THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l’Université Paul Sabatier – Toulouse III Discipline : Physiopathologie moléculaire, cellulaire et intégrée Présentée et soutenue par Pierre VANTOUROUT Le 30 Juin 2009 ROLE DE L’ECTO-F1-ATPASE DANS LA RECONNAISSANCE DES CELLULES TUMORALES PAR LES LYMPHOCYTES T VGAMMA9/VDELTA2 Pr Bertrand PERRET Dr Julie DECHANET-MERVILLE Dr Francis HARAUX Pr Monique CAPRON Dr Eric CHAMPAGNE Dr Laurent MARTINEZ Dr Xavier COLLET JURY Président Rapporteuse Rapporteur Examinatrice Examinateur Invité Invité Ecole doctorale : Biologie - Santé - Biotechnologie Unité de recherche : INSERM U563, Département LML, CPTP Directeurs de Thèse : Dr Eric CHAMPAGNE, Dr Laurent MARTINEZ « As an adolescent I aspired to lasting fame, I craved factual certainty, and I thirsted for a meaningful vision of human life - so I became a scientist. This is like becoming an archbishop so you can meet girls. » M Cartmill A ma mère… REMERCIEMENTS Je tiens à remercier tout d’abord les membres de mon jury de thèse Madame le Docteur Julie Déchanet-Merville pour m’avoir fait l’honneur d’être rapporteuse de ma thèse. Je vous remercie pour vos commentaires très gentils sur mon travail de thèse ainsi que pour la discussion lors de la soutenance qui était enrichissante. Je suis très content que vous ayiez pu venir malgré le contretemps et j’ai apprécié nos discussions. Monsieur le Docteur Francis Haraux pour m’avoir fait l’honneur d’être également rapporteur de ce travail. Je vous suis très reconnaissant d’avoir accepté malgré le peu de points communs entre vos travaux et mon sujet de thèse. Je vous remercie également pour vos commentaires, pour la discussion très intéressante ainsi que pour votre aide sur les propriétés enzymatiques de l’ATP synthase, qui m’a été très précieuse lors de la rédaction de mon manuscrit. Madame le Professeur Monique Capron pour m’avoir fait l’honneur d’assister à ma soutenance de thèse bien que l’université ne vous ait pas retenue comme rapporteuse. Je vous remercie d’avoir fait tout ce trajet avec un timing très serré, ainsi que pour votre gentillesse et la discussion intéressante que nous avons pu avoir au cours de et après la soutenance. Monsieur le Professeur Bertrand Perret pour m’avoir fait l’honneur de présider mon jury de thèse et pour vos commentaires, questions et remarques extrêmement pertinents et très utiles. Je vous remercie également de m’avoir accueilli au sein du département LML ainsi que pour votre gentillesse, votre implication et l’intérêt que vous avez porté à mes travaux, et votre disponibilité. Monsieur le Docteur Eric Champagne, mon directeur de thèse. Comme tu l’as dit nous avons passé de nombreuses années ensemble avec des hauts et des bas dans nos recherches mais je pense (et j’espère !) que dans l’ensemble nous avons fait du très bon travail. Je te remercie de m’avoir fait découvert les γδ et d’avoir entretenu mon intérêt pour l’immunologie bien que ce ne soit pas ma formation initiale. Je te suis également reconnaissant de m’avoir accordé ta confiance dans le développement de ces projets ainsi que de m’avoir laissé une grande autonomie qui me sera je pense très utile par la suite. Je te remercie également pour tes mots très gentils pendant la soutenance qui m’ont beaucoup touché. J’espère que tes nouveaux projets porteront tous leurs fruits et que les travaux que nous avons menés à bien ouvriront de nouvelles directions fructueuses. Monsieur le Docteur Laurent Martinez, mon co-directeur de thèse. Merci d’avoir cru en moi, de m’avoir soutenu et de t’être grandement impliqué dans mes travaux, bien que très éloignés de tes perspectives de recherche. Je te remercie également pour ta disponibilité de tout instant et pour toutes les discussions que nous avons pu avoir, scientifiques ou non. Un grand merci également pour tes commentaires très gentils lors de la soutenance. Je te souhaite le meilleur pour ta nouvelle équipe et j’espère que la voie Ecto-F1-ATPase / P13Y2 (coquille volontaire !) continuera de fournir des résultats toujours aussi intéressants, tout comme tes nombreux nouveaux projets. Monsieur le Docteur Xavier Collet pour avoir participé activement à mon jury. Je te remercie pour toutes tes questions (nombreuses comme toujours !) très intéressantes et pour ton implication dans ce sujet et le grand intérêt que tu lui as porté. Je te remercie également de m’avoir accueilli pendant toutes ces années au sein de ton équipe, pour ta disponibilité de tout instant (malgré ta double casquette !) et pour ton soutien tout au long de ma thèse. Sans oublier ta bonne humeur et ton humour, bien sûr. Je remercie tous les membres présents et passés du Thème A Tous les chercheurs de l’équipe. Je vous remercie tous pour votre gentillesse, votre disponibilité et pour votre soutien sur un projet bien éloigné de vos thématiques de recherche. Désolé de vous avoir assomé avec toute cette immunologie ! François pour ton humour, ta gentillesse, et désolé mais tu n’auras pas réussi à me convertir aux Macs ! Ha, et puis désolé pour la bio mol aussi, mais tu le sais, c’est ma grande passion ! Mêmes excuses pour Ronald, et je te souhaite le meilleur dans ta nouvelle direction et j’espère que l’aventure Cerenis sera pleine de succès. Stéphane pour tout ton temps et ta patience pour tous ces concepts d’enzymologie qui me semblaient bien obscurs, ainsi que ta bonne humeur permanente. Dernière (mais pas des moindres), merci Christine pour ta gentillesse, tous tes conseils (labo et hors labo) et pour ta disponibilité de tout instant. Je te suis infiniment reconnaissant de m’avoir énormément aidé pendant les périodes difficiles, je ne l’oublierai jamais. Je te souhaite de tout cœur le meilleur pour tes nouveaux projets de recherche et je suis sûr que tes petites goutelettes t’apporteront de nombreux résultats passionants avant que tu t’envoles vers de nouveaux horizons plus « verts » ! Tous les post-doctorants (et affiliés) du laboratoire. Véro, un grand MERCI en Arial 56 gras souligné (oui je ne le fais pas pour de vrai sinon la mise en page va me faire hurler). On ne se sera pas cotoyés très longtemps mais ce fut un réel plaisir. Merci pour toutes ces soirées organisées avec brio et pour ton dévouement pour toujours être Sam ! Un grand merci également pour tes corrections très efficaces, et pour t’être intéressée à mon projet. Je te remercie pour ta gentillesse, ton soutien, et ton aide dans les coups durs. J’espère que tu auras très bientôt ton poste (satané gamma factor) car tu le mérites amplement. Je t’attends donc très bientôt à Londres, sans faute ! Gérald (saluuuuuuuut ! namasteeeee !) merci pour ton soutien et tous tes conseils. Je te souhaite le meilleur pour la suite et j’espère que tu finiras par obtenir un poste car tu le mérites vraiment et tu seras sans aucun doute un excellent chercheur « officiel » sur qui tout le monde peut compter. J’ai beaucoup apprécié toutes les discussions que nous avons pu avoir au cours de ces quelques mois. Annelise (ma presque compatriote !) merci pour ton soutien, ton humour et ton extrême gentillesse. Encore toutes mes félicitations pour ton nouveau bonheur, et je te souhaite le meilleur dans ton futur parcours. Safouane, un grand merci à toi (le seul hormis notre petite équipe à faire de l’immuno, je me sentais moins seul !) pour tous tes conseils très avisés et l’intérêt que tu as porté à mes travaux. Je te souhaite toute la réussite que tu mérites pour tes nouveaux projets (même s’il ne s’agit plus d’immuno, traître !). Michela, notre italienne préférée ! Ton passage très rapide dans l’équipe restera je pense dans toutes les mémoires. Je n’oublierai certainement pas ton infinie gentillesse et ta bonne humeur permanente qui ont fait partie des petits rayons de soleil du labo. Il semble que tu t éclates dans ton nouveau poste qui est plus près de ce que tu attends et aimes. Je te souhaite le meilleur pour cette nouvelle direction. Finally, I would like to thank Jayati who joined our team for 2 years. It was a real pleasure to meet you and work with you. Your everlasting good mood was very pleasant and helpful. Thank you for all your advices and your great help on this project. I wish you and Ananda the best for your new positions and hope you will be able to get back to India soon and find a position there. On second thought, maybe I should have written this in French since you are almost fluent now! Je remercie également tous les techniciens de l’équipe. Corinne pour ta gentillesse, pour ces bons moments de rigolade au cours des soirées (un peu de verveine peut-être ?). Je te remercie pour ton aide inestimable (notamment ton expertise de l’HPLC !) et ta disponibilité permanente. Et bien sûr pour avoir veillé sur nous en tant que (ex) pro de l’hygiène et sécurité ! (je suis sûr que cette douche nécessite un contrôle supplémentaire, il faudrait qu’on s’en occupe avant que je parte !). Je te souhaite le meilleur pour tes nouveaux projets. Chris, pour ta gentillesse, tes conseils, et ton moral d’acier ! Merci d’avoir été présente et également d’avoir assuré avec perfection le bon fonctionnement de nos réserves ! A toi aussi je souhaite le meilleur pour tes nouveaux projets et je suis sûr que tu exporteras avec brio la hyène attitude ! Super Michel pour ta bonne humeur constante et toute ton aide, notamment à mon arrivée dans le labo. Merci aussi pour toutes ces discussions très agréables que nous avons pu avoir sur tous les sujets possibles et imaginables. Je te souhaite une très bonne fin de carrière et une belle et heureuse retraite amplement méritée ! Et enfin Guillaume, merci pour ton amitié et ton soutien, ainsi que pour cette mémorable finale de l’euro (dois-je rappeler que tu as fait une lamentable performance à l’euro-foot ? Très décevant de la part d’un tel expert en sports !). Je te félicite pour ta persévérance malgré la difficulté à trouver un poste, et j’espère que tu finiras par en obtenir un « pour de vrai » car tu le mérites très largements. Je te souhaite bonne route ainsi qu’à Emilie, et si tu comptes faire un saut à Londres à l’occasion c’est sans problème ! Je n’oublie pas les petites nouvelles du laboratoire. Céline félicitations pour ton DEA et mes meilleurs vœux de réussite pour la poursuite de tes études (avec l’activité clinique en plus !). Je suis sûr que tout se passera bien et j’espère que tu pourras poursuivre la carrière de ton choix. Et que tu resteras dans la recherche, bien sûr ! Manuela (bouh !), un grand merci pour ta gentillesse, ton soutien, et ton aide à beaucoup de niveaux. Je te félicite également pour ton DEA. A l’heure où j’écris ces lignes tu ne sais pas encore si tu auras une bourse ministérielle mais je crois en toi et je suis sûr que tu donneras le meilleur comme tu l’as fait pendant ton DEA (oui, je sais, on ne dit plus DEA et ça fait quatre fois déjà que je l’écris, mais ceci est dû à mon grand âge bien sûr). Je suis sûr que tu feras une très bonne doctorante et je te souhaite le meilleur. Tu peux bien sûr compter sur moi si tu as besoin de quoi que ce soit, et puis je ne serai pas bien loin, tu viens quand tu veux ! Un petit chapitre spécial pour mes deux ex-thésardes préférées ! Bin oui, je n’allais pas vous placer ni dans les thésards, chères Docteurs, ni dans les post-docs du labo, et puis vous méritez largement votre section rien qu’à vous ! Flo, merci pour tous tes conseils et ton soutien surtout ces derniers mois, pendant la douloureuse phase d’accouchement du présent bébé. Je n’oublierai pas ton humour, ta bonne humeur et ton côté déjanté qui te va si bien. Je suis content que tu aies pu faire ce qui te plaisait à l’issue de la thèse et que tu aies trouvé un bon post-doc où tu t’éclates visiblement. Tout le meilleur pour la suite, et on se voit de toute façon très bientôt à Amsterdam ! Ma petite Camcam (ou devrais-je dire Mère Noël ?), un très grand merci pour toutes ces années passées ensemble au labo. On a suivi le même parcours (complètement atypique on pourrait dire) et ça nous a pas trop mal réussi ! Je n’oublierai jamais ton humour, ta gentillesse, ta bonne humeur permanente et tous tes conseils. Et tes fringues, bien évidemment ! Il y a eu du relâchement sur la fin d’ailleurs, probablement la faute à Lilian ! Tous mes vœux de réussite pour la poursuite de ta carrière, je suis content que tu aies pu trouver toi aussi un très bon post-doc. J’ai beaucoup admiré ta persevérance et tes facultés d’adaptation malgré un sujet pas évident et une situation parfois très délicate. Ton petit lutin te souhaite le meilleur, accompagnés de vœux de bonheur pour toi et le grand chef Lilian (rien à voir avec les indiens). On se revoit très bientôt (plusieurs fois !) et vous êtes tous les deux les bienvenus à Londres quand vous voulez, évidemment. TADAAAAAA ! Et pour finir, mes très chers compagnons, les inestimables, inimitables et irremplaçables thésards du thème A ! Aurélie, halala le dossier… la spécialiste ès-diplomatie ! Bon bon, je plaisante… un grand merci à toi pour ton soutien à beaucoup de niveaux, pour tous ces bons moments en soirée et pour nos nombreuses discussions. Je suis vraiment content de t’avoir rencontrée et d’avoir travaillé avec toi (très partiellement, mais nous avons deux articles en commun quand même, la classe !). Hormis ta diplomatie (oui oui, j’insiste) je retiendrai de toi ta gentillesse et ta timidité qui a très vite disparu (la faute à Véro ? Je suis sûr que les dates coïncident) pour laisser place à « la petite » que nous aimons tous. Je te souhaite une très bonne fin de thèse ete si tu as besoin de quoique ce soit tu n’hésites pas, c’est la tradition (j’ai suffisamment embêté Camille pour le savoir !). Pas de faux espoirs, je participerai activement à ton anti-thèse, et promis je serai là pour la soutenance ! Je suis sûr que tout se passera très bien pour toi et j’espère que tu trouveras très vite un post-doc qui permettra à Fred de t’accompagner. Tous mes vœux de bonheur à tous les deux (c’est pour quand ? OK OK j’ai rien dit !). Et quand vous voulez vous passez me voir à Londres bien sûr ! Pequeñita Claudia ! Oui hum, bon, je vais arrêter là l’espagnol, j’ai vraiment besoin de m’y remettre. Un grand merci pour ta gentillesse, ton humour (et tes magnifiques chansons !) et pour ton soutien et ton aide sur tous les plans. Je te souhaite à toi aussi une très bonne fin de thèse qui approche (t’en es oùùùùùù ? T’as fini le chapitre endothélium ???? Oui moi aussi je fais ma Véro, y’a pas de raisons !) et bien sûr je ferai le maximum pour assister à ton triomphe ! Et puis un très bon retour au pays et je vous souhaite à toi et Pablo le meilleur pour la suite. Vous êtes tous les deux formidables et je suis très heureux d’avoir pu vous cotoyer ! Et si jamais vous revenez en cette bonne vieille Europe j’espère vous voir à Londres tous les deux ! Emmanuel (cher Docteur !) merci pour ta gentillesse, ton humour et ton soutien. Je te souhaite également une bonne fin de thèse et j’espère que tes travaux se concrètiseront bientôt. Bonne chance pour la suite de ta carrière et j’espère que tu resteras dans la recherche car tu sembles vraiment t’y épanouir et y être brillant. Zeina, tu démarres tout juste ta thèse donc bon courage et accroche toi. Tout le meilleur pour la suite. Je profite enfin de cette partie dédiée au thème A pour remercier nos « membres invités » de l’ICR/Chimie/Fac/etc (bon désolé mais c’est compliqué votre histoire !). Denis (ouuuuuyaaaaah. Oui bon, je ne sais pas comment retranscrire notre salut officiel par écrit). J’ai vraiment beaucoup apprécié de te cotoyer (à mi-temps ? enfin partiellement, enfin bref) pendant ces quelques mois. Merci pour ta sympathie et ton soutien. Bon courage pour la rédaction de ta thèse et je te souhaite le meilleur pour la suite. Greg, très heureux également de t’avoir connu. On a bien rigolé et passé de bonnes soirées ensemble. J’espère vraiment que les galères s’arrêteront vite et que tu trouveras un poste le plus rapidement possible. Et n’oublie pas le logo de l’association internationale des toilettes, ça peut toujours servir (ainsi que l’albatros. Ou la mouette, je ne sais plus). Edern, rencontre très brève et sporadique mais j’ai apprécié de discuter et rigoler avec toi. Bon courage pour la suite et j’espère que tu pourras trouver rapidement un job après ton M2. Je remercie également tous les membres du thème B Et plus particulièrement : Fabienne (même si tu n’es pas venue à ma soirée de thèse !). Un immense merci pour ton soutien, ta disponibilité et ton aide inestimable dans les périodes difficiles. Je te remercie également pour ta bonne humeur, ton humour, et toutes nos discussions autour d’un café ou d’une cigarette. J’ai décidé comme tu le sais de laisser tomber les macaques pour mon postdoc (oui, tu n’allais pas y couper désolé !), la souris c’est bien plus porteur… Je te souhaite du fond du cœur le meilleur pour la suite et j’espère vraiment que nous resterons en contact. Muriel, merci pour ta bonne humeur, ton dynamisme et tous ces bons moments à la table café. Je te remercie également de t’être intéressée à mes travaux, et pour ton aide irremplaçable pour les dossiers de soutenance (c’est combien de rangs A extérieurs déjà ? Et puis c’est quoi cette histoire de prix de thèse ?!). Tout le meilleur pour la suite, pour cette nouvelle équipe avec Laurent ! Armelle, un grand merci à toi pour tous tes conseils et ton soutien. J’espère que tes projets se développeront et que tu seras bientôt à la tête d’une armée de thésards qui sauteront partout en salle de culture lorsqu’ils écriront leur thèse ! Enfin je ne pense pas que cela arrivera avec Audrey… si ? Merci à toi Dreydrey (un p’tit cookiiiiiiiie ?) pour ta gentillesse, ton écoute et ton soutien. Je te souhaite bon courage pour la poursuite de ta thèse qui sera brillante je suis sûr. Tous mes vœux à toi et Thibault qui est également quelqu’un de bien que j’ai eu plaisir à rencontrer bien que brièvement. Anne, merci à toi également pour ta gentillesse, ton humour, et les nombreuses pauses clope passées à discuter. Et un grand merci d’avoir récupéré mon PV tu as assuré ! Bon courage pour la fin de ta thèse à toi aussi. Clo, merci pour ta gentillesse, ta bonne humeur et ces concours endiablés de mots croisés. Merci également pour m’avoir dépanné si souvent pour de nombreux réactifs, qu’aurais-je fait sans toi ? Tu viens de quitter le département à l’heure où j’écris ces lignes donc je te souhaite le meilleur pour ta nouvelle direction. Marianne, un grand merci pour ton humour et ta bonne humeur permanente bénéfique et très communicative. Bon courage pour la suite et j’espère que tu trouveras un vrai poste très prochainement. Hélène, tu es la prochaine sur la liste ! Malheureusement je ne pourrai pas assister à ta thèse, mais je suis content que tu te sois finalement sortie des péripéties de date et autres formalités ! Je suis sûr que tout se passera bien et je te souhaite le meilleur pour ton post-doc. Peut-être en Angleterre, qui sait ? Jean-Phiphi, merci à toi pour tous tes conseils et nos discussions. Et toutes mes félicitations pour ton poste, ct toutes mes félicitations pour ton poste, c’est génial !. Pour finir tous mes remerciements également à Patrick, Nicole, Monique, Elvire, Emmanuelle et Françoise que j’ai beaucoup moins cotoyés mais que je n’oublie pas ! Pour finir un grand merci aux autres habitants du bâtiment C (les dom-tom) Justine et son équipe de choc du plateau de lipidomique, Véronique et Séverine. Je n’ai pas eu à utiliser vos talents mais j’ai apprécié de vous cotoyer au cours de ces années. J’espère que le plateau se développera et je vous souhaite le meilleur pour la suite. Tous les membres de l’équipe de Jean-Luc Davignon, Michel, Myriam et Jean-Frédéric. Ce fut un plaisir de vous rencontrer et de partager les locaux avec vous. Et pour finir notre très chère Yvette qui prend tant soin de nous et sans qui nous serions perdus ! Je te remercie pour ta gentillesse, ta disponibilité et toute ton aide dans les démarches administratives. A bientôt à Londres alors ? Je tiens à remercier tous les membres de l’IFR et du CPTP que j’ai rencontrés au cours de ces 6 années Merci à tous pour votre accueil et votre aide. Je pense notamment aux meilleures responsables de plateau de cytométrie (ma deuxième maison) et de d’imagerie de France (voire du monde !) Fatima (ainsi que Valérie) et Sophie. Merci pour votre aide inestimable dans la réalisation de ces travaux, pour votre gentillesse et pour toutes les discussions que nous avons pu avoir. Un grand merci également d’avoir participé à ma soirée de thèse, j’ai été très touché par votre présence. Je tiens également à remercier les autres responsables des plateaux qui ont participé directement et indirectement à mes travaux. Hélène et Claudie, Jacques et Nordine (les McGuyver de l’U563 !) ainsi que Joël Teyssier, notre invité spécial de la pause déjeuner ! J’ai également une pensée pour tous les gens que j’ai cotoyés depuis la fac ou mon arrivée à l’U563. Damien, Cécile, Marinela, Hicham, Nico, Gaëtan, Frédérique Gaits, Hélène Tronchère, Loïc Dupré et son équipe (notamment Ronan et Fanny), Bernard Payrastre et bien d’autres personnes que je n’oublierai pas. Un grand merci spécial à Anne Huchenc-Champagne ! Merci infiniment d’avoir été aussi disponible le jour de ma thèse tu mérites vraiment une médaille (ou une casquette, c’est vrai). Merci pour ta gentillesse et ton soutien. Je remercie finalement les enseignants de l’UAG et de l’UPS qui ont grandement contribué à mon désir de m’orienter vers la recherche. Voilà donc pour la partie travail ! Encore merci à tous et tous mes vœux pour vos futurs travaux. Et de tout cœur, bon courage aux futurs impétrants. Si j’ai réussi à écrire ma thèse (moi et mon horreur de l’écriture…), vous pouvez tous le faire ! Je remercie également tous mes amis. Djébraïl, trop longtemps perdu de vue mais récemment retrouvé, merci pour ton soutien et ton amitié indéfectible. Tous mes autres amis de collège et lycée, Florent, Julien, Frédo, Nicolas et tous les autres que je n’oublie pas. Mes amis de l’université (UAG et UPS) et notamment Loïc, Charles, Arthur, Aline, Hayat, Anne-Claire, Greg et tous les autres. Nous avons tous pris des chemins différents mais je suis heureux d’avoir croisé votre route et je vous souhaite tout le bonheur possible. Une mention spéciale à Donia pour être venue assister à ma thèse, ainsi qu’à toi et Magda pour être venues à ma soirée. Merci pour votre amitié, votre gentillesse et votre soutien. Vous venez quand vous voulez à Londres ! Mes amis de l’auberge, Jean-Pierre, Bachir (mon bro !), François, Matthieu et Mathieu (Dupontt et Dupont), Dom le tenancier, Pascal, Reda, Arnaud et tous les autres ! Egalement mes nouveaux amis de phdcomics (dont je conseille la lecture à tout le monde !), Catherine, Emily, Caoimhe, Fiona, Erwin, Michael, Joel, John et les autres. You all have my deepest thanks for all your advices, help and support. I wish you the best for your PhD, postdocs or jobs. I really look forward to meeting some of you soon and I hope I will be able to meet all of you guys one day. Je terminerai ces remerciements par ma famille. Un grand merci à mon papa de m’avoir aidé et accompagné pour mes études. Le résultat final n’est pas celui originellement prévu, mais le titre est le même après tout. Merci à toi pour ton aide et ton amour et je sais que je n’en serais pas là aujourd’hui sans toi. A mes deux sœurs adorées, merci pour votre soutien et votre amour. Vous me manquez beaucoup et j’espère que vous me rendrez visite à Londres. SOMMAIRE 1 Sommaire ABREVIATIONS ET ACRONYMES p.5 RESUME p.10 AVANT-PROPOS p.11 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE p.17 Chapitre I : Le système immunitaire p.17 1) Généralités p.18 1.1) Organes et cellules p.18 1.2) Molécules fondamentales du système immunitaire : quelques exemples p.21 1.3) Déclenchement de la réponse immunitaire p.23 2) Les lymphocytes T p.25 2.1) Développement p.27 2.2) Les sous-populations T conventionnelles p.30 3) Les lymphocytes T non-conventionnels p.33 3.1) Les lymphocytes NKT p.34 3.2) Les lymphocytes MAIT p.37 Chapitre II : Les lymphocytes T γδ p.41 1) Généralités p.42 2) Développement : la priorité aux lymphocytes T γδ p.44 3) Fonctions des lymphocytes T γδ : multiplicité et diversité p.48 3.1) Fonctions effectrices p.49 3.2) Fonctions régulatrices p.53 4) Lymphocytes T γδ et pathologies : dualité de leurs rôles 4.1) Pathogènes intracellulaires p.55 p.55 4.1.1) Bactéries et parasites p.55 4.1.2) Virus p.56 4.2) Pathologies inflammatoires et auto-immunes p.58 4.3) Cancer p.60 5) Antigènes reconnus par les TCR γδ : une diversité déroutante p.62 5.1) Molécules apparentées au CMH p.63 5.2) Antigènes non-peptidiques p.67 2 Sommaire 5.2.1) Phosphoantigènes p.67 5.2.2) Aminobisphosphonates et alkylamines p.70 5.3) L’Ecto-F1-ATPase p.72 Chapitre III : L’ATP synthase p.75 1) La F1Fo ATP synthase mitochondriale p.76 1.1) Généralités p.76 1.2) Structure p.77 1.3) Mécanisme enzymatique p.78 1.4) Pathologies liées à l’ATP synthase p.80 2) L’Ecto-F1-ATPase p.80 2.1) Ecto-F1-ATPase, la même enzyme que l’ATP synthase mitochondriale ? p.81 2.2) Une localisation inattendue et toujours inexpliquée p.84 2.3) Nouvelle localisation, nouveaux rôles p.87 2.3.1) Métabolisme du HDL-cholestérol p.88 2.3.2) Survie et prolifération des cellules endothéliales p.90 2.4) Synthétiser ou ne pas synthétiser, telle est la question p.93 3) Une fascinante enzyme qui n’a pas encore révélé tous ses secrets p.96 RESULTATS EXPERIMENTAUX p.99 Partie I : Interaction entre l’Ecto-F1-ATPase et le CMH-I p.99 1) Introduction p.100 2) Article 1 p.101 3) L’interaction est-elle spécifique d’un ou plusieurs isotypes de CMH-I ? p.109 3.1) Introduction p.109 3.2) Matériel et méthodes p.110 3.3) Résultats p.114 3.4) Discussion p.117 Partie II : L’ApppI, un prototype de phosphoantigène nucléotidique p.121 1) Introduction p.122 2) Article 2 (Soumis) p.124 Partie III : Présentation des phosphoantigènes par l’Ecto-F1-ATPase p.141 1) Introduction p.142 2) Article 3 (Manuscript en préparation) p.143 3 Sommaire 3) Modulation de l’activité enzymatique de l’ATP synthase par l’ApppI p.150 3.1) Introduction p.150 3.2) Matériel et méthodes p.151 3.3) Résultats et discussion p.152 Partie IV : Etude du métabolisme nucléotidique à la surface des cellules p.157 1) Introduction p.158 2) Article 4 p.159 3) Rôle de l’ANT dans la conversion ADP Æ ATP à la surface des cellules p.168 3.1) Introduction p.168 3.2) Matériel et méthodes p.169 3.3) Résultats et discussion p.170 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES p.173 1) Interaction entre CMH-I et Ecto-F1-ATPase p.174 1.1) HLA-B et autres partenaires potentiels p.174 1.2) Implications fonctionnelles et physiopathologiques p.175 1.3) Rôle du CMH-I dans l’expression de l’Ecto-F1-ATPase ? p.177 2) Mécanisme de présentation des phosphoantigènes p.178 2.1) Voie(s) de transit de l’Ecto-F1-ATPase de la mitochondrie à la surface p.178 2.2) Protéines impliquées dans le routage/chargement de l’Ecto-F1-ATPase ? p.179 3) Métabolisme des phosphoantigènes p.180 3.1) Mécanisme d’internalisation de l’ApppI p.180 3.2) Nucleotide pyrophosphatase p.183 3.3) Autres phosphoantigènes et dérivés nucléotidiques p.184 4) Interactions entre phosphoantigènes, Ecto-F1-ATPase et TCR Vγ9/Vδ2 p.186 4.1) Liaison de l’ApppI sur l’Ecto-F1-ATPase p.186 4.2) Reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase par le TCR Vγ9/Vδ2 p.187 5) Spécificité d’espèce de la présentation des phosphoantigènes p.189 BIBLIOGRAPHIE p.191 ANNEXES (Article 5) p.207 ABSTRACT p.223 4 Sommaire ABREVIATIONS ET ACRONYMES 5 Abréviations et acronymes AA : AlkylAmines AAC : ADP, ATP Carrier AB : Acide Bongkrékique ABCC5 : ATP-Binding Cassette sub-family C member 5 ADCC : Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNc : ADN complémentaire AK : Adenylate Kinase AMP, ADP, ATP : Adénosine mono-, di- ou triphosphate ANT : Adenosine Nucleotide Translocase apo : apolipoprotéine ApppI : gamma-P-(3-méthyl-but-3-en-1-yl)-5'-adénosine disodium triphosphate ARN : Acide RiboNucléique ARNi: ARN interférent ARNm : ARN messager ARNt : ARN de transfert β2m : beta-2-microglobuline BCR : B Cell Receptor (récepteur B à l’antigène) CCR : CC chemokine Receptor CD : Cellule Dendritique (ne pas confondre avec CD suivi d’un numéro qui correspond à la nomenclature Cluster de Différenciation utilisée pour les marqueurs de surface) CDR : Complementarity Determining Region CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité (de classe I ou II) CMV : Cytomégalovirus CPA : Cellule Présentatrice d’Antigènes CSF : Colony Stimulating Factor CXCR : CXC chemokine Receptor DETC : Dendritic Epidermal T Cell DMAPP : DiMéthyl-Allyl PyroPhosphate DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DO : Densité Optique DOXP : DeOxy-Xylulose-Phosphate DN : Double Négatif DP : Double Positif 6 Abréviations et acronymes EAE : Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EBV : Epstein Barr Virus EEA1 : Early Endosomal Antigen 1 ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay EMAP II : Endothelial Monocyte-Activating Polypeptide II ETP : Early T cell Progenitor EtPP : Ethyl PyroPhosphate FPP : Farnesyl PyroPhosphate GFP : Green Fluorescent Protein HDL : High Density Lipoprotein HDMAPP : Hydroxy- DiMéthyl-Allyl PyroPhosphate (aussi appelé HMBPP) HLA : Human Leukocyte Antigen HMBPP : Hydroxy-Méthyl-Butényl PyroPhosphate HPLC : High Pressure Liquid Chromatography Hsp : Heat shock protein HSV : Herpes Simplex Virus HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cells ICAM-1 : Inter-Cellular Adhesion Molecule-1 ICOS : Inducible CO-Stimulator IFN : Interféron Ig : Immunoglobuline IHH : Immortalized Human Hepatocytes IL : Interleukine IMGT : Système d’information international en ImMunoGénéTique IPP : Isopentenyl PyroPhosphate ITAM/ITIM : Immunoreceptor Tyrosine-based Activation/Inhibition Motif KGF : Keratinocyte Growth Factor KIR : Killer Inhibitory Receptor LAK : Lymphokine Activated Killer LAMP-1 : Lysosomal Associated Membrane Protein-1 LB : Lymphocyte B LDH : Lactate DesHydrogenase LDL : Low Density Lipoprotein LIR : Leucocyte Ig-like Receptor 7 Abréviations et acronymes LT : Lymphocyte T MAIT : Mucosal Associated Invariant T MAPL : Mitochondria Anchored Protein Ligase MICA/B : MHC class I polypeptide-related sequence A/B MttP: Microsomal triglyceride transfer Protein MR1 : MHC-I-Related protein 1 MRP5 : Multidrug Resistance Protein 5 MSC : Mesenchymal Stem Cell NADH : NicotinAmide Dinucléotide (forme réduite) NARP : Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinitis Pigmentosa N-BP : Aminobisphosphonates NCL : Neuronal Ceroid Lipofuscinosis NDPK : Nucleoside DiPhosphoKinase NK : Natural Killer NKT : Natural Killer T NKR : Natural Killer Receptor (aNKR : activateur, iNKR : inhibiteur) NPP : Nucleotide PyroPhosphatase OSCP : Olygomycin Sensitivity-Confering Protein PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cells PCR : Polymerase Chain Reaction PEP : PhosphoEnol Pyruvate PHA : PhytoHémAgglutinine Pi : Phosphate inorganique PK : Pyruvate Kinase PPADS : Pyridoxal-Phosphate-6-Azophenyl-2',4'-DiSulfonate PPD : Purified Protein Derivative Ppt1 : Palmitoyl protein transferase 1 RAET : Retinoic Acid Early inducible Transcript RAG1/2 : Recombination Activating Gene 1/2 RE : Réticulum Endoplasmique RFP : Red Fluorescent Protein ROCK-I : Rho-associated Coiled-coiled Kinase I ROS : Reactive Oxygen Species RPMI : Roswell Park Millenium Institute 8 Abréviations et acronymes RPS : Résonance Plasmonique de Surface RT-PCR : Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction SEA : Staphylococcal Enterotoxin A SH : Sérum humain SIDA : Syndrôme de l’ImmunoDéficience Acquise SVF : Sérum de Veau Fœtal SP : Simple Positif TCR : T Cell Receptor (récepteur T à l’antigène) TdT : Terminal deoxyribonucleotidyl Transferase TGF : Transforming Growth Factor TIL : Tumor Infiltrating Lymphocytes TLR : Toll-Like Receptor TNF : Tumor Necrosis Factor Tom : Translocase of outer membrane TT : Toxine Tétanique TUBAg : TUBerculosis Antigen ULBP : UL16-Binding Protein VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine 9 RESUME La biologie des lymphocytes T (LT) Vγ9/Vδ2 est encore très peu comprise. Cette souspopulation non-conventionnelle, spécifique à l’homme et certains primates supérieurs, joue un rôle important dans la défense de l’organisme contre des pathogènes intracellulaires (tels que mycobactéries et plasmodium). La reconnaissance des cellules infectées implique de petites molécules, appelées phosphoantigènes, formées d’un radical alkyl et un pyrophosphate. Les plus communs sont l’isopentenyl pyrophosphate (IPP, intermédiaire de la voie du mévalonate) et l’hydroxy-methyl-butenyl pyrophosphate (HMBPP, intermédiaire de la voie DOXP, voie alternative de synthèse de l’IPP chez certains organismes). Leur reconnaissance est mal caractérisée mais requiert un contact cellulaire, suggérant qu’une structure de présentation est nécessaire. Les LT Vγ9/Vδ2 sont également capables de lyser des lignées tumorales in vitro. L’implication de l’IPP a été établie et l’équipe a récemment identifié l’Ecto-F1-ATPase, une forme de l’ATP synthase mitochondriale exprimée à la surface, comme antigène participant à la reconnaissance des cellules tumorales. Cette thèse a eu pour but de mieux caractériser le rôle de l’Ecto-F1-ATPase dans cette reconnaissance. Nous avons montré que l’Ecto-F1-ATPase interagit en surface des cellules avec les molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I. HLA-B est préférentiellement impliqué dans cette interaction et diminue fortement l’activation les LT Vγ9/Vδ2. Cette interaction joue donc un rôle important dans le contrôle de la réactivité de ces lymphocytes et renforce le lien entre Ecto-F1-ATPase et immunité. Dans une deuxième partie, nous avons étudié les mécanismes de reconnaissance de l’ApppI, un dérivé nucléotidique de l’IPP. Contrairement aux phosphoantigènes classiques, cette molécule est résistante aux phosphatases terminales, son mécanisme de reconnaissance est indirect et implique une activité de type Nucleotide pyrophosphatase, et elle peut être capturée par des cellules et les rendre sensibles aux LT Vγ9/Vδ2. Pour finir, l’ApppI nous a permis de démontrer que l’Ecto-F1-ATPase est impliquée dans la reconnaissance des phosphoantigènes. Nos travaux représentent une avancée importante dans la compréhension des mécanismes de reconnaissance des cellules tumorales par les LT Vγ9/Vδ2. L’Ecto-F1-ATPase représente la première molécule directement impliquée dans la présentation des phosphoantigènes. Ces résultats pourraient à terme permettre le développement de stratégies d’immunothérapie anticancéreuse. 10 AVANT-PROPOS 11 Avant-propos Le système immunitaire est composé d’un très grand nombre de populations cellulaires différentes coopérant pour assurer la protection de l’organisme contre les pathogènes. Les lymphocytes T jouent un rôle central dans cette protection, en participant directement à l’élimination des pathogènes et des cellules infectées ainsi qu’à la mise en place de la réponse immunitaire. Ils sont en effet capables de contrôler la différenciation et l’activation des autres populations formant ce système extrêmement complexe. Le compartiment T se compose luimême d’une grande variété de cellules ayant des phénotypes et des fonctions bien distincts. Parmi celles-ci, on distingue les lymphocytes T αβ, dits conventionnels, et les γδ, qui font partie des lymphocytes T non-conventionnels avec des sous-populations αβ particulières, les cellules NKT et MAIT. Découverts au milieu des années 80, ces lymphocytes restent extrêmement mal connus à l’heure actuelle. Ceci est notamment dû aux nombreuses différences entre les sous-populations γδ humaines et murines, ce qui rend leur étude délicate. Ils font partie de l’immunité dite innée, et à ce titre font partie des premières lignes de défense contre les pathogènes. Ils participent également à l’homéostasie tissulaire et jouent probablement un rôle important dans l’immuno-surveillance de la transformation tumorale. Chez l’homme et certains primates « supérieurs », la grande majorité des lymphocytes T γδ circulants expriment un TCR composé d’une chaîne Vγ9 appariée à une chaîne Vδ2. Ils ont initialement été décrits pour participer à la réponse dirigée contre Mycobacterium tuberculosis, l’agent responsable de la tuberculose. Ils sont activés par des antigènes particuliers appelés phosphoantigènes, qui sont des molécules de très faible poids moléculaire (<1kDa) et dont la structure générale comprend une courte chaîne alkyl et un pyrophosphate. Ces molécules ont été identifiées il y a 15 ans, mais le mécanisme exact permettant leur reconnaissance par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 n’a jamais été identifié. Cette reconnaissance fait probablement intervenir une structure de présentation antigénique. Dans le cas de toutes 12 Avant-propos les autres sous-populations T, ce rôle est rempli par les molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH), classiques ou apparentées. Néanmoins, en ce qui concerne les lymphocytes T γδ, il est communément admis qu’elles ne sont pas impliquées. Ces lymphocytes sont également capables de lyser de nombreuses lignées tumorales in vitro. De nombreuses études ont cherché à identifier l’antigène reconnu et plusieurs candidats ont été proposés, bien qu’aucun travail n’ait pu mettre en évidence de reconnaissance directe de ces antigènes. Récemment, les phosphoantigènes ont également été impliqués dans cette reconnaissance. Mon équipe d’accueil est multidisciplinaire, avec trois thématiques principales. Deux d’entres elles sont centrées sur le métabolisme du cholestérol : les mécanismes et récepteurs impliqués dans son absorption intestinale (thématique dirigée par Xavier Collet), et la captation hépatique des lipoprotéines de haute densité (HDL). Récemment, les travaux de Ronald Barbaras et Laurent Martinez ont permis l’identification de l’Ecto-F1-ATPase, une forme de l’ATP synthase mitochondriale exprimée à la surface des cellules, comme récepteur majeur le l’apolipoprotéine A-I, protéine majoritaire des HDL, à la surface des hépatocytes. En collaboration avec ce groupe, la dernière thématique de l’équipe, menée par Eric Champagne, mon directeur de thèse, a permis d’identifier l’Ecto-F1-ATPase comme antigène participant à l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par les cellules tumorales. Les données obtenues montrent que ce complexe enzymatique est capable d’activer spécifiquement ces cellules et qu’il lie directement leur récepteur antigénique. Cette thèse s’inscrit dans la poursuite de ces travaux. L’Introduction Bibliographique sera composée de trois grands chapitres. La première partie sera dédiée à une vue globale du système immunitaire et particulièrement centrée sur 13 Avant-propos les lymphocytes T, afin de fournir des éléments utiles pour la compréhension de la biologie de la sous-population Vγ9/Vδ2. Elle s’achèvera par une description plus détaillée des souspopulations αβ non-conventionnelles qui partagent quelques caractéristiques communes avec les lymphocytes T γδ. Le deuxième chapitre proposera une revue des connaissances actuelles sur les lymphocytes T γδ. Tous les aspects de leur physiologie, de leur développement aux antigènes qu’ils reconnaissent, seront abordés. Enfin, l’objet de cette thèse ayant été de mieux comprendre le rôle de l’Ecto-F1-ATPase dans la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2, la dernière partie de l’introduction sera dédiée à une brève description de l’ATP synthase mitochondriale. Elle sera également destinée à présenter un résumé des données récentes sur l’Ecto-F1-ATPase, qui participe à de nombreuses fonctions cellulaires en plus de son rôle dans l’immunité antitumorale. La partie Résultats Expérimentaux présentera les données obtenues au cours de cette thèse. Nous avons tout d’abord cherché à mieux caractériser l’expression de l’Ecto-F1ATPase à la surface d’un nombre important de lignées cellulaires et nous avons montré qu’elle peut interagir avec les molécules de la famille du CMH-I. Cette interaction entraîne un masquage d’épitopes de l’Ecto-F1-ATPase, ce qui indique que l’expression de ce complexe à la surface des cellules peut ne pas être détectée par des méthodes directes. HLA-B, un des isotypes classiques de CMH de classe I, semble préférentiellement impliqué et responsable d’une forte inhibition de la stimulation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Nous avons ensuite étudié les propriétés antigéniques de l’ApppI, un analogue d’ATP nouvellement décrit et dont la structure est similaire à celle de dérivés nucléotidiques de phosphoantigènes identifiés dans des extraits mycobactériens. Nos résultats indiquent que 14 Avant-propos l’ApppI n’est pas un antigène au sens propre du terme puisqu’il n’active pas directement les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. En revanche, il possède des propriétés uniques qui le