revue - John Libbey Eurotext

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Tests d’amplification génomique multiple
pour le dépistage des infections virales :
développement et applications
D. Candotti
1
J.-P. Allain
2
1
National Blood Service, Long Road
<[email protected]>
2
Division of Transfusion Medicine,
Department of Haematology,
University of Cambridge, Cambridge CB2
2PT, Grande-Bretagne
Résumé. Du fait de progrès constants des méthodes d’amplification et de détec-
tion des acides nucléiques viraux, le diagnostic moléculaire est devenu une
procédure essentielle de caractérisation des infections virales. Le développement
des tests moléculaires appliqués au diagnostic clinique et à la sécurité transfusion-
nelle reste limité essentiellement par leur coût. Cette limitation peut être atténuée
par le développement de tests d’amplification génomique multiple (multiplex)
détectant simultanément et, éventuellement, identifiant immédiatement plusieurs
génomes viraux grâce aux récentes avancées techniques dans ce domaine. Malgré
une optimisation parfois délicate, les tests multiplex, commerciaux ou non, ont été
utilisés avec succès, en particulier pour le dépistage à grande échelle des infections
à HBV, HCV et VIH1 dans les dons de sang, ce qui a amélioré la sécurité
transfusionnelle en réduisant la fenêtre sérologique. Ces tests hautement sensibles
et spécifiques ont également montré un potentiel de réduction des coûts et des
délais opératoires de la détection moléculaire. Le format multiple offre la pers-
pective d’accroître la sécurité transfusionnelle dans des régions endémiques à
faibles ressources tout en maintenant un rapport coût/efficacité favorable grâce à
l’association à d’autres procédés réducteurs de coût tels que la détection en pools
de plasmas et le dépistage sérologique avant le don.
Mots clés :amplification génomique multiple, génomes viraux, RT-PCR en
temps réel, sécurité transfusionnelle
Abstract.Advances in viral nucleic acid amplification and detection techniques
have resulted in molecular diagnostics becoming key procedures in viral infec-
tion characterization. Molecular assay development applied to clinical diagnos-
tic and transfusion safety is essentially limited by cost. To overcome this
limitation, multiplex nucleic acid testing (NAT) assays allowing simultaneous
detection and eventually direct identification of several viral genomes have been
developed using recent technical improvements in genomic amplification tech-
nologies. Optimization may prove difficult, but commercial and in-house mul-
tiplex NAT assays have been successfully applied to large-scale screening of
blood donations for HBV, HCV and HIV-1, improving transfusion safety by
reducing the pre-seroconversion window period. They showed high sensitivity
and specificity, and may decrease operating costs and testing turnaround time.
Multiplexing has the potential to improve blood safety in highly endemic
resource-limited areas in a cost-effective way when associated with other cost-
reducing procedures such as plasma pooling and pre-donation serological
screening.
