Blood Muscle cells - Université Paris-Est
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Développement d’un vaccin recombinant contre la trichinellose porcine Isabelle Vallée, Pascal Boireau UMR BIPAR, Laboratoire Santé Animale Pourquoi un vaccin anti-Trichinella chez le porc? Trichinella spp. : nématode parasite zoonotique des viandes Au plan mondial: porcs infestés sont la principale source de contamination humaine La lutte contre la trichinellose porcine permet de protéger les consommateurs Pourquoi un vaccin anti-Trichinella chez le porc? Trichinella spp. : nématode parasite zoonotique des viandes Au plan mondial: porcs infestés sont la principale source de contamination humaine La lutte contre la trichinellose porcine permet de protéger les consommateurs Santé publique Santé Animale Sécurité alimentaire Impact économique Pourquoi un vaccin anti-Trichinella chez le porc? Outils disponibles pour lutter contre Trichinella: Inspection des viandes à l’abattoir Réglementation EU, Norme ISO (OIE, Codex) = diagnostic direct - digestion artificielle d’échantillons de viande - coût élevé (> 1 euro/porc) - mise en place nécessite un système AQ (accréditation) - difficile à mettre en place à échelle mondiale Pourquoi un vaccin anti-Trichinella chez le porc? Outils disponibles pour lutter contre Trichinella: Inspection des viandes à l’abattoir Traitements thermiques - Congélation efficace si processus industriel - Cuisson à cœur - Pb des charcuteries (salaison, fumaison…) et mélange de viandes (consommé peu cuit) Pourquoi un vaccin anti-Trichinella chez le porc? Outils disponibles pour lutter contre Trichinella: Inspection des viandes à l’abattoir Traitements thermiques Pourquoi un vaccin anti-Trichinella chez le porc? Outils disponibles pour lutter contre Trichinella: Inspection des viandes à l’abattoir Traitements thermiques Vaccination? - protection des porcs plein air - Asie et Amérique latine : difficulté de mise en place du diagnostic direct et augmentation de la production de porcins - coût < diagnostic direct (estimé à moins de 1 €/porc) Trichinella chez son hôte Stomach Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Intestinal epithelium Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Muscle cells Larve L1 musculaire Trichinella chez son hôte Stomach Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Intestinal epithelium Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Muscle cells Larve L1 musculaire Trichinella chez son hôte Stomach Intestinal epithelium Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Réponse immunitaire mucosale = protectrice Muscle cells Larve L1 musculaire Trichinella chez son hôte Stomach Intestinal epithelium Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Réponse immunitaire mucosale = protectrice Th2 Muscle cells Larve L1 musculaire Trichinella chez son hôte Stomach Intestinal epithelium Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Adultes Muscle cells Larve L1 musculaire Réponse immunitaire mucosale = protectrice Th2 Mixte Th1-Th2 puis prédominance Th2 IL-10 IFN-g IgG1 / IgG2 IgA Picherot et al, 2007 Les 1er essais vaccinaux anti-Trichinella Stomach Intestinal epithelium Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Muscle cells Larve L1 musculaire Réponse immunitaire mucosale = protectrice 95% protection avec antigène L1NN + adjuvant complet de Freund Marti, Murrell and Gamble, 1987 Les 1er essais vaccinaux anti-Trichinella Stomach Intestinal epithelium Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Muscle cells Larve L1 musculaire Réponse immunitaire mucosale = protectrice 95% protection avec antigène L1NN + adjuvant complet de Freund Mise en évidence du rôle des Ag L1NN dans la protection mais utilisation: - adjuvant de Freund - extrait d’antigène total Marti, Murrell and Gamble., 1987 Les 1er essais vaccinaux anti-Trichinella Stomach Intestinal epithelium Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Muscle cells Larve L1 musculaire Réponse immunitaire mucosale = protectrice => 82% protection avec Ag L1M et adjuvant « émulsion eau dans huile », voie intra-musculaire Sélection de: - adjuvant efficace et sûr: Montanide ISA - voie d’inoculation (IM) Mais : souris OF1, extrait d’antigène total Deville et al., 2005 , Aucouturier et al., 2001 Développer un vaccin recombinant efficace et sûr chez le porc domestique - Sélectionner les antigènes cibles pertinents - Formulation du vaccin - association des antigènes - Sélection de l’adjuvant - Voie d’inoculation - Mise en place d’un schéma vaccinal - Tester l’efficacité par test d’épreuve Sélection des antigènes cibles pertinents Trichinella spiralis = 15 800 protéines ? Approche de sélection des antigènes précoces, exprimés pendant la phase intestinale Mitreva et al., 2011 Sélection des antigènes cibles pertinents Trichinella spiralis = 15 800 protéines ? Approche de sélection des antigènes précoces, exprimés pendant la phase intestinale Stomach Intestinal epithelium Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Réponse immunitaire mucosale = protectrice Muscle cells Larve L1 musculaire Sélection des antigènes cibles pertinents Stomach Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Intestinal epithelium Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Muscle cells Larve L1 musculaire 411 TsGST24 NBL1 TsGST24 NBL2 Boireau et al., 2007, Patent; Liu et al., Parasitology 2007; 2008; Fu et al., Vet. Parasitol. 2005. Sélection des antigènes cibles pertinents Stomach Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Intestinal epithelium Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Muscle cells Larve L1 musculaire 411 TsGST24 NBL1 TsGST24 NBL2 411 Induit une seroconversion chez souris et chez porc TsGST24 Les Glutathion S-Transferase parasitaires induisent une protection - GST Shistosoma mansoni immunoprotectrice chez rats, souris - GST Fasciola hepatica immunoprotectrice chez ovin, bovin Boireau et al., 2007, Patent; Liu et al., Parasitology 2007; 2008; Fu et al., Vet. Parasitol. 2005. Sélection des antigènes cibles pertinents Stomach Larve L1 L2, L3, L4 musculaire TsGST24 Intestinal epithelium Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées 411 Muscle cells Larve L1 musculaire TsGST24 NBL2 NBL1 411 Induit une seroconversion chez souris et chez porc TsGST24 Les GST parasitaires induisent une protection NBL2 Fonction cystatine = inhibiteur de cystéine protéases Cystatine des nématodes parasites: modulation de réponse immunitaire de l’hôte Boireau et al., 2007, Patent; Liu et al., Parasitology 2008; Fu et al., Vet. Parasitol. 2005. Sélection des antigènes cibles pertinents NBL1 - Expression spécifique du stade L1 Nouveau-Né - Protéase à sérine - Antigène précoce, immunodominant Peptide répété 4 fois : PSSGSRPTYP + un peptide très proche : PSSGSRPTSP Domaine PYTGSRPT Peptide répété 2 fois : PYTGSRPT Domaine trypsine Domaine PSSGSRPTYP I-TASSER Novafold + Protean 3D Yang et al. , 2015 Liu et al. 2001; Liu et al. 2003 Boireau et al. Brevet, 2006 Sélection des antigènes cibles pertinents NBL1 - Expression spécifique du stade L1 Nouveau-Né Protéase à sérine Antigène précoce, immunodominant Implication dans la morphogenèse de la cellule nourricière de Trichinella (Pr Liu Minguyan) Translocation de NBL1 vers les noyaux des cellules hôtes lors de l’installation de Trichinella dans les cellules musculaires et formation de la cellule nourricière D.Despommier Sélection des antigènes cibles pertinents Stomach Intestinal epithelium Larve L1 L2, L3, L4 musculaire Adultes Blood Larves L1 Nouveaux-Nées Muscle cells Larve L1 musculaire Réponse immunitaire mucosale = protectrice ? 4 Protéines recombinantes sélectionnées - NBL2 - TsGST 24 - 411 - NBL1 Essais vaccinaux chez le porc Schéma vaccinal Adjuvant: Montanide ISA 206 Vaccine 1000 ML T. spiralis Boost J0 Challenge J28 J14 Autopsy J56 J42 J90 J69 Serum Muscles Serologie ELISA IgG1: évaluation réponse Th2 IgG2: évaluation réponse Th1 Protection Digestion artificielle Charge parasitaire (Larve Musculaire) Essai vaccinal avec cocktail protéique 4 Protéines recombinantes - NBL2 - TsGST 24 - 411 - NBL1 L1M/g Vaccination Test d’épreuve Contrôle négatif - - Contrôle positif - X Porcs vaccinés X X 80 70 60 50 40 Diaphragme Langue Masseters Triceps brachial Biceps femoral 30 20 10 0 3244 3413 Contrôles négatifs 3317 3435 3411 Contrôles positifs 3266 3412 Porcs Vaccinés 3386 Essai vaccinal avec