différencient des phosphoantigènes classiques et suggèrent que les dérivés nucléotidiques pourraient jouer un rôle important dans le mécanisme de présentation des phosphoantigènes. L’ApppI nous a également permis de réconcilier les données impliquant les phosphoantigènes et l’Ecto-F1-ATPase dans la reconnaissance des cellules tumorales. En effet, nous avons pu montrer qu’elle est capable de présenter des phosphoantigènes aux lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Ces données sont également en faveur d’une implication majeure des dérivés nucléotidiques dans les mécanismes de reconnaissance des phosphoantigènes, puisque l’ApppI est capable de lier l’ATP synthase de façon stable. Pour finir, la dernière partie présentera les données obtenues en collaboration avec la thématique développée par Laurent Martinez sur le métabolisme nucléotidique à la surface des cellules. Cette collaboration m’a permis de développer des connaissances théoriques et pratiques sur l’activité enzymatique de l’ATP synthase et s’est avérée utile pour l’étude des propriétés de l’ApppI. Elle ouvre également des perspectives potentiellement intéressantes pour l’étude du métabolisme des dérivés nucléotidiques des phosphoantigènes. Enfin, la partie Discussion et Perspectives sera consacrée à une conclusion générale de nos résultats, placés dans le contexte des données de la littérature. De futurs travaux, visant à caractériser de façon plus précise les mécanismes impliqués dans l’expression et la reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase ainsi que dans la présentation des phosphoantigènes par ce complexe, seront proposés. Bonne lecture… 15 16 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE CHAPITRE I LE SYSTEME IMMUNITAIRE D’une vue d’ensemble aux lymphocytes T non-conventionnels 17 Introduction I : Le système immunitaire Ce chapitre d’introduction est destiné à offrir une vue globale du système immunitaire. Il sera concentré sur la description succincte du système immunitaire des vertébrés supérieurs (les organismes les précédant dans l’évolution ne disposant généralement que de certains de ses éléments ou de systèmes « primitifs ») et des partenaires cellulaires et moléculaires participant à son organisation. Il fait intervenir de nombreux organes et une incroyable diversité de populations cellulaires, qui interagissent avec la totalité des cellules de l’organisme. Son rôle premier est fondamental : défendre l’organisme (le soi) contre les agents pathogènes (le non soi), ainsi que l’épurer des cellules stressées, endommagées ou cancéreuses (le soi modifié). Il participe également au maintien de l’intégrité des tissus en régulant leur homéostasie. Ses caractéristiques le rendent malheureusement responsable d’effets secondaires indésirables comme le développement de pathologies telles que les maladies auto-immunes ou inflammatoires, ainsi que le rejet de greffes. L’objet de cette thèse étant l’étude d’une sous-population lymphocytaire T non-conventionnelle particulière, les lymphocytes T Vγ9/Vδ2, nous partirons d’une vision globale et succincte des différentes composantes du système immunitaire pour finalement atteindre la description plus détaillée des lymphocytes T non-conventionnels, introduction au chapitre II qui portera sur les lymphocytes T de type γδ. 1) Généralités 1.1) Organes et cellules Les organes impliqués dans la genèse et le fonctionnement du système immunitaire sont généralement divisés en deux catégories : les organes lymphoïdes primaires (ou centraux) et secondaires (ou périphériques). Les organes primaires (moelle osseuse et thymus) correspondent aux lieux de développement et de différenciation des cellules du système immunitaire alors que les organes secondaires (rate, ganglions lymphatiques et formations 18 Introduction I : Le système immunitaire lymphoïdes associées aux tissus telles que les amygdales ou les plaques de Peyer) sont des centres fonctionnels, assurant la rencontre des lymphocytes avec les antigènes et le développement de la réponse immunitaire dite adaptative. Les cellules du système immunitaire (Figure 1) comprennent deux lignées majeures (myéloïde et lymphoïde) et sont séparées en deux groupes fonctionnels, formant l’immunité innée et l’immunité adaptative. L’immunité innée est caractérisée par une réponse rapide et directe. C’est la première ligne de défense cellulaire de l’organisme contre les pathogènes et elle est de ce fait souvent associée aux tissus exposés au milieu extérieur. Elle regroupe les cellules phagocytaires (telles que les polynucléaires neutrophiles, les monocytes/macrophages et les cellules dendritiques), les cellules dites « autres » (polynucléaires éosinophiles et basophiles, mastocytes, cellules Natural Killer ou NK) et enfin les lymphocytes nonconventionnels (Natural Killer T cells ou NKT, lymphocytes T γδ, et les Mucosal Associated Invariant T cells ou MAIT), même si ces derniers peuvent être considérés comme étant à la frontière innée / adaptative. L’immunité adaptative est caractérisée par une réponse plus lente, mais disposant d’une mémoire, c’est-à-dire que des cellules spécifiques d’un antigène préalablement activées vont persister, ce qui permettra une réponse plus rapide en cas de nouvelle rencontre avec l’antigène. La mémoire du système immunitaire est la base de la vaccination. Le système adaptatif comprend les lymphocytes T αβ (dits conventionnels) et les lymphocytes B. Il existe de nombreuses interactions entre l’immunité innée et l’immunité adaptative, la principale étant la capacité de certaines cellules de la première à activer celles de la seconde via le mécanisme de présentation d’antigènes. Ce mécanisme implique généralement les phagocytes (macrophages et cellules dendritiques principalement) d’une part, et les lymphocytes T d’autre part. 19 Introduction I : Le système immunitaire Figure 1. Les cellules du système immunitaire. Adapté de (1) Le système immunitaire comporte de très nombreuses sous-populations cellulaires, dont les principales familles sont décrites ici. En teintes bleues, les membres de la lignée lymphoïde, en teinte verte, ceux de la lignée myéloïde. A noter que les populations les plus différenciées de cet arbre comportent également de nombreuses sous-populations différentes pouvant se distinguer par des phénotypes moléculaires très variés. Quelques cytokines importantes pour leur différenciation sont mentionnées. LB : Lymphocyte B, LT : Lymphocyte T, NK : Natural Killer, IL : Interleukine, CSF : Colony Stimulating Factor (G : Granulocyte, M : Monocyte). 20 Introduction I : Le système immunitaire 1.2) Molécules fondamentales du système immunitaire : quelques exemples Le système immunitaire s’appuie sur une grande variété de molécules indispensables à son fonctionnement. Nous verrons ici quelques exemples principaux pertinents pour les sujets traités au cours des prochains chapitres, cette liste n’étant bien évidemment pas exhaustive mais visant à donner une base moléculaire pour la compréhension du fonctionnement général du système immunitaire. Les cellules de l’immunité adaptative, ainsi que certaines cellules de l’immunité innée, sont caractérisées par l’expression de récepteurs dédiés à la reconnaissance de molécules précises. C’est le cas des lymphocytes B qui expriment un récepteur B à l’antigène (B Cell Receptor ou BCR) ainsi que des anticorps, et des lymphocytes T exprimant un récepteur T (T Cell Receptor ou TCR). Ces récepteurs sont extrêmement spécifiques d’un antigène donné et font l’objet d’une incroyable variabilité. On trouve également des récepteurs moins spécifiques, appelés Toll-Like Receptors (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires généraux. Par exemple, certains vont être spécialisés dans la reconnaissance d’ARN viraux, ou de polymères bactériens. Tous ces récepteurs jouent un rôle central dans l’activation des cellules du système immunitaire et sont complétés par de nombreux corécepteurs, molécules d’adhésion, de co-stimulation, etc. Comme mentionné précédemment, il existe des cellules spécialisées dans la présentation des antigènes. Ces cellules vont donc capturer un pathogène, et apprêter les antigènes pour les présenter aux lymphocytes T. Ce mécanisme fait intervenir d’une manière générale des structures présentatrices, les plus connues et les mieux caractérisées étant les molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité « classique ». Ces protéines, regroupées en deux familles (classe I et classe II) lient des antigènes peptidiques et sont reconnues par le TCR des 21 Introduction I : Le système immunitaire lymphocytes T αβ conventionnels. Chez l’homme, le CMH-I regroupe les isotypes HLA-A, B, et -C (dits classiques ou CMH-Ia) et -E, -F et -G (non-classiques ou CMH-Ib), généralement reconnus par le TCR des lymphocytes T cytotoxiques et/ou les NKR (Natural Killer Receptors) ; le CMH-II regroupe HLA-DP, DQ et DR et il est reconnu par le TCR des lymphocytes T auxiliaires. Le CMH est extrêmement polymorphe, permettant ainsi au système immunitaire de réagir contre une grande variété de pathogènes, et d’assurer la survie globale d’une espèce en permettant à une proportion non négligeable d’une population de se défendre contre un large spectre de pathogènes. Cette grande variabilité est par ailleurs la cause principale du rejet de greffe, comme le terme « Histocompatibilité » l’indique. Les molécules du CMH-I, ainsi que d’autres protéines qui leur sont apparentées, ont également la propriété de moduler l’activation de la quasi totalité des lymphocytes T (conventionnels et non-conventionnels) ainsi que des cellules NK, via leur interaction avec des récepteurs appelés Natural Killer Receptor (ou NKR) qui peuvent transduire des signaux inhibiteurs ou activateurs selon le récepteur considéré. Par exemple, l’hétérodimère CD94/NKG2A reconnaît HLA-E et transmet des signaux inhibiteurs. L’absence d’expression de molécules du CMH-I à la surface d’une cellule étant généralement, hormis cas particuliers, le signe d’une infection ou d’un « soi modifié » (les virus par exemple ont tendance à inhiber l’expression de ces molécules pour échapper aux lymphocytes T cytotoxiques), il n’y aura plus de signaux inhibiteurs ce qui peut favoriser l’activation d’une cellule effectrice. Au contraire, CD94/NKG2D reconnaît des molécules apparentées au CMH-I et dites « de stress » telles que MICA/B, et transmet des signaux activateurs. L’activation d’une cellule effectrice est donc déterminée par le bilan de signaux transmis par une grande variété de récepteurs. Les cytokines et chimiokines jouent également un rôle central dans l’organisation des défenses immunitaires. Elles sont regroupées en plusieurs superfamilles (telles que les 22 Introduction I : Le système immunitaire interleukines, interférons, etc) pouvant compter des dizaines de membres. Elles assurent de nombreux rôles fondamentaux et indispensables au fonctionnement du système immunitaire : différenciation et activation cellulaires, migration, communication entre cellules, etc. Les cytokines sont classées en 2 groupes antagonistes, pro-inflammatoires (Th1) ou antiinflammatoires (Th2), et la plupart des cellules sont spécialisées dans la production d’un seul de ces groupes. La grande majorité des cytokines a des effets pléiotropes, synergiques et redondants. 1.3) Déclenchement de la réponse immunitaire D’une manière générale, les barrières naturelles de l’organisme protègent contre la très grande majorité des pathogènes, de manière physique (en s’opposant simplement à leur entrée), biochimique (pH, enzymes) ou biologique (par exemple, la présence d’une flore microbienne naturelle, non pathogène, limite le développement de populations pathogènes par simple compétition pour les ressources disponibles). Les réponses rapides et à large spectre, bien que peu spécifiques, des cellules de l’immunité innée contrôlent ensuite la majorité des pathogènes ayant pénétré les barrières mentionnées précédemment. En cas d’échec de ces deux systèmes, la réponse immunitaire adaptative va se déclencher. Elle implique de nombreux acteurs et se déroule en plusieurs phases précises et ordonnées aboutissant à l’activation, la prolifération et la mise en route des fonctions effectrices de cellules spécifiques du pathogène ciblé, les lymphocytes T et B (Figure 2). La peau et les muqueuses sont colonisées par de nombreuses cellules dendritiques résidant en permanence dans ces tissus, dans un état immature. L’entrée d’un pathogène déclenche rapidement une réponse inflammatoire locale se traduisant par l’expression de molécules d’adhésion par l’endothélium vasculaire, 23 de chimiokines et de cytokines. Introduction I : Le système immunitaire Figure 2. Vue générale de la réponse immunitaire. Adapté de (1) (1) Une cellule dendritique (CD) capture un pathogène et migre vers un ganglion lymphatique proche, en passant d’un phénotype phagocytaire à « présentateur ». (2) La CD active les lymphocytes T (LT). Les CD8 migrent vers la zone infectée, comme les CD4 qui participent également à l’activation des lymphocytes B (LB). Ces derniers sortent du follicule primaire (zone B) après reconnaissance et phagocytose du pathogène pour rencontrer les LT CD4 de même spécificité, puis y retournent pour finir leur différenciation et sécréter des anticorps. (3) Les lymphocytes atteignent la zone infectée balisée par des molécules d’adhésion et un gradient de cytokines et chimiokines. Les CD8 détruisent les cellules infectées, les CD4 participent à l’activation des macrophages. Les anticorps neutralisent les pathogènes, et facilitent leur élimination via la phagocytose ou le complément. 24 Introduction I : Le système immunitaire Dès qu’une cellule dendritique capture un pathogène, elle migre vers le ganglion lymphatique le plus proche et effectue sa maturation au cours de son trajet. Les protéines du pathogène seront clivées en peptides courts chargés sur les molécules du CMH. Ainsi, la cellule dendritique activera les lymphocytes T naïfs qui vont proliférer et exprimer des récepteurs pour certaines chimiokines et molécules d’adhésion, leur permettant de migrer vers le lieu de l’infection et de traverser l’endothélium pour éliminer les pathogènes. Les lymphocytes B quant à eux peuvent être activés soit par les lymphocytes auxiliaires exprimant le corécepteur CD4, soit par des antigènes solubles, polymériques, dits « thymoindépendants » (car ne nécessitant pas l’intervention des lymphocytes T). Ils comprennent eux aussi diverses sous-populations qui ne seront pas détaillées ici. Ils sécrèteront les anticorps à distance du site d’infection, en restant dans les organes lymphoïdes secondaires. Cette description succincte de la réponse immune est bien évidemment très simplifiée et restreinte aux phénomènes principaux. Elle fait intervenir de nombreux autres types cellulaires et des mécanismes bien plus variés et complexes. 2) Les lymphocytes T Quel que soit leur sous-type, tous les lymphocytes T sont caractérisés par l’expression du TCR, qui ne se limite pas au récepteur antigénique seul, mais comprend également les molécules de signalisation γ, δ, ε et ζ formant le complexe CD3 (Figure 3). Le type de récepteur antigénique (αβ ou γδ), l’expression (ou non) des corécepteurs CD4 ou CD8, ainsi que d’autres récepteurs, détermine le sous-type général ainsi que les fonctions d’un lymphocyte T donné. On sépare cette population en deux groupes, les lymphocytes T conventionnels (αβ), et les lymphocytes T non-conventionnels qui comprennent les lymphocytes T γδ, ainsi que les lymphocytes αβ de type NKT et les MAIT. 25 Introduction I : Le système immunitaire Figure 3. Structure générale du TCR : Exemple du TCR αβ d’un lymphocyte T CD8+ On parle souvent du TCR comme étant l’association de deux chaînes αβ ou γδ, mais le TCR dans son ensemble comprend également les sous-unités CD3 (γ, δ, ε et ζ) portant des motifs de type ITAM et participant à la transduction du signal, en association avec de nombreuses kinases. Le TCR peut être également couplé (en fonction du type de lymphocyte T considéré) à un corécepteur de type CD4 ou CD8 renforçant l’interaction avec le CMH (de classe II ou I, respectivement). Ici, le TCR d’un lymphocyte T CD8 reconnaît un peptide antigénique (en rouge) présenté par le CMH-I composé d’une chaîne lourde (CL) formée de trois domaines immunoglobuliniques α1, α2 et α3, et de la beta-2-microglobuline (β2m). Le corécepteur CD8 interagit avec le domaine α3 (très conservé) tandis que le TCR reconnaît à la fois le peptide antigénique et les domaines α1 et α2 (présentant une importante variabilité) du CMH-I via des domaines appelés boucles CDR pour Complementarity Determining Region (CDR3 pour le peptide et CDR1 et 2 pour le CMH-I). La chaîne α du TCR reconnaît le domaine α2 du CMH-I ; la chaîne β, le domaine α1. Encadré : structure tridimensionnelle du complexe TCR / CMH-I. Vert : CMH-I, Jaune : Peptide, Bleu et Rose : Chaînes β et α du TCR (2). Les populations non-conventionnelles faisant l’objet de la section suivante, nous nous concentrerons ici sur des généralités sur les lymphocytes T et sur les sous-populations de lymphocytes T conventionnelles αβ. 26 Introduction I : Le système immunitaire 2.1) Développement Les lymphocytes T se développent dans le thymus, à partir de progéniteurs lymphoïdes pluripotents (ETP, Early T cell Progenitors) provenant de la moelle épinière ou du foie. Ils sont appelés thymocytes une fois qu’ils sont entrés dans le cortex thymique, et qualifiés de Double Négatifs (DN) à ce stade car ils n’expriment pas les corécepteurs CD4 et CD8. Ce développement s’effectue par étapes clés, comprenant deux points de contrôle majeurs, les sélections positive et négative, pour former un répertoire T efficace et tolérant, c’est-à-dire qu’il ne doit pas reconnaître le « soi » comme étranger. L’évènement initiant la différenciation des thymocytes est le réarrangement des gènes du TCR. Ces gènes sont morcelés et se composent de très nombreux segments géniques, appartenant à plusieurs groupes : V (Variable), D (Diversité), J (Jonctionnel) et C (Constant). Cette propriété est identique pour les TCR αβ ou γδ (les segments D n’existant néanmoins que pour les chaînes β et δ), et le BCR (et par extension les immunoglobulines). Les gènes du TCR étant morcelés, leur expression nécessite un mécanisme de remodelage génique irréversible particulier et unique aux gènes des récepteurs antigéniques, appelé recombinaison somatique (Figure 4). Dans tous les cas, elle fait intervenir les recombinases RAG-1 et -2 (Recombination Activating Gene) qui vont aléatoirement assembler un gène fonctionnel à partir d’un segment V, D, et J, dans l’ordre D+J puis V+DJ (ou V+J directement pour les chaînes α et γ). Le segment C ainsi que le peptide signal (L) seront quant à eux assemblés aux autres segments par épissage après la transcription (3). Ce processus étant aléatoire et basé sur une grande variété de segments géniques (Tableau 1), il permet d’obtenir une incroyable diversité de TCR différents. D’autres processus de la recombinaison introduisent une variabilité supplémentaire, en ajoutant ou en retirant des nucléotides au niveau des jonctions entre les segments V, D et J. 27 Introduction I : Le système immunitaire Figure 4. Structure et recombinaison d’un locus TCR : Exemple de la chaîne β. Adapté de (1) Les recombinases RAG 1 et 2 effectuent la recombinaison des gènes du TCR dans l’ordre indiqué. Les autres segments J, D et C ainsi que les introns sont éliminés par épissage. Au niveau des jonctions, des endonucléases ainsi que des ADN polymérases et la Terminal deoxyribonucleotidyl Transferase (TdT) retirent ou ajoutent respectivement des nucléotides, ce qui contribue à la variabilité du TCR. Les segments sont assemblés aléatoirement et toutes les combinaisons sont possibles, bien que ne codant pas forcément pour un TCR fonctionnel. Locus Localisation chromosomique V D J C α 14q11.2 * 54 ** 0 61 1 β 7q34 64-67 2 14 2 γ 7p14 12-15 0 5 2 δ 14q11.2 * 8 ** 3 4 1 Tableau 1. Organisation des loci TCR Ce tableau récapitule le nombre de segments géniques pour chaque locus TCR. * Le locus δ est situé dans le locus α ** 5 segments V sont communs aux loci α et δ Source : Base de données de l’IMGT (système d’information en ImMunoGénéTique) 28 Introduction I : Le système immunitaire Une fois la recombinaison de la chaîne β effectuée, elle sera exprimée en surface avec une chaîne α provisoire et invariante (appelée pTα) et les thymocytes vont également exprimer les deux corécepteurs CD4 et CD8 ; ils seront alors qualifiés de « Double Positifs » (DP). Le réarrangement chromosomique de la chaîne α va ensuite avoir lieu, et les thymocytes pourront alors subir les sélections positive puis négative (Figure 5). La sélection positive, qui se déroule également dans le cortex thymique, fait intervenir des cellules épithéliales qui vont présenter des peptides du soi aux thymocytes. Cette étape va permettre d’une part de déterminer si le TCR exprimé reconnaît le CMH de classe I (auquel cas le thymocyte deviendra CD8+CD4-) ou de classe II (CD8-CD4+) mais aussi d’éliminer les cellules incapables de reconnaître le CMH (4). La sélection négative va quant à elle se faire au niveau de la medulla et implique des cellules présentatrices d’antigènes spécialisées (macrophages, cellules dendritiques, et cellules épithéliales thymiques). Elle permet l’élimination des thymocytes exprimant un TCR reconnaissant des peptides du soi, qui représenteraient un danger pour l’organisme en étant activés par des cellules normales. A la différence de la sélection positive, la mort des cellules T auto-réactives au cours de la sélection négative est donc un processus actif (5). Une fois ces points de contrôle passés, les lymphocytes T matures vont sortir du thymus grâce à l’expression du marqueur de surface S1P1 et entrer dans la circulation sanguine puis lymphatique (6). Ils vont circuler en permanence entre les différents ganglions lymphatiques de l’organisme, jusqu’à rencontrer un antigène présenté par une cellule dendritique. Ils exprimeront alors des récepteurs aux chimiokines différents leur permettant d’atteindre le site de l’infection, tandis qu’ils perdront l’expression du récepteur CCR7, récepteur principal de la migration vers la zone T des ganglions lymphatiques. 29 Introduction I : Le système immunitaire Figure 5. Principales étapes du développement des lymphocytes T et sélection thymique. (1) Les cellules souches hématopoïetiques destinées à se différencier en lymphocytes T (Early T cell Progenitors ou ETP) entrent dans le thymus à la jonction cortico-médullaire. Les thymocytes transitent à travers le cortex thymique en passant par les divers stades DN au cours desquels les gènes du TCR sont réarrangés, pour aboutir au stade DP. (2) Les thymocytes DP traversent alors un réseau de cellules épithéliales pour subir la sélection positive, les cellules incapables de reconnaître le CMH étant éliminées car elles ne reçoivent pas de signaux de survie. (3) Les thymocytes passent alors au stade SP (Simple Positif, CD4 ou CD8) et migrent dans la medulla où ils interagissent avec des cellules présentatrices d’antigènes spécialisées (cellules dendritiques, macrophages…) pour passer la sélection négative, ceux reconnaissant le complexe peptide/CMH trop fortement étant éliminés. (4) Enfin, les lymphocytes T terminent leur maturation environ quatre jours après l’entrée dans la medulla et quittent le thymus via la circulation lymphatique ou sanguine grâce à l’expression du marqueur S1P1. Adapté de (6). 2.2) Les sous-populations T conventionnelles Comme mentionné précédemment, les lymphocytes T αβ conventionnels sont séparés en fonction du corécepteur qu’ils expriment (CD4 ou CD8) en deux groupes, qui sont dédiés à la reconnaissance d’une classe de CMH donnée (II ou I respectivement). L’expression de ces 30 Introduction I : Le système immunitaire corécepteurs est indispensable car elle renforce entre autres rôles l’interaction entre le TCR et le CMH. Les lymphocytes T αβ CD4+ reconnaissent des peptides antigéniques présentés par le CMH de classe II, provenant de protéines produites par des pathogènes extracellulaires. Ces lymphocytes, qualifiés d’auxiliaires (ou helpers) participent à la réponse immunitaire en modulant l’activation des autres populations via la sécrétion de cytokines. Ils peuvent par exemple stimuler l’activation des macrophages ou participer à la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécrétant des anticorps. Ils sont également classés en sous-populations en fonction du type de cytokines qu’ils produisent, appelées Th1 (généralement pro-inflammatoires comme l’IFN-γ), ou Th2 (généralement anti-inflammatoires comme l’IL-4). Ces deux sous-populations s’antagonisent, c’est-à-dire que les cytokines produites par les Th1 inhibent la différenciation des Th2, et inversement (7). Cette caractéristique fait qu’une réponse immunitaire est généralement très polarisée. Les lymphocytes T CD4+ Th1 activent généralement les macrophages, les neutrophiles (stimulation de la phagocytose) et les lymphocytes T CD8+, donc favorisent plutôt une réponse contre les pathogènes intracellulaires. Les lymphocytes T CD4+ Th2 activent plutôt les réponses dirigées contre les pathogènes extracellulaires, via les lymphocytes B, les éosinophiles et les mastocytes. Plus récemment, une nouvelle sous-population, les lymphocytes Th17, a été identifiée. Leur développement est distinct et antagonisé par celui des sous-types Th1 et Th2. Ils sécrètent entre autres cytokines de l’IL-17, interviennent dans les réponses inflammatoires et participeraient également au développement de pathologies liées au système immunitaire, mais leur rôle exact est toutefois encore très mal connu (8, 9). 31 Introduction I : Le système immunitaire Enfin, il existe un autre type distinct de lymphocytes T CD4+, appelés Treg (pour régulateurs), caractérisés par une forte expression du marqueur CD25 et par le facteur de transcription FoxP3 qui leur est spécifique (10, 11). Ces lymphocytes jouent un rôle dans l’induction de la tolérance périphérique (complétant la tolérance centrale mise en place par la sélection des lymphocytes T dans le thymus) et pourraient être un outil utile dans le traitement de l’allergie, ou pour prévenir le rejet de greffe. Ces lymphocytes sont par ailleurs probablement impliqués dans le développement tumoral, en inhibant les réponses immunitaires dirigées contre les cellules cancéreuses (12). Les lymphocytes Th17 et Treg pourraient également présenter des liens fonctionnels importants mais encore mal connus (13). De nombreux pathogènes intracellulaires sont capables d’échapper à la destruction directe après leur phagocytose par les cellules de l’immunité innée. Le seul moyen d’éliminer ces pathogènes est donc de détruire la cellule infectée. Ce rôle est rempli en grande partie par les lymphocytes T CD8+ (dits cytotoxiques), qui sont pourvus d’une machinerie de lyse cellulaire, le système perforine/granzyme. Les protéines le composant sont stockées dans des vésicules dérivées des lysosomes dont le contenu est exocyté par les lymphocytes après reconnaissance du peptide dont ils sont spécifiques, présenté par le CMH de classe I. Le système perforine/granzyme conduit au final à une activation des caspases et donc à l’apoptose des cellules ciblées. Les lymphocytes T CD8+ sont également capables d’induire l’apoptose en exprimant FasL, qui active son récepteur Fas s’il est exprimé par la cellule cible (14). Ces lymphocytes sécrètent également de nombreuses cytokines pro-inflammatoires telles que l’IFN-γ favorisant donc la réponse dirigée contre les pathogènes intracellulaires. Pour finir, les lymphocytes T CD8+ disposent eux aussi d’une sous-population régulatrice encore mal caractérisée, dont le rôle serait d’éliminer les lymphocytes T CD4+ auto-réactifs (15). 32 Introduction I : Le système immunitaire Cette description des lymphocytes T conventionnels, bien que très résumée, montre leur rôle central dans la réponse immunitaire ainsi que leur grande diversité. Ils sont souvent considérés comme les chefs d’orchestre du système immunitaire de par leur capacité à communiquer avec les autres populations mais aussi à réguler leur activation ou leur différenciation en sécrétant de très nombreuses cytokines. Les lymphocytes T comptent également dans leurs rangs des populations particulières qualifiées de non-conventionnelles, plus rares, mais jouant un rôle extrêmement important au sein du système immunitaire. 3) Les lymphocytes T non-conventionnels On regroupe dans les lymphocytes T dits « non-conventionnels » des sous-populations lymphocytaires se situant à la frontière entre immunité innée et adaptative. Elles possèdent en effet des caractéristiques des deux systèmes, et représentent un pont fonctionnel important entre les deux composantes du système immunitaire. Ces lymphocytes comprennent des souspopulations très différentes, mais possédant un certain nombre de caractéristiques communes les démarquant nettement des lymphocytes T αβ classiques : ils sont souvent oligoclonaux ; la reconnaissance d’antigènes (qui ne sont d’ailleurs pas de nature peptidique, hormis dans des cas très rares et particuliers) par ces lymphocytes n’est pas restreinte par le CMH « classique » ; enfin ils sont très souvent associés à différents tissus déterminés par le type de récepteur T qu’ils expriment. L’ensemble des sous-populations T exprimant un TCR de type γδ fait partie des lymphocytes T non-conventionnels. Chez les lymphocytes T αβ, on trouve les NKT (Natural Killer T cells) ainsi que les MAIT (Mucosal Associated Invariant T cells), découvertes plus récemment. 33 Introduction I : Le système immunitaire 3.1) Les lymphocytes NKT Décrits pour la première fois au milieu des années 80, ces lymphocytes T expriment un marqueur originellement identifié sur les cellules NK (d’où leur nom) : NK1.1 (aussi appelé NKRP1 ou CD161). Ces lymphocytes ont un phénotype Double Négatif ou CD4+ (et plus rarement CD8+ mais chez l’homme uniquement) présentant des fonctions légèrement différentes, notamment au niveau de leur profil d’expression de cytokines. Les NKT se développent dans le thymus probablement à partir du stade DP, selon le même schéma que les T conventionnels. En revanche, il est généralement admis que les NKT quittent le thymus avec un phénotype activé, exprimant des marqueurs de cellules mémoire. Cette caractéristique pourrait être en relation avec leur capacité à effectuer des réponses très rapides. Les lymphocytes NKT sont relativement rares (moins de 1% des lymphocytes T matures totaux) et sont concentrés préférentiellement au niveau de certains tissus tels que le foie ou la rate. Ils ont généralement un rôle régulateur, en sécrétant très rapidement une large variété de cytokines (de type Th1 comme l’IFN-γ mais aussi de type Th2 comme l’IL-4). Bien qu’ils expriment des marqueurs des cellules NK et soient dans certains cas capables d’effectuer des réponses cytotoxiques, il ne semble pas que ce soit leur fonction effectrice principale (16). La sous-population NKT la mieux connue à l’heure actuelle est dite de type I et appelée iNKT (i pour invariant). Elle exprime un TCR comportant toujours une chaîne α du TCR porteuse d’un segment variable Vα14 chez la souris, et Vα24 chez l’homme. La chaîne β est quasi exclusivement de type Vβ11 chez l’homme et de type Vβ2, 7 ou 8 chez la souris (17, 18). Chez l’homme, ces lymphocytes reconnaissent la molécule CD1d qui est apparentée au CMH-I et associée à la beta-2-microglobuline. Cette molécule est principalement exprimée sur les cellules présentatrices d’antigènes ainsi que les hépatocytes et diverses cellules 34 Introduction I : Le système immunitaire épithéliales. Les autres membres de la famille CD1 (a, b, c et e) forment un groupe distinct (groupe 1) et seraient eux reconnus par des lymphocytes T αβ conventionnels ainsi que certaines sous-populations γδ, exception faite de CD1e qui n’est pas exprimé en surface et participerait au chargement des lipides sur les autres molécules du groupe 1. Chez la souris il n’existe que deux gènes CD1 (1.1 et 1.2), orthologues de CD1d dérivant probablement d’un même gène ancestral dupliqué (19). Contrairement au CMH-I classique, CD1d présente des antigènes de nature glycolipidique qui peuvent être exogènes (issus de pathogènes) ou endogènes. L’antigène le plus couramment utilisé pour stimuler ces cellules est l’α-galactosylcéramide, qui n’est pas un antigène « naturel » dans le sens où il est produit par une éponge marine. Il a néanmoins permis une avancée considérable des connaissances sur les lymphocytes NKT. Cet antigène était à l’origine utilisé pour ses propriétés anticancéreuses, mais ce n’est que plus tardivement que sa capacité à activer les lymphocytes NKT a été découverte (20). Récemment, le mécanisme de présentation des antigènes glycolipidiques par CD1d a été caractérisé plus précisément (Figure 6). Il fait intervenir deux voies distinctes en fonction du type d’antigène considéré. Dans le cas des antigènes endogènes, il fait intervenir la Microsomal triglycéride transfer Protein (MttP), une enzyme classiquement impliquée dans le transfert de lipides sur l’apolipoprotéine B (la protéine majoritaire des lipoprotéines de basse densité ou LDL). Cette protéine charge l’antigène sur la molécule CD1d au niveau du Réticulum Endoplasmique (21, 22). Dans le cas des antigènes exogènes, il se déroule au niveau des endosomes tardifs et fait intervenir les saponines (23). 35 Introduction I : Le système immunitaire Figure 6. Les deux voies de présentation antigénique par CD1d. Une fois entré dans le Réticulum Endoplasmique (RE), CD1d peut soit être chargé avec un antigène endogène par la MttP (Microsomal triglycéride transfer Protein) et être exprimé directement en surface (voie de gauche), soit lier la chaîne invariante Ii et être adressé dans les endosomes, où il sera chargé avec un antigène exogène par une saponine (voie de droite). Dans ce dernier cas, les antigènes ont été transportés par l’apolipoprotéine E (apoE), internalisée majoritairement via le récepteur aux LDL (LDLR). Ce double mécanisme rappelle la présentation d’antigènes par les CMH de classe I et II. Il n’y a à l’heure actuelle aucune donnée précisant si ces deux voies de présentation parallèles activent plus particulièrement des sous-types de lymphocytes NKT différents. Ag : Antigène ; exo. : exogène ; endo. : endogène ; CPA : Cellule Présentatrice d’Antigène. De plus, CD1d peut interagir avec la chaîne invariante Ii, classiquement impliquée dans la biogenèse des complexes peptides/CMH-II, ce qui permet son routage au niveau des endosomes (24). Par ailleurs, l’apolipoprotéine E (apoE) a récemment été montrée comme étant impliquée dans le mécanisme de capture d’antigènes glycolipidiques par les cellules présentatrices d’antigènes (25). Ce rôle de l’apoE dans l’activation des NKT est relativement paradoxal. En effet, de nombreux travaux ont démontré une forte implication des NKT dans le développement de l’athérosclérose, chez des souris invalidées pour l’apoE (26), un modèle classique d’étude de l’athérosclérose chez la souris. Ceci apparaît donc contradictoire avec le fait que cette apolipoprotéine participe à leur activation. Une hypothèse possible est que 36 Introduction I : Le système immunitaire l’accumulation de lipides « exogènes » dans les macrophages, un des processus initiateurs de la pathologie, pourrait entraîner une forte activation des NKT, de manière indépendante de l’apoE. Généralement, les lymphocytes NKT jouent un rôle protecteur dans de nombreux processus physiopathologiques, notamment certaines pathologies auto-immunes comme le diabète de type I (27). En revanche, ils ont tendance à exacerber l’athérosclérose (28). Ils influencent également le développement des tumeurs, avec des effets différents en fonction du sous-type de lymphocytes NKT considéré (29). Généralement, les NKT de type I ont des fonctions anti-tumorales. Les NKT de type II, exprimant un TCR plus diversifié (30), favoriseraient plutôt le développement des tumeurs. Leurs rôles exacts sont encore très mal connus, et ils s’opposeraient en général à ceux des NKT de classe I (31). Cette population est elle aussi restreinte par CD1d mais ne reconnait pas l’α-galactosylcéramide (32). 3.2) Les lymphocytes MAIT Population non-conventionnelle la plus récemment découverte, ces lymphocytes de type αβ ressemblent beaucoup aux lymphocytes NKT. Ils expriment en effet un TCR peu diversifié (Vα19 chez la souris, Vα7.2/Jα33 chez l’homme) et reconnaissent une molécule apparentée au CMH-I, MR1 (MHC-Related molecule 1). Ils sont situés quasi exclusivement au niveau de la lamina propria de l’intestin. Leur phénotype peut être DN, CD8+, voire CD4+ mais de façon beaucoup plus rare (33). Le développement des cellules MAIT reste encore très mal caractérisé. Elles sont absentes chez les souris nude (athymiques), et sont très peu nombreuses dans le thymus. En revanche, l’expression de MR1 par les cellules épithéliales thymiques ne semble pas requise. Son expression sur les lymphocytes B est probablement importante pour l’accumulation des MAIT dans l’épithélium intestinal, ainsi que la présence d’une flore commensale. Ces deux éléments 37 Introduction I : Le système immunitaire ne semblent pas indispensables à la sélection thymique de ces cellules, dont le développement est probablement régulé par d’autres populations intra-thymiques d’origine hématopoïétique. Pour finir, et contrairement aux NKT, les MAIT sortent du thymus avec un phénotype naïf, et n’acquièrent un phénotype mémoire qu’après avoir atteint l’intestin, probablement après contact avec certains lymphocytes B et la flore commensale (33). Le mécanisme global de l’activation des MAIT par MR1 est encore très peu caractérisé. Des travaux récents indiquent que, de la même façon que pour CD1d et les NKT, une surexpression de MR1 est suffisante pour activer les MAIT, ce qui indique que l’antigène présenté peut être endogène (34). Il faut par ailleurs noter que jusqu’à présent, une telle surexpression artificielle est requise pour permettre la détection de MR1 à la surface des cellules. Par ailleurs, cette expression ne semble être dépendante d’aucune molécule classiquement impliquée dans les mécanismes de présentation antigénique, telle que TAP (un transporteur important les peptides antigéniques dans le RE pour leur chargement sur le CMH-I) ou la chaîne invariante Ii. En revanche, la chaîne Ii et HLA-DM (une molécule de CMH-II non-classique ne présentant pas de peptides mais qui participe elle aussi à l’expression du CMH-II) jouent un rôle important pour l’activation des MAIT, probablement en facilitant le trafic de MR1 dans les endosomes tardifs, qui devraient donc être le lieu où MR1 rencontre son ligand (35). Il apparaît donc que deux voies d’adressage existent, comme pour CD1d, mais pour MR1 la voie Ii-indépendante ne semble pas être impliquée dans la présentation antigénique. La nature de l’antigène présenté par MR1 est toujours totalement inconnue. L’analyse de la poche peptidique de MR1 indique qu’elle est beaucoup plus hydrophile que celle de CD1d (36), donc plus proche du CMH-I classique et lierait à priori plutôt un peptide, bien que des travaux récents indiquent que des antigènes glycolipidiques sont capables d’activer les MAIT (37). 38 Introduction I : Le système immunitaire Au niveau de leur fonction, les cellules MAIT sont encore assez énigmatiques. Elles seraient probablement des cellules de type régulateur. Des travaux récents suggérent qu’elles pourraient participer au contrôle de la production des anticorps de type IgA (38) qui sont associés aux muqueuses. Ceci est en accord avec le fait que les MAIT interagissent avec les lymphocytes B et siègent principalement au niveau de l’intestin. Par ailleurs, ces cellules auraient un rôle dans les pathologies auto-immunes inflammatoires, comme suggéré par des travaux récents sur l’EAE (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) chez la souris (39), modèle d’étude pour la sclérose en plaque chez l’homme. A l’heure actuelle, les lymphocytes MAIT sont donc probablement, avec les lymphocytes T γδ, une des populations T les moins bien connues. 39 40 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE CHAPITRE II LES LYMPHOCYTES T γδ Des lymphocytes à part et toujours méconnus 41 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Découverts il y a maintenant 25 ans suite au clonage du gène de la chaîne γ du TCR (40), ces lymphocytes restent pourtant extrêmement méconnus, particulièrement chez l’homme. Ils représentent la sous-population non-conventionnelle T la plus diversifiée, comprenant de nombreux sous-types cellulaires caractérisés par l’expression de TCR distincts. Ce chapitre sera dédié à une revue la plus complète possible des données actuelles. Le compartiment γδ étant extrêmement diversifié, il est important de garder en mémoire que les caractéristiques décrites ici ne s’appliqueront pas forcément à l’ensemble des sous-populations. 