Génétique bactérienne – Les plasmides bactériens

Génétique bactérienne
Les plasmides bactériens
Stéphane CORVEC, Laboratoire de Bactériologie, UFR de Médecine - Nantes, 2009
1- Plasmides : généralités et fonctions
1.1- Généralités- définition :
Molécules d’ADN bicaténaire, circulaires en général
Facultatifs (1 à 3% de l’ADN total)
Extra-chromosomiques le plus souvent
Capacité de réplication autonome (réplicons)
Transmission stable au cours des générations
Codent pour des fonctions de meilleure adaptation de
la bactérie hôte à l’environnement
Maintien d’autant mieux qu’il procure
un avantage sélectif
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1- Plasmides : généralités et fonctions
1.2- Fonctions diverses non indispensables mais utiles à
l’adaptation de l’hôte à l’environnement :
Fertilité, mobilisation d’autres éléments génétiques
Résistance aux antibiotiques
Chaînes dégradatives et métaboliques particulières
supplémentaires
Facteurs de virulence : toxines, adhésines
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1- Plasmides : généralités et fonctions
1.2- Fonctions diverses :
Plasmides conjugatifs : pili sexuel facteur F
Plasmides de Résistance : facteur R résistance aux
antibiotiques et métaux lourds
Plasmides métaboliques : gènes permettant l’utilisation de
certains nutriments (citrate, soufre, urée)
Plasmides de virulence : E. coli enterotoxinogène (tourista)
- plasmide : facteur de colonisation
- plasmide : toxine
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2- Plasmides : structure et organisation
2.1- Structure (plasmides circulaires)
Taille très variable de 1 à 400 kb ou plus
Formé d’ADN double brin : 3 formes
Forme I : circulaire covalente fermée
Forme II : circulaire, relâchée, un des 2 brins est coupé
Forme III : forme linéaire (deux brins coupés)
Techniques
d’étude
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2- Plasmides : structure et organisation
Forme II : forme relachée
OC Open Circle
Forme I : Forme normale
surenroulée
CCC Covalent Close
Circle
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2- Plasmides : structure et organisation
2.2- Organisation des plasmides
Flexible et variable suivant le plasmide
Comporte une zone obligatoire de réplication
Réplicon
Peut comporter aussi :
Une région de transfert (opéron tra) chez les
plasmides conjugatifs : pili et conjugaison
Des éléments génétiques mobiles ou non (IS, Tn, Int)
Gènes divers (résistance aux antibiotiques, etc…)
Plasmides conjugatifs : même espèce ou
différentes, conséquences et implication
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2- Plasmides : structure et organisation
Facteur F
Operon tra
IS, Tn
Réplication
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2- Plasmides : structure et organisation
Dissémination de
l’information
génétique
= gènes de résistance
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3- Plasmides : méthodes d’étude
3.1- Méthodes génétiques :
La (les) fonction(s) est (sont) liées au plasmide
porteur:
Transferts plasmidiques
Cure plasmidique
Couplage des 2 méthodes
3.2- Méthodes physiques :
Isolement et purification de plasmide
Ultracentrifugation à l’équilibre de densité
(CsCl + bromure d’ethidium) - colonne
Electrophorèse en gel (avec ou sans enzymes de
restriction)
Hybridation ADN-ADN (Southern blot)
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3- Plasmides : méthodes d’étude
3.1- Méthodes génétiques :
Transferts plasmidiques
Hémolysine
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3- Plasmides : méthodes d’étude
3.1- Méthodes génétiques :
Cure plasmidique
Elimination du plasmide par croissance dans des conditions
inhibant spécifiquement sa réplication
Plasmide perdu et perte de fonction
Ex. : résistance aux antibiotiques, marqueur de virulence
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3- Plasmides : méthodes d’étude
Pouvoir pathogène : Bacillus anthracis repose principalement
sur la présence d'une capsule et sur la synthèse de toxines.
Plasmides de Bacillus anthracis
–pXO1
•174 kb portent les gènes codant
–Le facteur oedématiant (cya)I
–Le facteur léthal (lef)III
–L’antigène protecteur (pag)II
–pXO2
•90 kb portant les gènes codant
–La synthèse de la capsule (capA, capB, capC)
.