Key words:transfusion safety, multiplex nucleic acid testing, viral genomes,
real-time RT-PCR
Tirés à part : D. Candotti
Virologie 2007, 11 : 135-50
doi: 10.1684/vir.2007.0082
Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 135
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Au cours des dix dernières années, les performances des
méthodes moléculaires d’amplification et de détection des
génomes viraux (ADN et ARN) n’ont cessé de progresser,
non seulement en matière de sensibilité et de spécificité
mais aussi de par une automatisation les rendant utilisables
à grande échelle ; leur utilisation en diagnostic clinique et
dans les laboratoires de recherche ne cesse de se dévelop-
per. Ces méthodes moléculaires, dont la plus populaire est
la PCR, associent une détection directe et extrêmement
spécifique des séquences virales ciblées, avec une sensibi-
lité analytique bien supérieure à celle des méthodes de
détection sérologique des antigènes viraux ou d’isolement
des virus. Un des moteurs particuliers de ce développement
est la recherche de la sécurité transfusionnelle en matière
d’infections virales : cela implique le dépistage à grande
échelle de marqueurs sérologiques et/ou génétiques des
virus présents même en faible quantité dans les dons de
sang, qui constituent un risque pathogène pour les rece-
veurs. Ce dépistage nécessite, non seulement une sensibi-
lité maximale afin de détecter de faibles concentrations des
marqueurs viraux recherchés, mais également une très
grande spécificité de manière à limiter l’élimination de
dons identifiés de façon erronée comme contaminés. Ces
deux conditions sont nécessaires au maintien d’un rapport
coût/efficacité favorable du dépistage viral systématique en
transfusion. Les performances des tests actuels détectant
l’antigène de surface du virus de l’hépatite B (HBV) et les
anticorps dirigés contre le virus de l’immunodéficience
humaine de type 1 (VIH1) et le virus de l’hépatite C (HCV)
permettent de réduire le risque de transmission par transfu-
sion de ces trois virus à un niveau compris entre 1 : 50 000
et 1 : 1 500 000. Un risque transfusionnel résiduel demeure
du fait de la fenêtre sérologique qui suit le contact initial
avec le virus et précède l’apparition de niveaux détectables
des marqueurs sérologiques (antigènes et anticorps), et de
la période suivant la disparition de ces marqueurs sérologi-
ques dans les phases tardives de l’infection dans le cas du
HBV. Ce risque résiduel peut être à son tour significative-
ment réduit grâce au développement récent de méthodes
moléculaires de détection des génomes viraux.
L’utilisation en diagnostic clinique et en transfusion de ces
méthodes moléculaires souvent complexes est également
limitée par leur coût élevé et parfois le volume d’échan-
tillon à tester disponible. En particulier, dans le domaine
transfusionnel, elle est caractérisée par un rapport
coût/efficacité élevé dans les pays développés dans lesquels
le risque résiduel est extrêmement faible [1]. Le rapport
coût/bénéfice en année de vie de qualité (Qaly) y est de plus
de 1 000 000 dollars au lieu du seuil généralement accepté
de 50 000 dollars. Cependant, la volonté des pouvoirs pu-
blics et des populations elles-mêmes de payer pour un sang
« sans risque » a encouragé le développement de méthodes
de détection génomique, non seulement des HBV, HCV et
VIH1 représentant un risque majeur, mais aussi du parvo-
virus humain B19 (B19), du virus West Nile et du virus de
l’hépatite A. Le coût considérable de ces nouvelles techno-
logies, pour une grande part lié à des frais de brevets, a
stimulé la recherche de diverses stratégies destinées à le
réduire et à accroître la capacité diagnostique des méthodes
de détection génomique. Une première solution, utilisée en
sécurité transfusionnelle, a été de pratiquer le dépistage des
génomes viraux sur des mélanges (pools) contenant de 8 à
500 échantillons de plasma mais cela s’accompagne d’une
baisse de sensibilité due au facteur de dilution introduit.
Cette limitation peut cependant être partiellement atténuée
par l’introduction de procédures, souvent compliquées,
permettant de concentrer les virus recherchés. Une telle
approche est essentiellement applicable au dépistage à
grande échelle mais semble peu adaptée au diagnostic
clinique. Une seconde approche consiste à développer des
méthodes capables de détecter simultanément plusieurs
génomes différents dans une même réaction. Elle réduit le
coût en réactifs, le volume d’échantillon à tester, le temps
nécessaire à l’obtention des résultats, mais rend encore plus
complexe un procédé qui nécessite déjà plusieurs étapes
pour la détection d’un seul génome viral.
La présente revue a pour objectif de donner un aperçu non
exhaustif des méthodes de détection génomique en format
multiple (multiplex) actuellement disponibles en tant que
tests commerciaux manufacturés ou tests « maison » déve-
loppés dans un but de recherche ou de diagnostic, en parti-
culier dans le domaine de la sécurité transfusionnelle ; à
cette occasion, seront discutés les problèmes techniques
liés à ces nouvelles méthodes et donnés des exemples de
leurs applications cliniques.
