de repetitions a ete effectue, celui-ci
est indique au-dessus des points correspondants. •
• , Injection de cellules
de moelle prelevees sur des animaux de 2,5 mois. Coefficient de regression b = 22,1
x 10~7±2,8x 10~7; O
O, injection de cellules de sang d'embryons de
11 jours. Coefficient de regression b = 2,2 x 10~7±0,3x 10~7; •
• , injection de
cellules de sac vitellin. En comptant le nombre de cellules vitellines de la meme facon
que sur la Fig. 1 et sans tenir compte de la regeneration due aux cellules du sang
greffees simultanement, on calcule un coefficient de regression b = 8,lxlO" 7 ±
1,8 x 10"7. La valeur de b peut etre corrigee apres deduction des effets dus aux cellules
du sang:
b corrige = 6,8 x 10~7 ± 1,5 x 10"7.
268
J. SAMARUT ET V. NIGON
Tableau 4. Mesure du rendement de la grejfe apres injection de cellules
de moelle adulte ou de sac vitellin d'embryons de 11 jours
Origine des cellules greffees
Frequence apparente des CFU dans
les preparations injectees = /?„
Nombre de cellules injectees aux
receveurs primaires = Nx
Nombre de colonies par tibia chez
les receveurs secondaires = N2
Rendement de la greffe = /
Moelle de 2,5 mois
7
Sac vitellin
7
21,2 x 10~ ± 5,6 x 10~
4,4 x 10~7 ± 1,0 x 10~7
2 x 108
5 x 108
20,8 ± 2,6
5,0 ±1,5
0,049 ± 0,007
0,023 ± 0,013
Des poussins de 3 semaines irradies recoivent une injection de A^ cellules. Deux heures
plus tard, les tibias de ces receveurs primaires sont preleves et la totalite de la moelle d'un
tibia est injectee a un poussin receveur secondaire. Le nombre de colonies chez ces receveurs
secondaires est mesure 6 jours apres l'injection.
La frequence apparente des CFU dans les preparations injectees est determined, apres
injection a des poussins de 3 semaines irradies, par le rapport entre le nombre de colonies
par tibia mesure au 6eme jour et le nombre de cellules injectees.
nombre donne de cellules lorsque celles-ci sont issues de la moelle d'un animal
adulte que lorsqu'elles proviennent du sac vitellin. Les pentes des droites sont
significativement differentes l'une de l'autre (P < 0,01). Apres greffe de sang
d'embryon, la regeneration est faible, mais la presence, dans la moelle, de
cellules erythrocytaires et granulocytaires tres jeunes laisse supposer l'existence
d'une colonisation effective.
B. Nature et frequence des diverses cellules medullaires {Tableau 2)
L'extreme pauvrete de la moelle des animaux greffes avec du sang d'embryon
n'a pas permis l'etablissement de myelogrammes valables pour ces animaux.
Apres greffe de cellules de moelle adulte ou de cellules de sac vitellin, plus de
90 % des cellules issues du greffon appartiennent a la lignee erythrocytaire et
sont representees en majorite par des erythroblastes polychromatophiles.
La transformation de la moelle affecte aussi les autres lignees hematopoietiques mais on observe des differences selon l'origine du greffon. La population granulocytaire est relativement plus importante apres greffe de cellules de
sac vitellin qu'apres greffe de cellules de moelle. La situation inverse est observee
pour les cellules lymphocytaires et monocytaires.
La regeneration apres greffe est caracterisee par des index de mitose superieurs a celui observe dans la moelle normale (Tableau 3).
