Florian CHAIN (UMR MICALIS) : Identification des
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Identification des fonctions bactériennes par une approche de banque génomique Florian CHAIN (Equipe ProbiHôte, Institut MICALIS, INRA, Jouy en Josas) Vitagora, colloque Flores d’intérêt, 7 octobre 2014 Microbiologie de l’Alimentation pour la Santé « Ecosystèmes » Mima2 Microscopie électronique et confocale Ecosystèmes microbiens alimentaires et intestinal: interactions fonctionnelles Pappso aliment-microbiote-hôte Analyse protéomique par spectrométrie de masse « BioSys » Biologie systémique et synthétique microbienne et biotechnologies Anaxem Animalerie de rongeurs axéniques CIRM-Levures Caractérisation et préservation des levures alimentaires « Risques » Mécanismes d’émergence et contrôle des pathogènes opportunistes d’origine alimentaire Métagénopolis SAMBO: Bio-Banque d’échantillons de microbiotes intestinaux METAQUANT: Séquençage Métagénomique à haut-débit METAFUN: Phénotypage haut-débit des clones métagénomiques Introduction Les micro-organismes sont depuis longtemps utilisés dans l’élaboration de produits destinés à la consommation humaine et animale. Levures et bactéries sont notamment utilisées pour leur capacités de ferment (boissons alcoolisées, yaourt, etc.) Depuis longtemps, également, il y a une volonté d’améliorer l’ensemble des procédés existants… et une recherche d’applications nouvelles. Existant : Une des voies d’amélioration possible est la recherche de souches plus performantes que celles classiquement utilisées (production de biomasse facilitée, enzyme plus performante, développement de saveurs plus agréables,…) Applications nouvelles : utilisation des capacités des microorganismes pour réaliser des opérations nouvelles ou différemment : méthanisation, bioremédiation, production de matières (polymères, gels,…), bactéries probiotiques… Introduction Dans certains cas, la fonction recherchée est bien caractérisée. Le mécanisme est décortiqué au niveau moléculaire… et dans d’autres cas, tout reste à faire. Un cas typique est celui des bactéries probiotiques : certaines bactéries ont des effets potentiellement bénéfiques mais pour autoriser leur commercialisation avec utilisation d’une allégation, il faut un accord de l’EFSA (European Food Safety Agency). De nombreux dossiers ont été soumis jusqu’à présent. Une des causes de rejet est le manque de lien de cause à effet. Ce lien peut être établi si le MODE d’ACTION est caractérisé. Deux cas de figure nous intéresseront ici : - recherche ciblée d’une fonction connue - recherche du support d’une fonction Banque génomique : définition Une banque génomique est une POPULATION de vecteurs (e.g. plasmides ou autres) contenant des fragment d'ADN divers (i.e. gènes) représentatifs d'un type cellulaire, par exemple une bactérie. Intérêt d’une banque génomique C’est un répertoire. Une banque comprend théoriquement l’ensemble de l’ADN d’intérêt. Et dans cet ensemble se trouve le support (la séquence) recherché. Mais pour localiser cet élément, il faut « lire le répertoire », et donc cribler la banque. Le criblage est rendu possible par le fait que les séquences insérées restent fonctionnelles. Principe de construction d’une banque Extraire l’ADN de l’organisme (ADN génomique) ou de la population ciblée (ADN méta-génomique). Le fractionner en éléments clonables. Insérer ces éléments dans les vecteurs Les faire se multiplier Valider la banque Organiser la banque ADN clivage insertion dans un vecteur réplication / validation / organisation Fragmenter l’ADN On cherche à avoir une banque contenant des fragments homogènes en taille. Pourquoi ? Chaque type de vecteur ne permet le clonage que d’une plage de taille donnée. Plasmides : entre 500 et 5 000 paires de bases Cosmides/Fosmides : entre 35 000 et 45 000 paires de bases BAC/YAC : Yeast/Bacterial Artificial Chromosome : environ 350 000 Solution possible : utilisation d’enzyme de restriction après la récupération de l’ADN. En théorie : oui. En pratique, à éviter car introduction d’un biais : les sites de restrictions ne sont pas répartis aléatoirement sur le génome. Fragmenter l’ADN LL T7 40kB 0X 10X 20X 30X 40X T7 Insertion dans les vecteurs La technique dépend du vecteur que l’on