Tests d’amplification génomique
en format multiple (multiplex)
pour le dépistage des génomes viraux
Au cours de dix dernières années, plusieurs études ont
démontré la faisabilité et l’efficacité de la détection des
génomes viraux en multiplex dans différentes situations
cliniques et épidémiologiques (tableaux 1 et 2) [2-28]. Ces
méthodes de détection mutiple peuvent constituer une ré-
ponse pratique au besoin d’un dépistage rapide, simultané
et à grande échelle de plusieurs virus. Elles sont suffisam-
ment sensibles pour détecter des infections virales, telles
que les infections à VIH1, HCV, HBV et virus humain
T-lymphotrope (HTLV), en l’absence de toute réponse sé-
rologique (fenêtre de préséroconversion). Le multiplexage
s’applique également au typage/sous-typage de souches
virales dans des études épidémiologiques. La plupart de ces
tests multiplex sont des tests « maison » à but diagnostique
ou de recherche. Seuls quelques-uns ont été développés
commercialement, en particulier dans le but d’être appli-
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qués au dépistage à grande échelle des dons de sang
(tableau 1). Dans ce cas, les virus recherchés sont essen-
tiellement le HBV, le HCV et le VIH1
M, N, O
ainsi que, dans
une moindre mesure, le VIH2, le virus dit de l’hépatite G
(GBV-C) et les HTLV-I et II [17-28]. Ces différents tests
sont capables de détecter simultanément de deux à quatre
génomes viraux (ADN et/ou ARN) mais peu d’entre eux
contiennent un témoin interne d’amplification.
Le multiplexage a été appliqué avec succès aux différentes
méthodes les plus utilisées d’amplification des ADN et
ARN viraux et de détection des séquences amplifiées (ta-
bleau 2). Les méthodes d’amplification regroupent la réac-
tion de polymérisation en chaîne (polymerase chain reac-
tion, PCR) de type conventionnel ou niché (nested PCR)et
associée ou non a une transcription inverse préalable des
ARN (RT-PCR) [17, 20, 25, 29], la PCR en temps réel
(real-time PCR) [18, 19, 21, 23, 26, 28], l’amplification
isothermique de séquences nucléiques (isothermal nucleic
acid sequence-based amplification, Nasba) [22] et l’ampli-
fication par transcription (transcription-mediated amplifi-
cation, TMA) [24, 27].
Caractéristiques générales des tests
d’amplification génomique multiplex
Dans les tests multiplex utilisant une réaction convention-
nelle de type (RT)-PCR, les produits amplifiés sont détectés
et identifiés selon leur taille après migration par électropho-
rèse dans un gel d’agarose [17, 29]. La PCR nichée apporte
un gain de sensibilité et de spécificité mais introduit cepen-
dant un risque accru de contamination croisée du fait de la
manipulation de produits déjà amplifiés [29]. Afin d’éviter
cette deuxième étape d’amplification, la détection des pro-
duits d’une première amplification a été rendue plus effi-
cace par l’utilisation de sondes oligonucléotidiques d’hy-
bridation associées à différentes méthodes de marquage et
de détection des produits d’hybridation. Les tests utilisant
cette méthodologie sont classés en deux groupes en fonc-
tion du type de signal d’amplification produit.