C. Colonies medullaires erythrocytaires
Apres la greffe d'un nombre reduit de cellules (106 a 5 x 107 cellules de
moelle), la regeneration de l'erythropoiese medullaire est localisee au niveau
d'ilots erythropoietiques bien individualises, visibles a la surface de la moelle
(Fig. 2 A). Des frottis effectues apres prelevement de ces ilots montrent une
Tissus hematopoietiques injectes a des poussins irradies
0
2
4
6
8
10
Nombre de cellules greffees x 10~8
269
12
Fig. 4. Effets de la greffe sur la population des erythroblastes polychromatophiles
du sang circulant. Des poussins de 3 semaines sont irradies puis regoivent une
injection de cellules. Apres 6 jours, le taux d'erythroblastes polychromatophiles
sanguins est determine sur frottis. Chaque point represente un pourcentage moyen
accompagne de son intervalle de confiance au seuil 5%, excepte pour les pourcentages tres faibles inferieurs a 0,2 %. Chaque mesure comporte 5 repetitions au
moins. Certaines mesures reposent sur un nombre de repetitions plus eleve, indique
au-dessus des points correspondants. •
• , Injection de cellules de moelle
prelevees sur des animaux de 2,5 mois. Coefficient de regression b = 3,4 x 10~ n ;
O
O> injection de sang d'embryons de 11 jours. Coefficient de regression
b = 0,4 xlO~ u ; •
*, injection de cellules de sac vitellin d'embryons de
11 jours. Coefficient de regression b = 7,0 x 10~u. Le nombre de cellules vitellines
injectees a ete calcule de la meme facon que sur la Fig. 1. Aucune correction n'a
ete apportee dans ce cas pour tenir compte d'une participation eventuelle a la regeneration medullaire des cellules du sang circulant injectees simultanement.
moelle riche, peuplee exclusivement de cellules erythrocytaires plus ou moins
jeunes dans un etat de synchronisme remarquable (Fig. 2B). Ces observations
contrastent avec celles eflfectuees dans les zones situees entre les colonies, ou la
moelle presente un aspect tres pauvre, identique a celui des moelles des temoins
irradies.
Pour une meme origine des cellules grefTees, le nombre de colonies par tibia
observe 6 jours apres la greflfe presente une relation lineaire avec la dose de
cellules injectees (Fig. 3). On peut considerer que chaque colonie ainsi observee
270
J. SAMARUT ET V. NIGON
resulte du developpement d'une seule cellule souche erythrocytaire que nous
nommerons CFUEm ('colony forming unit' erythropoietique medullaire).
D. Rendement de la greffe. Estimation de la 'frequence reelle' des CFUEm
Les pentes des droites de la Figure 3 permettent de calculer une 'frequence
apparente' des CFUEm representant le rapport entre le nombre total de cellules
injectees et le nombre de colonies trouvees au niveau d'un seul tibia. Ces
'frequences apparentes' peuvent etre transformers en 'frequences reelles' en
tenant compte du rendement de la greffe (voir Materiel et Methodes).
Si n0 est la 'frequence apparente' des CFU dans les preparations injectees,
Nx le nombre de cellules injectees aux poussins receveurs primaires et N2 le
nombre de colonies observe chez les poussins receveurs secondaires, la valeur
du rendement de la greffe, / , est donnee par la relation
Les resultats sont portes dans le Tableau 4. Le rendement de la greffe est de
4,9 % apres greffe de moelle adulte et de 2,3 % apres greffe de cellules vitellines.
Les frequences reelles des cellules souches, estimees a partir des pentes des
droites de la Figure 3, sont done 300 CFU pour 107 cellules dans le sac vitellin
et 450 CFU pour 107 cellules dans la moelle adulte.
E. Erythropo'iese au niveau du sang circulant
Des erythroblastes polychromatophiles apparaissent dans le sang des animaux
greffes a partir du 5eme jour qui suit la greffe. Au 6eme jour, le taux de ces
cellules affecte une relation lineaire avec la dose des cellules greffees, pour des
cellules d'une meme origine (Fig. 4). Pour des nombres equivalents de cellules
injectees, on observe, apres la greffe de sac vitellin, environ deux fois plus
d'erythroblastes polychromatophiles sanguins qu'apres greffe de moelle. Une
erythropoiese non negligeable est observee apres l'injection de sang embryonnaire. Nous avons verifie que le volume sanguin et le nombre de cellules erythrocytaires par mm3 de sang ne sont pas modifies de facon sensible quel que
soit le type de greffe (Tableau 3). Les differences observees au niveau des taux
d'erythroblastes polychromatophiles ne peuvent done pas etre attribuees a des
differences dans le nombre de cellules erythrocytaires du sang.