1) Généralités Comme leur nom l’indique, les lymphocytes T γδ expriment un TCR composé d’une chaîne γ et d’une chaîne δ, associées comme pour les lymphocytes T αβ au complexe CD3. A l’instar des NKT et des MAIT, ils sont généralement associés à des tissus bien déterminés, et ce en fonction des régions variables du TCR qu’ils expriment. Par exemple, dans le sang périphérique humain, on trouve majoritairement des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, alors que les lymphocytes T de type Vδ1 sont concentrés dans les tissus. Chez la souris, l’épiderme est quasi exclusivement colonisé par les lymphocytes T Vγ5/Vδ1, l’épithélium utérin par les Vγ6/Vδ1, etc. Cette spécificité tissulaire est d’ailleurs beaucoup plus marquée chez la souris que chez d’autres espèces. Les loci codant pour les chaînes γ et δ du TCR comportent globalement la même organisation et présentent les mêmes mécanismes de recombinaison que les loci α et β, avec toutefois quelques particularités. Globalement, on considère que la diversité combinatoire potentielle du TCR γδ, malgré un nombre beaucoup plus restreint de segments géniques (voir Tableau 1, p.28), est plus élevée que celle du TCR αβ. En effet la recombinaison peut associer plusieurs segments D, ce qui n’est pas le cas pour le TCR αβ. La diversité du TCR γδ est donc concentrée au niveau du CDR3. Toutefois, la variabilité 42 Introduction II : Les lymphocytes T γδ effective du TCR des lymphocytes T γδ matures est plus restreinte, ce qui est probablement dû à des évènements de sélection thymique et périphérique intensifs. La structure tridimensionnelle du TCR γδ, bien que similaire à celle du TCR αβ, comporte également des différences intéressantes mais dont la signification reste une question ouverte. Par exemple, l’angle formé par les domaines V et C est beaucoup plus prononcé pour le TCR γδ (Figure 7). Pour finir, le répertoire du TCR γδ est également biaisé. En effet, on trouve quasiexclusivement des associations préférentielles entre des chaînes γ et δ particulières, comme Vγ9 avec Vδ2 chez l’homme, ou Vγ5 avec Vδ1 chez la souris. Figure 7. Comparaison des structures tridimensionnelles des TCR γδ et αβ. L’angle formé par les domaines V et C est beaucoup plus prononcé pour le TCR γδ, ce qui le rapproche d’une immunoglobuline. Il s’agit ici d’un TCR humain de type Vγ9/Vδ2 (clone G115). La surface du TCR γδ est également plus irrégulière avec certaines boucles CDR (flèches) plus prononcées ce qui suggère que le TCR γδ (au moins pour cet exemple de TCR) reconnaît une structure très différente du CMH, qui a une surface plate (Figure 3 p. 26). Tiré de (41). Les lymphocytes T γδ ont donc quelques traits en communs avec les lymphocytes T αβ mais représentent une population bien à part qui a divergé il y a plusieurs millions d’années (on les retrouve chez les requins) et poursuivi une évolution indépendante et constante 43 Introduction II : Les lymphocytes T γδ marquée par l’émergence des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 chez les primates « supérieurs ». Ils sont extrêmement diversifiés, tant au niveau phénotypique que fonctionnel, ce qui ne facilite pas leur étude. En effet, contrairement aux autres lymphocytes T, il semble exister d’importantes différences entre les lymphocytes T γδ murins et humains. Par exemple, il ne semble pas exister d’équivalent des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, sous-population γδ humaine majeure et caractérisée par sa capacité à répondre à des antigènes particuliers (voir section 5.2 de ce chapitre, p.67), chez d’autres espèces à l’exception de certains primates non-humains. De plus, un nombre restreint de ligands des TCR γδ a été identifié. Bien qu’ils fassent l’objet de nombreuses études et que leur découverte précéde celle des autres sous-populations T non conventionnelles, il est donc clair qu’à tous les niveaux, ces lymphocytes restent largement méconnus. 2) Développement : la priorité aux lymphocytes T γδ. Les connaissances actuelles sur le développement des lymphocytes T γδ sont beaucoup plus limitées que celles acquises sur les lymphocytes T αβ. Les lymphocytes T γδ dérivent des mêmes progéniteurs que les lymphocytes T αβ et effectuent eux aussi leur maturation dans le thymus. Leur développement est le plus précoce et se déroule par vagues successives (au moins chez la souris), correspondant à l’émergence de sous-populations exprimant un TCR particulier qui vont résider dans des tissus déterminés. Les lymphocytes T γδ exprimant un TCR Vγ5/Vδ1 (aussi appelés Dendritic Epidermal T Cells ou DETC) sont les premiers à quitter le thymus et migrent vers la peau, entre les jours 14 et 17 du développement embryonnaire (E14 à E17) (42). Ils sont suivis par les Vγ6 (poumon, utérus, cavité buccale), puis les Vγ4 (poumons et périphérie) et enfin les Vγ1 (périphérie). Ce développement par vagues successives semble exister chez l’homme et serait dû à un changement précoce de potentialité des progéniteurs (43). Les lymphocytes T Vγ7 résident quant à eux dans l’intestin 44 Introduction II : Les lymphocytes T γδ et pourraient se développer en dehors du thymus au niveau de structures lymphoïdes intestinales appelées cryptopatches. Cette particularité a été décrite pour des souris athymiques (44) mais pourrait être le résultat d’un mécanisme d’adaptation, aucune activité du promoteur de la recombinase RAG-2 n’ayant été détectée dans l’intestin de souris normales (45). Comme mentionné précédemment (Chapitre I, section 2.1, p.27), les thymocytes ont d’abord un phénotype DN, c’est-à-dire n’exprimant pas les corécepteurs CD4 ou CD8. Ce phénotype regroupe quatre phases successives de différenciation dinstinguées par l’expression des marqueurs CD44 et CD25 (DN1 : CD44+CD25-, DN2 : CD44+CD25+, DN3 : CD44CD25+, DN4 : CD44-CD25-). La scission entre les lignages γδ et αβ s’effectue au stade DN3 (46), après la recombinaison des loci γ, δ et β, initiée au stade DN2 (Figure 8). L’expression d’un TCR γδ fonctionnel détermine l’orientation d’un thymocyte DN3 vers le lignage γδ ; la différenciation en lymphocyte T αβ pourrait donc être vue comme une « voie de secours ». Contrairement aux lymphocytes T αβ, la majorité des lymphocytes T γδ ne va en revanche pas exprimer les corécepteurs CD4 et CD8 au cours de cette différenciation. Les lignages γδ et αβ se distinguent par l’expression de gènes différents (47), comme certains facteurs de transcription tels que la famille Notch, dont le rôle reste assez obscur et complexe (48). Néanmoins Notch1 n’est pas indispensable pour le développement des lymphocytes T γδ (49), contrairement à celui des αβ. Inversement, l’expression de Sox13 serait favorable au développement du lignage γδ au détriment des αβ (50). Cette apparente opposition entre lymphocytes T αβ et γδ est néanmoins nuancée par des phénomènes de trans-régulation. 45 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Figure 8. Développement des lymphocytes T : La scission γδ / αβ. L’orientation vers le lignage γδ versus αβ est déterminée au stade DN3, après expression du TCR γδ. La sélection des lymphocytes T γδ est encore mal connue et pourrait dépendre des sous-populations considérées. Néanmoins en fin de différenciation les lymphocytes T γδ présentent un répertoire limité et biaisé, composant des sous-populations distinctes et bien déterminées ayant des fonctions et des localisations tissulaires très différentes. Quelques acteurs moléculaires de la différenciation γδ / αβ sont indiqués. Ces deux sous-populations lymphocytaires T seraient en effet capables de moduler leurs développements respectifs. Les thymocytes αβ DP peuvent par exemple réguler positivement le développement des lymphocytes γδ via l’expression de la lymphotoxine β (51). La sélection des lymphocytes T γδ reste encore extrêmement mal connue. Le fait que, malgré une diversité combinatoire théorique plus importante, le répertoire γδ mature soit plus restreint et biaisé que celui des αβ, suggère qu’une telle sélection existe, au moins pour une partie des sous-populations γδ. Si l’on prend l’exemple de la sous-population γδ majoritaire chez l’homme, la très large majorité des cellules expriment un TCR composé des segments Vγ9 et Jγ1.2, préférentiellement associés à une chaîne Vδ2. Ce biais d’associations 46 Introduction II : Les lymphocytes T γδ préférentielles est probablement déterminé en périphérie (52). En revanche, la diversité jonctionnelle du TCR Vγ9/Vδ2 est plus importante, ce qui explique peut être leur capacité à répondre à des antigènes ayant une structure relativement variée (voir section 5.2.1 de ce chapitre, p.67). Comment la sélection thymique se déroule et quelles sont les molécules impliquées restent des questions ouvertes. Récemment, plusieurs travaux ont fourni de nouvelles perspectives intéressantes sur le développement des lymphocytes T γδ. Chez la souris, une sous-population non négligeable de lymphocytes T γδ reconnait les molécules T10 et T22, qui sont des antigènes de CMH-I non-classiques associés à la β2m. Cette sous-population peut se développer en l’absence de ligand, ce qui a été montré dans un modèle de souris invalidées pour la β2m n’exprimant pas les molécules T10/T22. Cette sélection serait rendue possible grâce à une auto-activation du TCR par dimérisation. Il faut néanmoins noter que l’existence d’un ligand alternatif, ne dépendant pas de la β2m, ne peut pas être totalement exclue. Les cellules sélectionnées par T10/T22 sécrètent de l’IFN-γ alors que celles qui se sont développées en l’absence de reconnaissance de ces molécules sécrètent de l’IL-17 (53). Cette sous-population γδ possède donc deux groupes différant par leur mode de développement et ayant des fonctions effectrices distinctes. Cette dichotomie fonctionnelle pourrait par ailleurs être caractéristique d’autres sous-populations γδ (principalement Vγ1 et Vγ4) chez la souris et dépendre de l’expression du marqueur CD27 ((54) et B. Silva-Santos, communication personnelle). Les connaissances sur les acteurs moléculaires de la sélection des lymphocytes γδ ont progressé récemment, suite à l’identification d’une nouvelle famille de gènes dont un des membres, Skint1, joue un rôle essentiel dans la sélection des lymphocytes T Vγ5/Vδ1 (ou DETC) résidant dans la peau. Les souris porteuses d’un gène skint1 déficient sont dépourvues de lymphocytes T Vγ5/Vδ1. Le produit de skint1 n’étant à priori pas exprimé en surface, il ne 47 Introduction II : Les lymphocytes T γδ s’agit très probablement que d’un acteur indirect, intervenant peut-être dans la régulation de l’expression du ligand du TCR (55, 56). Globalement, le développement des lymphocytes T γδ laisse encore beaucoup de questions sans réponses, et s’avère être difficile à étudier, surtout pour les populations humaines présentant de nombreuses différences avec les modèles murins. La possibilité qu’ont certains lymphocytes T γδ de se développer en l’absence de sélection positive dans le thymus les démarque nettement des autres sous-populations T. Le fait que le répertoire γδ soit extrêmement biaisé et restreint suggère néanmoins que cette propriété est limitée à certaines populations dont le TCR a tendance à former spontanément des dimères, ce qui n’est pas le cas des DETC par exemple (53). 3) Fonctions des lymphocytes T γδ : multiplicité et diversité. La diversité de phénotypes, localisations, et spécificités antigéniques des lymphocytes T γδ est à l’origine d’une multitude de fonctions. Contrairement aux lymphocytes T αβ conventionnels, les lymphocytes T γδ re-circulent rarement en permanence dans le réseau lymphatique. Ils restent associés préférentiellement à leur tissu de résidence, et sont souvent activés directement sans dépendre réellement des cellules présentatrices d’antigènes spécialisées. Ils effectuent donc des réponses effectrices très rapides qui jouent un rôle important dans le maintien de l’intégrité de l’organisme. Comme les autres cellules de l’immunité innée, ceci leur permet également de jouer un rôle important dans le contrôle du développement de la réponse adaptative. Il faut par ailleurs noter qu’une population γδ donnée, définie par un TCR particulier, peut également se composer de sous-populations ayant des phénotypes différents associés à des fonctions distinctes. Par exemple, comme mentionné précédemment, le marqueur CD27 chez certaines sous-populations murines définit 48 Introduction II : Les lymphocytes T γδ un biais pour la production d’IFN-γ ou d’IL-17. Ce même marqueur, en association avec CD45 permet de distinguer plusieurs sous-populations au sein des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 humains (57). 3.1) Fonctions effectrices Les sous-populations γδ sont, comme les lymphocytes T CD8, les populations αβ nonconventionnelles et les cellules NK, dotées d’une machinerie de cytotoxicité leur permettant de lyser leurs cellules cibles par induction de l’apoptose. Cette machinerie présente deux composantes principales : les granules lytiques faisant intervenir principalement le couple perforine/granzyme, et le système Fas/FasL (Figure 9). Chez les lymphocytes T γδ, comme les cellules NK, les granules lytiques sont préformés, ce qui leur permet une cytotoxicité immédiate. Ceci les distingue des lymphocytes T CD8 qui ne sont « armés » qu’après avoir été activés par une cellule présentatrice d’antigènes. La spécificité pour la cellule ciblée est assurée par un relargage vectoriel des granules (58). Après reconnaissance de l’antigène, les granules vont en effet être orientés directement au niveau de la synapse immunologique formée entre cellule effectrice et cellule cible par les interactions entre le récepteur activateur (TCR dans le cas des lymphocytes T) et de nombreuses molécules d’adhésion et de costimulation. Les granules cytotoxiques, dérivés des lysosomes, contiennent de nombreuses protéines majoritairement impliquées dans l’activation des voies d’apoptose, mais certaines d’entre elles, comme la granulysine, pourraient également avoir des activés microbicides (59). Le mécanisme exact d’action du couple perforine/granzyme est encore mal connu et les données actuelles ont principalement été obtenues in vitro dans des modèles simplifiés où les cellules cibles sont incubées en présence de ces protéines. 49 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Figure 9. Mécanismes de cytoxicité : induction de l’apoptose de la cellule cible. La reconnaissance de l’antigène induit la polarisation et le relargage des granules cytotoxiques vers la synapse immunologique, et potentiellement l’interaction Fas/FasL. Les granzymes sont internalisées par endocytose et libérées dans le cytoplasme sous l’action de la perforine. Le rôle principal des granzymes et du couple Fas/FasL est d’induire l’apoptose des cellules cibles, via l’activation des caspases, mais aussi en activant directement certaines cibles des caspases. Ces voies cytotoxiques sont communes aux lymphocytes T CD8 et nonconventionnels ainsi qu’aux cellules NK. Adapté de (14). Si la perforine était à l’origine vue comme un canal permettant l’entrée des autres protéines dans la cellule cible, des données plus récentes suggèrent que le mécanisme est plus complexe et fait intervenir une endocytose des protéines effectrices (60), pouvant également impliquer des récepteurs aux granzymes tels que le récepteur au mannose-6-phosphate (61). Les granzymes sont des sérine-protéases activant les voies apoptotiques des cellules cibles via plusieurs mécanismes dépendants ou non des caspases. En effet, il semblerait que les 50 Introduction II : Les lymphocytes T γδ granzymes soient capables de remplacer les caspases dans de nombreux processus de l’apoptose (14). Le deuxième mécanisme majeur de cytotoxicité par les lymphocytes T γδ fait intervenir le couple Fas/FasL. FasL (pour Fas Ligand) est une protéine homotrimérique membranaire de la famille du TNF et son récepteur Fas est couplé à des voies de signalisation pro-apototiques induisant la mort de la cellule cible, principalement via l’activation des caspases. L’interaction Fas/FasL est, de la même façon que la polarisation des granules cytotoxiques, facilitée par la formation de la synapse immunologique. En plus de ces fonctions effectrices de lyse de la cellule cible, les lymphocytes T γδ sont également une source importante de cytokines permettant l’activation d’autres souspopulations du système immunitaire. Globalement, les lymphocytes T γδ ont un profil de sécrétion de cytokines qui est plutôt biaisé vers une réponse de type Th1 (62) ce qui est en accord avec une implication préférentielle dans des réponses dirigées contre des pathogènes intracellulaires, ou dans l’immunosurveillance des cellules stressées ou transformées. Certaines sous-populations particulières peuvent toutefois secréter des cytokines de type Th2, comme l’IL-4 ou l’IL-10. Bien que reposant essentiellement sur la reconnaissance antigénique par le TCR, les mécanismes d’activation de la cytotoxicité ou de la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T γδ peuvent également impliquer l’ADCC (Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity), comme pour les cellules NK. Cette propriété est toutefois restreinte aux souspopulations exprimant le marqueur CD16 (aussi appelé FcγRIII), un récepteur de basse affinité pour le fragment constant des immunoglobulines. CD16 ne joue probablement qu’un 51 Introduction II : Les lymphocytes T γδ rôle secondaire, complétant l’activation par le TCR (63, 64). De la même façon, les lymphocytes T γδ expriment certains TLR ayant un rôle principalement co-stimulant (65). Jusqu’à présent, les ligands des TCR γδ décrits sont principalement de nature endogène, ce qui pourrait entraîner une auto-réactivité de ces lymphocytes. Leur activation est donc finement régulée par des récepteurs pour les antigènes du CMH ou apparentés, les NKR (pour Natural Killer Receptor car initialement décrits sur les cellules Natural Killer) pour empêcher toute réaction auto-immune (66). Ces récepteurs peuvent être divisés en deux groupes, de type activateur ou inhibiteur. Le rôle des récepteurs de type inhibiteur (iNKR) est d’antagoniser la signalisation des récepteurs activateurs (dont le TCR) via la reconnaissance des molécules du CMH-I. En cas de diminution d’expression du CMH-I, fréquente dans les infections virales ou au cours de la transformation tumorale, ces récepteurs ne transmettront donc plus leurs signaux inhibiteurs (hypothèse du « soi manquant »). Les récepteurs activateurs (aNKR) reconnaissent généralement des molécules apparentées au CMH-I telles que MICA/MICB ou les protéines de la famille RAET (aussi appelées ULBP) dont l’expression est initiée en cas de stress cellulaires. Comme pour le CMH-I, de nombreuses protéines virales sont impliquées dans l’inhibition de l’expression de ces marqueurs de stress notamment pour échapper à la cytotoxicité des cellules NK. Pour les lymphocytes T γδ, cette caractéristique a été principalement étudiée dans le cas de la sous-population Vγ9/Vδ2 humaine. La très grande majorité des cellules de cette souspopulation exprime des récepteurs de type inhibiteurs (67) jouent un rôle majeur dans la régulation de leur activation, notamment le couple CD94/NKG2A qui reconnaît principalement HLA-E. Cependant, cette régulation reste un phénomène très complexe et multifactoriel dépendant de l’intégration des signalisations induites par de nombreux récepteurs activateurs et inhibiteurs (68). 52 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Plus récemment, une nouvelle fonction effectrice a également été décrite pour les lymphocytes T humains de type Vγ9/Vδ2. Cette sous-population, une fois activée, présenterait en effet les caractéristiques d’une cellule présentatrice d’antigènes : activation de l’expression de CCR7 (favorisant une migration vers les ganglions lymphatiques) et des antigènes des CMH-I et II, comparable au phénotype des cellules dendritiques ; induction de la capacité d’internalisation et de présentation d’antigènes solubles ; forte capacité à activer des lymphocytes T CD8 naïfs (69, 70). Ces caractéristiques soulignent une fois de plus la position des lymphocytes T γδ à l’interface entre immunité innée et immunité adaptative. 3.2) Fonctions régulatrices Faisant partie de la première ligne de défense contre les pathogènes, les lymphocytes T γδ participent à la régulation des autres sous-populations du système immunitaire. Ce rôle est principalement rempli par leur capacité à sécréter rapidement de nombreuses cytokines. Un des rôles importants dans le passage de relai entre immunité innée et adaptative par les lymphocytes T γδ pourrait résider dans leur forte capacité à stimuler les cellules dendritiques immatures. Cette propriété a principalement été décrite pour les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 et se déroule via la sécrétion de diverses cytokines, notamment l’IFN-γ et le TNF-α (71, 72). Récemment, ils ont également été décrits comme antagonisant les lymphocytes T CD4 régulateurs dans le cadre de la réponse contre les mycobactéries (73). Les lymphocytes T γδ sont généralement associés à une réponse de type Th1. Néanmoins certaines sous-populations pourraient également avoir un rôle voisin des Th2, par exemple en activant les lymphocytes B, participant ainsi à l’immunité humorale. C’est le cas d’une souspopulation Vγ9/Vδ2 chez l’homme, définie par le marqueur CXCR5, qui potentialise la sécrétion d’anticorps par les lymphocytes B. Ce mécanisme fait intervenir principalement deux cytokines, l’IL-4 et l’IL-10, ainsi que CD40L et ICOS, des molécules de co-stimulation 53 Introduction II : Les lymphocytes T γδ classiquement impliquées dans l’activation des lymphocytes B (74). De façon similaire, les lymphocytes T γδ intra-épithéliaux de l’intestin chez la souris (Vγ7) sécrètent du TGF-β, cytokine jouant un rôle important dans la production des IgA, anticorps classiquement associés aux muqueuses (75). Certains lymphocytes T Vγ1 pourraient intervenir en fin de réponse immunitaire en participant à l’arrêt de la réaction inflammatoire (via la secrétion de cytokines comme l’IL-4) et l’élimination de cellules activées, comme les macrophages (76). Enfin, de nombreuses études in vivo ont montré que les lymphocytes T γδ participent également à l’induction de la tolérance périphérique, mais les mécanismes sous-jacents sont peu connus (77). En complément de ces rôles de modulation du système immunitaire, les sous-populations γδ intra-épithéliales jouent également un rôle très important dans le maintien de l’intégrité des tissus auxquels elles sont associées. Cette propriété a particulièrement été étudiée pour les lymphocytes T Vγ5/Vδ1 chez la souris. En plus de leur implication dans les mécanismes de défense contre des pathogènes ou dans l’immuno-surveillance, ces lymphocytes sont également une source importante de facteurs de croissance notamment pour les kératinocytes (Keratinocyte Growth Factor, KGF), favorisant ainsi la régénération du tissu endommagé suite à une blessure ou une infection (78). Cette capacité a également été décrite pour les lymphocytes T γδ intra-épithéliaux de l’intestin (79). Ces fonctions très variées (Figure 10) suggèrent que les lymphocytes T γδ, bien que plus rares que les lymphocytes T conventionnels, jouent un rôle primordial dans le maintien de l’intégrité de l’organisme, en participant directement ou indirectement aux réponses immunitaires, ainsi qu’.à l’homéostasie tissulaire. Ceci est validé par de nombreux modèles murins déficients pour tout ou partie des sous-populations γδ et des données décrivant le rôle de plusieurs de ces sous-populations dans des pathologies diverses décrites ci-après. 54 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Figure 10. Fonctions des lymphocytes T γδ. Les principales fonctions décrites des lymphocytes T γδ sont schématisées. Elles sont en général restreintes à des populations particulières. Voir le texte pour le détail. LB, LT : Lymphocytes B et T. CD : cellule dendritique. 4) Lymphocytes T γδ et pathologies : dualité de leurs rôles. Compte tenu de leur grande variété de fonctions et de leur localisation préférentielle au niveau des épithéliums, donc en première ligne de défense de l’organisme, les lymphocytes T γδ jouent un rôle important dans le contrôle des infections. Ayant souvent des propriétés cytotoxiques et un profil de cytokines plutôt de type Th1, ils sont impliqués dans la défense contre divers pathogènes intracellulaires. Ils pourraient également moduler le développement de diverses pathologies auto-immunes et inflammatoires. Enfin, ils jouent un rôle primordial dans l’immuno-surveillance des cancers. Les lymphocytes T γδ contribuent à la protection de l’organisme, mais ils peuvent également avoir des effets néfastes. 4.1) Pathogènes intracellulaires 4.1.1) Bactéries et parasites Un des tout premiers rôles des lymphocytes T γδ dans la réponse dirigée contre les pathogènes a été suggéré par leur capacité à être activés par des extraits issus de préparations 55 Introduction II : Les lymphocytes T γδ mycobactériennes (Purified Protein Derivative ou PPD). Ceci a été montré chez la souris aussi bien que chez l’homme et originellement l’antigène impliqué dans cette activation a été identifié comme étant un homologue mycobactérien de la protéine Hsp60 (Heat shock protein de 60kDa) (80-82). La réponse contre les mycobactéries a par la suite été restreinte, chez l’homme, à la sous-population Vγ9/Vδ2, qui est largement majoritaire au niveau du sang périphérique (83, 84). Les antigènes mycobactériens principalement responsables de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 humains n’ont été caractérisés que plus tard, et correspondent à de petits alkyls phosphorylés appelés phosphoantigènes (85) (voir Chapitre II, section 5.2, p.67). Ces antigènes ont par la suite été décrits comme produits par de nombreuses autres bactéries intracellulaires, ce qui explique la large réactivité des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Cette sous-population joue également un rôle important dans la défense contre l’infection par diverses souches de Plasmodium, l’agent pathogène responsable du paludisme, toujours via l’activation par des phosphoantigènes (86). Enfin, les lymphocytes T γδ sont, aussi bien chez l’homme que chez la souris, impliqués dans la réponse contre d’autres pathogènes intracellulaires tels que les leishmanies ou Listeria monocytogenes (87, 88). 4.1.2) Virus Le rôle primordial des lymphocytes T αβ cytotoxiques (CD8+) ainsi que des cellules NK dans l’immunité anti-virale est connu depuis de nombreuses années. Les lymphocytes T γδ présentant les caractéristiques de ces deux types de cellules immunitaires, il n’est pas étonnant qu’ils participent très largement aux défenses de l’organisme contre les virus. De nombreux travaux chez la souris ont décrit l’activation des lymphocytes T γδ lors d’infections virales variées (89) comme le virus de la leucémie murine (MuLV), certains virus de la famille de l’Influenza, ou le virus de Sendaï pour en nommer quelques uns. Cette large réactivité est 56 Introduction II : Les lymphocytes T γδ probablement due à la reconnaissance des cellules infectées via les NKR plutôt que grâce à des antigènes spécifiques (90). Chez l’homme, les deux virus principalement étudiés dans le contexte des lymphocytes T γδ sont le Cytomégalovirus (CMV) et le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH). L’infection par le CMV est généralement bénigne chez les individus immunocompétents. En revanche, les patients recevant une greffe d’organe étant généralement sous traitement immunosuppresseur, une infection par le CMV induit de nombreuses manifestions inflammatoires pouvant mettre en jeu le pronostic vital. C’est dans ce cadre que l’activation des lymphocytes T γδ, et plus particulièrement des sous-populations humaines Vδ1 et Vδ3, a originellement été identifiée (91). L’infection par le CMV induit une expansion durable de ces sous-populations γδ, ainsi qu’un biais vers un phénotype de type effecteur cytotoxique et mémoire, avec une nette sélection de sous-types de TCR particuliers (92, 93). L’antigène reconnu par les sous-populations γδ impliquées dans la réponse contre le CMV n’a à l’heure actuelle pas été identifié, mais comme souvent dans les réponses non-conventionnelles antivirales, il s’agit probablement d’un ligand endogène de stress, exprimé en réponse à l’infection. Il est peu probable que le mécanisme principal fasse intervenir uniquement les NKR, puisque dans ce cas les lymphocytes T Vγ9/Vδ2, majoritaires, devraient largement participer à la réponse contre le CMV, ce qui n’est pas le cas. La relation entre le VIH et les lymphocytes T γδ est complexe et fait intervenir différentes sous-populations. Comme mentionné précédemment, la population majoritaire dans le sang périphérique est de type Vγ9/Vδ2, représentant environ 80% des lymphocytes T γδ circulants chez la plupart des individus sains. Lors de l’infection par le VIH, il y a une expansion des lymphocytes T γδ caractérisée par une inversion complète du rapport entre les populations 57 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Vδ2+ et Vδ1+ (94). Bien que les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 soient capables de répondre de manière efficace aux cellules infectées par le VIH in vitro (95, 96), leur nombre est dramatiquement réduit au cours de la progression de la maladie et le faible pourcentage restant présente des déficiences fonctionnelles importantes au niveau de leur prolifération et de leurs fonctions effectrices. Les raisons de cette déplétion sélective ne sont pas claires, mais elle pourrait être due à un épuisement du répertoire Vδ2 suite à une activation chronique (97). Certaines sous-populations Vδ2 exprimant le marqueur CD4, on peut émettre l’hypothèse que le VIH est capable d’infecter ces cellules avec des conséquences négatives pour l’ensemble des sous-populations. Les raisons de l’inversion Vδ2/Vδ1 sont encore discutées. L’idée qu’une réponse anti-VIH médiée par des sous-populations Vδ1 se développe, supportée par le fait que ces cellules sont capables de détruire des cellules infectées (98), est envisageable. Néanmoins, il semble clair que cette réponse est relativement inefficace in vivo, et des données expérimentales indiquent qu’il n’y a pas de sélection de TCR Vδ1 particuliers (99), ce qui suggère qu’il n’y a pas réellement de développement d’une réponse spécifique des lymphocytes T Vδ1 contre le VIH. Pour finir, la déplétion des sous-populations Vγ9/Vδ2 participe largement au développement des pathogènes opportunistes, notamment les mycobactéries. Les travaux sur les relations entre lymphocytes T γδ et VIH représentent donc des voies potentiellement importantes dans l’étude de la physiopathologie du SIDA. 4.2) Pathologies inflammatoires et auto-immunes Le fait que les lymphocytes T γδ modulent de nombreuses autres populations du système immunitaire et qu’ils aient un potentiel auto-réactif important suggère qu’ils pourraient participer au contrôle aussi bien qu’au développement de pathologies auto-immunes. Plusieurs travaux chez la souris vont dans ce sens. Dans plusieurs modèles animaux, comme 58 Introduction II : Les lymphocytes T γδ ceux de la myocardite (100), de l’arthrite réactive (101), de l’uvéite (102), ou du lupus (103), les lymphocytes T γδ semblent capables de diminuer ou d’exacerber les symptômes. Néanmoins, de nombreux travaux ont montré que les lymphocytes T γδ sont capables de réduire l’inflammation et les dommages tissulaires en contrôlant la sur-activation des lymphocytes T αβ. Les biais pro- ou anti-inflammatoires pourraient dans certains cas être le résultat de l’utilisation de lignées murines différentes. Ces effets divergents pourraient dépendre des sous-populations γδ mises en jeu. En effet, dans plusieurs cas les populations pathogéniques sont CD8+, ou sécrètent de l’IL-17 (104). Chez l’homme, l’implication des lymphocytes T γδ dans le développement de pathologies auto-immunes et inflammatoires a également été étudiée. Des variations des populations γδ ont par exemple été observées dans le diabète gestationnel et le lupus (105, 106). La pathologie la plus étudiée dans ce cadre est probablement la sclérose en plaques. De nombreux travaux ont pu mettre en évidence un lien entre le développement de cette pathologie et les lymphocytes T γδ, qui pourraient participer activement à la formation des lésions. Deux mécanismes sont principalement en cause : une cytotoxicité directe dirigée contre certaines cellules du système nerveux central (principalement les oligodendrocytes), et une forte production d’IL-17, cytokine ayant le plus grand potentiel pro-inflammatoire et qui est impliquée dans de nombreuses pathologies auto-immunes et inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, ou la maladie de Crohn (107). Ces résultats sont par ailleurs confirmés dans des modèles murins d’EAE, reproduisant la pathologie humaine assez fidèlement. Encore une fois, l’intervention des lymphocytes T γδ dans cette pathologie est assez complexe, puisqu’ils pourraient également s’avérer protecteurs. De très nombreux facteurs pourraient influencer leur rôle exact, comme les sous-types de populations 59 Introduction II : Les lymphocytes T γδ étudiés, le modèle murin considéré, ou même le stade de la maladie auquel ils interviennent (108). Enfin, une forte infiltration de lymphocytes T γδ a été observée dans les lésions athérosclérotiques, et serait probablement liée à la surexpression d’Hsp60 (109), protéine dont l’expression à la surface des cellules a été rapportée comme influençant la réactivité des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 humains (110). Ceci a également été décrit dans le développement de la maladie de Behçet, une vascularite systémique (111). Globalement, les liens entre lymphocytes T γδ et pathologies inflammatoires ou autoimmunes apparaissent extrêmement complexes et sont encore mal compris, surtout chez l’homme, mais méritent certainement des travaux plus approfondis. 4.3) Cancer Les premières études fonctionnelles sur les lymphocytes T γδ ont très vite mis en évidence leur capacité à lyser in vitro des cellules tumorales, que ce soit des lignées (112) ou des tumeurs autologues (113). Globalement, cette capacité est étendue à tous les sous-types γδ et fait intervenir les NKR, les cellules tumorales perdant souvent l’expression du CMH-I (leur permettant d’échapper aux lymphocytes T CD8+) ou présentant une surexpression de molécules de stress liant les aNKR. Il n’y a donc pas nécessairement reconnaissance d’un antigène spécifique des tumeurs ni de restriction à un type γδ particulier. Ces cellules ont donc un potentiel de réactivité très large, ce qui fait leur immuno-manipulation dans le traitement des cancers une perspective séduisante. L’association courante des lymphocytes T γδ avec des tissus déterminés est également une propriété intéressante mais qui reste peu caractérisée chez l’homme. Les études sur des sous-populations particulières et leur réactivité anti-tumorale ont été extrêmement nombreuses, et plusieurs antigènes tumoraux ont été proposés, dont les 60 Introduction II : Les lymphocytes T γδ phosphoantigènes, des protéines de la famille des Hsp, ou des molécules de stress (voir Tableau 2, p.64). La participation importante des lymphocytes T γδ dans l’immunosurveillance des cancers a également été mise en évidence dans de nombreux modèles murins et pour différents types de cancers, que ce soit par utilisation de lignées invalidées pour toutes les sous-populations (114) ou pour une sous-population particulière. Par exemple, l’invalidation des lymphocytes T Vγ5/Vδ1 (DETC), spécifiques de la peau, entraîne une forte susceptibilité à la carcinogénèse chimique (115). Par ailleurs, cette étude montre que bien que des lymphocytes γδ exprimant un TCR différent remplacent les DETC en cas de déficience, ils sont incapables de fournir une protection efficace. Ceci indique donc qu’il y a malgré tout une certaine spécificité de la réponse anti-tumorale en fonction des sous-populations γδ considérées, et reflète peut-être la capacité naturelle de ces sous-populations à interagir de manière spécifique avec un type de cellules épithéliales donné. Chez l’homme, de nombreuses études chez des patients ont pu montrer une proportion importante de lymphocytes T γδ parmi les lymphocytes infiltrant des tumeurs (appelés TIL pour Tumor Infiltrating Lymphocytes), par exemple dans le cas du mélanome (116) ou de l’hépatocarcinome (117). Associé au fait que ces lymphocytes sont capables de lyser des cellules tumorales in vitro, ceci a donc encouragé le développement de protocoles précliniques et cliniques utilisant les lymphocytes T γδ comment agent thérapeutique (118-120). De même que les lymphocytes T γδ ont parfois des effets opposés dans certaines pathologies auto-immunes ou inflammatoires, un travail chez la souris montre que ces lymphocytes pourraient jouer un rôle pro-tumorigène (121). De plus, deux études récentes ont montré que les cellules souches mésenchymateuses (MSC), qui infiltrent très souvent les 61 Introduction II : Les lymphocytes T γδ masses tumorales, sont capables de réguler négativement l’activation des lymphocytes T γδ de type Vγ9/Vδ2, principalement via la production de prostaglandine E2 (122, 123). Cette propriété des MSC pourrait en revanche s’avérer utile dans le traitement de pathologies autoimmunes ou inflammatoires impliquant les lymphocytes T γδ. Les lymphocytes T γδ sont donc une cible très intéressante dans le développement de traitements pour des pathologies extrêmement variées. Néanmoins, ceci reste encore très limité du fait des connaissances toujours très restreintes sur ces sous-populations lymphocytaires non-conventionnelles. Comme mentionné plusieurs fois au cours de cette introduction, le principal facteur limitant est le manque cruel de connaissances sur les antigènes que ces lymphocytes reconnaissent via leur TCR. 5) Antigènes reconnus par les TCR γδ : une diversité déroutante. A l’heure où les techniques d’études de biochimie et d’identification des protéines ont fait des progrès considérables (l’HPLC, la spectrométrie de masse, et le séquençage, pour ne citer qu’elles, étant quasiment devenues des pratiques de routine) il peut paraître étonnant que les antigènes activant les lymphocytes T γδ soient totalement inconnus pour la majorité des souspopulations. Ceci est probablement dû à plusieurs facteurs, notamment une apparente divergence entre les sous-populations humaines et murines. L’utilisation fréquente de clones cellulaires, pouvant avoir des réactivités particulières et non représentatives d’une souspopulation γδ dans son ensemble, a probablement contribué à une accumulation de données n’étant pas forcément pertinentes. Evidemment, ce dernier point est longtemps resté un cercle vicieux. Comment étudier une sous-population précise si l’on n’a aucun moyen de l’amplifier de manière spécifique ? L’utilisation d’anticorps spécifiques et de méthodes de purification permet néanmoins aujourd’hui de pallier à ce problème dans certains cas. 62 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Par ailleurs, les quelques antigènes identifiés jusqu’à présent (Tableau 2) sont tellement différents que la recherche d’autres molécules activant les lymphocytes T γδ de façon spécifique ne peut à priori pas se baser sur les découvertes précédentes. Ces antigènes ayant souvent été identifiés à partir d’un nombre très limité de clones, ils pourraient représenter des cas particuliers anecdotiques plutôt qu’une règle générale applicable à des sous-populations entières. Nous nous concentrerons sur les antigènes les mieux caractérisés et activant des proportions importantes de sous-populations γδ. 5.1) Molécules apparentées au CMH La reconnaissance antigénique par les lymphocytes T γδ n’est pas restreinte par le CMH, au sens strict, conventionnel, du terme. A part pour certains clones décrits (voir Tableau 2), ils ne reconnaissent donc généralement pas d’antigènes peptidiques présentés par le CMH. Par exemple, il a clairement été établi que les antigènes activant la sous-population humaine Vγ9/Vδ2 peuvent être présentés par des cellules déficientes pour l’expression de ces molécules (124). En revanche, le CMH, et plus particulièrement de classe I, n’est pas totalement étranger aux lymphocytes T γδ. Comme nous l’avons vu, il est capable de réguler leur activité par interaction avec les NKR. De plus, un certain nombre de sous-populations ont été très étudiées pour leur capacité à reconnaître des molécules apparentées au CMH. L’exemple le mieux caractérisé correspond aux molécules murines T10 et T22, qui sont apparentées au CMH-I, associées à la β2m, mais ne présentent pas de peptides. Leur expression est augmentée en cas de stress cellulaire. Originellement identifiées comme ligands activant deux clones γδ, KN6 et G8 (125, 126), leur reconnaissance a pu être étendue à une proportion non négligeable de lymphocytes T γδ chez la souris (0.3 à 0.6% des γδ présents dans la rate, et environ le même pourcentage dans l’intestin) (127). 