Le premier groupe comprend les tests multiplex générant
un signal unique, tels que les tests utilisant des sondes
oligonucléotidiques marquées à la biotine à leur extrémité
5’ et un système de détection de type PCR Elisa DIG [25],
Tableau 1.Exemples de tests multiplex pour le diagnostic virologique
Auteurs Système Virus Témoin
interne
Origine(s) des
échantillons
Equipement
Tucker, 2001 RT-PCR en temps réel HPV6, HPV11,
HPV16, HPV18
Non Sécrétions vaginales ABI Prism 7700
Klein, 2001 RT-PCR en temps réel Sous-types de FIV Non Plasma ABI Prism 7700
Del Mar Mosquera,
2002
RT-PCR MeV, RUBV, B19V Non Diverses -
Druce, 2002 PCR nichée HSV1, HSV 2, VZV,
CMV
Non -
O’Neill, 2003 PCR en temps réel HSV1, HSV2, VZV Non Diverses Lightcycler
Safronetz, 2003 PCR en temps réel HHV6A, HHV6B,
HHV7
Non Tissus Lightcycler
Beuret, 2004 RT-PCR en temps réel NV1, NV2,
entérovirus, astrovirus
Non Diverses Lightcycler
Boivin, 2004 RT-PCR en temps réel influenza A,
influenza B, HRSV
Non Voies respiratoires Lightcycler
Kirschberg, 2004 PCR HBV génotypes A-F Non Sérum
Templeton, 2004 PCR en temps réel Influenza A,
Influenza B, HRSV
PIV1, PIV2,
PIV3, PIV4
Non Voies respiratoires iCycler IQ
Scheltinga, 2005 PCR en temps réel HMPV, RRSV Oui Voies respiratoires iCycler IQ
Gunson, 2005 RT-PCR en temps réel Influenza (A, B),
HRSV (A, B),
rhinovirus, PIV (1-3),
coronavirus (229E,
OC43, NL63)
Non Voies respiratoires ABI 7500 SDS
Rolfe, 2005 RT-PCR en temps réel Genotypes 1-6
de HCV
Non Serum Rotor-Gene 3000
Li, 2006 RT-PCR en temps réel GBV-C, WNV, dengue Non Plasma Mx3000P
Candotti, 2006 RT-PCR en temps réel HBV, B19V, HHV-8 Oui Plasma Mx3000P
HPV : papillomavirus humain ; FIV : virus de l’immunodéficience féline ; MeV : virus de la rougeole ; RUBV : virus de la rubéole ; B19V : parvovirus B19 ; HSV :
virus herpes simplex ; VZV : virus de la varicelle et du zona ; CMV : cytomegalovirus ; HHV : herpèsvirus humain ; NV : norovirus ; HRSV : virus respiratoire
syncytial ; HBV : virus de l’hépatite B ; PIV : virus parainfluenza ; HCV : virus de l’hépatite C ; WNV : virus West Nile ; GBV-C : virus dit de l’hépatite G.
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une détection fluorométrique LCx [23], des sondes chimio-
luminescentes pour la détection de produits amplifiés par
transcription [24, 27], et des sondes fluorescentes de type
TaqMan
®
(sondes doublement marquées par un rapporteur
en 5’ et un bloqueur en 3’) associées à une PCR en temps
réel utilisant uneADN polymérase ayant une activité nuclé-
asique [21]. Ces différents tests sont incapables de différen-
cier les uns des autres les génomes viraux détectés dans
l’échantillon analysé. Il faut alors avoir recours à des ampli-
fications secondaires individuelles spécifiques de chaque
virus afin d’identifier le génome viral à l’origine du signal.
Le second groupe est constitué de tests permettant la détec-
tion simultanée et l’identification immédiate d’ADN/ARN
viraux amplifiés dans une réaction multiple. Ces tests utili-
sent les techniques de (RT)-PCR conventionnelle, de Nasba
et plus communément de (RT)-PCR en temps réel. Les