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3- Plasmides : méthodes d’étude
3.2- Méthodes physiques :
3.2.1- Isoler et visualiser le plasmide : extraction d’ADN
1- Rupture intégrité paroi bact.
2- Dégradation des protéines et précipitation
3- Récupération ADN et purification
=> Séparer le chromosome du plasmide
Nombreuses techniques => lyse alcaline
Lyse : altération des enveloppes bactériennes
Alcaline : dénaturation ADN
Forme surenroulée, circulaire, double brin :
moins de rupture et renaturation possible
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3.2.2- Techniques d’extraction
Ultracentrifugation à l’équilibre de densité : CsCl + bromure
d’ethidium
Techniques modernes :
- lyse
- colonnes : rapide
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3.2.3- Electrophorèse conventionnelle
Confection du gel (Agarose, Acrylamide)
Chargement des échantillons d’ADN
Migration dans un champ électrique constant
Coloration au BET (Bromure d’éthidium)
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3.2.3- Electrophorèse après restriction
Collection de fragments de nombre et tailles définis
Fonction des GC% (site de l’enzyme et ADN)
Grande spécificité Grande reproductibilité (RFLP)
Linéariser le plasmide
Comparaison
du contenu plasmidique
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Typage moléculaire :
profils de bande par restriction
Profil plasmidique brut
Profil plasmidique après restriction
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4- Plasmides : réplication (1)
4.1- Généralités :
Réplication de type θ uni ou bidirectionnelle (oriV)
Réplication de type rolling circle ouverture d’un
brin, synthèse 5’-3’ et déplacement du brin coupé
Le plasmide fait largement appel pour sa synthèse à
l’équipement enzymatique de la bactérie hôte
Diversité des régulations du nombre de copies
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4.2- Plasmides : réplication de type θ
Monodirectionnelle
Bidirectionnelle
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4.3- Réplication de type rolling circle
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4.3- Réplication de type rolling circle
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4.5- Plasmides : réplication
Les fonctions de la région oriV
Spectre d’hôte : une ou plusieurs espèces
Régulation du nombre de copies (1 à des centaines) :
stringente ou rélâchée
Répartition des copies entre les bactéries filles (par)
Incompatibilité des plasmides
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5- Plasmides : classifications (1)
Selon la taille ou le phénotype
Peu de valeur, car ne tient pas compte de la plasticité
du plasmide
Selon la taille, conjugatif ou non, nombres de copies
Petits plasmides, non conjugatifs, nombre élevé de
copies, réplication relachée (peu contrôlée)
Gros plasmides, conjugatifs, faible nombre de copies :
réplication stricte
Phénomène de mobilisation (un petit plasmide non
conjugatif est mobilisé et transféré par un plasmide
conjugatif)
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5- Plasmides : classifications (2)
5.1- Groupes d’Incompatibilité :
Certains plasmides ne cohabitent pas durablement dans
la même bactérie (F’gal et F’lac), culture en milieux
non sélectifs (glucose) Elimination de l’un des
plasmides => compétition
L’incompatibilité est un phénomène général
Deux plasmides incompatibles ont un ancêtre commun
et des systèmes de réplication ou de répartition
semblables
Leurs ADN sont fortement homologues (réplication)
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5- Plasmides : classifications (3)
5.2- Types piliaires :
Plasmides conjugatifs : pili sexuels récepteurs de
phages
Pili identiques Sensibilité aux mêmes phages
Moins discriminants que les groupes d’incompatibilité :
groupe piliaire F comprend différents groupes
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6- Plasmides : quelque plasmides célèbres
Facteur F
Prototype du gros plasmide conjugatif à petit nombre de
copies (découverte de la conjugaison)
Facteurs R
Plasmides de résistance aux antibiotiques (conjugatifs le
plus souvent)
pBR322
Vecteur de clonage très utilisé aux premier temps du
clonage et du génie génétique
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6- Plasmides
Gènes de
réplication
et
répartition
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7- Plasmides : clonage génétique
Intérêts :
Biotechnologies production
de médicaments (plasmides
recombinants)
Application pour le
séquençage
Etc…
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