III. Production des colonies erythropoietiques {Tableau 5)
L'etude de la production des colonies erythropoietiques necessite l'injection
d'un grand nombre de cellules conduisant a une confluence des colonies dont le
denombrement n'est plus possible. Dans ces conditions, on ne peut verifier la
linearite de la relation entre le nombre de cellules injectees et le nombre de
colonies formees. Si nous supposons que cette linearite est conservee jusqu'a
Tissus hematopoietiques
injectes a des poussins irradies
111
Tableau 5. Nombre de cellules produites a partir d'une cellule souche fixee
par tibia au 6eme jour apres greffe de cellules de diverses origines
Greffe de
Greffe de
sac vitellin
sang
d'embryons de d'embryons de
11 jours
11 jours
Frequence, dans la preparation injectee,
6,8 x 10~7 ±
des CFUEm susceptibles de se fixer
1,5 x 10~7
dans un tibia
Nombre total de CFUEm implantees par
544 ± 120
tibia apres injection de 8 x 108 cellules
Nombre de cellules medullaires produites 14,7 x 104
a partir d'une CFUEm implantee par tibia*
Nombre d'erythroblastes polychromato287 x 104
philes presents dans le sang pour une
CFUEm implantee par tibiaf
Nombre de proerythroblastes et erythro1,10 x 10*
blastes basophiles dans la moelle,
produits a partir d'une CFUEm implantee
par tibia}
Nombre d'erythroblastes polychromato10,1 x 104
philes dans la moelle, produits a partir
d'une CFUEm implantee par tibia§
Greffe de
moelle de
2,5 mois
2,2xl0- 7 ±
0,3 x 10-7
22,lxl0- 7 ±
2,8 x 10~7
176 ±24
1760 ±220
13,6 xlO4
14,8 x 10*
28,4 xlO4
34,0 x 104
1,3 xlO4
7,1 x 104
* Calcule par le rapport des pentes des Figures 1 et 3.
t Calcule par le rapport entre le nombre d'erythroblastes polychromatophiles dans le
sang et le nombre de CFUEm implantees par tibia apres greffe de 8 x 108 cellules.
X Calcule par le rapport entre le nombre de proerythroblastes et erythroblastes basophiles
presents dans la moelle et le nombre de CFUEm implantees par tibia apres greffe de 8 x 108
cellules.
§ Calcule par le rapport entre le nombre d'erythroblastes polychromatophiles presents
dans la moelle et le nombre de CFUEm implantees par tibia pour 8 x 108 cellules greffees.
109 cellules injectees, on peut calculer le nombre de CFUEm fixees dans un tibia
pour 8 x 108 cellules greffees (Tableau 5, ligne 2). A partir de la, en rapprochant
les Figs. 1 et 3, on peut calculer la production de cellules medullaires par CFUEm
en 6 jours (Tableau 5, ligne 3). Noter que, dans ce cas, un facteur correctif
devrait etre introduit pour tenir compte des cellules detruites inevitablement au
cours de la dilaceration de la moelle. Si y est la proportion des cellules non
detruites, le facteur correctif doit etre \jy. On peut admettre que la valeur de ce
facteur est constante au cours des experiences, ce qui permet de comparer les
divers resultats en valeurs relatives: on constate que les valeurs obtenues sont
peu differentes quelle que soit l'origine des cellules greffees. Les memes
remarques doivent etre faites pour la production, par CFUEm, de proerythroblastes et erythroblastes basophiles et pour celle d'erythroblastes polychromatophiles presents dans la moelle (Tableau 5, lignes 5 et 6).
272
J. SAMARUT ET V. NIGON
Si Ton veut etablir des calculs similaires pour les erythroblastes polychromatophiles du sang, on doit tenir compte du fait que ceux-ci sont produits au niveau
de l'ensemble des sites medullaires. Les chiffres portes a la ligne 4 du Tableau 5,
ramenant la production d'erythroblastes polychromatophiles du sang au nombre
de CFU fixees dans un seul tibia, devront done etre corriges par un facteur x
representant la proportion des CFU fixees dans un tibia par rapport au nombre
total des CFU fixees dans l'ensemble des sites medullaires. L'intervention de ce
facteur, etant identique dans les diverses conditions experimentales, n'interdit
pas la comparaison. On observe alors que les valeurs trouvees ne sont pas
significativement differentes que Ton injecte du sang d'embryon ou de la moelle
adulte. En revanche, l'injection de cellules du sac vitellin fournit une valeur
environ huit fois plus elevee au 6eme jour.
Le rendement de la greffe, mesure sur un seul tibia, represente en fait le
produit de la fraction des CFU fixees dans un tibia (par rapport a l'ensemble
des CFU fixees dans tous les sites medullaires) par un facteur de viabilite des
CFU. Le rendement maximum observe represente done en fait la valeur minimale possible de x et Ton aboutit a la conclusion que x > ^ .