produits amplifiés peuvent être directement identifiés par
une technique d’hybridation sur microsphères utilisant un
cytomètre de flux [20]. Ce procédé implique des étapes
d’amplification et de détection séparées qui s’avèrent com-
pliquées et longues. Récemment, Dineva et al. [28] ont
décrit une méthode rapide, simple et ne nécessitant que peu
d’équipement pour la détection visuelle et l’identification
de plusieurs produits d’amplification par hybridation à
l’aide de sondes oligonucléotidiques spécifiques immobili-
sées sur bandelette ou dipstick. Les tests utilisant la (RT)-
Tableau 2.Amplification génomique multiplex pour le dépistage des dons de sang
Auteurs Année Virus Système
d’amplification
Système de
détection
Témoin
interne
Type
d’échantillon
et volume
(ll)
Sensibilité/ml Génotypes
ou sous-
types
Caudai 1998 HCV,
GBV-C
RT-PCR Gel Non Plasma 100 780 copies
Vet 1999 VIH1,
VIH2
HTLV-I,
HTLV-II
PCR en temps
réel
Sondes
fluorescentes
multiples
Non Whole blood
200
10 copies
VIH1
VIH2
VHTL-II
A-G
A, D, SD
A, B
Mercier 1999 HCV,
HBV
RT-PCR en
temps réel
Sondes
fluorescentes
multiples
Non Plasma 200 50 copies -
Defoort 2000 VIH1,
HCV,
HBV
RT-PCR Cytométrie de
flux
Non Plasma 100 - -
Meng 2001 VIH1,
HCV,
HBV
RT-PCR en
temps réel
Fluorescence
unique
Oui Plasma 200 VHB 22-60 UI
VHC 61-112
UI
VIH 33-66 UI
A-E
1-5
A-G
De Baar 2001 VIH1 NASBA Sondes
fluorescentes
multiples
Non Plasma 200 10 copies M, N, O
Abravaya 2001 VIH1 M,
O, VIH2
PCR Fluorescence
unique
Oui Plasma
1000
VIH1 50
copies
VIH2 10
copies
A-G, O
Candotti 2003 VIH1,
HCV
TMA Fluorescence
unique
Oui Plasma 500 VIH1 15-20 UI
VHC 16-18 UI
A-E
1-4
Adami 2004 VIH1,
HCV
RT-PCR Fluorescence
unique
Non Plasma 200 VIH-1 100 UI
VHC 200 UI
B
3
Candotti 2004 VIH1,
HCV,
HBV
RT-PCR en
temps réel
Sondes
fluorescentes
multiples
Non Plasma 200 VIH1 680 UI
VHC 167 UI
VHB 30 UI
A-G
1-6
A-F
Koppelman 2005 VIH1,
HCV,
HBV
TMA Fluorescence
unique
Oui Plasma 500 VIH1 26 UI
VHC 4.6 UI
VHB 11 UI
B
1
A-G
Dineva 2005 VIH1,
VIH2,
HBV
RT-PCR en
temps réel
Bandes
spécifique
Non Plasma 200 VIH1 500 UI
VHC 125 UI
VHB 50 UI
A-F
1-6
A-G
HPV : papillomavirus humain ; FIV : virus de l’immunodéficience féline ; MeV : virus de la rougeole ; RUBV : virus de la rubéole ; B19V : parvovirus B19 ;
HSV : virus herpes simplex ; VZV : virus de la varicelle et du zona ; CMV : cytomegalovirus ; HHV : herpèsvirus humain ; NV : norovirus ; HRSV : virus
respiratoire syncytial ; HBV : virus de l’hépatite B ; PIV : virus parainfluenza ; HCV : virus de l’hépatite C ; WNV : virus West Nile ; GBV-C : virus dit de l’hépatite
G.
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PCR en temps réel ou le Nasba cumulent les avantages
d’être des systèmes fermés combinant amplification et dé-
tection en une seule réaction, de limiter les risques de
contamination en ne nécessitant pas de manipulation post-
amplification, d’avoir des temps de réaction réduits du fait
de cycles d’amplification courts et d’utiliser des sondes
fluorescentes associées à des systèmes de détection optique
particulièrement sensibles [18, 19, 22, 26].