utilise Plasmides : habituellement, utilisation d’éléctroporation Cosmides/Fosmides : Extraits de phage lambda -> infection de E. coli et transfert du fosmide ou du cosmide Valider la banque Vérifier la non-redondance entre les clones. Extraction en parallèle des vecteurs insérés et obtention d’un profil de restriction enzymatique. Organiser la banque Taille de la banque Un génome bactérien : 2 à 3 millions de paires de bases p=1-e(N x ln(1-f)) Avec : p= probabilité de trouver une séquence donnée N= nombre de clones de la banque f = taille des inserts/ taille du génome Exemples pour un génomes de 3 millions de paires de bases en fixant p à 0.9999 (99,99%) Banque « plasmidique », f=5 000/3 000 000 Banque « fosmidique », f=40 000/3 000 000 N théorique = 5 521 N théorique = 686 Couverture = 9 X Couverture = 9 X Cribler la banque Utiliser ou mettre au point un modèle compatible avec le nombre de clones Passer au crible, validation des clones via répétitions Obtention des séquences des clones révélés Validation des séquences candidates Modèles de cribles Quelques exemples de modèles utilisés dans l’équipe Probihote Résistance à des stress : pH, température, sels biliaires Capacité d’inhibition d’autres micro-organismes Immuno-modulation : modèles HT29, Caco2 ou Peripheral Blood Mononuclear Cells Un exemple de recherche de fonction Notre souche modèle A2-165 de Faecalibacterium prausnitzii Bacille (Scanning Electron Microscopy) GRAM + Productrice de butyrate Extrêmement 1 µm (Platform MIMA 2, INRA, T. Meylheuc) sensible à O2 Duncan et al., 2002 Qin et al., 2010 Tap et al., 2009 Miquel et al, 2013a, b Un exemple de recherche de fonction Relation entre rechute et présence de F. prausnitzii chez des patients atteints du syndrôme de l’intestin irritable Sokol. et al., 2008 Effets anti-inflammatoires de F. prausnitzii? Principe du criblage basé sur HT-29 pour l’immunomodulation 10000 Bactérie mesure : Vivante ou fraction cellulaire Production IL8 TNFa 9000 8000 Cellules HT29 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 TNF 0ng/ml DMEM = milieu de culture des cellules HT29 BHI = milieu de culture de F. prausnitzii SN = surnageant de culture de F. prausnitzii TNF 4ng/ml BHI DMEM SN BHI DMEM SN BHI DMEM SN BHI DMEM 0 Cribler la banque Nombre de clones de la banque fosmidique de F. prausnitzii: 1 200 Utilisation des capacités de la plateforme Metafun, de Metagenopolis 4B-H12 1A-A5 3B-H2 4D-A5 3D-H9 2D-H10 3B-B1 1B-G12 1A-A3 3C-F8 2B-G1 3D-E8 3D-F10 4B-A11 4B-F9 3A-A8 2C-D8 3A-G9 4B-E10 2B-G5 3C-G5 1D-A1 2B-D2 3D-C6 2B-B5 1C-E3 2B-D7 1C-F8 3A-F6 2C-E3 3C-G9 3B-C5 15000 3A-A4 3A-E8 4C-D3 1C-H7 Résultats d’un criblage 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 Seuil à 8 000 pg/ml (environ) 10000 5000 0 5000 0 0 1C-A3 1B-G7 1D-G2 3B-D7 2C-C2 4C-E5 1B-D11 3A-E10 1A-C4 1A-F9 2D-H3 4D-B11 2C-B5 4D-F4 1C-F10 1A-E3 4B-G11 1B-C1 2B-C10 1A-G12 1D-G5 4B-C1 3B-B11 3B-G7 4B-A7 4D-B5 2B-B9 3A-A2 4A-G7 2A-H7 1D-H5 4C-A5 4D-A6 3C-A5 1A-E1 1B-A12 10000 15000 1C-A3 1B-G7 1D-G2 3B-D7 2C-C2 4C-E5 1B-D11 3A-E10 1A-C4 1A-F9 2D-H3 4D-B11 2C-B5 4D-F4 1C-F10 1A-E3 4B-G11 1B-C1 2B-C10 1A-G12 1D-G5 4B-C1 3B-B11 3B-G7 4B-A7 4D-B5 2B-B9 3A-A2 4A-G7 2A-H7 1D-H5 4C-A5 4D-A6 3C-A5 1A-E1 1B-A12 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 15000 1C-H7 4C-D3 3A-E8 3A-A4 3B-C5 3C-G9 2C-E3 3A-F6 1C-F8 2B-D7 1C-E3 2B-B5 3D-C6 2B-D2 1D-A1 3C-G5 2B-G5 4B-E10 3A-G9 2C-D8 3A-A8 4B-F9 4B-A11 3D-F10 3D-E8 2B-G1 3C-F8 1A-A3 1B-G12 3B-B1 2D-H10 3D-H9 4D-A5 3B-H2 1A-A5 4B-H12 Réalisation de réplicats 35000 30000 25000 20000 35000 30000 25000 20000 10000 5000 Sélection de quelques dizaines de clones identifiés au moins dans 2 réplicats sur 3 et validation manuelle Séquençage Identification de la région d’intérêt par séquençage des « fosmides candidats » (n=30) Opération facilitée si génome déjà séquençé Alignement des séquences Genome F. prausnitzii Identification de plusieurs régions d’intérêt, notamment des régions chevauchantes entre les différents clones. Environ une centaine de gènes candidats: présence d’opérons ? Perspectives Finaliser l’analyse entreprise avec F. prausnitzii A noter : approche identique menée également avec une autre bactérie modèle de notre laboratoire (L. casei BL23) Poursuite de la mise au