DISCUSSION
1. Origine des colonies erythropo'ietiques
L'existence de colonies hematopoietiques dans la moelle d'animaux irradies
et greffes a deja ete decrite chez la souris (Wolf & Trentin, 1968). Nous avons
raisonne, dans Interpretation de ces resultats, par homologie avec les interpretations, desormais classiques, employees pour rendre compte de la formation
de colonies spleniques apres injection de cellules souches a des souris irradiees
(Till & McCulloch, 1961). L'interpretation des colonies medullaires observees
en tant que clones cellulaires peut s'appuyer sur deux arguments. D'une part,
toutes les cellules d'une meme colonie manifestent un synchronisme remarquable
dans leur structure. D'autre part, le nombre moyen des colonies obtenues
evolue lineairement en fonction du nombre de cellules injectees, lorsque celles-ci
proviennent d'une meme origine. Ce dernier argument doit cependant etre
considere avec precaution car la variability des mesures est elevee et serait
eventuellement compatible avec une interpretation non lineaire. Celle-ci
represente, en tout etat de cause, l'hypothese la plus simple, a considerer en
premier lieu. Une hypothese non lineaire conduirait a supposer, par exemple,
l'intervention d'une saturation susceptible d'inflechir le graphique vers le bas
pour les valeurs les plus elevees des nombres de cellules injectees. Une telle
eventualite conduirait a modifier certaines valeurs du Tableau 5, comme il
a ete signale plus haut.
Tissus hematopo'ietiques
injectes a des poussins irradies
273
2. Taux de production de cellules erythrocytaires a partir des cellules souches
Comme principal critere de production, nous retiendrons le nombre des
erythroblastes polychromatophiles. Ce nombre peut donner un indice valuable
a condition d'admettre que la duree de vie de ces cellules dans le sang circulant
est identique, quelle que soit Porigine des cellules souches. En admettant cette
hypothese, on constate que la production d'erythroblastes polychromatophiles
par colonie est la meme, que les cellules souches aient ete fournies par du sang
d'embryon ou par de la moelle d'adulte. Au contraire, les cellules souches du
sac vitellin paraissent dotees d'une activite productrice beaucoup plus elevee.
La difference observee selon l'origine des cellules injectees peut etre interpretee en faisant appel a l'une ou l'autre des deux hypotheses suivantes:
Ou bien Perythropoiese declenchee par Pinjection de cellules vitellines se
deroule uniquement dans les sites medullaires. II faudrait admettre alors qu'elle
comporte des constantes cinetiques de valeurs differentes de celles qui sont
obtenues apres injection de cellules de sang d'embryon ou de moelle d'adulte.
Ou bien Perythropoiese consecutive a Pinjection de cellules de sac vitellin
s'effectue dans deux categories de sites distinctes. Les sites medullaires pourraient alors fonctionner avec les memes parametres cinetiques que lorsqu'ils
sont peuples de cellules issues du sang d'embryon. L'autre site pourrait repondre
a des caracteristiques differentes.
Les donnees actuellement recueillies ne permettent d'exclure aucune de ces
deux hypotheses. La premiere permet d'autres evaluations de sorte que nous en
examinerons les consequences plus en detail.
3. Calculs sur un modele
3.1. Construction du modele
Pour edifier un modele, nous formulons des hypotheses schematisees dans
la Fig. 5.
(1) Les cellules souches greffees se developpent uniquement dans les sites
medullaires.
(2) Une cellule souche initiate se divise regulierement au cours de i cycles de
division a Pissue desquels elle donne naissance a un nombre N.t (= 21) de
cellules similaires a elle-meme.
(3) A partir de la /feme generation, et a chacune des generations suivantes, une
proportion q des cellules souches presentes va se differencier en 'cellules meres
d'erythrocytes'. Le nombre de ces cellules meres a la ibme generation est alors
E( = qN{. Les cellules souches restantes (soit Nt — E^) continuent a se diviser
et a se differencier, pendant un nombre de generations indefini, selon des regies
constantes.
(4) Les cellules meres des erythrocytes subissent un nombre limite, n, de
divisions cellulaires. Nous supposons que le temps de generation de ces cellules
est identique a celui des cellules souches.