RT-PCR multiplex en temps réel :
principe et développement
La majorité des tests multiplex pour la détection des géno-
mes viraux décrits dans la littérature utilisent la (RT)-PCR
en temps réel (tableau 1). L’amplification en temps réel
semble être largement acceptée du fait de sa sensibilité, de
sa capacité à produire des résultats rapidement et du risque
de contamination réduit mentionné plus haut. La rapidité de
ce type de méthode est essentiellement due à des cycles
d’amplification courts suffisants pour amplifier des pro-
duits de petite taille (60-120 paires de bases), à l’absence
d’étape de détection post-amplification et à l’utilisation des
marquages fluorescents fondés sur le transfert d’énergie de
fluorescence par résonance (fluorescence resonance energy
transfert, Fret) (figure 1A) et de systèmes sensibles de
détection de la lumière. Cinq techniques chimiques de
détection des produits amplifiés sont majoritairement utili-
sées en PCR en temps réel : 1) molécules fluorescentes se
fixant non spécifiquement sur l’ADN double brin (Sybr
®
Green 1, Yo-Pro1), 2) sondes oligonucléotidiques fluores-
centes adjacentes (HybProbes), 3) sondes oligonucléotidi-
ques doublement marquées sensibles aux 5’ nucléases (oli-
gosondes TaqMan
®
, oligosondes minor groove binding),
4) sondes oligonucléotidiques en épingle doublement mar-
quées (sonde beacon), 5) amorces fluorescentes de type
sunrise (Ampifluor
TM
)etscorpion [30]. Une des technolo-
gies la plus communément utilisée est la méthode TaqMan
®
fondée sur l’activité 5’exonucléasique de la Taq polymé-
rase dégradant un oligonucléotide sonde [30] (figure 1B).
Elle est largement employée pour la détection individuelle
qualitative et quantitative de divers génomes viraux [2, 3,
6-9, 11-16]. Son application à un format multiple peut
cependant s’avérer problématique.
L’adaptation de la technologie d’amplification en temps
réel à un format multiple a initialement été limitée par le
nombre de molécules fluorescentes disponibles avec l’uti-
lisation d’une source d’énergie lumineuse monochromati-
que, généralement de type laser. Un spectre de longueurs
d’onde réduit limite le nombre de molécules fluorescentes
qui peuvent être incluses dans une réaction sans interfé-
rence et donc la possibilité de distinguer clairement diffé-
rents signaux de fluorescence dus à la présence simultanée
de différents génomes viraux [2, 21]. Cependant, le déve-
loppement de tests PCR multiples en temps réel, capables
en une seule étape de détecter et d’identifier jusqu’à quatre
génomes viraux distincts a été rendu possible grâce à deux
avancées technologiques récentes. Premièrement, le déve-
loppement de nouveaux bloqueurs tels que les black hole
quenchers ou le 4-(4’diméthylamino-phénylazo)-benzène
(Dabcyl) capables d’absorber un spectre plus large d’éner-
gie fluorescente libérée par les rapporteurs et de restituer
cette énergie non pas sous forme de fluorescence potentiel-
lement interférente, mais sous forme de chaleur. Cela élar-
git l’éventail des molécules de marquage disponibles et
permet de sélectionner ces rapporteurs de façon à minimi-
ser le risque d’interférence entre leurs longueurs d’onde
d’émission. La seconde innovation a été la mise sur le
marché de plateformes de PCR en temps réel équipées soit
de plusieurs diodes lumineuses couvrant le spectre visible
entier, soit d’une lampe au tungstène ou halogène comme
source de lumière d’excitation couvrant un large spectre de
longueurs d’onde (350-750 nm) et associée à des cellules
photomultiplicatrices ayant un spectre de détection de 350
à 830 nm [31]. En associant ces innovations technologi-
ques, il devenait possible d’inclure dans une réaction
B
Site de clivage
ADN polymérase 5’3’ Brin ADN matrice
Brin néosynthétisé
A
Rapporteur Bloqueur
3’5’
Figure 1. Principe de détection des produits d’amplification par
PCR utilisant la méthode Taqman
®
. Lorsque, sur une sonde
oligonucléotidique doublement marquée, le fluorophore rapporteur
en 5’ est proche du bloqueur en 3’, ce dernier absorbe les
longueurs d’onde d’émission du rapporteur résultant de l’excitation
par la source lumineuse de l’instrument (flèche rouge) comme
illustré en (A). Le bloqueur restitue alors cette énergie sous forme
de lumière ou de chaleur. Lorsque rapporteur et bloqueur sont
séparés par une certaine distance après hydrolyse de la sonde par
l’activité exonucléasique de la Taq polymérase comme indiqué en
(B), le bloqueur n’exerce plus aucune influence et le rapporteur
émet à une longueur d’onde distincte (flèches noires) enregistrée
par l’instrument.
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