point de la construction de banques non plus dans E. coli (Gram -), mais dans une bactérie Gram + Poursuivre le développement de méthodes de cribles adaptées aux fonctions recherchées Etendre la démarche aux ADNs métagénomiques Merci !!! Equipe ProbiHôte Contacts : [email protected] [email protected] Contrôles Test croissance = mesure de la croissance des clones par mesure de DO Test LDH = mesure de l’activité lactate dehydrogenase relarguée dans le surnageant. Est correlé avec dommages aux membranes (et lyse cellulaire) Test MTS = test d’activité métabolique de conversion du MTS en formazan. Conversion possible dans cellules métaboliquement active. Différentes options de clonage pour la banque génomique chez L. lactis Pour cette banque génomique, nous procéderons à une digestion enzymatique ménagée (e.g. TaqI, HindIII, etc.) de l’ADN génomique de la souche de façon à obtenir des fragments d’environ 3-5 kb qui seront clonés dans différents vecteurs et transformés directement chez L. lactis. Option A : Plasmide pGK (réplication rolling-circle, navette) • Avantages : Petit (donc facile à manipuler et à cloner des fragments de taille moyen), réplique chez des bactéries à Gram – (E. coli) et à Gram + (L. lactis) • Inconvénients : Réplication rolling-circle et donc pas très stable lorsqu’on clone des grands fragments Option B : Plasmide pIL252 réplication Thêta) • Avantages : Vecteur à bas nombre de copies et réplication Thêta : donc très stable • Inconvénients : Grand (~5 Kb) : donc plus difficile à cloner des fragments d’ADN de grand et/ou moyen taille, très difficile à purifier due à son bas nombre de copies Option C : TA-Cloning…. Option C : TA-Cloning Switch des vecteurs pGK ou pIL252 dans des vecteurs -T : ajout des extrémités -T dans les vecteurs linéarisés par une enzyme (principe Kit TOPO TA-Cloning) • Avantages : Ce protocole combine les avantages du clonage TA, qui permet la ligation directe d’un vecteur l’enzyme portant des extrémités –T, grâce à deoxynucleotidyl transferase (TdT) et dideoxythymidine triphosphate (ddTTP), avec un fragment d'ADN portant des extrémités –A, l’enzyme grâce Taq polymerase et du désoxyadénosine triphosphate (dATP) • Inconvénients : Faible % d’incorporation des –T et/ou -A Dans les 3 cas, nous estimons à ~3000-5000 clones (si fragments de 5-3 Kb, respectivement) pour couvrir environ 7 fois le génome Construction d’une banque de mutants Des difficultés dans la construction des banques génomiques sont très communs, mais souvent ne sont mentionnés que très sommairement dans la section M&M de la plupart des publications. Exemple : “A major technical difficulty was the inability to construct in E. coli gene banks representative of the entire B. subtilis chromosome....” - Kunst et al. The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390:249 (1997). Pour cela nous envisageons de construire en parallèle à la banque génomique, une banque de mutants de la souche, grâce à une méthode de mutagenèse insertionnelle efficace basé sur l’utilisation d’un plasmide thermosensible (nommé pG+host) (Maguin et al., 1996), et à un protocole mis au point pour le genre Lactobacillus dans notre laboratoire (Marion Lenoir, PhD. Student). -Maguin E, Prévost H, Ehrlich SD, Gruss A. Efficient insertional mutagenesis in lactococci and other gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 1996 Feb;178(3):931-5. Stratégie pour la construction d’une banque de mutants en utilisant le plasmide pGh:ISS1 Protocole pour L. casei BL23 (Marion Lenoir) pGh:ISS1 pGh8 et pGh8:ISS1 ISS1 Transformation dans L. casei BL23 Switch de T° de 30°C à 42°C pendant 8h Chromosome gène X inactivé Croissance dans MRS + tétracycline (tet) à 30°C Pour la souche : ISS1 Plasmides à tester en parallèle : pGh8:ISS1 et pGh9:ISS1 ISS1 pGh Points à optimiser et/ou déterminer : gène 1 ADN chromosomique Banque de mutants aléatoires % de transformation avec les 2 plasmides Temps et Switch de T° Etalement sur MRS et MRS+ tet à 30°C et 42°C Calcul de la fréquence d’insertion Vérification de l’insertion gène 1 gène 3 ADN chromosomique gène 2 ADN chromosomique gène 2 gène 3 Si ca ne marche pas Alternative : stratégie classique de construction de banques de mutants : e.g. pRV300 avec séquences ISS1 ou Transposons