63 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Sous-populations Antigène Références Vγ1 Hsp60 (128) Vγ2/Vδ5 (clone LBK5) I-Ek (129) Vγ2/Vδ8 (clone TgI4.4) HSV-gI (130) Vγ1, Vγ4, Vγ7 T10/T22 (131) Vγ1 (2 hybridomes) CL et apoH (132) Vδ1 (IEL) MICA/B (133) Vδ1 (clones) Lipohexapeptides (134) Vδ1 (clones) HLA-A2, -A24 (135, 136) Vδ1 (clones) CD1c (137) Vγ9/Vδ2 Phosphoantigènes (85, 138) Vγ9/Vδ2 Aminobisphosphonates (139) Vγ9/Vδ2 (clones) SEA (140) Vγ9/Vδ2 Alkylamines (141) Vγ9/Vδ2 (clones) Peptides Hsp/TT + HLA-DRw53 (142) Vγ9/Vδ2 Hsp60 (143) Vγ9/Vδ2 Ecto-F1-ATPase/apoA-I (144) Murines Humaines Tableau 2. Les antigènes activant les lymphocytes T γδ. Ce tableau résume les antigènes décrits dans la littérature. Ils témoignent de la grande diversité de la nature des ligands reconnus par des TCR γδ. Néanmoins la plupart d’entre eux restent décrits pour un petit nombre de clones cellulaires. La sous-population la mieux connue à l’heure actuelle à ce sujet reste les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 humains. Hsp60 : Heat shock protein de 60kDa ; I-Ek: Isotype de CMH-II murin ; HSV-gI: protéine gI du virus de l’herpès (Herpes Simplex Virus) ; T10/T22 : Molécules apparentées au CMH-I chez la souris ; CL : Cardiolipine (lipide principalement retrouvé dans la membrane interne de la mitochondrie) ; apoH : apolipoprotéineH ; IEL : Intra-Epithelial Lymphocytes ; MICA/B : MHC class I polypeptide-related sequence A/B ; HLA-A2, -A24 : Allèles de l’isotype HLA-A (CMH-I humain) ; SEA : Staphylococcal Enterotoxin A ; TT : Toxine Tétanique ; HLADRw53 : Allèle de l’isotype HLA-DR (CMH-II humain) ; apoA-I : apolipopréotéineA-I. Adapté de (62) 64 Introduction II : Les lymphocytes T γδ La reconnaissance de T22 est commune à des sous-populations exprimant des TCR portant des régions variables différentes. En effet, la caractérisation des sous-populations réactives a montré qu’elles exprimaient un TCR de type Vγ1, Vγ4 (majoritaires en périphérie) et Vγ7 (présentes dans l’intestin). Néanmoins, tous les TCR réactifs identifiés ont la propriété marquante de porter un motif précis au niveau de la boucle CDR3 de la chaîne δ (131). Enfin, la reconnaissance de T22 par le TCR du clone G8 a pu être montrée de manière directe (Figure 11 et (145)) par ce qui reste à l’heure actuelle le seul cas de co-cristallographie d’un TCR γδ avec son ligand. Chez l’homme, deux cas de reconnaissance de molécules apparentées au CMH ont été rapportés. MICA a été identifié comme étant le ligand de certains TCR de type Vδ1 (133). Comme mentionné précédemment, cette molécule est également reconnue par certains NKR tels que NKG2D. On peut alors se demander pourquoi une sous-population reconnaissant la même molécule via un deuxième type de récepteur se serait développée. Toutefois, la redondance est une caractéristique fréquente du système immunitaire et pourrait permettre un meilleur contrôle de l’immuno-surveillance en cas de dysfonctionnement d’un des deux systèmes. Une étude consécutive par les mêmes auteurs a d’ailleurs montré que des cellules n’exprimant pas NKG2D, et transfectées par un TCR isolé à partir d’un clone réactif, acquéraient la capacité d’être activées par MICA (146). La possibilité que les clones identifiés reconnaissent MICA par le biais d’autres récepteurs a également été exclue par un travail plus récent montrant une interaction directe entre un TCR γδ et MICA (147). Enfin, certains clones, toujours de type Vδ1, sont capables de reconnaître des lipides présentés par CD1c (148) qui est principalement exprimé par les cellules dendritiques et les lymphocytes B. Ces lipides peuvent d’ailleurs être d’origine endogène ou exogène. 65 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Figure 11. Structure tridimensionnelle d’un TCR γδ et de son ligand, T22. (A) Le contact entre les deux molécules est uniquement assuré par la chaîne δ du TCR et plus particulièrement la boucle CDR3 qui interagit avec le plateau (feuillets β représentés par des bandes fléchées) et le domaine α1. Le type d’interaction est radicalement différent de la reconnaissance du CMH-I par un TCR αβ (B). Tiré de (145). Les lymphocytes T γδ sont donc complémentaires d’autres sous-populations T (conventionnelles ou non) et participent à la complexité de la biologie des molécules CD1. En revanche, aucune donnée démontrant une interaction directe n’a été obtenue, et tous les lymphocytes Vδ1+ ne reconnaissent pas CD1c. Il devrait en théorie s’agir de sous-populations différentes de celles reconnaissant MICA, et la reconnaissance de ces deux groupes de molécules fait peut-être intervenir, par analogie avec T10/T22, des TCR relativement divers mais portant des motifs structuraux conservés. 66 Introduction II : Les lymphocytes T γδ 5.2) Antigènes non-peptidiques Ce terme relativement vague désigne différentes classes d’antigènes activant les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Il doit son origine au fait que le potentiel stimulateur d’extraits mycobactériens pour les lymphocytes T γδ humains, d’abord attribué aux protéines de type Hsp, a par la suite été montré comme étant résistant à diverses activités protéasiques (149). Les antigènes majoritairement responsables de l’activation de cette sous-population γδ ont par la suite pu être purifiés et caractérisés. 5.2.1) Phosphoantigènes Les phosphoantigènes représentent une classe de molécules de très petite taille (inférieure à 1kDa) et dont la structure globale principale est celle des isoprénoïdes, comportant une courte chaîne hydrocarbonée (le plus souvent à 5 carbones) ainsi qu’un groupement pyrophosphate (Figure 12). Ils ont à l’origine été isolés à partir d’extraits de Mycobacterium tuberculosis. TUBAg 1 et 2 sont des antigènes de type pyrophosphate alors que TUBAg3 et 4 correspondent à des dérivés nucléotidiques de TUBAg2 et 1, respectivement (85). Des travaux indépendants ont identifié le même type d’antigènes, synthétiques comme l’Ethyl PyroPhosphate (EtPP), ou naturels comme l’Isopentenyl PyroPhosphate (IPP) et son isomère le DiMéthyl-Allyl PyroPhosphate (DMAPP) (138, 150). Leur reconnaissance est dépendante du TCR comme suggéré par le transfert de la réactivité pour ces antigènes par transfection des chaînes du TCR Vγ9/Vδ2 dans un variant de la lignée Jurkat, déficient pour l’expression du TCR αβ (151). Il a été montré que la réactivité aux phosphoantigènes est déterminée par l’expression d’un segment Jγ de type 1.2 (aussi appelé JγP) et que la boucle CDR3 de la chaîne γ est donc essentielle (152, 153). 67 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Figure 12. Exemples de phosphoantigènes. Les phosphoantigènes les plus utilisés sont indiqués ici, et classés dans l’ordre croissant de leur bioactivité (le moins actif étant l’EtPP). Le DMAPP et l’IPP sont des isomères et sont produits par toutes les cellules vivantes. L’EtPP est synthétique. L’HDMAPP est un précurseur du DMAPP chez certaines plantes, la plupart des bactéries et quelques parasites. A l’heure actuelle, l’antigène naturel le plus efficace qui ait été identifié est l’HydroxyDiMéthyl-Allyl PyroPhosphate (HDMAPP, aussi appelé HMBPP pour Hydroxy-Méthyl Butényl PyroPhosphate), environ 1000 fois plus efficace que l’IPP ou le DMAPP. Cet antigène est un intermédiaire de la voie du DeOxy-Xylulose-Phosphate (DOXP), voie alternative de la synthèse du cholestérol chez certaines plantes, la majorité des bactéries et archées, et quelques parasites. Tous les eucaryotes (végétaux exclus) n’utilisent que la voie classique du mévalonate pour synthétiser le cholestérol (également utilisée par la plupart des organismes utilisant la voie DOXP). Ceci explique probablement la très forte activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par l’HDMAPP par rapport à l’IPP puisqu’il est un antigène totalement étranger à l’organisme humain. Comme mentionné précédemment, ces antigènes sont impliqués dans la reconnaissance d’un large spectre de pathogènes intracellulaires, et l’IPP a également été impliqué dans la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (154). 68 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Plusieurs travaux ont décrit les caractéristiques requises pour l’antigénicité de ces molécules (155, 156). Globalement, plusieurs points semblent importants : la chaîne hydrocarbonée doit être courte (5 carbones ou moins) et ne pas comporter de cycle ; les versions mono- ou triphosphate d’un antigène sont généralement très peu actives ; le traitement de ces antigènes par des phosphatases élimine complètement leur activité ; enfin la liaison entre les deux atomes de phosphore doit être assurée par un oxygène, et si celui-ci est remplacé par un carbone par exemple, l’antigène perd toute son activité. De plus, la conformation tridimensionnelle de ces molécules est importante pour leur bioactivité, les stéréoisomères Z de ces molécules étant quasiment inactifs (157). Les raisons de cette spécificité des propriétés physico-chimiques restent encore obscures mais sont probablement le reflet d’une nécessité de compatibilité structurale avec le TCR et une hypothétique molécule de présentation. Enfin, si les dérivés nucléotidiques des phosphoantigènes ont été parfois utilisés, aucun travail n’a vraiment étudié leurs propriétés de façon précise. La reconnaissance des phosphoantigènes est indépendante de tous les types de molécules de présentation connues (CMH-I et -II, CD1, etc) (156). De plus, elle ne dépend pas de cellules présentatrices d’antigènes spécialisées. En revanche, un contact cellulaire, qui peut être effectué entre deux lymphocytes T Vγ9/Vδ2, est indispensable à l’activation par ces antigènes (124), ce qui suggère qu’une structure de présentation est très probablement requise. Bien qu’il puisse y avoir des variations d’efficacité, la plupart des cellules sont capables de présenter les phosphoantigènes, ce qui indique que la structure en question est exprimée de façon ubiquitaire et probablement non polymorphe. En revanche, ces cellules doivent être d’origine humaine (158). Des travaux récents indiquent par ailleurs que cette structure de présentation est de nature protéique, puisque sensible à la trypsine (159). Bien que la structure tridimensionnelle du TCR Vγ9/Vδ2 suggère qu’il puisse lier des phosphoantigènes (41), 69 Introduction II : Les lymphocytes T γδ aucune étude n’a pu mettre en évidence de liaison directe. Ceci est probablement dû au fait que la reconnaissance dépend de la liaison du phosphoantigène sur sa molécule présentatrice, de la même façon qu’un TCR αβ conventionnel ne peut lier son peptide spécifique en dehors du contexte du CMH par exemple. Bien que ces phosphoantigènes soient connus depuis 15 ans, le mécanisme exact de leur reconnaissance est toujours mal caractérisé. 5.2.2) Aminobisphosphonates et alkylamines Ces deux types de molécules ont été décrits pour leur capacité à activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 et à l’origine leur mode de reconnaissance était considéré comme équivalent à celui des phosphoantigènes classiques. Néanmoins, il s’est vite avéré que leur reconnaissance comporte des différences fondamentales, notamment une dépendance stricte de cellules présentatrices d’antigènes (pas forcément spécialisées) ainsi qu’une réponse beaucoup moins rapide. En d’autres termes, leur potentiel activateur est dépendant de leur capture et leur « apprêtement » par des cellules cibles a été évoqué. Leur structure (Figure 13) est également différente de celle des phosphoantigènes classiques et ne présente pas les caractéristiques décrites plus haut. Figure 13. Structure générale des aminobisphosphonates et des alkylamines. Le radical R des aminobisphosphonates actifs (A) comporte toujours une fonction amine (les bisphosphonates sont inactifs). Les plus utilisés sont le zoledronate (R = cycle pentavalent C3N2H3) et le pamidronate (R = -CH2-CH2-NH2). Les alkylamines actives comportent un radical alkyl court (entre 2 et 5 carbones). 70 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Les aminobisphosphonates sont des drogues couramment utilisées depuis de nombreuses années dans le traitement de diverses pathologies osseuses comme l’ostéoporose. Leurs propriétés anti-tumorales ont été découvertes plus tardivement et peuvent en partie être dues à leur capacité à activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (139). L’identification du mécanisme exact d’activation par les aminobisphosphonates a été rendu possible par l’identification de leur capacité à inhiber la Farnésyl PyroPhosphate synthase (FPP synthase), enzyme en aval de l’IPP dans la voie du mévalonate (160). Après internalisation par une cellule cible, par exemple une cellule tumorale, ces composés vont donc inhiber la FPP synthase et entraîner une accumulation d’IPP, responsable de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (154). Ces travaux ont confirmé l’implication de la voie du mévalonate dans le potentiel stimulant de lignées tumorales, en montrant que les statines par exemple, qui inhibent l’HMG-CoA Reductase en amont de l’IPP, réduisent fortement ce potentiel (Figure 14). Les alkylamines ont été identifiées à partir d’extraits de la bactérie Proteus morganii, dont le potentiel stimulant s’est avéré résistant, contrairement aux phosphoantigènes, au traitement par des phosphatases (141). Par la suite, la capacité de ces molécules à activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 a été attribuée à leur inhibition de la FPP synthase (161). Globalement, les alkylamines sont de moins bons inhibiteurs que les aminobisphosphonates, ce qui est reflété par leur potentiel activateur moindre. Il est donc à présent clair que les aminobisphosphonates et les alkylamines ne sont pas des antigènes au sens propre du terme, mais qu’ils induisent la production des phosphoantigènes classiques par les cellules traitées avec ces composés. 71 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Figure 14. La voie du mévalonate. Cette voie représente chez les espèces animales la seule voie de biosynthèse du cholestérol et de multiples composés (vitamines, cytochromes), et des dérivés de farnésylation et géranylation des protéines, essentiels pour de nombreuses fonctions cellulaires. L’IPP et le DMAPP (encadrés en bleu) sont des intermédiaires centraux de cette voie, et sont par ailleurs les seuls à avoir un potentiel antigénique significatif. Les variations de la quantité de ces antigènes par traitement avec les aminobisphosphonates et les alkylamines (augmentation, en vert) ou les statines (diminution, en rouge) influencent le potentiel stimulant de la cellule cible traitée. N-BP : aminobisphosphonates AA : Alkylamines 5.3) L’Ecto-F1-ATPase L’implication des phosphoantigènes dans la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 a été établie récemment, mais de nombreuses études antérieures ont postulé que cette reconnaissance pourrait faire intervenir un antigène différent. Les protéines de la famille Hsp ont longtemps été les candidates principales, mais des évidences directes de leur implication n’ont jamais pu être réellement fournies. Récemment, l’équipe a identifié l’Ecto-F1-ATPase, une forme de l’ATP synthase mitochondriale exprimée à la surface des cellules (voir Chapitre III, p.75) comme antigène 72 Introduction II : Les lymphocytes T γδ reconnu par le TCR Vγ9/Vδ2. La spécificité de cette reconnaissance a été démontrée par l’étude de la liaison du TCR sur de l’ATP synthase bovine purifiée par Résonance Plasmonique de Surface (RPS) et par ELISA, ainsi que la capacité de cette dernière à activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. De plus l’apolipoprotéine A-I (apoA-I, protéine majoritaire des lipoprotéines de haute densité ou HDL) est capable de lier à la fois l’Ecto-F1-ATPase et le TCR, renforçant probablement l’interaction entre ces deux complexes. Toutefois, cette caractéristique pourrait dépendre de séquences particulières portées par le TCR, puisque certains clones montrent une réactivité équivalente en présence ou non d’apoA-I (144). L’intervention de l’apoA-I dans la biologie des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 rappelle celle de l’apoE pour les lymphocytes NKT et souligne l’importance des liens entre l’immunité et le métabolisme lipidique ((162) et Annexes, Article 5, p.209), bien que les fonctions précises de ces deux apolipoprotéines ne probablement soient pas équivalentes. Ces données pourraient également être reliées à l’implication souvent suggérée des protéines de la famille Hsp (notamment Hsp60) dans la reconnaissance des tumeurs par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 et dans les réponses inflammatoires faisant intervenir les γδ en général (163, 164). Hsp60 est en effet une des principales chaperonnes mitochondriales participant à la conformation des nombreuses protéines, dont des sous-unités de l’ATP synthase (165) mais elle peut être également exprimée à la surface de divers types cellulaires (166). Dans ces circonstances, l’Ecto-F1-ATPase pourrait être un de ses récepteurs (167). On peut donc émettre l’hypothèse que cette liaison pourrait, comme celle de l’apoA-I, améliorer la reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase. Ceci réconcilierait ainsi les travaux récents sur la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 avec l’implication souvent décrite mais largement inexpliquée des protéines Hsp dans ce phénomène. Les fonctions précises de l’apoA-I et Hsp60 restent cependant à élucider. 73 Introduction II : Les lymphocytes T γδ Mes travaux de thèse ayant eu pour objet l’étude du rôle de l’Ecto-F1-ATPase dans la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2, le dernier chapitre de cette introduction bibliographique sera dédiée à quelques notions sur l’ATP synthase mitochondriale et à la revue des connaissances actuelles sur l’Ecto-F1-ATPase. 74 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE CHAPITRE III L’ATP SYNTHASE De la mitochondrie à la surface cellulaire 75 Introduction III : L’ATP Synthase L’ATP synthase est une fascinante machine moléculaire et le parfait exemple d’un nanomoteur. C’est l’une des enzymes les plus étudiées depuis les 40 dernières années et a valu aux Professeurs P.D. Boyer et Sir J.E. Walker le prix Nobel de Chimie en 1997 pour leurs travaux sur la compréhension de son mécanisme enzymatique et sur la détermination de sa structure tridimensionnelle (168-170). Son rôle central dans la production d’énergie est fondamental, une personne active synthétisant son propre poids en ATP chaque jour. Ce rôle essentiel est à présent complété par de nouvelles implications dans divers processus cellulaires, dues à une localisation inattendue de cette enzyme à la surface des cellules. Ce dernier chapitre d’introduction sera dédié à une brève description de l’ATP synthase mitochondriale, et à la revue des données actuelles sur l’ATP synthase de surface, aussi appelée Ecto-F1-ATPase. 1) La F1Fo ATP synthase mitochondriale 1.1) Généralités La F1Fo ATP synthase, l’enzyme terminale de la voie de la phosphorylation oxydative, est un moteur moléculaire complexe responsable de la très large majorité de la synthèse d’ATP chez tous les organismes vivants, à l’exception des archéobactéries qui utilisent une enzyme similaire, l’A1Ao ATP synthase (171). Elle est située au niveau de la membrane interne des mitochondries, de la membrane thylakoïde des chloroplastes chez les plantes, et de la membrane plasmique des bactéries. L’ATP synthase est concentrée au niveau des crêtes de la membrane interne, où elle fait partie d’un complexe appelé “ATP synthasome” en association avec un transporteur de phosphate inorganique (Pi) et l’Adenosine Nucleotide Translocase (ANT) qui permet l’échange entre ADP et ATP (172). Des résultats expérimentaux suggèrent que l’ATP synthase est organisée en dimères (173) voire même en oligomères (174). Cette 76 Introduction III : L’ATP Synthase organisation supramoléculaire est impliquée dans la génération des crêtes et dépend de certaines sous-unités transmembranaires (175). 1.2) Structure En dépit de quelques différences dans la composition en sous-unités, la structure générale de l’ATP synthase (Figure 15) ainsi que les séquences de ses sous-unités sont extrêmement conservées au cours de l’évolution. Dans les cellules eucaryotes, elle se compose de 16 sousunités différentes (les sous-unités α, β, et c étant présentes en plusieurs exemplaires dans le complexe entier). Elle comprend : - un domaine catalytique portant l’activité enzymatique composé de trois hétérodimères αβ. - un rotor formé des sous-unités γ, δ, ε et de l’anneau de sous-unités c (d’un nombre variable en fonction de l’espèce) - un stator comprenant les sous-unités a, b, d, e, f, g, A6L, F6 et OSCP, dont le rôle est de maintenir les dimères αβ immobiles et ancrés à la membrane, et dont la sous-unité a fait partie du canal à protons. L’ATP synthase est également divisée en deux grands domaines : le domaine F1 soluble (α, β, γ, δ, ε) portant l’activité catalytique et le domaine Fo associé à la membrane interne qui sert de canal à protons. La biogenèse de l’ATP synthase suit un mécanisme complexe se déroulant par étapes bien précises (176) qui implique au moins 5 facteurs d’assemblage identifiés chez la levure : Atp10p, Atp11p, Atp12p, Atp22p et Fmc1p (177-180). A l’heure actuelle seuls les orthologues humains d’Atp11p et Atp12p ont été identifiés (181). 77 Introduction III : L’ATP Synthase Figure 15. Structure de l’ATP synthase mitochondriale. Le domaine F1 comprend les trois hétérodimères αβ ainsi que les sous-unités γ, δ et ε ; le domaine Fo comprend toutes les sous-unités du stator (en vert) ainsi que l’anneau de sousunités c. Les sous-unités A6L, e, f et g n’ont pas été positionnées avec précision mais sont des protéines intramembranaires très probablement associées à la sous-unité a. Lors de la synthèse d’ATP, les protons passent au travers de la sous-unité a, intègrent l’anneau c, puis gagnent la matrice en repassant par la sous-unité a. Ils entraînent la rotation du rotor (en orange). Le mouvement de la chaîne γ change la conformation des sites catalytiques situés aux interfaces α/β et permet la liaison de l’ADP et du Pi ainsi que la synthèse et la libération de l’ATP, alternativement. 1.3) Mécanisme enzymatique Le domaine Fo utilise le gradient de protons créé par les quatre autres complexes de la chaîne respiratoire. Les données actuelles indiquent que le flux de protons passe à travers la sous-unité a pour rejoindre l’anneau de sous-unités c et entraîner sa rotation. Les autres sousunités du rotor étant solidaires de l’anneau c, la chaîne γ va elle aussi tourner sous l’action du flux de protons. Elle interagit alternativement avec les hétérodimères αβ et change leur conformation, permettant la synthèse d’ATP à partir d’ADP et de Pi. Dans le cas de l’ATP 78 Introduction III : L’ATP Synthase synthase des eucaryotes, le passage de 10 protons par l’anneau c entraîne un tour complet du rotor, et la synthèse de trois molécules d’ATP. La synthèse et l’hydrolyse d’ATP impliquent un mécanisme de « liaison-modification » (182, 183) dans lequel les sites catalytiques sont soumis à des modifications conformationnelles par interaction avec la sous-unité γ. Le domaine F1 porte également trois sites non-catalytiques dont le rôle proposé est de stabiliser l’enzyme et améliorer la synthèse ou l’hydrolyse d’ATP en liant des nucléotides (184). Toutefois, le mécanisme enzymatique exact est toujours débattu ; plusieurs résultats expérimentaux sont en faveur d’un mécanisme bi-site, pour lequel un des sites catalytiques est vide à tout moment (185), ou d’un mécanisme tri-site pour lequel tous les sites sont remplis (186). Le mécanisme rotationnel de l’ATP synthase a été visualisé par microscopie, grâce à un couplage de la chaîne γ à un filament d’actine fluorescent et une immobilisation des hétérodimères αβ (187). En l’absence d’un gradient de protons, ou si le domaine F1 est artificiellement découplé du domaine Fo, l’enzyme va se comporter comme une hydrolase d’ATP. Cette perte potentielle d’énergie est régulée par le peptide IF1 lorsque le gradient de protons décroît, par exemple en cas d’hypoxie qui entraîne un arrêt de la chaîne respiratoire. Dans des conditions normales, IF1 se présente sous la forme d’un homotétramère qui se change en homodimère lorsque le pH de la matrice mitochondriale diminue (188). Cette modification lui permet de se lier fortement à l’ATP synthase en interagissant à la fois à l’interface des dimères αβ et avec la chaîne γ, verrouillant ainsi la rotation de l’ATP synthase et empêchant l’hydrolyse d’ATP (189). En plus de dépendre du pH (donc de son oligomérisation), la liaison de l’IF1 dépend de l’activité catalytique de l’enzyme (190). La structure et le mécanisme rotationnel de l’ATP synthase ont fait l’objet de très nombreux travaux mais comportent toujours des éléments peu connus, tels que la localisation de 79 Introduction III : L’ATP Synthase certaines sous-unités et le mécanisme catalytique exact. De nombreuses revues détaillent les connaissances actuelles de façon très complète (191-193). 1.4) Pathologies liées à l’ATP synthase Etant donné son rôle essentiel et central dans la synthèse de l’ATP, les déficiences en ATP synthase sont impliquées dans des pathologies graves et souvent mortelles puisqu’elles entraînent une très forte réduction de la production d’ATP ainsi qu’une accumulation de composés extrêmement toxiques pour la cellule tels que les espèces réactives de l’oxygène (Reactive Oxygen Species ou ROS) (194, 195). Ces déficiences peuvent être dues à des mutations dans les gènes des sous-unités de l’ATP synthase, les plus fréquemment décrites touchant le gène atp6 (situé dans le génome mitochondrial) correspondant à la sous-unité a. Ces mutations sont responsables de pathologies neurodégénératives graves, à transmission maternelle, telles que le syndrome NARP (Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinitis Pigmentosa) ou le syndrome de Leigh (encéphalopathie sévère et fatale), en fonction du nombre de mutations hétéroplasmiques. Des défauts de la biogenèse de l’ATP synthase, dus à des mutations de gènes codant pour ses facteurs d’assemblage par exemple, ont également été décrits (196). Pour finir, des accumulations anormales de sous-unités de l’ATP synthase ont été trouvées dans diverses maladies neurodégénératives, par exemple la sous-unité c dans la céroïdelipofuscinose neuronale (Neuronal Ceroid Lipofuscinosis, NCL) (197, 198) ou la sous-unité α dans la maladie d’Alzeihmer (199). 2) L’Ecto-F1-ATPase Au cours des dernières années, de nombreux travaux réalisés par différentes équipes ont démontré la présence à la surface de cellules de mammifères de diverses sous-unités de l’ATP 80 Introduction III : L’ATP Synthase synthase (qui sera par la suite appelée Ecto-F1-ATPase). Bien que la structure exacte de cette ATP synthase exprimée de façon ectopique ne soit pas encore déterminée, il existe un certain nombre de données expérimentales indiquant qu’il s’agit probablement de la même entité que l’ATP synthase mitochondriale. 2.1) Ecto-F1-ATPase, la même enzyme que l’ATP synthase mitochondriale ? Le premier travail décrivant une expression en surface d’une sous-unité de l’ATP synthase a été publié par Das et al. (200). Ils ont montré que la sous-unité β est exprimée à la membrane plasmique de cellules tumorales et est impliquée dans la lyse de ces cellules par les cellules Natural Killer (NK) et Lymphokine Activated Killer (LAK). Depuis, de nombreux travaux, incluant ceux de notre laboratoire, ont décrit la présence de nombreuses sous-unités de l’ATP synthase à la surface d’une grande variété de cellules tumorales et normales. Bien que la plupart de ces travaux se soient focalisés sur les sous-unités α et β, quelques uns ont décrit la présence d’autres sous-unités à la surface de cellules. C’est le cas d’une publication récente qui a démontré l’expression à la surface des sous-unités FoI-PVP (un autre nom de la sous-unité b), γ et OSCP en surface d’hépatocytes de rat (201), et d’un autre travail montrant, par une approche protéomique, que toutes les sous-unités de l’ATP synthase étaient retrouvées au niveau des radeaux lipidiques isolés à partir de la lignée HepG2, un hépatocarcinome humain (202). Le peptide inhibiteur IF1 a également été détecté à la surface cellulaire (203). Il faut noter que la préparation de membranes plasmiques pures est extrêmement difficile à accomplir car facilement contaminée par des membranes issues d’autres organites intracellulaires. Des quantités très faibles de matériel mitochondrial pourraient expliquer la 81 Introduction III : L’ATP Synthase présence de sous-unités de l’ATP synthase dans ces préparations. Néanmoins, de nombreux travaux se sont basés sur des techniques de cytométrie de flux et de microscopie, sur cellules intactes, montrant une nette expression de ces sous-unités, et certains laboratoires utilisant des méthodes biochimiques ont inclus des contrôles de l’absence d’autres protéines mitochondriales dans leurs échantillons, éliminant de ce fait une possible contamination par du matériel mitochondrial (201, 204). Pour finir, la spécificité des anticorps utilisés pour la détection de l’Ecto-F1-ATPase pourrait être remise en question, si ces anticorps reconnaissent des protéines portant des épitopes communs avec l’ATP synthase (les sites nucléotidiques par exemple sont relativement conservés dans d’autres enzymes hydrolysant l’ATP). Plusieurs travaux ont néanmoins clairement montré que l’Ecto-F1-ATPase et l’ATP synthase mitochondriale ne sont qu’une seule et unique entité, en utilisant des techniques de spectrométrie de masse et de séquençage peptidique (200, 202, 205). La présence de sous-unités autres qu’α et β n’est d’ailleurs pas complètement inattendue. En effet, ces sous-unités ne comportant aucun domaine transmembranaire, l’expression d’autres protéines du complexe (notamment du domaine Fo) à la surface des cellules est à priori requise pour permettre une telle localisation de l’enzyme. En résumé, bien qu’une preuve formelle et définitive manque toujours, il semble à présent très probable que l’Ecto-F1-ATPase soit une forme exprimée en surface de l’ATP synthase mitochondriale. La liste des types cellulaires exprimant l’Ecto-F1-ATPase suggère par ailleurs que cette localisation ectopique n’est pas restreinte à un nombre limité de lignées cellulaires, mais apparaît comme très fréquente (Tableau 3). Parmi tous les types cellulaires que nous avons étudiés en utilisant diverses approches, seule la lignée 721.221 (une lignée B 82 Introduction III : L’ATP Synthase immortalisée par l’EBV) semble ne pas exprimer l’Ecto-F1-ATPase, ou du moins à des niveaux trop faibles pour être réellement détectables (204). Cellules / Tissus Sous-unités Méthodes Références K562, A549, Raji β B, CF, S (200) HUVEC α, β, IF1 (203, 206) HepG2, IHH, Hépatocytes humains α, β (205) 3T3-L1 α, β CF, MC RPS, CF, MC B, MC Jurkat β PR + SM (208) Hepatocytes de rat α, β, δ, γ, b, d, e, F6, OSCP MC (202) HaCat, peau humaine β PR + SM, MC (209) CF (144) Daudi, RPMI-8226, U937, SK-NEP, G401, α et/ou β G402 Awells, ST-EMO, HeLa, fibroblastes, Rmaα, β S Amygdale de rat β (207) B, MC, CF (204) MP (210) Neurones (hippocampe), neuroblastome et astrocytome α B, MC (211) Ostéosarcome α, β, d MC (212) Tableau 3. Sous-unités de l’Ecto-F1-ATPase à la surface de divers types cellulaires. Les principaux tissus et lignées cellulaires exprimant l’Ecto-F1 sont résumés ici. Les méthodes expérimentales utilisées sont précisées. B : biotinylation de protéines de surface ; CF : Cytométrie de Flux ; S : Séquençage ; MC : Microscopie Confocale ; RPS : Résonance Plasmonique de Surface (Biacore) ; PR + SM : Purification de Radeaux lipidiques et Spectrométrie de Masse ; MP : préparations de Membranes Plasmiques. Les lignées cellulaires sont d’origine humaine, sauf mention contraire. K562 : Erythroleucémie ; A549 : Adénocarcinome pulmonaire ; RPMI-8226 : Myélome B ; Raji, Daudi : Lymphomes de Burkitt ; Jurkat : Lymphome T ; HUVEC : cellules endothéliales humaines de veine du cordon ombilical ; HepG2 : Hépatocarcinome ; IHH : Hépatocypes immortalisés ; 3T3-L1 : fibroblastes murins (différenciés en adipocytes) ; HaCat : Kératinocytes immortalisés ; U937 : Leucémie monocytaire ; SK-NEP, G401, G402 : Adénocarcinomes rénaux ; Awells, ST-EMO : lymphocytes B immortalisés par l’EBV (STEMO provenant d’un patient atteint d’une déficience en CMH-I) ; HeLa : Adénocarcinome du col de l’utérus ; Rma-S : Lymphome T murin. 83 Introduction III : L’ATP Synthase 2.2) Une localisation inattendue et toujours inexpliquée Bien que des localisations subcellulaires multiples aient été décrites pour de nombreuses protéines, une expression de protéines mitochondriales à la surface des cellules est relativement rare et intrigante. A notre connaissance, il n’y a pas à l’heure actuelle de travaux décrivant le mécanisme utilisé par l’ATP synthase pour atteindre la surface cellulaire. Deux hypothèses sont envisageables : a) Les sous-unités de l’ATP synthase sont adressées à la membrane plasmique au lieu de la mitochondrie. Le concept de localisation multiple d’une protéine est relativement établi de nos jours et de nombreux mécanismes peuvent être impliqués (voir (213) pour une revue complète). Le premier impliquerait des isoformes différentes d’ARNm des sous-unités de l’ATP synthase, portant un peptide signal différent. C’est le cas de la sous-unité c bovine, pour laquelle deux isoformes ont été identifiées (214) mais ceci représente un cas isolé et à notre connaissance il n’y a pas de données expérimentales indiquant que ces différents peptides adressent l’ATP synthase à des destinations différentes. Une autre explication possible serait que les peptides signaux des sous-unités de l’ATP synthase soient ambigus, ce qui conduirait à une expression dans la mitochondrie ou à la surface des cellules. L’analyse des peptides signaux de l’ATP synthase à l’aide du programme SignalP (215) montre que certains portent des similarités avec des peptides d’adressage à la membrane plasmique, mais ce n’est le cas que pour un nombre très limité de sous-unités. Pour finir, certaines protéines portent deux peptides signaux distincts, les adressant à des localisations différentes, comme par exemple la Catalase A chez la levure (216). Cette dernière possibilité semble peu probable étant donné que les séquences des sous-unités de l’ATP synthase sont bien connues et ne semblent pas porter de peptide signal en plus de celui d’adressage à la mitochondrie. 84 Introduction III : L’ATP Synthase Même si cette première hypothèse ne peut pas être définitivement exclue, elle est à priori la moins probable, pour un certain nombre de raisons. Tout d’abord, elle impliquerait que toutes les sous-unités de l’ATP synthase portent des peptides signaux ambigus, ou qu’il existe différentes isoformes, et il n’y a à l’heure actuelle aucun élément dans ce sens, malgré une connaissance très précise des séquences de ces sous-unités. De plus, deux sous-unités (a et A6L) sont codées par des gènes mitochondriaux, et il semble peu probable qu’elles soient adressées à la membrane plasmique au lieu de rester dans la mitochondrie. Pour finir, les facteurs d’assemblage de l’ATP synthase devraient également avoir une autre localisation pour permettre l’expression du complexe entier et sa conformation correcte. b) L’hypothèse la plus simple, et donc la plus tentante, est qu’une fois assemblée dans la mitochondrie, l’ATP synthase est exportée à la membrane plasmique. Comme un « simple » routage de l’ATP synthase par des transporteurs semble peu probable étant donné la taille du complexe (environ 600kDa et 19x11nm), cela signifierait que l’enzyme atteindrait la surface cellulaire via un transport vésiculaire ou une fusion des membranes mitochondriales avec la membrane plasmique. Dans des conditions normales, les mitochondries forment un réseau complexe et dynamique, constamment remodelé par des évènements de fusion et de fission. Ce phénomène implique diverses protéines récemment identifiées telles que les mitofusines ou Drp1 (217, 218). Une fusion directe des membranes mitochondriales avec la membrane plasmique est difficile à envisager, les mitochondries possédant deux membranes et l’ATP synthase étant localisée au niveau de la membrane interne, à moins que la fusion se déroule au niveau des points de contact. Ces derniers sont des structures distinctes, où membrane interne 85 Introduction III : L’ATP Synthase et externe sont fusionnées, et jouent un rôle important dans le métabolisme mitochondrial et l’apoptose (219). Toutefois, des données expérimentales récentes indiquent que les mitochondries peuvent communiquer avec d’autres compartiments intracellulaires. C’est le cas du Réticulum Endoplasmique (RE), et cette interaction fait intervenir la mitofusine 2, permettant l’échange de calcium entre ces organelles (220). Bien qu’aucun travail à notre connaissance n’ait encore montré un échange de protéines entre RE et mitochondrie, ceci reste une hypothèse tentante qui pourrait permettre à des protéines mitochondriales d’atteindre la surface cellulaire en transitant par la voie de secrétion classique RE-golgi. D’autres travaux ont identifié une nouvelle protéine, MAPL (Mitochondria Anchored Protein Ligase), caractérisant des vésicules émergeant de la mitochondrie et adressées aux peroxysomes. De plus, ces mêmes travaux ont décrit d’autres vésicules, caractérisées par le marqueur Tom20 (Translocase of Outer Membrane 20, un membre du complexe d’import des protéines mitochondriales codées par des gènes nucléaires) ne fusionnant pas avec les peroxysomes. Leur destination est à l’heure actuelle en cours d’étude (221). Par ailleurs, il a été montré que la chaperonne mitochondriale Hsp60 est alternativement localisée dans des vésicules distinctes des organelles majeurs qui pourraient communiquer avec la membrane plasmique (222). De façon notable, Hsp60 a été décrite en surface de différents types cellulaires. Dans les deux cas, ces vésicules (toujours non caractérisées) pourraient représenter un système de transport assurant la communication et le routage de protéines entre la mitochondrie et la membrane plasmique, permettant l’expression en surface de protéines mitochondriales spécifiques. 86 Introduction III : L’ATP Synthase Un autre élément discuté de l’expression de l’Ecto-F1-ATPase est sa sous-localisation au sein de la membrane plasmique. Certaines de ses sous-unités, ainsi que quelques autres protéines mitochondriales, ont été identifiées dans les radeaux lipidiques à l’aide de méthodes de protéomique (202, 208). Toutefois, un récent travail suggère que ces protéines mitochondriales, dont l’ATP synthase, seraient dans le meilleur des cas des contaminants des préparations de radeaux lipidiques. Ceci est surtout basé sur le fait que dans cette étude les protéines mitochondriales en question se sont avérées résistantes à la déplétion du cholestérol par la Methyl-β-cyclodextrine, alors que les protéines résidant dans les radeaux lipidiques y sont habituellement sensibles (223). Néanmoins, la détection de l’ATP synthase par microscopie confocale révèle généralement un profil en patchs, ce qui peut être le cas pour des protéines résidant dans les radeaux lipidiques (204, 205). Nous possédons également des éléments expérimentaux montrant une colocalisation au moins partielle de l’Ecto-F1-ATPase avec des marqueurs de radeaux lipidiques (données non publiées). Ceci pourrait indiquer que la présence de l’Ecto-F1-ATPase dans les radeaux lipidiques n’est pas absolue et pourrait être variable en fonction du type cellulaire, et dépendre de la méthode de purification des radeaux lipidiques. La sous-localisation précise de l’Ecto-F1-ATPase au niveau de la membrane plasmique est donc toujours très débattue, et le mécanisme conduisant à cette expression ectopique reste énigmatique. 