cocktail protéique 4 Protéines recombinantes - NBL2 - TsGST 24 - 411 - NBL1 L1M/g Réduction globale de 95% de la charge parasitaire 80 70 60 50 40 Diaphragm Tongue Masseters Brachial triceps Femoral biceps 30 20 10 0 3244 3413 Negative controls 3317 3435 Positive controls 3411 3266 3412 3386 Vaccinated pigs Essai vaccinal avec cocktail protéique sans NBL1 Protein cocktail: - NBL2 - TsGST24 - 411 - No NBL1 L1M/g Vaccination Challenge Negative controls - - Positive controls - X Vaccinated pigs X X 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Negative controls (n=2) Positive controls (n=3) Vaccinated pigs (n=3) Essai vaccinal avec cocktail protéique sans NBL1 Protein cocktail: - NBL2 - TsGST24 - 411 - No NBL1 L1M/g Global reduction of 44.95% of ML burden 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Negative controls (n=2) Positive controls (n=3) Vaccinated pigs (n=3) Essai vaccinal avec NBL1 seul Vaccination Challenge Negative controls - - Positive controls - X Vaccinated pigs X X 250 Diaphragm Tongue Masseter Triceps Brachii Femoral muscle Larvae per Gram 200 150 100 50 0 5 6 Negative controls 8 9 10 11 Pig identification Positive controls 12 1 2 3 Vaccinated pigs Essai vaccinal avec NBL1 seul 250 Diaphragm Tongue Masseter Triceps Brachii Femoral muscle Réduction globale de 72.19% de la charge musculaire Larvae per Gram 200 150 100 50 0 5 6 Negative controls 8 9 10 11 Pig identification Positive controls 12 1 2 3 Vaccinated pigs Réponse sérologique : IgG1 Kinetic of specific IgG1 antibodies production against recombinant proteins Vaccin associant les 4 protéines recombinantes Vaccine Boost Vaccin NBL1 Challenge Vaccine 3,000 3,000 2,500 2,500 2,000 2,000 1,500 1,500 1,000 1,000 Boost Challenge 0,500 0,500 0,000 0,000 J0 J14 J28 J42 J56 J70 J90 J0 J14 J28 Contrôles négatifs Forte réponse IgG1 (humorale) induite par les 2 vaccins Réponse plus précoce avec les 4 protéines recombinantes J42 J56 J70 J90 Réponse sérologique : IgG2 Kinetic of specific IgG2 antibodies production against recombinant proteins Vaccin associant les 4 protéines recombinantes Vaccine Boost Vaccin NBL1 Challenge Vaccine 3,000 3,000 2,500 2,500 2,000 2,000 Boost Challenge 1,500 1,500 1,000 1,000 0,500 0,500 0,000 0,000 J0 J14 J28 J42 J56 J70 J90 J0 J14 J28 J42 Contrôles négatifs Forte réponse IgG2 (cellulaire) induite par les 2 vaccins Réponse plus précoce avec les 4 protéines recombinantes Vaccin NBL1 induit réponse IgG2 plus précoce que IgG1 J56 J70 J90 Réponse cytokinique systémique Expression des mRNA des cytokines de type Th2 au niveau splénique Vaccin associant les 4 protéines recombinantes 0,80 IL5 IL6 IL13 * 0,70 0,60 0,50 0,40 * 0,30 0,20 0,10 0,00 Neg control Positive control Recomb vaccine Cocktail vaccinal induit une réponse cytokinique systémique IL5, IL6 Profil Th2 Symbol (*) indicates a significative difference compared to negative control (Mann-Whitney test, p<0.001). Conclusion Vaccin basé sur 4 protéines recombinantes induit une protection des porcs avec forte réduction charge parasitaire (95%) Protection associée à production IgG1, IgG2, IL5 et IL6 mixte Th1-Th2, proche immunité naturelle Rôle majeur de NBL1 dans la protection Conclusion Vaccin basé sur 4 protéines recombinantes induit une protection des porcs avec forte réduction charge parasitaire (95%) Protection associée à production IgG1, IgG2, IL5 et IL6 mixte Th1-Th2, proche immunité naturelle Rôle majeur de NBL1 dans la protection Perspectives Améliorer le taux de protection pour obtention de porcs « Trichinella free » Comprendre comment la vaccination induit la protection: - blocage de l’émission de L1NN? - blocage de l’installation dans la fibre musculaire? Conclusions / Perspectives 1er vaccin recombinant aussi efficace contre Trichinella spiralis chez le Porc (espèce cible) Prototype vaccinal qui offre des garanties - efficace; - « safe » - standardisable Ouvre des perspectives de nouvelles stratégies de contrôle des nématodes parasites Association vaccin anti-Trichinella avec le vaccin recombinant anti-Taenia solium? Animal Experimentation units: ENVA: Benoît LECUELLE, Thomas LILIN, Francis MOREAU Anses Ploufragan: Roland CARIOLET Partenaires: Nicolas VERSILLÉ Sébastien DEVILLE