274
J. SAMARUT ET V. NIGON
Fig. 5. Modele schematique representant la production de cellules erythropoietiques
a partir d'une cellule souche. O, Cellule souche capable de se multiplier indefiniment; • , cellule mere des erythrocytes dont la multiplication est limitee a n cycles;
®, erythroblaste incapable de se multiplier; *, erythrocyte mur;
, division
cellulaire;
, maturation sans division cellulaire. /, n, v, nombres de generations.
(5) A Tissue de la nhmG division, les cellules meres se transforment en erythroblastes polychromatophiles qui ne se divisent plus. Ceux-ci survivent sous cette
forme, dans la moelle ou dans le sang circulant, pendant une duree qui est
egale a celle de v cycles de division des cellules souches. Us se transforment
ensuite en erythrocytes murs. A un instant determine, le nombre total de polychromatophiles presents et issus d'une cellule souche initiale est Pt.
Lorsque le nombre m de generations cellulaires parcourues apres la greffe est
superieur ou egal a i+n + v, il s'etablit un regime pour lequel on peut calculer la
frequence theorique des diverses categories de cellules issues d'une meme cellule
souche. Ainsi, a la nfmG generation cellulaire on demontre que le nombre total
Tissus hematopoietiques injectes a des poussins irradies
275
Tm de cellules capables de se multiplier ( = cellules souches + cellules meres des
erythrocytes) est:
Tm = 2 wl (l-g) m-n -* +1 .
Au meme moment, le nombre total d'erythroblastes polychromatophiles
presents est:
Pm = 2—^(1-?)™—»- * 2* [2(1-$)]*.
<= 0
D'ou
^
l
V
q)]*-"-\
(1)
3.2. Evaluation des parametres du modele a partir des donnees experimentales
Soient Z le nombre d'erythroblastes polychromatophiles observes a un
moment donne dans un tibia et formes a partir d'une CFUEm et z le rapport
entre le nombre d'erythroblastes polychromatophiles du sang et le nombre de
CFUEm observees dans un tibia. En considerant les divers facteurs correctifs
envisages pages 271 et 272 le nombre total d'erythroblastes polychromatophiles
presents a un moment donne et produits a partir d'une CFUEm peut s'ecrire:
„
z
Z + xyz
P = - + xz =
—.
y
y
Soit T l'ensemble des proerythroblastes + erythroblastes basophiles correspondant par CFUEm a une valeur denombree Y. II vient: T = Yjy.
D'ou:
P Z + xyz Z + Xz
si X = xy.
T
Y
Si Po est la production d'erythroblastes polychromatophiles a partir d'une
CFUEm d'origine vitelline et Pm la production d'erythroblastes polychromatophiles a partir d'une CFUEm d'origine medullaire, on peut ecrire:
P
2 —
~ 7
V+
»
A-Y?
'
^ '
Si Ton admet que six jours apres la greffe, le nombre m de generations
parcourues repond a la relation m ^ i + n + v, on peut estimer les valeurs de 6
et n a partir des donnees numeriques du Tableau 5.
II vient:
7,1 + 34,0^
apres greffe de moelle,
(3)
1,25
n
tlv =
18
10,1+287^
r-:
10,1+287^
_ A
. u.
apres greffe de sac vitelhn,
EMB
...
(4)
33
276
J. SAMARUT ET V. N I G O N
Fig. 6. Representation graphique de la fonction v = f(q). Les parametres de la
fonction sont tires du Tableau 4. Les courbes ont ete representees apres greffe de
moelle et de sac vitellin pour trois valeurs de X. X = Coefficient de correction des
mesures (X = 0,05; X = 0,10 et X = 0,15). v = Duree de vie des erythroblastes
polychromatophiles estimee par rapport au temps de generation (valeurs portees en
ordonnees). q = Proportion de cellules souches qui se differencient a chaque
generation cellulaire (valeurs portees an abscisses).
Fig. 7. Representation graphique de la fonction n = i/r(X). n = Production d'erythroblastes polychromatophiles a partir des cellules souches d'origine vitelline par
rapport a la production d'erythroblastes polychromatophiles a partir des cellules
souches d'origine medullaire. X = Coefficient de correction des mesures.
A partir des relations (1), (3) et (4), on peut etablir une fonction v = f{q)
representee graphiquement sur la Fig. 6.
A partir de la relation (2) et des donnees du Tableau 5, on etablit une fonction
n = f(X) (Fig. 7).