2.3) Nouvelle localisation, nouveaux rôles Le terme « moonlighting proteins » (« to moonlight » est une expression anglaise désignant le cumul d’emplois) a été introduit en 1999 par C.J. Jeffery pour désigner des protéines pouvant avoir de multiples fonctions bien distinctes. Celles-ci peuvent dépendre de différents facteurs : localisations multiples, expression dans des cellules différentes pouvant créer un contexte différent, concentration en ligand, etc. (224). L’ATP synthase est un parfait 87 Introduction III : L’ATP Synthase exemple de « moonlighting protein ». En effet, certaines de ses sous-unités sont impliquées dans des mécanismes cellulaires très différents de son rôle classique dans la synthèse d’ATP. La sous-unité α, par exemple, a été décrite comme participant à un complexe d’import d’ARN de transfert (ARNt) cytosoliques dans la mitochondrie (225). La sous-unité F6 (ou CF6) a été détectée dans le plasma et serait impliquée dans l’hypertension, en se liant à l’Ecto-F1ATPase sur les cellules endothéliales (226), mais le mécanisme précis régissant ce phénomène n’a pas encore été caractérisé. De plus, il apparaît clair à présent que l’expression ectopique de ce complexe enzymatique est impliquée dans de nombreux phénomènes physiologiques, en fonction du ligand et du type cellulaire (Tableau 4). A l’heure actuelle, les fonctions les mieux caractérisées de l’Ecto-F1-ATPase sont : son implication dans l’endocytose des lipoprotéines de haute densité (High Density Lipoproteins ou HDL) par les hépatocytes ; la survie et la prolifération des cellules endothéliales ; et enfin la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Ce dernier point ayant été abordé précédemment (Chapitre II, section 5.3, p.72) et étant donné qu’il sera traité en détail dans la partie Résultats Expérimentaux, il ne sera pas développé ici. 2.3.1) Métabolisme du HDL-cholestérol Les travaux de l’équipe sur les lipoprotéines de haute densité (HDL) ont permis d’identifier l’Ecto-F1-ATPase comme récepteur de l’Apolipoprotéine A-I (apoA-I, protéine majoritaire des HDL) à la surface des hépatocytes. La liaison des HDL sur des membranes d’hépatocytes révèle deux sites de liaison, de basse et de haute affinité (227). Le récepteur de haute affinité, liant également l’apoA-I libre (délipidée) a été purifié par Résonance Plasmonique de Surface (RPS) et identifié comme étant la chaîne β de l’ATP synthase. 88 Introduction III : L’ATP Synthase Cellules/Tissus K562, A549, Raji Ligands Rôles proposés Références Lyse des cellules tumorales par les cellules NK/LAK (200) HUVEC Angiostatine HDL/apoA-I CF6 Survie cellulaire via la synthèse d'ATP. Survie cellulaire via l'activation des récepteurs purinergique. Contrôle de la tension artérielle (226, 228, 229) Hepatocytes HDL/apoA-I Endocytose des HDL (205) Survie cellulaire ? (207, 209) 3T3-L1, HaCat ? ? Cellules tumorales TCR Vγ9/Vδ2, apoA-I, CMH-I Reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (144, 204) Amygdale (souris) Entérostatine Régulation de la prise alimentaire ? (210) Neurones APP, Amyloid β-peptide Régulation de la plasticité synaptique ? (211) Tableau 4. Rôles et ligands de l’Ecto-F1-ATPase. Les principaux rôles décrits de l’Ecto-F1-ATPase, et les ligands associés, sont résumés. NK : Natural Killer ; LAK : Lymphokine Activated Killer ; HDL : Lipoprotéines de Haute Densité ; apoA-I : apolipoprotéine A-I ; CF6 : Coupling Factor 6 ; ATP : Adénosine TriPhosphate ; APP : Amyloid Precursor Protein. Sauf mention contraire les types cellulaires référencés sont d’origine humaine. K562 : Erythroleucémie ; A549 : Adénocarcinome pulmonaire ; Raji : Lymphome de Burkitt ; HUVEC : Cellules endothéliales de veine du cordon ombilical ; 3T3-L1 : Fibroblastes murins (différenciés en adipocytes) ; HaCat : Kératinocytes immortalisés. L’apoA-I étant capable d’activer l’endocytose de la particule HDL entière par les sites de basse affinité, l’équipe a émis l’hypothèse que l’activité enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase joue un rôle dans ce processus. En effet, l’ajout d’ADP dans le milieu est également capable de stimuler l’endocytose des HDL, avec une amplitude comparable à celle de l’apoA-I. La liaison de l’apoA-I sur l’Ecto-F1-ATPase entraîne une augmentation de son activité hydrolase et mène à une stimulation de l’internalisation des HDL. A l’inverse, l’inhibiteur de l’activité hydrolase de l’ATP synthase, IF1, induit une diminution de cette internalisation (205). Le récepteur purinergique P2Y13 a par la suite été identifié comme étant la cible de 89 Introduction III : L’ATP Synthase l’ADP produit par l’Ecto-F1-ATPase (230) et les travaux récents de l’équipe ont montré que la petite GTPase RhoA et son effecteur ROCK I sont activés en aval de la voie Ecto-F1-ATPase / P2Y13 (231). Plus récemment, nous avons montré que cette voie d’endocytose peut également être régulée par une activité de type Adenylate Kinase qui consomme l’ADP généré par l’Ecto-F1-ATPase après liaison de l’apoA-I, diminuant ainsi de façon constitutive l’activation du récepteur P2Y13 et donc la captation des HDL par les hépatocytes ((232), Résultats IV, Article 4, p.159). Les travaux les plus récents de l’équipe sont focalisés sur l’étude de cette voie dans des modèles murins et ont pour but de développer de nouveaux traitements améliorant le turnover des HDL, ce qui pourrait représenter une méthode efficace de traitement et de prévention de l’athérosclérose. 2.3.2) Survie et prolifération des cellules endothéliales L’Ecto-F1-ATPase a également été caractérisée par le groupe de S.V. Pizzo comme étant le récepteur de l’angiostatine, un inhibiteur de l’angiogénèse issu de la protéolyse du plasminogène (233). Les travaux suivants de ce groupe ont établi que l’Ecto-F1-ATPase en surface des cellules endothéliales est capable de synthétiser de l’ATP. Cette propriété participerait à la prolifération des cellules, particulièrement en conditions d’hypoxie qui compromettent la survie cellulaire notamment par l’inhibition de la phosphorylation oxydative. L’angiostatine serait capable d’inhiber cette activité de synthèse, prévenant ainsi la génération d’ATP et diminuant la prolifération. Les auteurs proposent également que cette inhibition empêche l’extrusion de protons par l’Ecto-F1-ATPase, ce qui diminuerait le pH intracellulaire et donc compromettrait la survie des cellules (206, 228, 234). 90 Introduction III : L’ATP Synthase Les HDL et l’apoA-I sont également connues pour leur rôle protecteur contre le développement de dysfonctionnements de l’endothélium, un des premiers évènements dans la pathogenèse de l’athérosclérose, en améliorant la survie des cellules endothéliales. Le mécanisme impliqué dans cette « athéroprotection » est mal connu. Etant donné que les HDL ainsi que l’apoA-I lient l’Ecto-F1-ATPase l’équipe a émis l’hypothèse que l’effet protecteur de ces lipoprotéines dépend de l’activité de l’Ecto-F1-ATPase. D’une façon similaire aux mécanismes d’endocytose des HDL discutés précédemment (205), l’activité hydrolytique de l’Ecto-F1-ATPase en surface des cellules endothéliales peut être augmentée par l’apoA-I, stimulant ainsi la prolifération des cellules endothéliales d’une manière dose-dépendante. A l’inverse, l’inhibition de l’Ecto-F1-ATPase par IF1, l’angiostatine ou des anticorps dirigés contre la chaîne β de l’ATP synthase augmente l’apoptose et bloque la prolifération en conditions basales, mais également en compétition avec l’apoA-I (229). Les résultats obtenus ont donc démontré pour la première fois un effet direct de l’activité enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase sur la survie des cellules endothéliales, via une production extracellulaire d’ADP. Les récepteurs et les voies de signalisation en aval ne sont pas encore caractérisés mais les récepteurs purinergiques sensibles à l’ADP pourraient être impliqués. L’Ecto-F1-ATPase a donc des rôles divers (dont les principaux sont schématisés en Figure 16), dépendant du type cellulaire considéré ainsi que du ligand impliqué. Il est probable qu’elle puisse intervenir dans de nombreuses autres fonctions cellulaires. A l’exception de la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (même si nous ne l’excluons pas de façon définitive pour l’instant) ces rôles semblent impliquer l’activité enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase. Alors qu’une activité de type ATP hydrolase est largement envisageable puisqu’elle ne requiert ni flux de protons, ni la présence de toutes les sous-unités de l’ATP synthase, la possibilité d’une activité synthase est très débattue. 91 Introduction III : L’ATP Synthase Figure 16. Quelques rôles de l’Ecto-F1-ATPase. Les rôles les mieux caractérisés de l’Ecto-F1-ATPase sont schématisés ici. (1) Endocytose des HDL par les hépatocytes. La liaison de l’apoA-I sur l’Ecto-F1-ATPase augmente son activité hydrolase. L’ADP formé active P2Y13, qui stimule l’endocytose des particules HDL entières via un récepteur non caractérisé (HDLR). Ce mécanisme dépend d’une voie de signalisation RhoA/ROCK-I. Une activité de type Adénylate Kinase (AK) peut réguler de façon négative cette endocytose en consommant l’ADP produit. (2) Survie des cellules endothéliales. En milieu acide, la production d’ATP par l’Ecto-F1ATPase améliore la survie et la prolifération en régulant le pH intracellulaire et en fournissant une source d’ATP alternative en cas de dysfonctionnement de la chaîne respiratoire. (3) Survie des cellules endothéliales. La production d’ADP stimulée par l’apoA-I (ou les HDL) active probablement un récepteur purinergique (P2Y?). Les voies de signalisation en aval passent par Akt, connue pour inhiber l’apoptose et favoriser l’expression de gènes favorisant la survie. (4) Reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Ces lymphocytes reconnaissent les cellules tumorales via l’interaction de leur TCR avec l’Ecto-F1-ATPase, qui peut être augmentée par l’apoA-I. Ceci entraîne une activation de la machinerie cytotoxique et une secrétion de cytokines pro-inflammatoires. Une faible expression du CMH-I et une production de phosphoantigènes par la cellule cible sont probablement nécessaires pour une activation optimale des lymphocytes. 92 Introduction III : L’ATP Synthase 2.4) Synthétiser ou ne pas synthétiser, telle est la question De nombreux groupes, incluant notre équipe, ont étudié les propriétés enzymatiques de l’Ecto-F1-ATPase. Puisqu’elles semblent impliquées dans de nombreux rôles physiologiques, leur caractérisation est un point important de l’étude de ce complexe enzymatique exprimé à la surface des cellules. A l’heure actuelle, il existe de nombreuses contradictions entre les résultats de différents groupes. Certains travaux montrent que l’Ecto-F1-ATPase est capable de synthétiser ou d’hydrolyser de l’ATP, tandis que d’autre résultats, incluant ceux de l’équipe, n’ont pu mettre en évidence qu’une activité de type hydrolase. Plusieurs éléments théoriques sont à prendre en compte. Le potentiel moyen de la membrane plasmique des cellules « non-activables » (excluant donc les neurones, ou les cellules musculaires par exemple) est de -40mV, alors qu’il est de -200mV environ pour la membrane interne de la mitochondrie. Il est donc peu probable que le potentiel de la membrane plasmique soit suffisant pour générer un flux de protons pouvant entraîner la synthèse d’ATP. De plus, dans ces deux configurations, l’orientation des sous-unités de l’ATP n’est pas la même par rapport au potentiel. Dans le cas de la membrane plasmique, le domaine F1 est donc situé du côté chargé positivement. Il faudrait une inversion complète et suffisamment forte du potentiel de membrane pour que l’Ecto-F1-ATPase soit capable de synthétiser de l’ATP. Les travaux du groupe de S.V. Pizzo, repris par différents groupes dans des modèles cellulaires différents, ont montré qu’une activité de type synthase peut être observée par simple ajout d’ADP dans le milieu extracellulaire (206, 207, 209). Or, ceci n’est pas compatible avec les points discutés précédemment. L’implication de l’Ecto-F1-ATPase dans cette production d’ATP a généralement été démontrée par l’utilisation de l’oligomycine, un inhibiteur classique de l’ATP synthase mitochondriale. Toutefois, l’oligomycine pourrait agir sur d’autres enzymes, telles que la H,K ATPase non-gastrique (235). Son utilisation pour la 93 Introduction III : L’ATP Synthase démonstration d’une activité de type synthase par l’Ecto-F1-ATPase apparaît donc compromise étant donné son manque de spécificité. Des travaux plus récents ont montré que la diminution du pH extracellulaire améliore la production d’ATP par l’Ecto-F1-ATPase et il a été proposé que cette synthèse améliorerait la survie des cellules tumorales en milieu acide (228, 234) en pompant des protons indésirables hors de la cellule. Ceci serait analogue au rôle de l’ATP synthase dans la survie des bactéries en conditions acides (236). Toutefois, l’orientation de l’ATP synthase bactérienne est inversée (par rapport à celle de l’Ecto-F1-ATPase) et donc dans ce cas l’extrusion de protons consomme de l’ATP. Le fait que l’Ecto-F1-ATPase puisse synthétiser de l’ATP tout en pompant des protons depuis un compartiment neutre vers un compartiment acide défie la notion établie que le transport actif allant à l’encontre d’un gradient consomme de l’énergie, comme c’est le cas pour l’ATP synthase bactérienne. Les travaux récents du groupe de S. Papa sont également en faveur d’une activité de type synthase. En revanche, dans leur étude, Mangiullo et al. (201) ont montré que l’augmentation du pH extracellulaire entraîne une amélioration de la synthèse d’ATP. Ceci paraît à priori plus logique et en accord avec les notions de dynamique des flux, si l’Ecto-F1-ATPase est effectivement capable de synthétiser de l’ATP. Ils ont également pu observer que cette activité est corrélée à un flux de protons sensible à l’oligomycine entre le cytoplasme et le milieu extracellulaire (201). Une quantification plus précise du flux de protons serait nécessaire pour déterminer s’il est suffisant pour assurer une synthèse d’ATP par l’Ecto-F1ATPase. Comme discuté précédemment, l’oligomycine étant potentiellement capable d’inhiber d’autres pompes à protons, le rôle réel de l’Ecto-F1-ATPase dans la création de ce flux reste très incertain. Pour finir, ils suggèrent qu’une acidification du cytoplasme en activant la glycolyse par ajout de glucose permet également d’augmenter la synthèse d’ATP 94 Introduction III : L’ATP Synthase par l’Ecto-F1-ATPase. Néanmoins, il n’est pas certain que cette acidification soit suffisamment forte pour permettre cette activité. Dans des conditions relativement similaires, mais sur des modèles de neurones, les concentrations de glucose utilisées entrainent au mieux une réduction du pH intracellulaire de l’ordre de 0,3 unités, ce qui n’est probablement pas suffisant pour permettre une synthèse d’ATP (237). Nos travaux, ainsi que ceux d’autres laboratoires, ont déterminé que l’Ecto-F1-ATPase est dépourvue d’activité synthase. Yegutkin et al. ont montré que la production d’ATP après ajout d’ADP sur cellules endothéliales n’est pas améliorée par l’ajout de Pi, ce qui devrait être le cas puisque l’Ecto-F1-ATPase synthétise l’ATP via la réaction ADP + Pi Æ ATP. Ils en ont conclu que la phosphorylation de l’ADP en ATP est principalement due à des activités extracellulaires de type Adenylate Kinase (AK, qui produit de l’ATP et de l’AMP à partir de deux molécules d’ADP) et Nucleoside DiPhospho Kinase (NDPK, qui transfère le phosphate terminal entre un nucléotide triphosphate et un nucléotide diphosphate) (238). Ces conclusions concordent avec nos propres résultats montrant qu’en surface des hépatocytes et des cellules endothéliales, l’ajout d’ADP tritié et de 32 Pi n’entraîne aucune synthèse d’ATP doublement marqué, et produit uniquement de l’ATP tritié. Nous n’avons également jamais observé de diminution de la production d’ATP en présence d’oligomycine dans nos modèles cellulaires (205, 229, 232). En conclusion, l’activité synthase de l’Ecto-F1-ATPase est loin d’être établie et des études plus poussées, ainsi qu’une ré-évaluation des techniques et inhibiteurs utilisés par le passé, sont clairement indispensables. 95 Introduction III : L’ATP Synthase 3) Une fascinante enzyme qui n’a pas encore révélé tous ses secrets. Quinze ans après les premiers travaux montrant l’expression d’une sous-unité de l’ATP synthase en surface de cellules tumorales par Das et al. (200), les données provenant de très nombreux laboratoires ont confirmé cette expression ectopique d’une enzyme jusqu’alors considérée comme résidant en permanence dans la mitochondrie. Il y a toujours un grand besoin d’une caractérisation définitive de son activité enzymatique, de sa structure exacte, ainsi que de données sur son mécanisme d’expression en surface. L’activité synthase de l’Ecto-F1-ATPase est toujours fortement discutable que ce soit au niveau théorique ou expérimental. Il s’agit d’un point fondamental qui requiert des travaux additionnels et pourrait dépendre du développement de nouvelles techniques plus spécifiques et plus sensibles que celles utilisées à l’heure actuelle. A l’heure actuelle la mesure de la production d’ATP doublement marqué à partir d’ADP tritié et de 32 Pi par HPLC est probablement la meilleure méthode pour déterminer si l’Ecto-F1-ATPase est réellement capable de synthétiser de l’ATP, puisqu’il s’agit de la seule enzyme capable de générer de l’ATP à partir d’ADP et de Pi libre. Il devrait donc s’agir de la méthode de choix pour toute tentative de détermination des propriétés enzymatiques de l’Ecto-F1-ATPase. Comprendre le mécanisme d’expression de l’Ecto-F1-ATPase en surface est également un point crucial, mais très délicat. Etant donné que l’utilisation d’ARN interférents dirigés contre des sous-unités de l’ATP synthase est difficilement envisageable puisque cela entraînerait une mort rapide des cellules, inhiber son expression en surface devrait se révéler plus simple, efficace, et à priori moins destructeur pour la cellule cible. A notre connaissance, à l’heure actuelle un seul travail a montré que l’expression de la sous-unité α à la surface de neurones peut être inhibée par la Brefeldine A, un inhibiteur classique du transport transgolgien (211). 96 Introduction III : L’ATP Synthase Un travail récent a montré qu’une déficience en Palmitoyl protein transferase 1 (Ppt1), responsable du syndrome de ceroïde-lipofuscinose neuronale infantile, est liée à une augmentation de l’expression de l’Ecto-F1-ATPase par les neurones (239). Ceci suggère que Ppt1 pourrait être impliquée dans la régulation de la localisation subcellulaire de l’ATP synthase. De plus, il a récemment été montré que la niacine (vitamine B3) était capable d’inhiber l’expression de l’Ecto-F1-ATPase. De façon notable, la niacine est connue depuis de très nombreuses années pour augmenter le taux de HDL circulantes (240). Ceci confirme donc, bien qu’indirectement, les résultats de l’équipe sur l’implication de l’Ecto-F1-ATPase dans l’endocytose des HDL. Toutefois, ces deux derniers travaux n’ont fourni aucune donnée sur le mécanisme de l’expression de l’Ecto-F1-ATPase. Des études poussées sont donc définitivement nécessaires pour caractériser ce mécanisme. Pour finir, la manipulation de l’activité enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase au lieu de son expression en surface pourrait également être d’un grand intérêt. A ce sujet, plusieurs options sont possibles. Des ligands régulant son activité, tels que l’apoA-I, IF1, CF6 ou l’angiostatine peuvent être utilisés. Des moyens indirects sont également envisageables ; il a par exemple été montré que la calmoduline interagit avec l’IF1, et pourrait diminuer sa disponibilité en surface des cellules, augmentant donc l’activité de l’Ecto-F1-ATPase (241, 242). L’ATP synthase est donc impliquée, en plus de son rôle central dans la production de l’ATP et grâce à son expression à la surface des cellules, dans de très nombreuses fonctions cellulaires faisant intervenir des ligands très différents. Nous n’en sommes qu’aux premiers pas de la compréhension de ces nouvelles fonctions. Elle pourrait s’avérer être une cible intéressante dans le traitement de pathologies variées comme le cancer ou l’athérosclérose. 97 Introduction III : L’ATP Synthase Les chapitres suivants détailleront les résultats expérimentaux obtenus au cours de ma thèse portant sur la caractérisation du rôle de l’Ecto-F1-ATPase dans la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. 98 RESULTATS EXPERIMENTAUX Partie I Interaction entre l’Ecto-F1-ATPase et le Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I 99 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 1) Introduction La reconnaissance de cellules infectées ou tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2, hormis quelques cas particuliers mentionnés précédemment (Tableau 2, p.64) n’est pas restreinte au sens strict du terme par le CMH. Leur activation est toutefois finement régulée par le CMH-I via sa reconnaissance par de nombreux récepteurs inhibiteurs et activateurs, les NKR. A l’origine décrite à la surface de quelques lignées cellulaires, l’expression de l’Ecto-F1ATPase a été étendue à d’autres types cellulaires très différents. Pourtant, nos résultats initiaux indiquent que des lignées très proches peuvent différer. Par exemple, les sous-unités α et β sont détectables par cytométrie de flux sur la lignée Daudi mais pas sur Raji, deux lignées B issues de lymphomes de Burkitt (144). De plus, Daudi diffère principalement de Raji du fait qu’elle n’exprime pas le CMH-I, le gène de la β2m étant muté dans cette lignée. L’analyse de la détection de l’Ecto-F1-ATPase à la surface de plusieurs lignées cellulaires par cytométrie de flux nous a suggéré qu’elle était corrélée négativement à celle du CMH-I. En effet, hormis le cas de 721.211, toutes les lignées sur lesquelles l’Ecto-F1-ATPase peut être détectée n’expriment que peu, voire pas du tout, les molécules du CMH-I. Nous avons donc cherché à comprendre cette corrélation inverse et nous avons pu montrer que l’Ecto-F1-ATPase interagit avec les molécules de CMH-I à la surface des cellules. Cette interaction masque les épitopes reconnus par les anticorps commerciaux dirigés contre les sous-unités α et β et d’ATP synthase et pourrait donc participer au contrôle de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. L’expression de l’Ecto-F1-ATPase apparaissant à présent comme un phénomène ubiquitaire, ceci permettrait donc de contrôler une potentielle auto-réactivité des ces lymphocytes cytotoxiques. 100 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 2) Article 1 101 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 102 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 103 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 104 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 105 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 106 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 107 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 108 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I 3) L’interaction est-elle spécifique d’un ou plusieurs isotypes de CMH-I ? 3.1) Introduction Le CMH-I regroupe de nombreux isotypes différents, classés en deux groupes : les isotypes classiques (HLA-A, -B et -C) et non classiques (HLA-E, -F, -G et les molécules apparentées comme CD1). Nous avons donc cherché à savoir si l’Ecto-F1-ATPase interagit avec toutes ces molécules, ou avec des isotypes particuliers. Le rôle principal des isotypes classiques est de présenter des peptides aux lymphocytes T αβ CD8+ et ils sont également reconnus par divers NKR. Les molécules non-classiques ont des spécificités et des fonctions diverses. HLA-E lie le plus souvent des peptides issus des séquences d’adressage des autres isotypes de CMH-I à la membrane plasmique. Il est principalement reconnu par CD94/NKG2A, un NKR hétérodimérique de type inhibiteur (243) et exprimé par la plupart des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Tous ces isotypes sont donc des candidats potentiels. HLA-F étant très peu détecté à la surface des cellules qui l’expriment (244) et l’expression d’HLA-G étant excessivement restreinte, peut-être même aux cellules du trophoblaste seules (245), nous avons exclu ces deux isotypes. Nos résultats précédents indiquant que les molécules de CMH-I impliquées sont dépendantes de la β2m et reconnues par l’anticorps W6/32, nous avons également exclu les molécules telles que MICA/B et CD1. Ceci ne signifie néanmoins pas que ces molécules n’interagissent pas avec l’Ecto-F1-ATPase, mais que dans les modèles cellulaires que nous avons utilisé, ce ne sont à priori pas elles qui sont impliquées dans le masquage d’épitopes que nous avons observé. Nous avons donc cloné les isotypes -A, -B, -C et -E à partir de la lignée Raji dont l’expression de l’Ecto-F1-ATPase en surface n’est détectable qu’après dénaturation des 109 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I molécules du CMH-I. Les ADNc ont été transfectés dans la lignée K562 qui exprime l’EctoF1 mais pas le CMH-I. Nos résultats indiquent que l’Ecto-F1-ATPase interagit préférentiellement avec HLA-B. L’expression de ce dernier entraine une forte diminution de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. En revanche, bien que la diminution de l’expression d’HLA-B par utilisation d’ARNi sur ces transfectants permette à nouveau une détection partielle de l’Ecto-F1-ATPase, elle n’est pas capable de restaurer la capacité de stimulation de ces cellules. Ceci suggère donc qu’une faible expression d’HLA-B ou que d’autres molécules non identifiés sont capables d’inhiber les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. 3.2) Matériel et méthodes Lignées et culture cellulaires. Les lignées K562 et Raji proviennent de l’ATCC et ont été cultivées en RPMI 1640 Glutamax complémenté par 10% de Sérum de Veau Fœtal décomplémenté (SVF), du pyruvate de sodium et de la pénicilline/streptomycine (RPMI complet). Tous les réactifs de culture proviennent d’Invitrogen. Les lignées Vγ9/Vδ2 ont été obtenues à partir de PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) purifiés par gradient de centrifugation (Ficoll) à partir de « buffy coats » provenant de L’Etablissement Français du Sang de l’hôpital Purpan, Toulouse. Brièvement, 108 PBMC ont été cultivées en présence d’IPP, 5µM (Isoprenoids LC), et d’IL-2 (Sanofi-Synthélabo), 400U/mL, pendant 20 à 24 jours en milieu RPMI complet, le SVF étant remplacé par du sérum humain (SH, PAA Laboratories), puis congelées. Les lignées obtenues par ce protocole sont généralement >90% Vδ2+. Les cellules sont décongelées la veille de leur utilisation et incubées en RPMI complet (avec SH) sur la nuit sans ajout d’IL-2. 110 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I Anticorps et réactifs. Le pamidronate, le G418 et les amorces PCR ainsi que les ARNi proviennent de Sigma Aldrich. Les anticorps anti-Vδ2-FITC et anti-IgG de souris-FITC (anticorps polyclonal de chèvre) proviennent de Beckman-Coulter, l’anticorps anti-CD107a-PE de BD Pharmingen, l’anticorps W6/32 correspond à un surnageant d’hybridome gracieusement fourni par le Dr. Philippe Lebouteiller (INSERM U563, Toulouse) et l’anticorps anti-β ATP synthase (3D5) provient d’Invitrogen. Tous les réactifs de biologie moléculaire proviennent d’Invitrogen. Amorces. Des séquences publiées ont été utilisées pour HLA-A, -B et -C (246). HLA-A : 5’-TATAAAGCTTGATTCTCCCCAGACGCCGAGG-3’ (sens) 5’-ATATGCGGCCGCACAAGGCAGCTGTCTCACA-3’ (anti-sens) HLA-B : 5’-TATAAAGCTTCACCCGGACTCAGRTCTCCT-3’ (sens) 5’-ATATGCGGCCGCATCTCAGTCCCTCCACAAGA-3’ (anti-sens) HLA-C : 5’-TATAAAGCTTTTCTCCCCAGACGCCGAGA-3’ (sens) 5’-ATATGCGGCCGCGTCTCAGGCTTTACAAGCGA-3’ (anti-sens) (R = A ou G) Les séquences des amorces pour HLA-E ont été déduites d’alignements du consensus HLA-E avec le consensus A, B, C et les séquences strictement spécifiques d’HLA-E ont été choisies. HLA-E : 5’-TATAAAGCTTTCTCAGGACTCAGAGGCTGG-3’ (sens) 5’-ATATGCGGCCGCGGCTTTACAAGCTGTGAGACT-3’ (anti-sens) Les séquences soulignées correspondent aux sites de restriction HindIII et NotI ajoutés sur les amorces sens et anti-sens respectivement pour simplifier le sous-clonage des ADNc. 111 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I Clonage de HLA-A, -B, -C et E et transfection dans K562. Les ARN ont été isolés à partir de la lignée Raji par la technique classique d’extraction au Trizol. Brièvement, 2x107 cellules ont été lysées dans 4mL de Trizol, et 800µL de chloroforme ont été ajoutés. Après centrifugation (12000g, 5min, 4°C) la phase aqueuse (~2mL) a été récupérée et l’ARN a été précipité par ajout de 1,4mL (0,7 volume) d’isopropanol froid et centrifugation à 12000g pendant 15min à 4°C. Les culots d’ARN ont été lavés en éthanol 70% et la quantité obtenue a été estimée par mesure de la densité optique à 260nm. Les ADNc ont été obtenus par RT-PCR en utilisant les amorces anti-sens spécifiques de chaque isotype (l’utilisation d’amorces de type oligo-dT donnant des résultats peu satisfaisants). La spécificité de l’amplification a été vérifiée par digestion enzymatique (données non montrées). Les ADNc ont été clonés directement après PCR dans le vecteur TOPO (Invitrogen) selon les recommandations du fournisseur, puis séquencés. Les isotypes isolés correspondent aux allèles A*0301, B*1510, Cw*0304, Cw*0401 et E*0101, ce qui concorde avec les données de l’IMGT pour le typage de la lignée Raji. Ces allèles seront notés A, B, Cw3 et Cw4 par la suite, par simplification. Les ADNc ont ensuite été sous-clonés dans le vecteur d’expression eucaryote pcDNA3.1 (Invitrogen) par les enzymes HindIII et NotI. Les cellules K562 ont été tranfectées par nucléofection (Amaxa) selon les instructions du fournisseur puis cultivées et clonées (dilution limite) en RPMI complet en présence de G418 (1mg/mL) après vérification de l’expression des isotypes par cytométrie de flux. Brièvement, les cellules ont été lavées en PBS 5% SVF, incubées avec l’anticorps W6/32 puis avec l’anticorps secondaire pendant 45min. Les données ont été acquises sur un FACScan (BD) et analysées avec le logiciel WinMDI 2.9 (The Scripps Research Institute). Après clonage et expansion des transfectants, l’expression du CMH-I et de la sous-unité β de l’ATP synthase a été mesurée par cytométrie de flux. 112 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I Interférence ARN. Les séquences des ARNi ont été déterminées par alignement des isotypes HLA clonés, sélection des séquences spécifiques d’HLA-B puis analyse des séquences pouvant être potentiellement ciblées, en utilisant le logiciel disponible sur le site internet de la compagnie Applied Biosystems (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). Les séquences des ARNi contrôles ont été déterminées par réarrangement aléatoire des nucléotides. Pour chaque séquence les ARN sens et anti-sens ont été synthétisés et appariés. Séquences cibles : hla-b1 :CACACAGATCTGCAAGACC et GGTCTTGCAGATCTGTGTG hla-b2 :GACCAACACACAGACTTAC et GTAAGTCTGTGTGTTGGTC Contrôles : scr1 :ATCCAAAGGCGCATCAACC et GGTTGATGCGCCTTTGGAT scr2 :AACACCTAACGATACACCG et CGGTGTATCGTTAGGTGTT Les ARNi ont été transfectés de la même façon que les vecteurs contenant les ADNc (voir cidessus). La diminution d’expression a été contrôlée par cytométrie de flux 24h après transfection selon la méthode décrite précédemment. Test d’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Un test d’expression du marqueur CD107a (aussi appelé LAMP-1, protéine lysosomale exprimée en surface lors de la libération des granules cytotoxiques) décrit précédemment a été utilisé (247). Brièvement, les cellules K562 transfectées ont été incubées ou non pendant 16h avec du pamidronate (50µM), lavées et co-cultivées avec les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (rapport 1:1) en présence de l’anticorps anti-CD107a-PE (dilution 1/25ème) pendant 5h à 37°C. La bréfeldine A, utilisée dans le protocole publié, a été omise après avoir vérifié qu’elle ne modifiait pas les réponses obtenues. Les cellules ont ensuite été lavées, marquées par l’anticorps anti-Vδ2-FITC (dilution 1/20ème) pour différencier les cellules effectrices des 113 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I cellules cibles, et les données ont été acquises sur un FACScan (compensations : Fl1-0.8% Fl2 et Fl2-18,8% Fl1), analysées avec le logiciel WinMDI et traitées avec Excel. 3.3) Résultats L’Ecto-F1-ATPase est préférentiellement masquée par HLA-B. L’expression des isotypes de CMH-I n’étant pas homogène après transfection, nous avons cloné les cellules et conservé les clones présentant la plus forte expression. HLA-E a originellement été co-transfecté avec HLA-B qui présentait l’expression la plus forte dans nos premiers essais. Le marquage par l’anticorps W6/32 n’est toutefois pas augmenté et le marquage à l’aide d’un anticorps spécifique anti-HLA-E s’est avéré négatif (données non montrées). Figure 17. Expression des isotypes HLA et effet sur la détection de l’Ecto-F1-ATPase. Les isotypes mentionnés ont été clonés à partir de la lignée Raji et transfectés dans la lignée K562. L’expression du CMH-I (ligne pointillée) et de la chaîne β de l’ATP synthase (ligne pleine) a été vérifiée par marquage avec les anticorps W6/32 et 3D5 respectivement, et l’anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé FITC. Histogramme grisé : contrôle isotypique. Le contrôle correspond aux cellules transfectées avec le vecteur pcDNA3.1 vide. 114 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I Les résultats présentés en Figure 17 montrent une expression relativement modérée des isotypes transfectés. De plus l’expression de Cw4 est plus faible que celle des autres isotypes. Comme le même vecteur d’expression a été utilisé, et que ce résultat est resté le même pour tous les clones analysés, cela suggère que cette caractéristique est inhérente à HLA-Cw4. Il est possible qu’il présente des peptides moins fréquents, ou qu’il soit moins bien reconnu par W6/32. Par ailleurs, ces données indiquent également que seul HLA-B induit un masquage de la chaîne β l’Ecto-F1-ATPase. HLA-E ayant été co-transfecté avec HLA-B, et n’étant pas détectable en surface (données non montrées), l’abolition de la détection observée pour ce clone est probablement due à HLA-B uniquement. Ces résultats suggèrent que, des trois isotypes de CMH-Ia testés, il est celui qui contribue majoritairement à l’interaction avec l’Ecto-F1-ATPase. On ne peut en revanche rien conclure sur la capacité ou non d’HLA-E à interagir avec l’Ecto-F1-ATPase. HLA-B diminue fortement l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Nous avons voulu savoir si l’expression de ces différents allèles modifiait le potentiel stimulateur naturel ou induit des cellules K562. Les transfectants ont donc été traités ou non par le pamidronate, un aminobisphosphonate induisant une surproduction de phosphoantigènes et augmentant la réponse cytotoxique des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. La Figure 18 indique que dans les deux cas, HLA-B induit une diminution quasi-totale de l’activation des lymphocytes. Les isotypes HLA-C entrainent par ailleurs une légère baisse de la stimulation de la lignée GDL6, alors que seul Cw4 semble légèrement moduler la lignée GDL9. HLA-B apparaît donc comme l’isotype majeur dans le contrôle de la réactivité des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par le CMH-I classique. 115 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I Figure 18. Modulation de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Les cellules K562 transfectées avec le vecteur vide (contrôle) ou les différents isotypes HLA ont été traitées ou non pendant 16 heures avec du pamidronate (50µM) puis incubées avec les lignées de lymphocytes T Vγ9/Vδ2 issues de deux donneurs différents (lignée GDL6, A ; lignée GDL9, B) en présence de l’anticorps anti-CD107a-PE. Les cellules ont ensuite été marquées par l’anticorps anti-Vδ2-FITC. Non stim. : Lymphocytes seuls. Le pourcentage de cellules positives pour CD107a indiqué représente la moyenne de trois puits de stimulation +/- écart type. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Des résultats équivalents ont été obtenus en test de secrétion d’IFN-γ. Inhiber l’expression d’HLA-B restaure partiellement la détection de l’Ecto-F1-ATPase. Nous avons ensuite voulu confirmer les résultats précédents en réalisant l’expérience inverse, c’est-à-dire diminuer spécifiquement l’expression d’HLA-B. Nous avons tout d’abord confirmé l’efficacité des ARNi en les utilisant sur les transfectants HLA-B uniquement (Figure 19A). hla-b1 et hla-b2 montrent une capacité quasi équivalente à diminuer l’expression d’HLA-B (~82% vs 73%). En revanche, ils ne permettent de restaurer que partiellement la détection de l’Ecto-F1-ATPase, hla-b1 semblant légèrement plus efficace. Nous avons ensuite utilisé ce dernier sur tous les transfectants, et seul le transfectant HLA-B montre une diminution du marquage par W6/32, ce qui confirme la spécificité de cet ARNi (Figure 19B). En revanche, cette diminution ne s’est pas accompagnée d’une restauration du potentiel stimulant des cellules (données non montrées). 116 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I Figure 19. Inhibition de l’expression de HLA-B par ARN interférence. (A) Les ARNi ciblant HLA-B (hla-b1 et hla-b2) et leurs contrôles respectifs (scr1 et scr2) ont été utilisés sur la lignée K562 transfectée par HLA-B et les expressions du CMH-I (vert) et de la chaîne β de l’ATP synthase (rouge) ont été contrôlées par les anticorps W6/32 et 3D5, respectivement. L’histogramme grisé correspond au contrôle isotypique. (B) hla-b1 semblant légèrement plus efficace, il a été utilisé sur tous les transfectants afin de vérifier sa spécificité. L’expression du CMH-I a été contrôlée par l’anticorps W6/32. Histogramme grisé : cellules transfectée par scr1. Histogramme en ligne pleine : cellules transfectées par hla-b1. Ces résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes. 3.4) Discussion Nos résultats indiquent que l’expression d’HLA-B permet de masquer l’Ecto-F1-ATPase et induit une diminution de la stimulation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Cette diminution pourrait s’expliquer de deux manières : L’interaction des molécules du CMH-I avec l’Ecto-F1-ATPase entraîne une diminution de la stimulation des lymphocytes causée par les NKR de type inhibiteur (iNKR). Il est admis que la proximité de ces récepteurs avec le TCR facilite son inhibition. De tous les iNKR connus à l’heure actuelle, seuls deux sont capables de reconnaître HLA-B. KIR3DL1 (famille des KIR) reconnaît des molécules de CMH-I portant un épitope de type Bw4 (248). L’allèle cloné à partir de la lignée Raji portant un épitope de type Bw6, ce récepteur n’est probablement pas en cause. Il reste donc ILT2 (famille des LIR) dont la spécificité est large puisqu’il reconnaît 117 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I le domaine α3 du CMH-I qui est conservé et peu polymorphe (249). De plus, un travail récent a montré qu’ILT2 est exprimé en surface de divers clones Vγ9/Vδ2 et qu’il est probablement le récepteur majoritairement responsable du contrôle de la réactivité de ces lymphocytes. Il s’agit donc d’un candidat potentiel intéressant. Alors qu’il a été montré que le blocage du CMH-I par l’anticorps W6/32 permet d’annuler l’effet inhibiteur d’ILT2 (68), nous n’avons pas observé une telle inhibition dans les mêmes conditions (données non montrées). Le rôle des iNKR reconnaissant HLA-B dans notre modèle nécessite donc des travaux supplémentaires. Alternativement, l’interaction entre HLA-B et l’Ecto-F1-ATPase pourrait, de la même manière qu’elle empêche la liaison des anticorps dirigés contre les chaînes α et β de l’ATP synthase, gêner la reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase par le TCR Vγ9/Vδ2. Ceci préviendrait donc directement l’activation des lymphocytes sans intervention des iNKR. La récupération partielle de la détection de l’Ecto-F1-ATPase et l’absence totale de restauration du potentiel stimulant après traitement par ARNi suggère qu’une faible expression d’HLA-B est suffisante pour inhiber fortement les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 malgré un démasquage de l’Ecto-F1-ATPase. Il est possible que dans ce cas, les iNKR puissent être impliqués dans la régulation de ces lymphocytes. Les deux mécanismes pourraient donc être impliqués. Nous avons également utilisé ces ARNi sur la lignée Raji, mais dans ce cas nous n’avons observé aucune détection de l’Ecto-F1-ATPase (données non montrées). Plusieurs hypothèses pourraient permettre d’expliquer ce résultat. L’expression du CMH-I par la lignée Raji est extrêmement élevée et la diminution obtenue étant relativement faible (~30%), elle ne suffit peut être pas à démasquer les épitopes. Il est possible que cette lignée exprime un autre allèle d’HLA-B qui n’a pas été identifié par typage génomique (IMGT) et que nous n’avons pas pu 118 Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I cloner. Enfin, il n’est pas exclu que d’autres molécules soient capables d’interagir avec l’Ecto-F1-ATPase. Même s’ils ne masquent pas l’Ecto-F1-ATPase, les isotypes Cw3 et Cw4 semblent diminuer légèrement l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Cette diminution, si elle s’avère significative, pourrait également impliquer des iNKR. Cw3 et Cw4 appartiennent à deux groupes distincts, nommés C1 et C2, qui sont reconnus par KIR2DL2 (CD158b) et KIR2DL1 (CD158a) respectivement. L’expression de ces récepteurs par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 a été décrite (250, 251) mais elle est très hétérogène, ce qui pourrait expliquer la faible diminution de l’activation globale d’une population polyclonale. L’absence d’inhibition par Cw3 pour la lignée GDL9 pourrait suggérer une incompatibilité entre cet allèle HLA et les iNKR exprimés par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 du donneur. Pour finir, le fait que cette inhibition soit faible et que HLA-A ne modifie pas la stimulation des lymphocytes suggère que l’interaction entre le CMH-I et l’Ecto-F1-ATPase est importante pour un contrôle efficace de la reconnaissance de cette dernière par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. En conclusion, nos résultats montrent que l’Ecto-F1-ATPase interagit en surface des cellules avec des molécules de CMH-I, préférentiellement HLA-B. Cet isotype inhibe fortement l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Des travaux complémentaires sont nécessaires pour déterminer son mode d’inhibition (iNKR et/ou encombrement stérique prévenant la liaison du TCR). Il n’est également pas exclu que d’autres molécules puissent interagir avec l’Ecto-F1-ATPase et moduler sa détection et/ou l’activation des lymphocytes. 119 120 RESULTATS EXPERIMENTAUX Partie II L’ApppI, un prototype de phosphoantigène nucléotidique 121 Résultats II : Propriétés de l’ApppI 1) Introduction Le deuxième projet développé au cours de ma thèse a eu pour but de déterminer s’il existe un lien entre les phosphoantigènes et l’Ecto-F1-ATPase, deux entités très différentes activant la même sous-population γδ. En d’autres termes, ce complexe enzymatique exprimé à la surface des cellules est-il éventuellement impliqué dans le mécanisme de présentation des phosphoantigènes aux lymphocytes T Vγ9/Vδ2 ? L’identification des phosphoantigènes à partir d’extraits de Mycobacterium tuberculosis a mis en évidence l’existence de dérivés nucléotidiques naturels de ces phosphoantigènes, TUBAg3 et TUBAg4 (85). Des travaux ont également montré que l’ajout d’un nucléotide sur un phosphoantigène classique par synthèse chimique avait généralement peu d’effet sur sa bioactivité (150). Toutefois, aucune étude n’a réellement étudié en détail les propriétés des phosphoantigènes nucléotidiques. L’ApppI, un dérivé adénylé de l’IPP, a récemment été isolé à partir de cellules traitées par des aminobisphosphonates. Il serait produit directement à partir de l’IPP et d’AMP par une activité de type aminoacyl tRNA synthase (252). Nous nous sommes intéressés à ce composé pour plusieurs raisons : - C’est un prototype de phosphoantigène nucléotidique. - Il est produit de façon importante par des cellules traitées par les aminobisphosphonates, qui augmentent la capacité de ces cellules à activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. - Etant un analogue d’ATP, l’ApppI pourrait lier l’Ecto-F1-ATPase. Dans un premier temps nous avons donc étudié les propriétés de l’ApppI (synthétisé en collaboration avec l’équipe du Pr. Christian Périgaud, UMR CNRS 5247, Montpellier). 122 Résultats II : Propriétés de l’ApppI L’utilisation de ce composé pour l’étude de la présentation de phosphoantigènes sera décrite dans la troisième partie des Résultats Expérimentaux. Nous avons pu montrer que l’ApppI est capable d’activer spécifiquement les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. En revanche, il n’est pas actif directement, mais après clivage par une activité de type Nucleotide PyroPhosphatase (NPP) qui le transforme en AMP + IPP. Cette activité peut être fournie soit par ajout de « cellules présentatrices », soit directement (enzyme commerciale). De plus, il possède des propriétés intéressantes qui le distinguent des phosphoantigènes classiques tels que l’IPP : - Il est résistant aux phosphatases terminales telles que la phosphatase alcaline ou l’apyrase. - Il peut être « pulsé » sur des cellules cibles (comme des lignées tumorales ou des cellules dendritiques), c’est-à-dire qu’il est capturé par ces cellules et leur confère une forte activité stimulatrice similaire à celle des lignées activant spontanément les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Pour finir, nous avons pu montrer que cet antigène est produit de façon naturelle par la lignée Daudi, une cible classique des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Nos résultats décrivent donc les caractéristiques uniques des phosphoantigènes nucléotidiques. Ils suggèrent qu’ils pourraient être impliqués dans le mécanisme d’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par des cellules infectées ou tumorales, et possèdent des propriétés qui pourraient les rendre intéressants dans le développement de protocoles thérapeutiques. 123 Résultats II : Propriétés de l’ApppI 2) Article 2 Ce travail est actuellement soumis au Journal of Immunology. Le manuscrit original est inclus ci-dessous. Il n’a pas été modifié, hormis la mise en page afin de limiter l’espace utilisé et de faciliter la lecture. Title: Specific requirements for Vγ9Vδ2 T cell stimulation by a natural adenylated phosphoantigen Authors: Pierre Vantourout*,¶, Jayati Mookerjee-Basu*,¶, Corinne Rolland*, Frédéric Pont#, Hélène Martin†, Christian Davrinche†, Laurent O. Martinez*, Bertrand Perret*, Xavier Collet*, Christian Périgaud‡, Suzanne Peyrottes‡, and Eric Champagne*,§,//. Affiliations : *,† INSERM, U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, *Département Lipoprotéines et Médiateurs Lipidiques ; †Immunologie et Pathologies Infectieuses, Toulouse, F-31000, France ; Université Toulouse III Paul Sabatier, Toulouse, F-31000, France. # Institut Claude de Préval (IFR150), Technical platform Interactions et Profils d'expression Protéiques, Toulouse, F-31000, France. ‡ UMR 5247-CNRS-UM1-UM2, Equipe Nucléosides et Effecteurs Phosphorylés, Université Montpellier 2, cc 1705, Montpellier, F-34095, France. § To whom correspondence should be addressed ¶ Contributed equally to this work // Financial support This work was financially supported by the French Association pour la Recherche sur le Cancer (PV and contracts #3711-3913-4847) and Ligue Nationale contre le Cancer (#R07002BBA). LM and JMB are supported by Inserm (Avenir) and FRM respectively. Correspondence Eric Champagne, INSERM U563, Dept. LML, CHU Purpan, BP 3028, F-31024, Toulouse, France. e.mail: [email protected] Running title Nucleotidic antigens for Vγ9Vδ2 cells Abbreviations : ApppI: triphosphoric acid 1-adenosin-5'-yl ester 3-(3-methylbut-3-enyl) ester HDMAPP: hydroxyl dimethylallyl pyrophosphate IPP: isopentenyl pyrophosphate Nano ESI-ITMS: nano electrospray ion trap mass spectrometry NPP: nucleotide pyrophosphatase 124 Résultats II : Propriétés de l’ApppI Abstract Human Vγ9Vδ2 T lymphocytes recognize phosphorylated alkyl antigens. Isopentenyl pyrophosphate (IPP) was previously proposed as the main antigen responsible for Vγ9Vδ2 T cell activation by cancer cells. However ApppI, a metabolite in which the isopentenyl moiety is linked to ATP, was reported in cells activated with aminobisphosphonates. The contribution of this compound to tumor stimulatory activity was thus examined. ApppI induces selective expansion of Vγ9Vδ2 T cells from PBMCs. In the absence of APCs however, ApppI has little stimulatory activity on Vγ9Vδ2 T cells and optimal activation with ApppI requires addition of a nucleotide pyrophosphatase releasing IPP + AMP. Thus ApppI has no intrinsic stimulatory activity. Nevertheless, stimulation by ApppI is strengthened by the presence of APCs. Moreover, in contrast to IPP, ApppI can be efficiently pulsed on dendritic cells as well as on non-professional APCs. Pulsed APCs display stable and phosphatase-resistant stimulatory activity, indicative of antigen modification. HPLC analysis of tumor cell extracts indicates that latent phosphoantigenic activity is stored intracellularly in the Vγ9Vδ2 cell-sensitive tumor Daudi and can be activated by a nucleotide pyrophosphatase activity. The presence of ApppI in Daudi cell extracts was demonstrated by mass spectrometry. ApppI thus represents a storage form of phosphoantigen and nucleotidic antigens are thus a major source of phosphoantigenic activity in tumor cells. The unique properties of ApppI may be important for the design of antigens used in anti-cancer immunotherapeutic protocols using Vγ9Vδ2 cells. through the deoxylulose pathway, an alternative INTRODUCTION The majority of human peripheral T cells of bacterial route to the isoprenoid precursor the γδ type express a T cell receptor (TCR) isopentenyl comprising Vγ9 and Vδ2 variable regions. These Pyrophosphorylated antigens can directly activate usually represent 1 to 10% of circulating T Vγ9Vδ2 T cells and do not absolutely require to be lymphocytes, expand and release inflammatory presented by specialized antigen presenting cells cytokines in response to diverse infectious agents nor to be displayed on MHC or CD1 antigens (257, such as mycobacteria, bacteria and parasites (253). 261). Nucleotidic derivatives of phosphoantigens They also display cytotoxicity towards diverse have been purified from mycobacteria and have tumor cells including laboratory tumor lines (Daudi been found to stimulate Vγ9Vδ2 cells (85, 256). Burkitt’s lymphoma, RPMI-8226 myeloma) and Multiple multiple cancer lines from patients with, among pyrophosphorylated others, lung, prostate, liver or kidney cancers (119, nucleotidic variants have been studied and some of 254, 255). them proved to be powerful stimulants of Vγ9Vδ2 Metabolites which stimulate Vγ9Vδ2 T cells in pyrophosphate synthetic (IPP) antigens compounds (258-260). analogous as well to as T cells (138, 156, 262). a TCR-dependent manner have been purified from The precise mechanism underlying mycobacteria and called phosphoantigens because phosphoantigen they consist in a short alkyl chain and a terminal Structure-activity correlation studies of synthetic pyrophosphate group (85, 256, 257). The most phosphoantigens indicated that, although short powerful natural antigen reported so far is hydroxyl alkyls such as ethyl pyrophosphate display some dimethylallyl a activity, optimal structures contain five carbon organisms atoms and one double bond (263). Belmant et al. metabolite pyrophosphate produced (HDMAPP), by microbial 125 recognition is still unclear. Résultats II : Propriétés de l’ApppI β-phospho-ester in cells after treatment with aminobisphosphonates be through inhibition of the mevalonate pathway cleavable(264) and a recent study by Boedec et al. enzyme farnesyl pyrophosphate synthase, resulting reported the strong stereospecificity of structural in an increased sensitivity to Vγ9Vδ2 T cell alkyl cytolytic reported that the pyrophosphorylated variants antigens (265). bond must Whether this reflects activity. Aminobisphosphonates also constraints for binding to the TCR or to a putative induce intracellular accumulation of ApppI, an presentation molecule is unknown. adenine TCR gene transfer experiments indicate that nucleotide derivative of IPP in macrophages (252). As the structure of this phosphoantigen recognition by Vγ9Vδ2 T cells is compound TCR-dependent (261). Nevertheless, a direct phosphoantigens such as TubAg3/4 and other interaction between the TCR and phosphoantigens analogous synthetic nucleotide derivatives with is only indirectly supported by structure-function stimulatory activity, we have studied its biological correlations (152, activity on Vγ9Vδ2 T cells(256). This revealed interaction models 266, 267) (268). In and these molecular studies, unique is reminiscent properties for of this bacterial nucleotidic aminoacids in the gamma chain complementarity phosphoantigen, making this type of compound of determining region-3 were found essential for particular interest for in vivo administration. We phosphoantigen recognition. show evidence that nucleotidic antigens are The presence of APCs improves direct Vγ9Vδ2 naturally produced in tumor cells and can play a T cell responses to phosphoantigens (269) but their major role in their stimulatory activity towards exact contribution is only partially characterized. Vγ9Vδ2 lymphocytes. Analyses with strong pyrophosphorylated agonist antigens such as bromohydrin pyrophosphate or MATERIALS AND METHODS HDMAPP (269-271) have shown that to some Antibodies and other reagents extent these antigens can be captured by APCs and Anti-TCRVδ2-FITC (IMMU360) and CD3-PE confer stable stimulatory activity, indicating that (UCHT1) were from Beckman-Coulter, anti-IFNγ- they can be somehow displayed on the cell surface PE (25273) from R&D systems, and anti-CD107a- as on stimulatory tumors. A mechanism for PE (H4A3) from BD- Pharmingen. Apyrase, phosphoantigen presentation is however supported Crotalus by recent experiments showing binding of soluble pyrophosphatase (NPP) and other reagents were Vγ9Vδ2 tetramers on APCs pulsed with HDMAPP. from This antigen-specific Pyrophosphate (Isoprenoids LC, Tampa, Florida, recognition of the membrane of pulsed cells which USA) and ApppI (see below). Apyrase and NPP was dependent on a trypsin-sensitive structure (271, were used in cellular and biochemical assays at the 272). concentration revealed Tumor a cells direct such and as Daudi Burkitt’s adamanteus Sigma Aldrich of venom except 0.2U/ml and nucleotide Isopentenyl 0.02U/ml respectively. lymphoma produce weak phosphoantigens through the mevalonate pathway. The major stimulatory Synthesis of ApppI compound, IPP, is overproduced in some tumors The procedure was adapted from Ryu et following hyper-activation of the mevalonate al.(274). Briefly, 110 mg (0.2 mmol) of ATP pathway (154, 273). IPP can also accumulate in (sodium salt) were converted into the corresponding 126 Résultats II : Propriétés de l’ApppI tetrabutylammonium salt then dissolved in dry were washed and incubated with the indicated acetonitrile (2 ml). To this mixture a solution of concentration of IPP or ApppI for 2h or 16h, isopentenyl tosylate (1 eq., 48 mg) was added in washed again 4 times, pelleted by centrifugation dry acetonitrile (2 ml). The reaction mixture was and used in T cell stimulation assays. stirred at room temperature overnight and For polyclonal Vγ9Vδ2 T cell lines concentrated. The oily residue was purified on a establishment, PBMCs isolated from buffy coats DEAE sephadex column using a gradient of from healthy donors (Etablissement Français du triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, pH Sang, Toulouse, France) were stimulated with 5µM 6.9, 0.2 to 1M). The fractions of interest were phosphoantigen (IPP or ApppI) in RPMI 1640- evaporated under vacuum, and passed through an glutamax medium supplemented with 10% heat- + ion-exchange Dowex (Na form) column to give inactivated human serum, sodium pyruvate and ApppI (1-(adenosin-5'-yl) 3-(3-methylbut-3-enyl) penicillin/streptomycin. 24h after stimulation, IL-2 triphosphoric diester) as sodium salt with a final was added at a final concentration of 200U/ml. On yield of 45%. ApppI was stored at -20°C. Aliquots day 5, IL-2 concentration was raised to 400U/ml. were reconstituted in molecular biology grade water Cells were passed every 2-3 days, maintained at a and stored at -80°C. In some preparations, HPLC concentration of 6.105/ml and frozen after 22-24 analysis of reconstituted product revealed the days of culture. Cell lines contained >94% Vδ2+ presence of 5-10% ADP (presumably from cells. Upon thawing, lymphocytes were left to spontaneous degradation). ADP does not affect recover overnight in culture medium without IL-2 responses of Vγ9Vδ2 cells in stimulations. This was before assessment of antigen responses. however checked additionally in control experiments in which this contaminating product Generation of DCs. was removed by apyrase treatment. To this end, PBMCs from healthy donors were sorted for ApppI was pre-treated for 1h with 0.2U/ml apyrase CD14+ cells using a MACS column (Miltenyi and the enzyme was then inactivated by heating at Biotec). DCs were obtained by culturing CD14+ 100°C for 10 minutes. cells in six-well plates (3x106 cells/ ml) for 7 days in Cell culture and pulsing with phosphoantigens human Dusseldorf, serum Germany) (PAA (Invitrogen) and interleukin-13 (IL-13, 50 ng /ml). Fresh IL-13 Laboratories, was added again after 4 days of culture. The phenotype of iDCs was monitored as described Synthelabo, Toulouse, France). Tumor cell lines previously (275) and was as follows: CD1a+, MHC- were obtained from ATCC and grown in RPMI I+, MHC-II+, CD64–, CD83–, CD80low, CD86low. For 1640 Glutamax supplemented with 10% heat- induction of maturation, immature DCs were inactivated and cultured for 48h in presence of 100ng/ml LPS and penicillin/streptomycin, or in Hybridoma SFM checked for maturation marker (CD83 and CD86). medium supplemented with sodium pyruvate, In some experiments, DCs were either pulsed with penicillin/streptomycin and L-glutamine (Complete pamidronate / IPP / ApppI (10μM) for 14-16h or SFM) for pulsing experiments since pulsing was kept untreated. After pulsing cells were washed less efficient in presence of FCS. In this case, cells three times with RPMI and used as antigen sodium IL-2 medium (Sanofi- FCS, and serum-free supplemented with GM-CSF (100 ng /ml; Novartis) Cell culture reagents were from Invitrogen except AIM-V pyruvate 127 Résultats II : Propriétés de l’ApppI presenting cells in Vγ9Vδ2 T cell activation assay 100 μL. Brefeldin A was omitted. Cells were using a T cell:APC ratio of 1:1. washed twice in FACS medium and stained for Proliferation assay TCR-Vδ2. Data were acquired and analyzed as for PBMCs were stimulated as described for proliferation assays. Results are expressed as the polyclonal Vγ9Vδ2 T cell lines establishment, mean of triplicate microwell cultures +/-SD. collected at the indicated times and stained for 30min at 4°C with anti-TCRVδ2-FITC and anti- Confocal CD3-PE antibodies (1/25 and 1/50 final dilutions, aggregation microscopy analysis of TCR respectively) in PBS 5% FCS (FACS medium). K562 were either pulsed with ApppI (20µM) or Data were acquired using a FACScan cytometer kept untreated for 16-18h, washed twice, stained (Becton Dickinson). with hexidium iodide (Molecular Probes, 5µM) and mixed with Vγ9Vδ2 T cells (1:1 ratio), centrifuged at 1200rpm for 1 min and incubated at 37°C for Intracellular cytokine staining were 30min (APCs). Cells were then resuspended gently stimulated for 5h in 96 U-bottom well plates with and layered onto poly-L lysine-coated 8-well slides. the indicated antigens after a brief centrifugation to After 10 min, 0.02% NaN3 was added and slides increase cell-cell contact. Brefeldin A (10μg/ml) were kept at room temperature for further 15 min. was added 1h after the initiation of culture. Cells The wells were washed once with PBS containing were then washed and stained with anti-TCRVδ2- 5% FBS and 0.02% NaN3. Finally cells were FITC antibody (1/25 final dilution) in FACS stained with anti-δ2-FITC, the slides were mounted medium, fixed for 15min with PBS containing 2% and observed under a Zeiss LSM 510 (Zeiss) paraformaldehyde (w/v) at room temperature and confocal microscope with a 63 Plan-Apochromat then permeabilized with saponin buffer (PBS, objective (1.4 oil), electronic zoom 3. Polyclonal Vγ9Vδ2 T cell lines 10mM HEPES, 5% FCS, 0.1% saponin) for 15min HPLC analysis of nucleotidic compounds at room temperature. Cells were then stained with anti-IFNγ-PE antibody (1/100 final dilution) in For NPP and apyrase sensitivity assays, saponin buffer for 30min at 4°C and washed twice reaction mixes containing nucleotidic compounds in FACS medium. Data were acquired and analyzed were adjusted to 200µL with water and products as for proliferation assays. Results are expressed as were separated by HPLC (System Gold, Beckman the mean of triplicate microwell cultures +/-SD. Coulter) on a PL-SAX anion exchange column (1000Å, 5µm, 50x4.6mm from Polymer Labs Varian, Marseille, France) using water (A) and 1M CD107 expression assay for cytolytic function Experiments were performed as previously (NH4)2HPO4, pH 3.5 (B) and the following elution described (247) with minor modifications. Briefly, gradient: 0-1 min: 0% B; 1-11 min: 0% to 30% B; polyclonal Vγ9Vδ2 T cell lines (105 cells) were 11-13 min: 100% B; 13-20min: 100% A. Eluted stimulated in 96-well U-bottom plates with the nucleotides were detected by monitoring UV indicated antigens, antibody-coated beads or tumor absorbance at 260nm. To evaluate phosphatase cell lines (1:1 ratio) for 5h after a brief sensitivity, centrifugation, in presence of the anti-CD107a-PE concentration) were incubated for 1h at 37°C in antibody (1/25 final dilution) in a final volume of 20µl RPMI in the presence of 0.2U/ml apyrase or 128 ApppI and ATP (100µM final Résultats II : Propriétés de l’ApppI 0.02U/ml nucleotide pyrophosphatase before voltage was set to 700 V. Samples were analyzed in analysis. the negative ion mode. ApppI (m/z 574) was For the assessment of intracellular antigens, fragmented using the following parameters : parent 8 Daudi cells (3x10 in 250ml) were washed in PBS, ion isolation width, 3 m/z; collision energy, 30%; pelleted and resuspended in 600μl of ice-cold H2O activation Qz, 0.25; activation time, 30 ms. MS3 + 600μl of ice-cold acetonitrile. Cell lysis was analysis of the ApppI fragment at m/z 408 was completed using a FastPrep-24 tissue homogenizer performed using the following parameters : parent and lysing matrix D ceramic spheres (MP ion isolation width, 3 m/z; collision energy, 33%; Biochemicals, Selom, OH) set at 4m/s, with 4 activation Qz, 0.25. Analysis was performed with pulses of 15s. The cell lysate was ultracentrifuged the Xcalibur 1.2 software (Thermo Electron, San (2x105g, 15min) and the supernatant (cytosolic Jose, CA). fraction) was lyophilized and redissolved in 200μl of H2O. This was loaded on an anion exchange RESULTS cationic column (Amersham Life Sciences, type Q) Direct stimulation of γδ T cells with nucleotidic and bound material was eluted (2ml/min) using H20 phosphoantigens (A) and ammonium acetate 1M, pH6.5 (B), with the The adenylated derivative of IPP, namely following gradient: 0 to 1min: 0% B, 1 to 17min: 0 triphosphoric acid 1-adenosin-5'-yl ester 3-(3- to 100% B, 17 to 20min: 100% B, 20 to 25min: 0% methylbut-3-enyl) ester, will be referred to as B. 0.5min, ApppI. In this compound the isopentenyl moiety is lyophilized and redissolved in 100μl of H2O. 10 μl linked to the γ-phosphate of ATP instead of being of each fraction was then tested for stimulatory linked to a pyrophosphate group (Fig.1). Fractions were collected every activity on Vγ9Vδ2 T cell microcultures. Mass Spectrometry Mass spectrometry was performed using an LCQ ion-trap mass spectrometer (Finnigan MAT, San Jose,CA). Nano electrospray analysis was performed using a nanospray ESI source (The Protein Palladium Analysis Co., Odense, and gold-coated glass Denmark). capillaries (Proxeon Biosystems, Odense, Denmark) were filled with 3 µL of analyte solution and positioned using a stereomicroscope at a distance of 1 mm to the opening of the heated transfer capillary kept at a Figure 1. Structure of ApppI and IPP. NPP and Apyr indicate the cleavage sites by nucleotide pyrophosphatase and apyrase. temperature of 150°C. A nebulizer gas was not necessary in this spray mode. The nanospray needle 129 Résultats II : Propriétés de l’ApppI Figure 2. Activation of Vγ9Vδ2 T cells by ApppI. (A,B) PBMCs were stimulated with phosphoantigens and IL-2 before staining for CD3 and TCR Vδ2 expression. (A) PBMC staining before and after in vitro culture (19 days) with ApppI (5µM). Numbers indicate the percentage of cells in each quadrant. (B) Comparative outgrowth of Vδ2 T cell 1 week after PBMC stimulation with IPP or ApppI plus IL-2. (C) Intracellular IFN-γ staining of Vδ2+ cells following PBMC stimulation with IPP and ApppI. (D) A Vγ9Vδ2 T cell line was stimulated with the indicated antigens in the presence of anti-CD107a-PE antibody to measure the activation of the cytolysis machinery. Cells were then washed and stained for TCRVδ2. Numbers indicate the percentage of CD107a+ cells among Vδ2+ cells. Data are representative ≥10 experiments. (E) PBMCs were stimulated in the presence of IPP (10μM) plus ApppI and stained as in C. (C,E) Results are means of triplicate cultures +/- SD. When added in a PBMC culture, ApppI induced the does not compete with IPP and has no toxic activity selective expansion of Vγ9Vδ2 T cells and the on responder cells (Fig.2E). culture reached homogeneity (~94%) in 3 weeks, as Effect of phosphatases on ApppI responses it is the case for most phosphoantigens (Fig.2A). Although IPP and ApppI both induce proliferation The phosphate groups of IPP are sensitive to and intracellular IFN-γ production, ApppI required terminal phosphatases such as alkaline phosphatase a 5 to 10-fold higher molar concentration for a (85, 262) or apyrase. Conversely ApppI is expected similar effect on Vγ9Vδ2 T cell expansion from to be resistant to degradation by the same enzymes. PBMCs (Fig.2B). The adenylated derivative was Indeed, treatment of ApppI with apyrase did not also less bioactive than IPP for the stimulation of change its HPLC profile whereas ATP used as a lymphokine production by Vγ9Vδ2 T cell, with half control for hydrolyzed maximum responses obtained at ~30μM instead of enzyme in activity similar is conditions completely (Fig3A). Strikingly, when added in stimulation assays, ~1μM for IPP (Fig.2C). Both compounds induced apyrase abolished the response to ApppI in the the cytotoxicity machinery as evidenced by the CD107 expression assay (Fig.3B) as well as in surface expression of the lysosomal marker cytokine production assays (data not shown). A CD107a although IPP induced again a stronger toxic effect of apyrase on lymphocyte responses is stimulation (Fig.2D). Addition of ApppI to IPP excluded as this enzyme does not influence the slightly increased stimulation, indicating that ApppI responses induced by anti-CD3 stimulation. 130 Résultats II : Propriétés de l’ApppI This suggests that ApppI has no stimulatory activity per se and requires to be converted into a compound in which the phosphate is terminal, most likely IPP. The structure of ApppI indicates that it could be hydrolysed to give IPP + AMP through cleavage of the α-β phosphoester bond by a nucleotide pyrophosphatase activity (276). ApppI was thus treated with nucleotide Crotalus adamanteus pyrophosphatase (NPP) venom and subsequently analyzed by HPLC. The profile of NPP-treated ApppI indicates the release of a nucleotidic moiety which elutes like AMP but not like ADP and is compatible with the expected cleavage of ApppI between the α and β phosphates Figure 3. Effect of apyrase on ApppI and ApppIinduced lymphocyte response. (A) Individual nucleotides or nucleotide mixtures were either untreated or treated with apyrase before analysis by anion exchange chromatography to assess their sensitivity to the enzyme. (B) Vγ9Vδ2 T cells were stimulated with ApppI, anti-CD3 antibody-coated beads or control medium in the presence or absence of apyrase, and the expression of CD107a was monitored as in Fig.2D. Data are means of triplicate stimulation experiments +/- SD. *: p≤0.003; NS: non-significant (2-tailed Student test). relative to the adenosinyl group (Fig.4A). We then evaluated the effect of NPP addition in the culture medium of ApppI-stimulated Vγ9Vδ2 T cells. NPP addition to the culture medium strongly increased the stimulatory activity of ApppI. Figure 4. Effect of nucleotide pyrophosphatase on ApppI and ApppI-induced responses. (A) Individual nucleotides or nucleotide mixtures were either untreated or treated with NPP before HPLC analysis as in Fig.3A. (B) Vγ9Vδ2 T cells were stimulated with ApppI in the presence or absence of NPP and the expression of CD107a was monitored as in Fig.2D. (C) The effect of NPP and its inhibitor PPADS was tested on lymphocyte stimulations by ApppI or anti-CD3 and monitored as in B. Data (B,C) are means of triplicate stimulation experiments +/- SD. *: p≤0.001; NS: non-significant (2tailed Student test). 131 Résultats II : Propriétés de l’ApppI As the enzyme was deprived of any effect in the antigens, absence of antigen, this was not due to the presence stimulation. Although pulsing with both antigens of nucleotidic antigens in the cultures or to a non- increased the stimulatory activity of tumors, pulsing specific enzyme with ApppI was again more efficient than with IPP, (Fig.4B). NPPs are sensitive to the pyrophosphatase and ApppI-pulsed tumors were stronger stimulators inhibitor than cells pulsed with the same molar concentration stimulatory pyridoxal activity of the phosphate-6-azophenyl-2',4'- disulfonic acid (PPADS (277)). PPADS completely extensively washed and used for of IPP (Fig.5B). abolished the weak spontaneous response to ApppI These results could be explained by an effect of in the absence of exogenous NPP, confirming that ApppI similar to aminobisphosphonate blockade of this response is due to partial conversion of ApppI farnesyl pyrophosphate synthase. If this was the into IPP in the culture medium. PPADS had no case, ApppI effect would be abolished by effect on the CD3-mediated stimulation, excluding simultaneous treatment of tumors with lovastatin, a non-specific toxicity of this compound (Fig.4C). preventing accumulation of endogenous IPP (154). Altogether, these data indicate that ApppI has no Fig.5C shows that lovastatin treatment abolishes significant and Daudi spontaneous stimulatory potential and K562 requires conversion into IPP for the stimulation of sensitization with pamidronate but has no effect on Vγ9Vδ2 T cells in the absence of APCs. K562 sensitization with ApppI. Thus ApppI does intrinsic stimulatory activity not act as an inhibitor of farnesyl pyrophosphate synthase. Effect of tumoral APCs on phosphoantigen- In order to determine if the acquisition of mediated stimulation It is largely documented that Vγ9Vδ2 T cell stimulatory activity by tumor cells required an stimulation is increased by the presence of active process, we studied the effect of temperature bystander APCs(269). However, although strong and cytoskeleton integrity on pulse efficiency. We agonist pyrophosphorylated antigens can be pulsed used RPMI-8226 cells and short pulsing conditions on antigen presenting cells (270, 271), this is (2h) which confer stable stimulatory activity generally considered as poorly efficient even on without dendritic cells (278, 279). When RPMI-8226 cells, temperature of pulse or with drug addition during which are week stimulatory tumors were added in pulsing. Pulsing was abrogated when performed at cultures of Vγ9Vδ2 T cells and phosphoantigens, 4°C or on cells which were previously treated with we observed a synergistic activation which was the actin polymerization inhibitor cytochalasin D more pronounced with ApppI than with IPP (Fig.5D). This indicates that pulsing is not simply (Fig.5A). This prompted us to compare the pulsing due to passive adsorption, requires an active efficiency of these two antigens on different APCs. mechanism and involves cytoskeletal components, We first compared the ability of IPP and ApppI to indicative of an active process. Finally, a specific be pulsed on tumor lines which are not professional TCR engagement following ApppI recognition on APCs. K562 and RPMI-8226 myeloma cell lines K562 cells is substantiated by a massive TCR have aggregation on the T cell surface (Fig.5E) as well as weak whereas spontaneous Daudi has a stimulatory strong activity, cell subsequent spontaneous alteration TCR downmodulation analysis (not shown). stimulatory activity for Vγ9Vδ2 T cells. All three cell lines were incubated overnight with both 132 when varying by the FACS Résultats II : Propriétés de l’ApppI Figure 5. Effect of antigen presentation on ApppI response. Vγ9Vδ2 T cells were stimulated as indicated and CD107a expression was monitored as in Fig.2D. Data are means of triplicate stimulation experiments +/- SD. (A) Stimulation with IPP, ApppI, RPMI-8226 cells (1:1 ratio) or RPMI-8226 plus phosphoantigens. (B) Indicated tumor cell lines were pulsed overnight with the indicated antigens before co-culture with Vγ9Vδ2 cells. (C) Daudi and K562 cells were treated overnight with the indicated compounds, washed and used as stimulators for Vγ9Vδ2 T cells. Lova: lovastatin (20µM); ApppI: 20µM; Pam: pamidronate (50µM). (D) RPMI-8226 cells were pulsed with ApppI (2h, 10µM) either at 37°C (Control), 4°C, or at 37°C after a 2h-pre-treatment with cytochalasin D (10µM), and washed extensively before addition of Vγ9Vδ2 T cells. (E) Vγ9Vδ2 T cells (surface-stained with anti-d2-FITC, green) were kept in contact for 20min at 37°C with K562 cells loaded with hexidium iodide (red) and loaded or not with ApppI. TCR aggregation was analyzed by confocal microscopy. (F) Tumor cells were pulsed overnight with pamidronate (50µM) or ApppI (20µM) or left untreated, washed, and polyclonal Vγ9Vδ2 T cells were added along with the indicated enzymes (Apyr: Apyrase, 0.2U/ml, NPP: Nucleotide Pyrophosphatase, 0.02U/ml). 133 Résultats II : Propriétés de l’ApppI ApppI-pulsed cells behave as classical Vγ9Vδ2 population target cell lines instead of phosphoantigen. The use of mature DC treated with pamidronate (50μM) As the direct stimulation of Vγ9Vδ2 T cells by was associated with a much lower Vγ9Vδ2 ApppI can be modulated by addition of NPP and lymphocyte response, suggesting that antigens are apyrase, it was important to check the effect of such captured less efficiently after DC maturation. Thus treatments on the stimulation by pulsed cells. These ApppI is similarly captured with higher efficiency enzymes were thus added in T cell stimulation than IPP by professional and non-professional assays using either Daudi cells or RPMI-8226 cells APCs. pulsed with pamidronate or ApppI (Fig.5F). In all cases, stimulation with tumor cells was completely resistant to treatment with apyrase and NPP whereas direct simulation was sensitive to phosphatases. Thus the antigen was not recognized in soluble form, was somehow processed to become resistant to these enzymes and was stably presented on the surface of tumors. This also indicates that the Vγ9Vδ2 T cell stimulation by antigen-pulsed tumors and their direct stimulation by soluble IPP or ApppI result from different mechanisms and different antigenic forms. Pulsing of professional APCs with ApppI Dendritic cells have previously been shown to potentiate phosphoantigen responses(280). Based on above observations we compared the pulsing Figure 6. Pulsing of phosphoantigens on dendritic cells. (A) DC were derived from CD14+ PBMCs (iDC) and maturation was induced by 48h LPS stimulation (mDC). They were subsequently pulsed with IPP or ApppI, extensively washed and cocultured with Vγ9Vδ2 cells. T cell activation was monitored by CD107a expression.in Vδ2+ cells. (B) Representative pattern of CD83 and CD86 expression on DC populations before and after LPS treatment. efficiency of IPP and ApppI on monocyte-derived dendritic cells (DC). As immature DC (iDC) are more prone to capture exogenous antigens than mature DCs (mDC) we also analyzed the ability of DC to be pulsed with IPP and ApppI and to stimulate Vγ9Vδ2 cells following maturation by 24h LPS treatment (Fig.6). Maturation of DC was confirmed by the increase of CD83 and CD86 Daudi cells naturally produce nucleotidic antigens surface expression. After incubation with IPP or Above results indicate that ApppI-pulsed cells ApppI (10μM) and extensive washing to eliminate are quite similar to spontaneously stimulating passively adsorbed antigens, both iDC and mDC tumors and that ApppI is more prone than IPP to be populations were able to stimulate Vγ9Vδ2 captured and displayed in a stimulatory form by lymphocytes. ApppI was however more efficiently tumors. This suggests that nucleotidic derivatives of pulsed than IPP and the stimulatory activity of phosphoantigens could be produced intracellularly ApppI-pulsed DC reached that of the same 134 Résultats II : Propriétés de l’ApppI by tumors as well as IPP. To check for the presence Synthetic ApppI gives a m/z 574 pseudo of nucleotidic stimulatory compounds in Daudi molecular ion ([M-H]-). As previously described cells, and (252), its fragmentation produces major ions at m/z separated by ion exchange HPLC. After elution of 408 and m/z 227). To increase the MS signature of bound material, fractions were collected, treated ApppI, MS3 analysis was performed on the major with non-nucleotidic ion with m/z 408 which could be further phosphoantigens, and tested for their stimulatory fragmented and produced an ion with m/z 273 and activity on Vγ9Vδ2 cells in the presence or absence the pyrophosphate related ion with m/z 159 of NPP. Stimulatory activity was barely detectable (Fig8A). The HPLC fraction containing the putative in the absence of NPP. However, in the presence of natural this active, analyzed using identical MS parameters. An ion nucleotidic with m/z 574 was present at trace levels (not cytosolic extracts apyrase enzyme, suggesting to prepared remove several the were fractions presence of were nucleotidic shown). phosphoantigens. A major peak of activity eluted After phosphoantigen fragmentation this was gave then the 2 with a retention time close to that of purified ApppI characteristic ions of ApppI in both the MS and the (10.5 to 11min) (Fig.7). This fraction was MS3 spectra (Fig.8B). Thus, although other subsequently analysed by electrospray ionization stimulatory compounds may also be present in cell ion trap mass spectrometry (ESI-ITMS MS). extracts, ApppI is produced intracellularly by Daudi cells. DISCUSSION When studying the inhibitory effect of aminobisphosphonates, Monkkonnen et al. found that these compounds induced the intracellular accumulation of ApppI which presents proapoptotic properties on macrophages and osteoclasts. They also provided evidence that this nucleotidic metabolite arose in cells following farnesyl pyrophosphate synthase inhibition and IPP accumulation and a tRNA synthase activity was proposed to be responsible for IPP to ApppI conversion (252, 281). The possibility that ApppI is somehow involved in the stimulatory effect of tumors on Vγ9Vδ2 lymphocytes was however Figure 7. Daudi cells produce endogenous nucleotidic phosphoantigens. (A) Elution profile of AMP, ADP, ATP and ApppI. (B) Fractions eluted from Daudi cytosolic extracts were treated with apyrase. This was then denatured by heating and samples were assayed for Vγ9Vδ2 T cell stimulation with or without adding exogenous NPP. Data are means of triplicate stimulation experiments +/- SD. never investigated before, and although many nucleotidic derivatives of phosphoantigens have been studied, ApppI has never been tested. We show here that ApppI efficiently stimulates Vγ9Vδ2 T cells when added in PBMC cultures and is thus comparable to other phosphoantigens. 135 Résultats II : Propriétés de l’ApppI Figure 8. Detection of ApppI in Daudi cell extracts by mass spectrometry. (A) Nano ESI-ITMS analysis of synthetic ApppI. Top panel: full scan MS, showing the pseudo molecular ion signal of ApppI corresponding to ([M-H]-). Middle panel: MS2 spectrum of m/z 574. Bottom panel: MS3 spectrum resulting from the fragmentation of the m/z 408 ion. (B) Nano ESI-ITMS analysis of biological extract corresponding to HPLC fraction eluting between 10.5 and 11 min (cf. Fig.7A). Top Panel: MS2 spectrum of an m/z 574 ion from full scan , showing the characteristic m/z 408 ion. Bottom: spectrum resulting from the fragmentation of the m/z 408 ion showing a pattern similar to that of synthetic ApppI. However ApppI has no intrinsic stimulatory and this display is strongly impaired when cells are activity on Vγ9Vδ2 T cells in the absence of APCs, kept at 4°C or when cytoskeletal components are requiring cleavage of the α-β phosphoester bond altered by cytochalasin D. After exposition to and IPP release for activity. This is apparently at ApppI, cells behave as spontaneously stimulatory odds that tumors or aminobisphosphonate-treated cells and on their stimulatory activity is not only stable on the phosphoantigen activity. However, although it is cell surface but also resistant to phosphatases which not pyrophosphate normally degrade pyrophosphorylated antigens derivatives display specific properties, in previous (such as apyrase) or nucleotidic derivatives (such as reports, the activity of nucleotidic antigens was NPP), indicating antigen modification or protection. evaluated in the presence of APCs (156, 262). Altogether, these data suggest the existence of a with nucleotide previous addition excluded that reports had indicating little isopentenyl effect ApppI can be captured by professional or non- specific receptor and transport mechanism for professional APCs and confers them a stimulatory nucleotide derivatives. Is tumor cell stimulatory activity. Strikingly, this is more efficient than activity due to pyrophosphates or nucleotidic pulsing with an equivalent molar concentration of antigens? HPLC analysis of cytosolic extracts IPP. Once captured by cells, the phosphoantigenic reveals that nucleotidic antigens are present in activity is stably “expressed” on the cell surface, stimulatory tumors. Their characterization is based 136 Résultats II : Propriétés de l’ApppI upon the fact that the stimulatory activity requires demonstrations of cell-cell contact requirement NPP addition for activation of Vγ9Vδ2 cells in the (124, 278) and the recent demonstration that soluble absence of APCs. Thus, both nucleotidic and non- recombinant TCR constructs bind the tumor cell nucleotidic antigens may be responsible for tumor surface after exposition of cells to HDMAPP (271). stimulatory activity. ApppI ultimately requires re- Although the antigen used in the latter quoted hydrolysis into IPP and the latter might be the only experiments were not nucleotidic derivatives, it is biologically relevant antigenic form for Vγ9Vδ2 T quite possible that part of the antigen has been cell stimulation. However, we propose that IPP to converted into a nucleotidic derivative and exposed ApppI conversion has two biologically important in this form on the cell surface, either covalently consequences. 