On peut determiner une valeur maximale de temps de generation en considerant que l'ensemble de la population cellulaire ( = T+P) resulte du doublement indefini et regulier d'une cellule initiale au cours de m generations:
T+P = 2m.
D'ou, comme les mesures sont effectuees au 6eme jour, un temps de generation moyen co:
144
144 log 2
0) <
OU 0) <
,
m
log (T+P)'
o) etant exprime en heures.
En considerant les resultats numeriques du Tableau 5 et diverses valeurs
possibles de X et y, on calcule pour la greffe de cellules de moelle (o < 8,6 et
pour celle de cellules du sac vitellin o) < 8.
Tissus hematopo'ietiques injectes a des poussins irradies
277
3.3. Discussion du modele et des resultats du calcul
Le modele employe presente quelques proprieties remarquables:
(1) L'equi valence du temps de generation pour les cellules souches et les
cellules meres et le synchronisme supposes lui conferent une structure tres
simple. Dans la realite, il est possible que ces temps de generation soient differents
et il est vraisemblable que le synchronisme aille en degenerant.
(2) Nous avons admis que q passe brusquement au cours de la generation
* de 0 a une valeur non nulle constante. On remarquera que, dans ce modele,
si q = 0,5, le nombre de cellules souches et de cellules meres reste stable; il
augmente pour ^ < 0,5 et diminue pour q > 0,5. Dans la realite, il parait
vraisemblable que la valeur de q evolue, au cours de la multiplication des
cellules souches, pour passer graduellement de 0 a 0,5.
Ainsi, les hypotheses admises permettent d'etablir des relations remarquables
issues de la structure du modele: la realite est sans doute plus nuancee. Les
valeurs calculees ne sauraient done representer qu'une evaluation des valeurs
reelles avec un degre d'approximation difficile a chiffrer. L'interet principal du
modele est alors d'attirer l'attention sur la fonction de certains parametres et de
suggerer les experiences destinees a mesurer directement les valeurs de ces
parametres et leurs variations eventuelles.
Si Ton admet que le nombre de cellules recuperees dans un tibia represente
entre 1/20 et 1/10 du nombre total de cellules medullaires de l'animal, on trouve
que la production d'erythroblastes polychromatophiles par cellules souche
doit etre trois a quatre fois plus elevee a partir des cellules du sac vitellin qu'a
partir des cellules de la moelle adulte (Fig. 7).
Ces observations sont similaires a celles effectuees par Micklem et d'autres
(1972) sur le developpement des CFU embryonnaires et adultes de la souris.
Les resultats sont interpretes par les auteurs comme indiquant une capacite
d'autorenouvellement des CFU du foie foetal superieure a celle des CFU de
la moelle adulte.
Si Ton considere la Fig. 6, on constate qu'a partir d'injection de cellules de
moelle, une valeur de q voisine de 0,5 conduisant a une population medullaire
stable est compatible avec des valeurs de v comprises entre 5 et 8. Pour un
temps de generation voisin de 8 heures, on obtient une duree de vie des erythroblastes polychromatophiles comprise entre 2 et 3 jours, ce qui correspond a des
valeurs communement admises. Au contraire, l'injection de cellules du sac
vitellin fournit, pour des valeurs de v similaires ou un peu plus elevees, des
valeurs de q superieures a 0,6 qui aboutiraient inevitablement a un depeuplement de la moelle par disparition progressive des cellules souches, sauf modification ulterieure de la valeur de ces parametres.
18-2
278
J. SAMARUT ET V. NIGON
CONCLUSIONS GENERALES
Les cellules de sang d'embryon et de moelle d'adulte produisent des erythropoieses dont les parametres ne peuvent etre distingues. Au contraire, Finjection
de cellules du sac vitellin produit une erythropoiese specifique affectee de parametres cinetiques particuliers. Ainsi, chez l'embryon de 11 jours, l'existence de
deux categories au moins de cellules souches semble prouvee. Les unes, presentes
dans le sang et, eventuellement, dans le sac vitellin, ont un fonctionnement
similaire a celui des cellules provenant de la moelle d'adulte. Les autres se trouvent
dans le sac vitellin seulement et presentent des caracteristiques particulieres.
L'existence de plusieurs categories de cellules souches pose evidemment la
question de leurs origines respectives qui peuvent etre communes ou distinctes.
Ce travail a beneficie d'une subvention de la DGRST.
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