1) ApppI represents an inactive bound or strongly associated to a presentation “storage” form of phosphoantigen which may bind structure. to carrier proteins and may be protected from It remains that ApppI is not active directly and degradation. Thus storage of antigens as nucleotidic requires final conversion to IPP to activate T cells. derivatives might prolong their half-life and However, this process could conceivably be immunogenicity. 2) Even if ApppI does not present achieved by cell-surface associated and tightly any direct stimulatory activity, it is more readily regulated NPPs (282). Thus, nucleotidic derivatives captured and displayed as a stimulatory antigen by of cells. After sensitization with ApppI, tumors intermediates acquire a stimulatory activity which is resistant to processing mechanism, although direct evidence of phosphatases and in this respect are similar to phosphoantigens on cell membranes is still actively naturally stimulating tumors. searched for. phosphoantigens in a may represent possible important phosphoantigen Based on these observations, we propose that tumoral phosphoantigens are in fact transported and displayed on the cell surface of tumors in the form ACKNOWLEDGMENTS of nucleotidic derivatives and are stably associated We thank F. L’Faqihi, V. Duplan-Eche (technical with a presentation structure. Such presentation platform of cytometry of IFR150) for their mechanism technical is supported by classical assistance in cytometry. REFERENCES 1. 2. 3. 4. Chen, Z. W., and N. L. Letvin. 2003. Vgamma2Vdelta2+ T cells and anti-microbial immune responses. Microbes Infect 5:491-498. Hayday, A. 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Bien que la structure tridimensionnelle du TCR suggère que le site de liaison antigénique est fortement compatible avec la structure générale des phosphoantigènes (41), aucune étude à ce jour n’a pu démontrer de liaison directe, que ce soit par Biacore ou cristallographie. Il est donc très probable que l’antigène est incapable de se lier directement au TCR sans molécule de présentation. L’identification de l’Ecto-F1-ATPase comme antigène tumoral reconnu par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 ainsi que les propriétés structurales et fonctionnelles de l’ApppI décrites précédemment nous ont conduits à utiliser ce dernier pour explorer la possibilité que l’EctoF1-ATPase puisse présenter les phosphoantigènes. Nous avons pu observer que la lignée 721.221, sur laquelle l’Ecto-F1-ATPase est à peine détectable, n’est pas capable de présenter des phosphoantigènes. De plus, des billes recouvertes d’ATP synthase sont capables de présenter des phosphoantigènes aux lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Pour finir, nous disposons de résultats expérimentaux, bien qu’indirects, confirmant la liaison stable de l’ApppI sur l’ATP synthase. 142 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase 2) Article 3 (Manuscrit en préparation) Title: Co-recognition of Phosphoantigens and F1-ATPase by Vγ9Vδ2 T Lymphocytes Running head Phosphoantigen Recognition by Vγ9Vδ2 Lymphocytes Authors: Jayati Mookerjee-Basu*,†,§, Pierre Vantourout*,†,§, Laurent O. Martinez*, Bertrand Perret*, Xavier Collet*, Christian Périgaud†, Suzanne Peyrottes†, and Eric Champagne*#. § contributed equally to this work. Affiliations : * INSERM, U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Département Lipoprotéines et Médiateurs Lipidiques, Université Toulouse III Paul Sabatier, Toulouse, France. † UMR 5247-CNRS-UM1-UM2, Equipe Nucléosides et Effecteurs Phosphorylés, Université Montpellier 2, Montpellier, France. Correspondence : Eric Champagne, INSERM U563, Departement LML, CHU Purpan, BP 3028, F-31024, Toulouse, France. E.mail: [email protected] # Financial support This work has been financially supported by the French Association pour la Recherche sur le Cancer (PV and contracts #3711-3913-4847) and Ligue Nationale contre le Cancer (#R07002BBA). LM and JMB are supported by Inserm (Avenir) and FRM respectively. Abbreviations ApppI: triphosphoric acid 1-adenosin-5'-yl ester 3-(3-methylbut-3-enyl) ester HDMAPP: hydroxyl dimethylallyl pyrophosphate IPP: isopentenyl pyrophosphate NPP: nucleotide pyrophosphatase bF1: bovine heart mitochondrial F1/Fo-ATPase complex ABSTRACT Vγ9Vδ2 T lymphocytes are activated by phosphoantigens provided exogenously or produced by tumors and infected cells. Activation requires a contact between Vγ9Vδ2 cells and neighboring cells. We previously reported a role for cell surface F1-ATPase in T cell activation by tumors and specific interactions between Vγ9Vδ2 TCRs and purified F1-ATPase. By monitoring calcium flux in single cells, we now show that contact of T cells with F1-ATPase on polystyrene beads can partially replace the cell-cell contact signal during phosphoantigen responses. ApppI, an adenylated derivative of IPP, can stably bind to F1-ATPase-coated beads and promotes TCR aggregation, lymphokine secretion and activation of the cytolytic process provided that a nucleotide pyrophosphatase activity is present. Our experiments support the notion that Vγ9Vδ2 T cells are dedicated to the recognition of phosphoantigens on cell membranes in the form of nucleotide derivatives which can bind to F1-ATPase acting as a presentation molecule. also recognize diverse tumor cells against which INTRODUCTION Human lymphocytes of the Vγ9Vδ2 subset they frequently exert cytotoxicity. The Vγ9Vδ2 represent the main pool of non-conventional T TCR is thought to function as a pathogen- lymphocytes in adult blood and lymph nodes. They associated molecular pattern receptor dedicated to expand and their effector functions are triggered the recognition of phosphoantigens. Strong agonists following non-peptidic such as hydroxy dimethyl allyl pyrophosphate phosphorylated antigens (85, 257) in a TCR- (HDMAPP) are produced by bacterial organisms dependent manner (41, 261). Mature Vγ9Vδ2 cells through the deoxyxylulose phosphate pathway the recognition of 143 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase (283). However, eukaryotic cells produce a weaker provided by the contacting cell has not been fully Vγ9Vδ2 isopentenyl elucidated and could involve antigen presentation, ubiquitous co-stimulation, or both. We reported previously that mevalonate pathway of isoprenoid synthesis. Vγ9Vδ2 sensitive tumors display on their surface a Accumulation of IPP naturally occurs in tumor cells complex similar to mitochondrial ATP synthase, following dysregulation of this metabolic pathway ecto-F1-ATPase (144). Recent experiments revealed by the tumorigenesis process (154). Dysregulation that the complex is tightly associated with MHC-I of the mevalonate pathway in macrophages can also antigens, an interaction which can mask antigenic result from phagocytosis of bacteria (284). IPP epitopes and prevent detection of the F1-ATPase accumulation can be induced pharmacologically by complex on many cell types expressing high levels aminobisphosphonate drugs which inhibit farnesyl of MHC-I antigens (204). Using soluble forms of pyrophosphate which the Vγ9Vδ2 TCR and of a soluble form of bovine normally consumes IPP in downstream isoprenoid F1-ATPase, specific interactions between the TCR synthesis (273). Tumor cells which accumulate IPP of the G115 Vγ9Vδ2 T cell clone and ecto-F1 strongly activate Vγ9Vδ2 T cells and become ATPase have been demonstrated (144). TCR pyrophosphate agonist (IPP) antigen, through synthase, the the enzyme highly susceptible to their cytolytic activity in particular after down-modulation of In the present work, we have used ApppI and MHC-I its non-nucleotidic analogue IPP to explore the expression(67). In addition phosphoantigens contribution of nucleotidic antigens and F1-ATPase to alkyl pyrophosphates, also exist as to phosphoantigen responses. nucleotidic conjugates co-produced by microorganisms (85). MATERIALS AND METHODS Moreover, ApppI, an adenylated derivative of IPP, Antibodies and other reagents accumulates in cells overproducing IPP (252, 281). Anti-TCRVδ2-FITC (IMMU360) and CD3ε- We found that it is naturally produced in the PE (UCHT1) were from Beckman-Coulter, anti- Vγ9Vδ2 tumoral target Daudi as well. ApppI CD107a-PE (H4A3) from BD- Pharmingen. Anti- requires cleavage into IPP+AMP to stimulate ATP synthase α-subunit (7H10) and β-subunit Vγ9Vδ2 cells in the absence of APCs. However, it (3D5) were from Molecular Probes. Apyrase, can be efficiently captured by diverse cell lines and Crotalus adamanteus nucleotide pyrophosphatase dendritic cells and confers a strong stimulatory (NPP). IPP was from Isoprenoids LC (Tampa, activity for Vγ9Vδ2 cells (PV et al, submitted). Florida, USA). The method for ApppI synthesis is TCR activation by phosphoantigens is not reported elsewhere (PV, submitted). Apyrase and completely understood. Although not absolutely NPP were used in cellular and biochemical assays required, antigen presenting cells (APC) increase at the concentration of 0.2U/ml and 0.02U/ml Vγ9Vδ2 T cell responses to phosphoantigènes respectively. F1Fo complexes from bovine heart (269). Nevertheless, the activation of Vγ9Vδ2 mitochondria (bF1) were kindly provided by Pr. J.E. lymphocytes by soluble phosphoantigens requires Walker (MRC, Cambridge, UK). contact with a neighboring cell which does not need Cell pulsing with phosphoantigens to be a specialized APC, is not required to express MHC molecules and can be a neighboring T cell Polyclonal Vγ9Vδ2 T cell lines (>94%) were (124, 285). However, the nature of the signal used throughout this study and generated by IPP 144 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase stimulation of PBMCs and expansion in IL2. cells were left to adhere for 10min to the bottom of Control αβ T-cell lines were obtained with the poly-D-lysine-treated same protocol using staphylococcal enterotoxin B chamber slides in 100μl of RPMI containing 5% instead of IPP. FCS and 10mM Hepes. Fluorescence measurements (5μg/ml) 8-well Labtek (excitation: 340 and 380nm, emission: 510nm) Pulsing ApppI on F1-ATPase-coated beads were performed on a Zeiss Axiovert 200M inverted For immobilization on beads, solubilized microscope equipped with a CCD camera and a bovine bF1 was diluted (5µg/ml) in 1 ml of PBS and 37°C, 5% CO2 chamber. Analysis was performed incubated with 10 7 6µm polystyrene beads on isolated T cells. The camera output was analyzed (Biovalley, Marne-la-Vallée, France) for 4h at room with temperature on a wheel. Beads were pelleted by fluorescence ratios were converted to approximate centrifugation, washed three times and kept in PBS intracellular calcium concentrations (intra cellular 1% BSA. Beads were used in stimulation assays as calcium indexes) as described (286). At each time cultured cell lines. In control beads bF1 was point, the ratios from 10 to 15 cells were averaged replaced by BSA or anti-CD3ε antibody (25μg/ml). and data were expressed as means +/- SD. the Metafluor software. 340/380nm For loading with phosphoantigens, a suitable aliquot of beads was incubated with ApppI or IPP Confocal microscopy (50µM) for 2 hours at 37°C in serum-free culture K562 or 721.221 cells were either pulsed with medium, washed extensively, and used for Vγ9Vδ2 ApppI (20µM) or kept untreated for 16-18h, T cells stimulation. In phosphatase sensitivity washed twice and stained with Hexidium Iodide assays NPP or control medium were added to the (Molecular Probes, 5µM) and used as APCs. beads 15 to 60min before or after pulsing the beads. Alternatively, F1-coated beads were pulsed with These were then washed extensively and cocultured 50µM ApppI as above and used for interaction of T with T cells and NPP (0.02U/ml). cells. Vγ9Vδ2 T cells were mixed with APCs at the ratio of 1:1 or with beads (5 beads for 1 T cell) in presence or absence of nucleotide pyrophosphatase, T cell activation assays CD107a expression assay for cytolytic function centrifuged at 1200rpm for 1 min and incubated at were performed as described (247) except that 37°C for 30min (APCs) or 50min (beads). Cells brefeldin A was omitted. For IFN-γ release assays, were then resuspended gently and layered onto T cells (5x105) were co-culture with antigen or poly-L lysine-coated slides. After 10min, 0.02% antibody-coated beads (106) in 100 μl/well in round NaN3 was added and slides were kept at room bottom 96-well plates, in CM supplemented with a temperature for further 15min. After washing, the substimulatory dose of PMA (0.6 ng/ml) for 24h. cells were stained with anti-δ2-FITC, the slides Supernatants were recovered and IFN-γ was were mounted and observed under a Zeiss LSM 510 measured using a standard ELISA assay (OptEIA, (Zeiss) confocal microscope as described(287). BD Biosciences). RESULTS AND DISCUSSION F1-ATPase promotes phosphoantigen responses Single cell analysis of calcium mobilization Ecto-F1-ATPase can be detected on many cell Vγ9Vδ2 T cells were loaded with fura-2-AM lines (Molecular probes, 5μM, 20min), washed, and 105 145 by surface immuno-staining with the Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase antibodies 7H10 (α-subunit) and 3D5 (β-subunit) although high MHC-I expression strongly interferes with its detection by masking target epitopes (204). However, it is barely detected on 721.221 cell line as opposed to Daudi and K562 which are similarly MHC class I-deficient (Fig.1A). In order to evaluate the possible implication of F1-ATPase in the delivery of a cell-cell contact signal for the response to IPP, we tested the ability of 721.221 to deliver it. An IPP-specific Vγ9Vδ2 T cell line was raised by stimulation of PBMC with IPP. Live Vγ9Vδ2 T cells were loaded with the fluorescent calcium probe fura-2 and immobilized in culture medium on the bottom of Labtek chamber slides in Figure 1. 721.221 cells do not support phosphoantigen responses. (A) Surface expression of α (dashed lines) and β (solid lines) subunits of human F1-ATPase monitored on three MHC class I-deficient lines by FACS. Shaded histograms: control IgG. (B) Vγ9Vδ2 cells loaded with Fura-2 were attached to the bottom of microscope chamber slides in conditions were they made minimal intercellular contacts. Intracellular Ca++ flux was monitored by recording the fluorescence ratio after 340/380nm excitation in T cells making no contact with neighboring T cells. IPP was added when indicated. K562 or 721.221 cells were added on top of the medium. (n=10 to 20 cells). (C,D) Vγ9Vδ2 T cells were co-incubated for 5h with Daudi, K562 or 721.221 cells, either untreated or pulsed overnight with 20μM ApppI (C) or pamidronate at the indicated concentration (D). Cell activation was monitored by measuring the percentage of CD107a+ cells in Vδ2 cells. (E) TCR aggregation in T cells (FITC, green) was examined by confocal microscopy following 30 min contact with ApppI-pulsed or untreated K562 or 721.221 cells loaded with hexidium iodide (red). conditions where they did not make contacts with each other. IPP was provided in solution. Cell contact was provided by adding unlabelled tumor cells on top of the culture and the increase in intracellular calcium concentration was then monitored by recording fluorescence using videomicroscopy (Fig.1B). In the absence of cell-cell contact, IPP did not induce intracellular Ca++ flux. Addition of K562 cells in the presence of IPP produced a calcium flux which was maximal a few minutes after initial contacts with K562 cells, and decreased gradually to reach the base line after ~15min. Calcium flux was not observed in the absence of IPP. 721.221 cells failed to promote IPP-mediated calcium response. Unlike K562, this cell line was also unable to promote Vγ9Vδ2 T cell activation and TCR aggregation after pulsing with the aminobisphosphonate pamidronate or with the To exclude a non-specific activation, BSA-coated phosphoantigen ApppI (Fig.1C-E). To confirm a beads were used as a control. The contact of bF1- direct involvement of F1-ATPase in the co- coated beads promoted a gradual increase of activation signal, calcium flux analysis was intracellular calcium when IPP was present in the performed as above except that contacting tumor culture medium. The calcium flux was delayed and cells were replaced by polystyrene beads coated increased slowly as compared with the rapid flux with purified bovine mitochondrial F1/Fo-ATPase triggered by whole cells expressing F1-ATPase. complexes (bF1, Fig.2). 146 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase is specific for Vγ9Vδ2 cells as a control αβ T cell Figure 2. Purified provides a bF1 contact signal for the response to IPP. The intracellular flux in Ca++ individual Vγ9Vδ2 cells was monitored as in Fig.1B except that tumor cells were replaced by beads coated with bF1 or BSA. (n=10 and 11 cells). line was unresponsive to ApppI-loaded bF1 although it responded well to anti-CD3 stimulation. Monitoring CD107a expression after stimulation gave qualitatively identical results (data not shown). bF1 loaded with ApppI also induced calcium mobilization in the single cell assay described above following addition of exogenous NPP. Thus bF1 can present ApppI to Vγ9Vδ2 cells but, in the absence of APCs, IPP must be released from complexes by addition of exogenous NPP to allow activation of Vγ9Vδ2 T cells. This flux presumably resulted from multiple weak To confirm that ApppI recognition on bF1 involved but antigen-specific contacts with beads since it TCR interaction, TCR redistribution on Vγ9Vδ2 T was not seen with beads which did not carry bF1 or cells was examined by confocal microscopy. After with bF1 in the absence of IPP. Thus purified bF1 50min co-incubation of T cells, bF1 alone did not can deliver at least part of the membrane contact induce significant TCR aggregation (4.4% of T signal normally delivered by contacting cells. cells). On the contrary, when ApppI was loaded on F1-ATPase stably binds bF1, typical patches of TCRs were observed. nucleotidic Similar results were obtained when ApppI-loaded phosphoantigens bF1 were used with or without NPP addition (43% We then tested the possibility that F1-ATPase versus 39%), indicating that ApppI recognition is could be used by cells to present phosphoantigens. required for TCR aggregation but that hydrolysis by To assess the stable binding of phosphoantigens to NPP is not. F1-ATPase, bF1-coated beads were incubated with IPP or ApppI, extensively washed and used to F1-ATPase protects ApppI from NPP activity stimulate Vγ9Vδ2 T cells. As ApppI in the absence Although tumor cells produce pyrophosphate of APCs requires addition of exogenous nucleotide antigens intracellularly, these are probably not pyrophosphatase (NPP) the stimulatory activity of recognized in solution since T cell activation by “antigen-pulsed” beads was evaluated in the tumors is not altered by enzymes which degrade presence and absence of exogenous NPP (Fig.3). pyrophosphates such as apyrase, or nucleotide Stimulation of Vγ9Vδ2 T cells with ApppI-pulsed pyrophosphatases which cleave their nucleotide bF1 promoted lymphokine secretion in the presence derivatives (PV, submitted). We wondered how of NPP. This indicates that ApppI can be stably NPP treatment of ApppI/bF1 complexes prior to loaded onto bF1 and that IPP can be released from their exposure to T cells would affect T cell the complex by exogenous NPP. No activity could activation. Beads carrying ApppI/bF1 complexes be retained on IPP-pulsed beads indicating that were thus treated with NPP for variable times and binding requires the antigen in nucleotidic form. washed. As a control for NPP activity, ApppI was Non-specific binding of nucleotidic antigen on similarly treated before its incubation with bF1- beads is excluded since no activity is retained on coated beads. control BSA-coated beads. The stimulatory activity 147 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase Figure 3. Stable binding of ApppI on bF1. (A) Polystyrene beads were coated with BSA (BSA) or bovine F1-ATPase (bF1), and incubated with IPP or ApppI. After extensive washing, the beads were co-incubated overnight with Vγ9Vδ2 cells plus a substimulatory dose of PMA, in the presence or absence of exogenous NPP. After incubation, supernatants were recovered and assayed for IFN-γ by ELISA. Results are from triplicate co-cultures (means +/-SD) and are representative of more than 3 similar experiments. (B) T cell stimulation was performed as in (A) using αβ and γδ T cell lines. Beads coated with anti-CD3ε antibody were used as control for cell integrity. (C) The intracellular Ca++ flux in individual Vγ9Vδ2 cells following contact with polystyrene beads coated with bF1 and subsequently loaded with ApppI. Ca++ flux was monitored with and without addition of exogenous NPP (n=11 cells for each panel). (D) TCR aggregation (anti-Vδ2-FITC, green) was examined by confocal microscopy as in Fig.1E except that tumor cells were replaced by ApppI-loaded, bF1-coated polystyrene beads, in the presence or absence of NPP. After the loading step, the beads were washed and As expected ApppI hydrolysis by a 30min enzyme tested for stimulatory activity in the presence of treatment before loading on beads abrogated NPP, by monitoring CD107a expression (Fig.4) or subsequent responses, due to deficient loading on intracellular cytokine accumulation (not shown). bF1. Nevertheless when the NPP treatment was Figure 4. F1 protects ApppI from hydrolysis by NPP. were bF1-beads loaded with ApppI and washed. ApppI was treated with NPP for the indicated time before (black bars) or after (white bars) addition to bF1coated beads. After washing, the beads were co-cultured 5h with Vγ9Vδ2 cells in the presence of NPP, and CD107a expression was monitored (mean of triplicate cultures+/-SD). Representative of three experiments. performed after loading on beads, a significant antigenic activity remained associated with beads after 1h of treatment, indicating that ApppI is protected from hydrolysis when loaded on bF1. Activation by F1-ATPase/ApppI complexes in the absence of APCs requires addition of NPP. If a similar mechanism is involved in tumor recognition, it seems likely that tumor cells/APCs provide the NPP activity. Our data suggest that antigen (IPP) release is mediated by a specific NPP activity occuring in a confined microenvironment at the T-cell-APC interface or is timely controlled to occur at the TCR contact site before a possible 148 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase action of other phosphatases. Several candidate cannot exceed the nM range. This is several orders NPPs have been reported on tumoral and non- of magnitude below IPP or ApppI concentrations tumoral tissues (282, 288). which give detectable activation when supplied in Single T cell responses to IPP are permitted by solution (μM range). Thus, presentation on F1- the co-recognition of F1-ATPase, although IPP, as ATPase increases the efficiency of phosphoantigen opposed to ApppI, does not stably bind to this recognition, possibly through concentrating the complex. We propose that this is because the antigen in the proximity of the TCR or by providing Vγ9Vδ2 TCR is dedicated to the recognition of protection from surrounding phosphatases. antigens on cell surfaces. It seems likely that this process is short-circuited by provision of phosphoantigens as pyrophosphates, allowing auto- ACKNOWLEDGMENTS presentation by γδ cells themselves which express We are grateful to Professor John Walker F1-ATPase (not shown). (Cambridge, UK) for kindly providing F1Fo Finally, assuming 100% binding of properly preparations. We thank F. L’Faqihi, V. Duplan- conformed bF1 to beads and hypothesizing six Eche (IFR-BMT, Toulouse, France, Technical catalytic and non-catalytic nucleotide binding sites Platform on the complex, an estimate of the phosphoantigen assistance in cytometry, and Sophie Allart (IFR- (ApppI) concentration in stimulation assays with BMT, Technical Platform Cell Imaging) for help in ApppI/bF1 complexes and NPP indicates that it confocal REFERENCES 1. Constant, P., F. Davodeau, M. A. Peyrat, Y. Poquet, G. Puzo, M. Bonneville, and J. J. Fournie. 1994. Stimulation of human gamma delta T cells by nonpeptidic mycobacterial ligands. Science 264:267-270. 2. Morita, C. T., C. Jin, G. Sarikonda, and H. Wang. 2007. Nonpeptide antigens, presentation mechanisms, and immunological memory of human Vgamma2Vdelta2 T cells: discriminating friend from foe through the recognition of prenyl pyrophosphate antigens. Immunol Rev 215:59-76. 3. Bukowski, J. F., C. T. Morita, Y. Tanaka, B. R. Bloom, M. B. Brenner, and H. Band. 1995. 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Monkkonen, H., P. D. Ottewell, J. Kuokkanen, J. Monkkonen, S. Auriola, and I. Holen. 2007. Zoledronic acid-induced IPP/ApppI production in vivo. Life Sci. 12. Rojas, R. E., M. Torres, J. J. Fournie, C. V. Harding, and W. H. Boom. 2002. Phosphoantigen presentation by macrophages to mycobacterium tuberculosis--reactive Vgamma9Vdelta2+ T cells: modulation by chloroquine. Infect Immun 70:4019-4027. 13. Morita, C. T., E. M. Beckman, J. F. Bukowski, Y. Tanaka, H. Band, B. R. Bloom, D. E. Golan, and M. B. Brenner. 1995. Direct presentation of nonpeptide prenyl pyrophosphate antigens to human gamma delta T cells. Immunity 3:495507. 14. Kato, Y., Y. Tanaka, H. Tanaka, S. Yamashita, and N. Minato. 2003. Requirement of speciesspecific interactions for the activation of human gamma delta T cells by pamidronate. J Immunol 170:3608-3613. 15. Scotet, E., L. O. Martinez, E. Grant, R. Barbaras, P. Jeno, M. Guiraud, B. Monsarrat, X. Saulquin, S. Maillet, J. P. Esteve, F. Lopez, B. Perret, X. Collet, M. 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De nombreuses études ont montré que la liaison de nucléotides ou de certaines autres molécules comme le pyrophosphate sur les sites non-catalytiques est capable d’augmenter de façon significative l’activité de l’ATP synthase. De plus, cette activité ne suit pas une loi michaëlienne, les sites catalytiques montrant une forte coopérativité. Selon les études, l’enzyme a été décrite pour posséder 2 voire 3 Km (289). L’ApppI étant capable de se lier de façon stable sur l’ATP synthase, nous avons donc voulu vérifier si cette liaison induisait une modulation de son activité enzymatique. Ceci pourrait 150 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase donner des informations importantes sur les modalités de liaison des phosphoantigènes nucléotidiques à l’Ecto-F1-ATPase. Nous avons donc utilisé deux techniques expérimentales permettant de mesurer cette activité. La première consiste à doser l’ATP à l’aide d’un kit basé sur la mesure de la bioluminescence de la luciférase, dépendante de l’ATP. La seconde correspond à la mesure de l’oxydation du NADH par la méthode dite des enzymes couplées, test classiquement utilisé dans les études de mesure d’activités d’hydrolyse d’ATP. Nos résultats montrent que l’ApppI est capable de stimuler l’activité ATPasique de la F1ATPase in vitro et qu’il n’est pas hydrolysé par cette enzyme. Ceci suggère donc qu’il se lie aux sites non-catalytiques. 3.2) Matériel et méthodes Enzymes et réactifs La F1-ATPase bovine purifiée (préparation précipitée en sulfate d’ammonium) a été gracieusement fournie par le Pr. J.E. Walker (MRC, Cambridge, Royaume-Uni). Tous les autres réactifs et enzymes proviennent de Sigma Aldrich hormis le kit de dosage de l’ATP (ATP CLSII, Roche). Dosage d’ATP par bioluminescence La F1-ATPase a été centrifugée (13000g, 2min) puis solubilisée en tampon d’activité (Hepes 10mM, NaCl 150mM, KCl 5mM, MgCl2 2mM). 250ng d’enzyme ont été utilisés pour chaque mesure. L’ATP (1µM final) ainsi que des concentrations croissantes d’ApppI (volume final : 50µL) ont été incubés avec la F1-ATPase pendant 5min à 37°C, puis 25 µL de solution de luciférase (ATP CLSII) ont été ajoutés. La luminescence a été lue sur un luminomètre Berthold Orion et les données ont été traitées avec Excel. 151 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase Test des enzymes couplées La F1-ATPase a été préparée comme décrit précédemment et pour chaque point mesuré 2µg d’enzyme ont été incubés en présence de PhosphoEnolPyruvate (PEP, 250µM), NicotineAmide Dinucléotide (NADH, 250µM), Pyruvate Kinase (PK, 5 unités par point) et Lactate DésHydrogénase (LDH, 1 unité par point), avec ou sans ApppI (100µM) dans un volume final de 200µL en plaques 96 puits à fonds plats. La réaction a été démarrée par l’ajout d’ATP à diverses concentrations et la Densité Optique (DO) mesurée à 340nm (longueur d’onde d’absorption du NADH) pendant deux minutes sur un spectrophotomètre Varioskan Flash (Thermo Corporation). Les données ont été traitées avec Excel. HPLC La F1-ATPase a été préparée comme précédemment et incubée (2µg) en présence d’ATP ou d’ApppI (500µM) pendant 15min à 37°C en milieu RPMI. La solution a ensuite été diluée avec de l’eau distillée, injectée sur colonne échangeuse d’anion et analysée comme décrit précédemment (Article 2, p.128). 3.3) Résultats et discussion L’ajout de quantités croissantes d’ApppI augmente l’activité ATP hydrolase de la F1ATPase bovine purifiée, de façon dose dépendante, avec une activité plus que doublée pour un ratio ApppI : ATP de 100 (Figure 20A). Le dosage par bioluminescence ne permettant pas de mesurer des quantités importantes d’ATP (la limite étant aux environs de 1-10 µM) et donc d’observer l’effet de l’ApppI en présence de fortes concentrations d’ATP, nous avons utilisé la technique des enzymes couplées. Cette méthode permet de mesurer les activités ATPasiques en temps réel et donc de calculer les vitesses d’hydrolyse. L’ajout d’ApppI 152 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase augmente cette vitesse, mais pour des concentrations faibles d’ATP uniquement (Figure 20B), et cette augmentation tend vers un doublement de l’activité. Figure 20. Augmentation de l’activité de la F1-ATPase par l’ApppI. (A) La F1-ATPase (250ng) a été incubée avec des concentrations croissantes d’ApppI et l’activité ATPasique a été déterminée en dosant par bioluminescence l’ATP restant après la réaction (concentration initiale : 1µM). Les résultats sont exprimés en % de l’activité contrôle (sans ApppI) et correspondent aux moyennes de trois puits +/- écart type (représentatif de deux expériences indépendantes). (B) La vitesse d’hydrolyse de l’ATP par la F1-ATPase a été déterminée en présence ou non d’ApppI par la méthode des enzymes couplées. Chaque point correspond à la pente de la droite obtenue par mesure de la décroissance de la DO à 340nm (oxydation du NADH). Encart : Rapport des vitesses d’hydrolyse en présence ou non d’ApppI. Dans la deuxième méthode utilisée, l’augmentation de la vitesse pourrait s’expliquer par une lente conversion de l’ApppI en ADP par la F1-ATPase. En effet, l’ADP ainsi formé serait régénéré par la PK et donc augmenterait « artificiellement » la vitesse d’oxydation du NADH. Ceci ne permettrait néanmoins pas d’expliquer l’amélioration de l’hydrolyse observée par dosage de l’ATP par bioluminescence. De plus, nous avons pu exclure toute hydrolyse de l’ApppI en ADP par la F1-ATPase en vérifiant par HPLC les nucléotides obtenus (Figure 21). La totalité de l’ATP est hydrolysé en ADP (voir les temps de rétention des tracés des panneaux de gauche), alors que la F1-ATPase n’hydrolyse pas l’ApppI puisque son temps de rétention sur colonne échangeuse d’anions n’est pas modifié. 153 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase Figure 21. La F1-ATPase n’hydrolyse pas l’ApppI. L’ATP et l’ApppI (25nmol) ont été incubés (en bas) ou non (en haut) avec 2µg de F1-ATPase bovine pendant 15min à 37°C en RPMI. Le produit de la réaction a ensuite été dilué et chargé sur colonne échangeuse d’anions. La DO (exprimée en mUA : milliUnités d’Absorption) à 260nm a été acquise. Bien qu’indirectes, les méthodes que nous avons utilisées dans les expériences précédentes (Article 3, p.143) ainsi que celles décrites ici montrent clairement que l’ApppI est capable de se lier de façon stable à l’ATP synthase. De plus, les résultats obtenus par les études enzymatiques sont plutôt en faveur d’une liaison de l’ApppI aux sites non-catalytiques de l’enzyme. En effet, étant donné que l’ApppI n’est pas hydrolysé par la F1-ATPase, il devrait inhiber l’activité ATPasique s’il se liait aux sites catalytiques. Enfin, sa capacité à augmenter l’hydrolyse d’ATP est équivalente à celle décrite pour le pyrophosphate, qui lie les sites non-catalytiques (289). En conclusion, l’ApppI nous a permis de démontrer l’implication de l’Ecto-F1-ATPase dans la reconnaissance des phosphoantigènes par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. La stimulation 154 Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase de ces lymphocytes par l’ApppI nécessitant sa conversion en IPP, il n’est pas un antigène au sens strict du terme. Néanmoins, les propriétés uniques de l’ApppI (notamment sa capture par les cellules cibles, sa liaison sur l’ATP synthase, et sa production par des cibles classiques les lymphocytes T Vγ9/Vδ2) indiquent que les dérivés nucléotidiques jouent probablement un rôle très important dans le mécanisme global de présentation et de reconnaissance des phosphoantigènes. 155 156 RESULTATS EXPERIMENTAUX Partie IV Etude du métabolisme nucléotidique à la surface des cellules 157 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 1) Introduction A la surface des cellules, l’ATP et d’autres nucléotides (ADP, UTP et UDP principalement) interviennent dans de nombreux processus cellulaires impliquant notamment les récepteurs purinergiques (P2X et P2Y). Les enzymes participant au métabolisme nucléotidique à la surface des cellules jouent donc un rôle important dans la régulation de ces processus (290). Comme mentionné dans le Chapitre III de l’introduction, l’Ecto-F1-ATPase fait partie de ces enzymes mais ses propriétés enzymatiques sont toujours débattues. L’équipe s’intéresse en particulier à son rôle dans le métabolisme des HDL et la survie des cellules endothéliales. J’ai ainsi été amené à participer à l’étude du métabolisme nucléotidique à la surface des hépatocytes. Il existe à la surface des cellules plusieurs enzymes de conversion des nucléotides et nous avons cherché à savoir si deux d’entres elles, l’Adenylate Kinase (AK, 2ADP Æ ATP + AMP) et la Nucleoside DiPhosphoKinase (NDPK, qui transfère le phosphate terminal d’un nucléotide triphosphate sur un nucléotide diphosphate), étaient capables de moduler les niveaux d’ADP à la surface des cellules. Nos résultats confirment que l’Ecto-F1-ATPase est dépourvue d’une activité de type ATP synthase. L’AK inhibe constitutivement la voie EctoF1-ATPase/P2Y13 en consommant l’ADP et elle est largement responsable de la conversion de l’ADP en ATP à la surface des cellules. Une activité de type NDPK peut être observée mais ne semble pas constitutivement active et ne joue donc probablement pas un rôle majeur dans le métabolisme nucléotidique. De plus, l’Adenosine Nucleotide Translocase (ANT), transporteur d’ADP/ATP associé à l’ATP synthase dans la mitochondrie, est également exprimé à la surface des cellules et intervient dans l’augmentation de la quantité d’ATP extracellulaire en réponse à l’ADP. 158 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 2) Article 4 159 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 160 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 161 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 162 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 163 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 164 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 165 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 166 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 167 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 3) Rôle de l’ANT dans la conversion ADP Æ ATP à la surface des cellules 3.1) Introduction Les résultats présentés ci-dessus indiquent que l’inhibition de l’AK, bien que réduisant fortement la production d’ATP suite à l’ajout d’ADP, n’abolit pas totalement cette conversion. Nos données indiquant que ni l’Ecto-F1-ATPase ni la NDPK ne peuvent expliquer cette activité résiduelle, nous avons donc étudié une autre protéine, l’Adenosine Nucleotide Translocase (ANT, aussi appelé AAC pour ADP, ATP Carrier). Nous avons principalement réalisé ces études avec la lignée Daudi. D’une part afin de vérifier si le métabolisme nucléotidique à la surface de ces cellules est similaire à celui étudié précédemment (Article 4), mais aussi pour envisager les conséquences potentielles pour la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. L’ANT est un transporteur mitochondrial situé dans la membrane interne et ayant une place importante dans la phosphorylation oxydative et les mécanismes de l’apoptose (291). Son rôle principal est d’échanger l’ADP avec l’ATP au sein de la mitochondrie, afin d’exporter l’ATP produit par l’ATP synthase et d’en assurer la synthèse permanente en important l’ADP. Cette fonction est facilitée par son interaction avec l’ATP synthase au sein de « l’ATP synthasome ». Ceci suggère donc que l’ANT pourrait également être exprimée à la surface et participer à la production d’ATP observée lors de l’ajout d’ADP, mais cette possibilité n’a à notre connaissance jamais été explorée. Nos résultats indiquent que, comme pour les hépatocytes, une grande partie de la conversion de l’ADP en ATP à la surface des cellules Daudi est due à l’AK. De plus l’ANT est détectable à la surface des cellules et son inhibition diminue de façon très significative la quantité d’ATP extracellulaire mesurée après ajout d’ADP. 168 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 3.2) Matériel et méthodes Culture cellulaire La lignée Daudi provient de l’ATCC et a été cultivée en RPMI 1640 Glutamax contenant 10% de SVF décomplémenté, du pyruvate de sodium et de la pénicilline/streptomycine. Tous les réactifs de culture proviennent d’Invitrogen. Pour les mesures de conversion de l’ADP, les cellules ont été pré-incubées (250000 cellules par puits, 150µL) pendant une heure à 37°C, 5% CO2 afin d’équilibrer les concentrations de nucléotides dans le milieu (voir Article 4, p.161) en milieu DMEM sans rouge phénol ni SVF. Anticorps et réactifs L’anticorps anti-ANT (N-19, anticorps polyclonal de chèvre) provient de Santa Cruz. L’anticorps secondaire âne anti-IgG de chèvre-FITC provient de Beckman Coulter. Le contrôle négatif est un anticorps polyclonal de chèvre anti-Ig de souris (Clinisciences). Le marquage et l’analyse par cytométrie de flux ont été effectués comme décrit précédemment (voir par exemple Résultats I, section 3.2, p.112). Le kit ATP CLSII (Roche) a été utilisé selon les instructions du fournisseur. L’Ap5A (Diadénosine pentaphosphate, inhibiteur de l’AK) et l’acide bongkrékique (AB, inhibiteur de l’ANT) proviennent de Sigma Aldrich. Mesure de la conversion ADP Æ ATP 1h après le passage des cellules en milieu DMEM sans rouge phénol les cellules ont été pré-incubées ou non pendant 10min avec les inhibiteurs séparément ou ensemble (Ap5A 10µM, AB 50µM). L’ADP (10µM) a été ajouté et les cellules ont été incubées 5min à 37°C. 50µL de surnageants ont été prélevés et 25µL de solution de luciférase ajoutés. La bioluminescence a été acquise et analysée comme décrit précédemment (voir Résultats III, section 3.2, p.151). 169 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire 3.3) Résultats et discussion L’analyse par cytométrie de flux montre que l’ANT est exprimée à la surface des cellules Daudi, bien que le marquage soit relativement faible (Figure 22A). L’ANT interagissant avec l’ATP synthase dans la mitochondrie, son expression à la surface avec l’Ecto-F1-ATPase n’est donc pas inattendue. Figure 22. Expression de l’ANT en surface des cellules Daudi. (A) Les cellules ont été marquées par l’anticorps contrôle (histogramme grisé) ou l’anti-ANT (histogramme en ligne pleine) puis par l’anticorps secondaire et analysées par cytométrie de flux. (B) Les cellules ont été incubées en présence des inhibiteurs (Ap5A, 10µM ; AB, Acide Bongkrékique, 50µM) pendant 10min puis l’ADP (10µM, 150pmol) a été ajouté. Après 5min, les surnageants ont été prélevés et l’ATP dosé par bioluminescence. Les données représentent les moyennes de trois incubations +/- écart type et sont représentatives de trois expériences indépendantes. Des résultats équivalents ont été obtenus avec la lignée K562 et des hépatocytes primaires humains. Nous avons également étudié la fonctionnalité de l’ANT exprimée à la surface (Figure 22B). Comme pour les hépatocytes, l’ajout d’ADP entraîne une augmentation rapide de la présence d’ATP à la surface des cellules, qui de façon reproductible correspond à environ 10% de l’ADP fourni. Environ 50% de cette production est inhibée par l’Ap5A, indiquant que l’AK joue un rôle majoritaire. Elle est également réduite par l’ajout d’acide bongkrékique (AB) et 170 Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire cette inhibition est plus marquée lorsque l’AK est inhibée, suggérant que l’inactivation de l’ANT est partiellement compensée par l’AK. Ces résultats sont en faveur d’une expression de l’ANT à la surface des cellules et de son implication dans la conversion de l’ADP en ATP. Ils pourraient être confirmés par des études biochimiques, par exemple par biotinylation et précipitation des protéines de surface. L’inhibition par l’Ap5A et l’AB n’est toutefois pas totale. Les NDPK n’étant à priori pas actives constitutivement (Article 4, p.159), cette activité résiduelle provient probablement d’autres enzymes ou transporteurs. En conclusion, nos résultats sur l’étude du métabolisme nucléotidique à la surface de divers types cellulaires confirment que l’Ecto-F1-ATPase n’est pas impliquée dans la production d’ATP observée après incubation des cellules avec de l’ADP et qu’elle possède donc uniquement une activité de type hydrolase. Cette conversion est majoritairement due à une activité de type AK, et de façon moindre à l’ANT. Cette étude pourrait ouvrir des perspectives intéressantes pour l’étude de la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Nous n’avons pas à l’heure actuelle de données expérimentales en faveur d’une implication de l’activité enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase dans l’activation de ces lymphocytes par les phosphoantigènes. En recvanche, les données relatives à l’ANT fournissent des éléments potentiellement intéressants pour l’étude des mécanismes de présentation de ces antigènes. L’ApppI a originellement été décrit par les auteurs qui l’ont identifié comme un inhibiteur de l’ANT puisqu’il diminue le transport d’ATP radiomarqué dans des mitochondries isolées (252). On pourrait également émettre l’hypothèse que l’ApppI est transporté par l’ANT et entre donc en compétition avec l’ATP. L’ANT pourrait ainsi être impliquée dans l’internalisation de ce phosphoantigène nucléotidique. 171 172 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES 173 Discussion générale et Perspectives Nos résultats sur l’interaction entre l’Ecto-F1-ATPase et le CMH-I ainsi que sur l’ApppI fournissent de nouveaux éléments importants permettant une meilleure compréhension de la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Ils sont également les premiers à proposer une molécule de présentation des phosphoantigènes. Les propriétés uniques des dérivés nucléotidiques de ces antigènes en font des molécules potentiellement intéressantes pour le développement de protocoles d’immunothérapie anti-tumorale basés sur l’utilisation des ces lymphocytes. Nos travaux ouvrent également de nombreuses perspectives de travail qui permettront de caractériser de manière encore plus précise les molécules et mécanismes moléculaires impliqués dans cette reconnaissance. Ce chapitre sera destiné à la discussion générale de nos résultats ainsi que les futurs travaux qui peuvent être envisagés. 1) Interaction entre CMH-I et Ecto-F1-ATPase 1.1) HLA-B et autres partenaires potentiels L’étude des isotypes impliqués dans l’interaction avec l’Ecto-F1-ATPase a été basée sur les résultats des expériences de co-immunoprécipitation initialement obtenus (Article 1, p.106) avec la lignée Raji. Ceci a restreint nos recherches aux isotypes de CMH-Ia ainsi qu’à HLA-E. HLA-B est le seul isotype à masquer de façon significative les épitopes de l’Ecto-F1ATPase et à réduire fortement l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Il semble donc être un partenaire préférentiel de l’Ecto-F1-ATPase. Le fait que nous n’ayons pas pu détecter l’expression de l’Ecto-F1-ATPase à la surface de cette lignée après diminution de l’expression de HLA-B à l’aide d’ARNi suggère que l’Ecto-F1-ATPase pourrait interagir avec d’autres molécules de CMH-I ou apparentées (MICA/B ou les protéines de la famille RAET). Bien que les données obtenues par traitement à l’acide suggèrent que les candidats potentiels sont associés à la β2m, l’implication de ces molécules non associées à la β2m mérite d’être 174 Discussion générale et Perspectives explorée. Ceci pourra être effectué par transfection de ces molécules dans la lignée K562 que nous avons utilisée pour l’étude des isotypes de CMH-I et qui s’avère être un bon modèle. HLA-E est également un candidat intéressant. Comme mentionné précédemment, il est reconnu par CD94/NKG2A, un iNKR jouant un rôle important dans la régulation de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. N’ayant pu obtenir d’expression de HLA-E dans nos transfectants, il sera nécessaire de poursuivre les expériences avec cet isotype, soit en améliorant les taux d’expression par l’utilisation d’autres vecteurs, soit par utilisation d’ARNi. HLA-E présentant des peptides issus des séquences d’adressage d’autres molécules de CMH-I, il est possible que celle de l’allèle HLA-B utilisé ne soit pas compatible. Il faudra donc envisager de co-transfecter HLA-E avec les autres isotypes clonés. 1.2) Implications fonctionnelles et physiopathologiques L’interaction entre le CMH-I et l’Ecto-F1-ATPase renforce le statut de cette dernière comme « molécule immunologique » et joue probablement un rôle important dans le contrôle de l’auto-réactivité des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Les conséquences fonctionnelles de l’interaction entre l’Ecto-F1-ATPase et le CMH-I (inhibition de la stimulation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2) méritent donc des études approfondies. Comme mentionné précédemment, cette inhibition pourraient être due à l’activation des iNKR (ILT2 étant un candidat potentiel), et dans ce cas leur implication pourra être confirmée par l’utilisation d’anticorps bloquants. Alternativement, elle pourrait également résulter de l’inhibition directe de la liaison du TCR à l’Ecto-F1-ATPase par encombrement stérique. Nous disposons d’ADNc codant pour des chaînes Vγ9 et Vδ2 permettant la production de TCR soluble qui pourra être utilisé pour vérifier cette hypothèse. 175 Discussion générale et Perspectives Le masquage d’épitopes de l’Ecto-F1-ATPase par le CMH-I suggère que l’interaction entre ces complexes implique les chaînes α et/ou β de l’ATP synthase, auquel cas 3 molécules de CMH-I peuvent potentiellement interagir avec un complexe d’Ecto-F1-ATPase. Ceci pourrait expliquer que cette dernière soit détectable malgré une expression modérée du CMH-I sur des lignées telles que RPMI-8226, HeLa ou HepG2 par exemple (Article 1, p.103). Il est donc envisageable que les deux mécanismes proposés précédemment puissent être impliqués en fonction de la densité de CMH-I présente à la surface des cellules. L’interaction préférentielle entre HLA-B et l’Ecto-F1-ATPase pourrait être pertinente dans la pathogenèse de diverses maladies auto-immunes et inflammatoires telles que les arthrites réactives et ankylosantes, ainsi que la maladie de Crohn. Plusieurs éléments sont à prendre en compte dans cette hypothèse : i) les personnes portant des allèles de type HLA-B27 montrent une forte prédisposition pour ces pathologies (292); ii) HLA-B27 a été caractérisé pour sa propension à former spontanément des dimères (293) ; iii) une implication des lymphocytes T γδ dans le développement de ces maladies a été suggérée (294, 295). Il est donc envisageable qu’à cause de sa tendance à former des dimères, HLA-B27 ne soit pas capable d’interagir avec l’Ecto-F1-ATPase. Ceci pourrait faciliter l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 au cours du développement de ces pathologies. Il est également possible que d’autres allèles HLA-B ne soient pas capables d’interagir avec l’Ecto-F1-ATPase. HLA-B51 par exemple est lié à une prédisposition pour la maladie de Behçet, dans laquelle une implication des lymphocytes T γδ a été suggérée (296). Ces hypothèses pourraient aisément être explorées en vérifiant si l’Ecto-F1-ATPase est détectable à la surface de cellules provenant de personnes porteuses de ce type d’allèles. 176 Discussion générale et Perspectives 1.3) Rôle du CMH-I dans l’expression de l’Ecto-F1-ATPase ? Par analogie avec Skint1, qui est probablement impliquée dans l’expression du ligand du TCR Vγ5/Vδ1 chez la souris (55), il est possible que le CMH-I soit directement impliqué dans l’expression l’Ecto-F1-ATPase à la surface des cellules. Toutefois la lignée Daudi, qui présente une forte expression de l’Ecto-F1-ATPase, n’exprime aucune molécule de CMH-Ia ni HLA-E de par sa déficience en β2m. Elle ne semble également pas présenter d’expression significative de MICA/B, ULBP-1, -2 ou -3 ((297) et données non montrées). Il est donc peu probable que ces protéines soient impliquées. En revanche, il est très intéressant de noter que la chaîne invariante Ii, classiquement impliquée dans l’expression du CMH-II (fortement exprimé sur la lignée Daudi), joue également un rôle dans l’expression de CD1d et l’activation des cellules MAIT par MR1 (Introduction, Chapitre I, Figure 6, p.36 et section 3.2 p.38, respectivement). Bien que l’EctoF1-ATPase n’ait pas d’homologie avec ces molécules, il est possible que par analogie avec les autres systèmes de présentation antigénique, la chaîne Ii participe à son expression à la surface des cellules. L’utilisation d’ARNi dirigés contre la chaîne Ii devrait permettre de facilement vérifier cette hypothèse. Comme discuté précédemment, la lignée 721.221 ne semble pas exprimer l’Ecto-F1ATPase, ou à des niveaux trop faibles pour être détectés malgré une expression extrêmement faible du CMH-I (Article 1, p.103). 721.221 présente une forte expression d’HLA-F qui reste très majoritairement intracellulaire et dont la fonction exacte est toujours inconnue (244, 298). Si HLA-F est capable d’interagir avec l’Ecto-F1-ATPase, il pourrait retenir cette dernière dans un compartiment intracellulaire par lequel elle transite avant son expression à la membrane plasmique. Cette hypothèse pourrait ainsi expliquer que l’Ecto-F1-ATPase ne soit pas détectée à la surface de 721.221. L’inhibition de l’expression d’HLA-F dans la lignée 721.221 à l’aide 177 Discussion générale et Perspectives d’ARNi, ou le clonage et la transfection de cet isotype de CMH-I dans la lignée K562 par exemple, devrait permettre de vérifier s’il induit une diminution de l’expression de l’Ecto-F1ATPase. 2) Mécanisme de présentation des phosphoantigènes 2.1) Voie(s) de transit de l’Ecto-F1-ATPase de la mitochondrie à la surface L’identification des voies impliquées dans l’export de l’ATP synthase hors de la mitochondrie est un point important, pertinent non seulement pour le mécanisme de présentation des phosphoantigènes, mais aussi pour ses nombreux rôles décrits plus haut. Comme discuté précédemment (Introduction III, section 2.2, p.84) il est probable que l’ATP synthase entière soit exportée à partir de la mitochondrie grâce à un transport vésiculaire, plutôt que ses sous-unités soient individuellement adressées à la membrane plasmique. L’ATP synthase pourrait transiter directement à la surface, ou inclure des étapes au niveau d’un ou plusieurs organelles intracellulaires. Un travail récent ayant décrit que la chaîne α de l’ATP peut être glycosylée (211), suggérant un possible passage par le RE et l’appareil de Golgi. L’interaction de l’ATP synthase avec Ppt1 suggère également que les peroxysomes pourraient être impliqués. Il n’est pas exclu qu’à l’image de CD1d (Figure 6, p.36) plusieurs voies soient utilisées et permettent la présentation d’antigènes endogènes ou exogènes. La transfection d’ADNc de chaînes de l’ATP synthase fusionnés avec des séquences codant pour des protéines fluorescentes (GFP et RFP) devrait permettre de déterminer, par des études de co-localisation en microscopie confocale, le(s) compartiment(s) intracellulaire(s) par le(s)quel(s) l’ATP synthase transite pour atteindre la surface cellulaire. 178 Discussion générale et Perspectives 2.2) Protéines impliquées dans le routage/chargement de l’Ecto-F1-ATPase ? De par leur interaction avec l’Ecto-F1-ATPase, les molécules du CMH-I sont des candidates séduisantes dans l’étude des protéines impliquées dans l’expression ectopique de ce complexe enzymatique. Alternativement, des protéines non-apparentées au CMH-I pourraient aussi bien être impliquées dans les mécanismes de routage de l’Ecto-F1-ATPase. 721.221 pourrait être déficiente pour l’expression d’un ou plusieurs gène(s) impliqué(s) dans ces mécanismes. La comparaison de son transcriptome avec celui de sa lignée parentale 721, qui exprime l’Ecto-F1-ATPase à sa surface (données non montrées), pourrait permettre d’identifier des protéines potentiellement impliquées dans cette expression. Il est également important de déterminer si des molécules particulières sont impliquées dans le mécanisme de « chargement » des phosphoantigènes sur l’Ecto-F1-ATPase. Des travaux de thèse récents ont décrit une implication de MRP5 (Multidrug Resistance Protein 5, aussi appelée ABCC5 pour ATP-Binding Cassette sub-family C member 5) dans la présentation des phosphoantigènes par les cellules tumorales (299). De plus, MRP5 est capable de transporter des nucléotides et contrairement aux autres membres de la famille MRP, une proportion importante de cette protéine peut rester localisée dans des compartiments intracellulaires, notamment dans les cellules non-polarisées (300). Il est donc possible que MRP5 puisse participer au chargement des nucléotides sur l’Ecto-F1-ATPase dans les compartiments intracellulaires où elle transite. Il faudra donc vérifier si MRP5 est localisée dans ces compartiments et si l’inhibition de son expression diminue la capacité des cellules à présenter des phosphoantigènes produits de façon endogène, par exemple après traitement par les aminobisphosphonates. 179 Discussion générale et Perspectives 3) Métabolisme des phosphoantigènes 3.1) Mécanisme d’internalisation de l’ApppI Nos résultats indiquent que l’ApppI possède la propriété unique, par rapport à l’IPP, d’être internalisé et présenté (« pulsé ») de manière très efficace aux lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par de nombreux types cellulaires, dont les cellules dendritiques. Nous n’avons aucune donnée sur les modalités de capture de ce composé, hormis le fait qu’elles impliquent probablement un processus actif (Article 2, p.133). Par analogie avec la présentation de peptides antigéniques exogènes, ce mécanisme pourrait faire intervenir une étape d’endocytose suivie d’un processus complexe de routage intracellulaire. L’utilisation de multiples inhibiteurs de l’endocytose et du transport vésiculaire (Brefeldine A, Monensine, Oxyde de phenylarsine, colchicine pour en citer quelques uns) pour les expériences de « pulse » par l’ApppI peut être envisagée pour vérifier si de tels mécanismes sont impliqués. Il faudra néanmoins vérifier que ces inhibiteurs n’ont pas d’effet sur l’expression de l’Ecto-F1-ATPase à la surface des cellules. Alternativement, l’ApppI pourrait être internalisé via un ou des transporteur(s) de nucléotides et un candidat particulier attire notre attention. L’étude du métabolisme nucléotidique extracellulaire nous a permis de mettre en évidence une expression de l’Adenosine Nucleotide Translocase (ANT, qui réalise l’échange entre ADP et ATP dans la mitochondrie) à la surface des cellules. Il pourrait participer à l’augmentation du niveau d’ATP extracellulaire après ajout d’ADP dans le milieu de culture (Résultats IV, section 3.3, p.170). L’ApppI a originellement été décrit par les auteurs qui l’ont identifié comme un inhibiteur de l’ANT puisqu’il diminue le transport d’ATP radiomarqué (252). Toutefois, leur étude a décrit une inhibition de ce transport d’environ 50% pour un ratio ApppI/ATP approchant 1. Ce résultat pourrait donc également s’expliquer par un transport de l’ApppI par 180 Discussion générale et Perspectives l’ANT, qui entrerait donc en compétition avec celui de l’ATP. L’ANT est en effet capable de transporter certains analogues d’ATP (291). Son implication dans l’internalisation de l’ApppI par les cellules pourra être vérifiée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques tels que l’acide bongkrékique. Le devenir des phosphoantigènes nucléotidiques internalisés est un élément intéressant à explorer. Il pourrait notamment permettre d’identifier le(s) compartiment(s) intracellulaire(s) où la rencontre entre les phosphoantigènes et l’Ecto-F1-ATPase se déroule, et ainsi donner des indices sur le mécanisme d’expression de l’ATP synthase à la surface des cellules, qui reste complètement inconnu à ce jour. La synthèse d’analogues fluorescents de l’ApppI est envisageable et pourrait être réalisée à partir de dérivés fluorescents de l’ATP tels que l’e-azaATP ou le FTP dont les structures sont très proches de celle de l’ATP (http://mc11.mcri.ac.uk/atpanaloguestrucs.html). Il faudra toutefois vérifier que les dérivés fluorescents de l’ApppI synthétisés à partir de ces composés conservent les mêmes propriétés (hydrolyse par la NPP, activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, liaison sur l’ATP synthase et augmentation de son activité hydrolase). L’identification des compartiments intracellulaires pourra être réalisée par des expériences de co-localisation en microscopie confocale à l’aide de marqueurs spécifiques. Par exemple, des anticorps anti-EEA1 (Early Endosomal Antigen 1) et anti-M6PR (Mannose-6-Phosphate Receptor) pour les endosomes précoces et tardifs respectivement, anti-LAMP-1 (Lysosomal Associated Membrane Protein-1) pour les lysosomes, anti-calréticuline pour le réticulum endoplasmique (RE), et enfin le mitotracker, une molécule fluorescente spécifique des mitochondries. Nous disposons également d’un variant de la lignée K562 (nommé K562 PVD) qui pourrait s’avérer utile pour l’identification de protéines impliquées dans l’internalisation de 181 Discussion générale et Perspectives l’ApppI. En effet, bien que le traitement de cette lignée par des aminobisphosphonates entraine une activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, elle n’acquiert aucun potentiel stimulant après avoir été « pulsée » par de l’ApppI (données non montrées). Puisque ce variant exprime l’Ecto-F1-ATPase et qu’il est capable de présenter des phosphoantigènes produits de façon endogène, ceci suggère fortement qu’il est déficient pour l’internalisation de l’ApppI, ou son routage intracellulaire. La comparaison des transcriptomes de K562 et K562 PVD pourrait permettre d’identifier la ou les protéine(s) impliquée(s). Ce variant semble également ne pas exprimer MRP5 à sa surface (données non montrées). Bien que les protéines de la famille MRP soient généralement impliquées dans l’efflux de molécules, il semble que certaines d’entre elles puissent également participer à l’influx de leurs substrats (301). Ceci pourrait donc être le cas de MRP5, et son rôle potentiel dans l’internalisation de l’ApppI devra être vérifié dans des cellules qui l’expriment (Daudi ou RPMI-8226 par exemple). L’utilisation d’ARNi en combinaison avec des analogues fluorescents de l’ApppI est envisageable pour démontrer le rôle de MRP5 dans l’internalisation des phosphoantigènes nuléotidiques. Alternativement, des anticorps antiMRP5 pourraient être testés pour bloquer son activité. Comme mentionné précédemment, l’apoA-I augmente la stimulation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par les cellules tumorales et semble augmenter l’interaction entre le TCR et l’EctoF1-ATPase (144). Par analogie avec le rôle de l’apoE dans le transport et l’internalisation des antigènes activant les lymphocytes NKT (25) on pourrait émettre l’hypothèse que l’apoA-I joue un rôle similaire dans le cas des phosphoantigènes. Nous avons toutefois observé que le « pulse » de phosphoantigènes nucléotidiques est nettement plus efficace en l’absence de sérum. Un rôle direct de l’apoA-I dans l’internalisation des phosphoantigènes est donc peu 182 Discussion générale et Perspectives probable. Son implication dans le mécanisme de présentation des phosphoantigènes reste donc à clarifier. 3.2) Nucleotide pyrophosphatase Nos résultats montrent qu’une activité de type Nucleotide PyroPhosphatase (NPP) est absolument requise pour que l’ApppI soit capable de stimuler les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. L’ApppI est très peu actif en l’absence de NPP exogène ou de cellules tumorales, et cette activité « résiduelle » est largement diminuée en l’absence de sérum (données non montrées). Ceci suggère que cette activité ne provient pas des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, mais des cellules cibles. 7 NPP (NPP1 à NPP7) ayant des différences de spécificité de substrat ont été identifiées jusqu’à présent (302). NPP6 et NPP7 hydrolysant des esters de phosphorylcholine, il est peu probable qu’elles soient impliquées. Les substrats de NPP4 et NPP5 ne sont pas connus. NPP1 à NPP4, mais pas NPP5, sont exprimées par un large spectre de tissus différents (276). Il faudra donc vérifier l’expression de ces enzymes dans les cellules qui internalisent et présentent l’ApppI de manière efficace, comme les lignées Daudi, K562 ou RPMI-8226. Il n’est pas exclu que plusieurs d’entre elles soient impliquées. La participation d’une NPP cellulaire dans le mécanisme de présentation des phosphoantigènes nucléotidiques pourra par la suite être confirmée par l’utilisation d’ARNi. Il faut noter que contrairement à une réponse directe, la stimulation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par des cellules tumorales prétraitées par l’ApppI n’est absolument pas modifiée par l’ajout d’apyrase (Article 2, p.133). Ceci suggère qu’une fois la conversion ApppI Æ IPP effectuée, nécessaire pour l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, l’IPP est protégé des phosphatases classiques. Cette conversion se déroule donc probablement de manière très localisée et contrôlée. On pourrait même émettre l’hypothèse qu’elle est effectuée par l’Ecto- 183 Discussion générale et Perspectives F1-ATPase elle-même, ou le TCR, voire la combinaison des deux. Néanmoins, nous n’avons pas pu observer de production d’IPP à partir d’ApppI in vitro par ces molécules, seules ou en combinaison (Résultats III, section 3.3, p.154 et données non montrées). De plus, nous n’avons pas observé de diminution significative de la quantité d’ApppI détectée par HPLC après son incubation avec des cellules tumorales et/ou des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Toutefois, nos résultats sur la présentation de l’ApppI par des billes recouvertes d’ATP synthase (Article 3, p.148) suggèrent qu’une concentration de l’ordre du nM, très loin d’être détectable par cette méthode, est suffisante pour activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 dans ces conditions. L’ApppI radiomarqué, qui permettrait l’utilisation de méthodes de détection beaucoup plus sensibles que la mesure de l’absorbance à 260nm, devrait permettre de vérifier cette conversion par les cellules. Enfin, il n’est pas exclu que dans le cas du « pulse », l’ApppI ne soit pas converti en IPP, mais qu’il puisse être modifié et lié de façon stable (voire covalente) à l’Ecto-F1-ATPase avant son expression à la surface des cellules. Ceci pourrait alors expliquer que les enzymes (NPP et apyrase) ainsi que le PPADS (inhibiteur des NPP) n’aient pas d’effet sur la stimulation par les cellules « pulsées », ou qui activent spontanément les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (Article 2, p.133 et données non montrées). Un moyen de vérifier ou infimer cette hypothèse sera d’utiliser de l’ApppI radiomarqué et de vérifier par immunoprécipitation, western blot et autoradiographie si des chaînes de l’ATP synthase sont ainsi radiomarquées. 3.3) Autres phosphoantigènes et dérivés nucléotidiques Il sera nécessaire de vérifier si nos résultats s’appliquent à d’autres phosphoantigènes, par exemple des dérivés de l’IPP synthétisés à partir de nucléotides différents, ou des dérivés nucléotidiques d’autres phosphoantigènes. Les antigènes de type NpppI devraient possèder les 184 Discussion générale et Perspectives mêmes propriétés. Ceci n’invaliderait d’ailleurs pas l’implication de l’Ecto-F1-ATPase dans le mécanisme de leur présentation, puisque l’ATP synthase est capable d’hydrolyser (donc de lier) d’autres nucléotides que l’ATP, bien que de manière moins efficace (303). De plus, de nombreux analogues de nucléotides capables de lier les sites nucléotidiques sont souvent utilisés dans les études de la structure tridimensionnelle de l’ATP synthase. En ce qui concerne les autres phosphoantigènes, un candidat évident est l’HDMAPP (ou HMBPP) puisqu’il semble être un antigène majeur impliqué dans la reconnaissance de nombreux pathogènes intracellulaires et qu’il a une activité biologique bien supérieure (environ 1000 fois) à celle de l’IPP. Ce phosphoantigène « classique » est un des rares à pouvoir être « pulsé » de manière relativement efficace, mais ceci est très probablement dû à son très fort potentiel activateur. Par exemple, une publication récente a montré que le « pulse » de cellules par de l’HDMAPP permet la liaison d’un tétramère de TCR Vγ9/Vδ2 fluorescent à la surface de ces cellules (159). Néanmoins, une concentration de l’ordre de la centaine de nM a été utilisée dans cette étude, très largement supérieure à la concentration active de l’HDMAPP (EC50 de l’ordre de 0.1nM). L’HDMAPP pourrait être capable, contrairement à l’IPP, de lier l’Ecto-F1-ATPase de façon relativement stable. Nous avons récemment obtenu cet antigène et il sera donc possible de déterminer s’il peut lier l’ATP synthase immobilisée sur des billes afin d’activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par les méthodes que nous avons utilisées précédemment. Il faudra également vérifier si l’HDMAPP est capable de moduler l’activité ATPase de l’enzyme, comme c’est le cas pour l’ApppI. Nous avons observé que la stimulation directe des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par l’IPP peut être partiellement augmentée par l’ajout de NPP, et partiellement inhibée par l’ajout de PPADS (données non montrées). Ceci suggère donc que l’IPP peut être partiellement converti 185 Discussion générale et Perspectives en dérivé nucléotidique à l’extérieur des cellules. Ceci pourrait donc être également le cas de l’HDMAPP qui serait ensuite internalisé ou se lierait à l’Ecto-F1-ATPase. L’HDMAPP étant bien plus actif que l’IPP, leurs dérivés nucléotidiques respectifs présentent probablement les mêmes différences d’activité biologique. La conversion de l’IPP en ApppI a été attribuée à une activité de type aminoacyl-tRNAsynthase (252). Des travaux récents indiquent que la lysyl-tRNA-synthase peut être sécrétée et se lier à la surface des cellules (304). De plus, EMAP II (Endothelial Monocyte-Activating Polypeptide II), un peptide issu de p43, une protéine faisant partie des complexes aminoacyltRNA-synthase, a été décrit comme étant capable d’interagir avec l’Ecto-F1-ATPase (305). Ceci suggère donc un lien potentiel entre ces deux complexes. L’implication de la lysyltRNA-synthase dans le métabolisme extracellulaire des phosphoantigènes pourra être explorée par l’utilisation d’inhibiteurs, ou d’ARNi si la survie cellulaire n’est pas compromise. 4) Interactions entre phosphoantigènes, Ecto-F1-ATPase et TCR Vγ9/Vδ2 4.1) Liaison de l’ApppI sur l’Ecto-F1-ATPase Nos données sur la modulation de l’activité hydrolase de la F1-ATPase par l’ApppI (Résultats III, section 3.3, p.153) suggèrent que ce dernier se lie aux sites non-catalytiques de l’ATP synthase. Il serait utile de vérifier si le pyrophosphate, qui lie ces sites noncatalytiques, est capable d’inhiber la liaison stable de l’ApppI sur l’ATP synthase immobilisée sur des billes dans les tests d’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Nous n’avons pas de preuve expérimentale directe de la liaison de l’ApppI sur l’Ecto-F1ATPase. L’utilisation de la Résonance Plasmonique de Surface n’est pas envisageable étant donné le poids moléculaire très faible de l’ApppI (575Da) comparé à celui de l’ATP synthase ou même de la F1-ATPase (environ 580kDa et 370kDa, respectivement). Deux autres 186 Discussion générale et Perspectives méthodes pourraient être utilisées. Des études de liaison en utilisant de l’ApppI radioactif et de l’ATP synthase/F1-ATPase purifiée sont envisageables, et permettraient par ailleurs de mesurer les constantes d’affinité de la liaison et de déterminer le nombre de sites impliqués (3 sites en théorie). La liaison des phosphoantigènes nucléotidiques sur l’ATP synthase pourrait également être visualisée par co-cristallographie, ce qui permettrait d’identifier les sites d’interaction. 4.2) Reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase par le TCR Vγ9/Vδ2 L’équipe a précédemment montré une liaison d’un TCR Vγ9/Vδ2 (issu du clone G115) sur de l’ATP synthase purifiée avec un Kd d’environ 800nM, soit une interaction de même ordre que celle décrite entre un TCR αβ et le complexe CMH-I/peptide (144). Cette interaction pourrait être caractérisée de manière plus précise, par exemple par cocristallographie des deux complexes. Si le TCR reconnaît les phosphoantigènes liés sur les sites nucléotidiques de l’Ecto-F1-ATPase, il devrait il devrait interagir avec l’enzyme à l’interface des chaînes α et β, où se situent ces sites. L’angle très prononcé formé par les domaines V et C du TCR Vγ9/Vδ2 (Figure 7, p.43) est compatible avec cette hypothèse. La reconnaissance de ligands par les TCR (quels qu’ils soient) se fait principalement via les boucles CDR. Si la reconnaissance des phosphoantigènes fait intervenir le CDR3 de la chaîne γ (152, 153), l’interaction du TCR Vγ9/Vδ2 avec l’Ecto-F1-ATPase n’est pas encore précisément caractérisée. Chen et al. ont récemment montré que la reconnaissance de cellules tumorales par 4 TCR Vγ9/Vδ2 dépend du CDR3δ (306). Ils ont de plus pu identifier des peptides reconnus par ces TCR. La comparaison des séquences de ces peptides avec celles des chaînes α et β de l’ATP synthase ne montre pas d’homologie particulière (données non 187 Discussion générale et Perspectives montrées) mais il est probable qu’il s’agisse d’épitopes conformationnels. Il serait utile de vérifier si ces peptides sont capables d’inhiber la liaison du TCR G115 sur l’ATP synthase. Il faut noter que les CDR3 utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir de clones de lymphocytes T Vγ9/Vδ2 provenant de patients atteints de carcinomes ovariens, ou infectés par le virus de l’hépatite B. Ils sont par ailleurs très différents du CDR3 de la chaîne δ du TCR G115. Les auteurs n’ont pas précisé si ces clones répondent aux phosphoantigènes. Il est donc possible qu’ils reconnaissent des antigènes différents de G115 qui est un clone Vγ9/Vδ2 « classique » reconnaissant la lignée Daudi et les phosphoantigènes, et qui lie l’ATP synthase in vitro. Certains clones Vγ9/Vγ2, bien que peu nombreux, ne répondent pas à ces antigènes (152). L’étude de la liaison de peptides dérivés des 6 boucles CDR du TCR G115 (ou d’autres TCR issus de clones activés par les phosphoantigènes) sur l’ATP synthase devrait permettre de caractériser plus précisément les séquences impliquées dans cette interaction. Nous avons observé que des lignées polyclonales de lymphocytes T Vγ9/Vδ2 obtenues après stimulation par de l’IPP ou de l’ApppI ne sont capables de répondre à des billes recouvertes d’ATP synthase bovine qu’en présence de phosphoantigènes. En revanche, des lignées obtenues par purification des lymphocytes T γδ et stimulation non spécifique (par exemple avec de la PhytoHémAgglutinine ou PHA, une lectine activant tous les lymphocytes T) sont capables de répondre à l’ATP synthase bovine seule. Ceci suggère fortement qu’en fonction de l’antigène utilisé pour l’établissement des lignées polyclonales, des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 exprimant des TCR portant des séquences particulières sont sélectionnés. L’isolement des différentes sous-populations et le séquençage de leurs TCR pourraient s’avérer utiles pour identifier les déterminants impliqués dans la reconnaissance de l’Ecto-F1ATPase, seule ou en combinaison avec des phosphoantigènes. Ces données pourraient permettre d’expliquer les différences de réactivité observées. 188 Discussion générale et Perspectives 5) Spécificité d’espèce de la présentation des phosphoantigènes Un point important de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par des cellules tumorales, infectées ou traitées aux aminobisphosphonates reste totalement obscur. Il est largement admis que des cellules non-humaines, traitées par les aminobisphosphonates par exemple, sont incapables d’activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (158). Plusieurs hypothèses permettraient d’expliquer cette restriction. Nous prendrons l’exemple des cellules murines pour lesquelles le plus de données et de modèles sont disponibles. - Les cellules de souris n’expriment pas l’Ecto-F1-ATPase. Cette hypothèse peut être écartée puisque nous avons observé son expression sur la lignée Rma-S, un lymphome T murin (Article 1, p.103). - L’Ecto-F1-ATPase ne lie pas les phosphoantigènes. Les chaînes α et β de l’ATP synthase murines montrant 98% d’identité avec les chaînes humaines, et les quelques différences n’étant pas situées au niveau des sites nucléotidiques, cette hypothèse est peu probable. - Les TCR Vγ9/Vδ2 ne reconnaissent pas l’ATP synthase murine. Une étude récente a décrit un tétramère de TCR Vγ9/Vδ2 ne liant pas diverses lignées de cellules de souris (159). Ce point reste discutable et pourrait dépendre du TCR considéré puisque des expériences préliminaires nous suggèrent que le TCR G115 est capable de se lier à la surface de la lignée Rma-S (données non montrées). - Il pourrait exister une incompatibilité d’espèce entre les molécules d’adhésion/costimulation et leurs récepteurs. Deux études ont montré que ICAM-1 (Inter-Cellular Adhesion Molecule-1) et CD166 sont importants pour permettre la réponse des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 aux phosphoantigènes (270, 285). Bien que la transfection d’ICAM-I dans des cellules murines n’ait pas permis de leur conférer un potentiel stimulateur, celle de CD166 n’a pas été étudiée. 189 Discussion générale et Perspectives - Enfin, il est possible que les cellules d’origine non-humaine n’expriment pas une ou plusieurs protéines impliquées dans le mécanisme de présentation des phosphoantigènes. Ces molécules n’étant pas caractérisées, leur identification préalable dans les cellules humaines sera nécessaire pour vérifier cette hypothèse. Cette problématique est donc importante et nécessite des travaux supplémentaires pour tenter d’expliquer les raisons de la spécificité d’espèce de la présentation des phosphoantigènes. Comme nous l’avons vu, la méthode d’obtention de clones ou de lignées polyclonales peuvent être à l’origine de biais importants dans l’interprétation de la réactivité des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. L’étude extensive de la réactivité de ces différents clones et lignées contre des cellules murines est à envisager. La transfection des chaînes α et β humaines de l’ATP synthase dans des lignées murines pourrait permettre de déterminer si elles sont en cause dans la restriction d’espèce observée. La co-transfection de molécules d’adhésion et/ou de costimulation humaines pourrait également être nécessaire. En conclusion, bien que nos résultats fournissent de nouveaux éléments importants, notamment en proposant la première molécule de présentation des phosphoantigènes, la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 laisse encore beaucoup de questions en suspens. Elle met probablement en jeu des mécanismes complexes et de nombreuses molécules qui sont très différentes de celles impliquées dans les mécanismes classiques de présentation antigénique. De nombreux travaux seront nécessaires pour disséquer ces mécanismes et réconcilier les données de la littérature qui peuvent parfois présenter certaines contradictions. 190 BIBLIOGRAPHIE 191 Bibliographie 1. Abbas, A. K., and A. H. Lichtman. 2005. Cellular and Molecular Immunology (5th edition). Elsevier 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. Saunders. Kjer-Nielsen, L., C. S. Clements, A. W. Purcell, A. G. Brooks, J. C. Whisstock, S. R. Burrows, J. McCluskey, and J. Rossjohn. 2003. A structural basis for the selection of dominant alphabeta T cell receptors in antiviral immunity. Immunity 18:53-64. Gellert, M. 2002. V(D)J recombination: RAG proteins, repair factors, and regulation. Annual review of biochemistry 71:101-132. Germain, R. N. 2002. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nature reviews 2:309-322. Palmer, E. 2003. Negative selection--clearing out the bad apples from the T-cell repertoire. 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The recognition of these pathogens involves small molecules, termed phosphoantigens, composed of a short alkyl chain and a pyrophosphate group. The most common are isopentenyl pyrophosphate (IPP, an intermediate in the mevalonate pathway) and hydroxyl-methylbutenyl pyrophosphate (HMBPP, an intermediate in the DOXP pathway, an alternative IPP synthesis pathway in some organisms). The recognition of these molecules is still poorly characterized but requires a cellular contact which suggests that a presentation structure is necessary. Vγ9/Vδ2 T cells are also able to lyse many tumor cell lines in vitro. The implication of IPP has been established and our group has recently identified the Ecto-F1ATPase, a cell surface form of the mitochondrial ATP synthase, as an antigen participating in the recognition of tumor cells. The goal of this thesis was to better characterize the role of Ecto-F1-ATPase in this recognition. First, we have shown that Ecto-F1-ATPase interacts with Major Histocompatibility Complex class I molecules at the cell surface. HLA-B would be preferentially involved in this interaction and strongly decreases the activation of Vγ9/Vδ2 T cells. While this interaction plays an important role in the control of Vγ9/Vδ2 T cell reactivity, it provides an additional link between Ecto-F1-ATPase and immunity. In a second part, we have studied the recognition mechanism of ApppI, a nucleotidic derivative of IPP. Unlike classical phosphoantigens, it is resistant to terminal phosphatases, its recognition is indirect and involves a nucleotide pyrophosphatase activity, and it can be efficiently captured by cells which then become sensitive to Vγ9/Vδ2 T cells. Finally, ApppI has allowed us to show that Ecto-F1-ATPase is involved in the recognition of phosphoantigens. Our work represents a new and important step in the understanding of the mechanisms driving tumor cell recognition by Vγ9/Vδ2 T cells. Ecto-F1-ATPase is the first molecule directly involved in the presentation of phosphoantigens. These results may eventually allow the development of very efficient anti-tumoral immunotherapy strategies. 223 Pierre VANTOUROUT Directeurs de thèse : Dr Eric Champagne, Dr Laurent Martinez UNIVERSITE PAUL SABATIER, LE 30 JUIN 2009 ROLE DE L’ECTO-F1-ATPASE DANS LA RECONNAISSANCE DES CELLULES TUMORALES PAR LES LYMPHOCYTES T VGAMMA9/VDELTA2 LES LYMPHOCYTES MOLECULES T VGAMMA9/VDELTA2 (PHOSPHOANTIGENES) ONT ORIGINELLEMENT ETE DECRITS POUR ETRE ACTIVES PAR DE PETITES ISOLEES A PARTIR DE RESPONSABLE DE LA TUBERCULOSE CHEZ L’HOMME. CES MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, AGENT PATHOGENE LYMPHOCYTES ONT EGALEMENT UN LARGE POTENTIEL ANTI- TUMORAL QUI POURRAIT ETRE UTILISE POUR LE DEVELOPPEMENT D’IMMUNOTHERAPIES ANTICANCEREUSES. NOUS NOUS INTERESSONS AUX MECANISMES D’ACTIVATION DES LYMPHOCYTES T VGAMMA9/VDELTA2 PAR LES CELLULES TUMORALES ET AVONS RECEMMENT IDENTIFIE L’ECTO-F1-ATPASE COMME ANTIGENE IMPLIQUE DANS LEUR RECONNAISSANCE. LES TRAVAUX EFFECTUES AU COURS DE LA PRESENTE THESE METTENT EN EVIDENCE UNE INTERACTION ENTRE CETTE MOLECULE ET LE COMPLEXE MAJEUR D’HISTOCOMPATIBILITE DE LYMPHOCYTES. NOUS CLASSE I, CONNU POUR REGULER L’ACTIVATION DE CES AVONS EGALEMENT OBTENU DES DONNEES INDIQUANT QUE L’ECTO-F1-ATPASE PEUT PRESENTER DES PHOSPHOANTIGENES AUX LYMPHOCYTES T VGAMMA9/VDELTA2. Mots clés : Immunité anti-tumorale ; Lymphocytes T gammadelta ; ATP synthase Discipline : Physiopathologie moléculaire, cellulaire et intégrée Ecole doctorale : Biologie – Santé – Biotechnologie Unité de recherche : INSERM U563, Département LML, CPTP, CHU Purpan, Toulouse, France