ATP synthase is a complex molecular motor

THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l’Université Paul Sabatier – Toulouse III
Discipline : Physiopathologie moléculaire, cellulaire et intégrée
Présentée et soutenue par Pierre VANTOUROUT
Le 30 Juin 2009
ROLE DE L’ECTO-F1-ATPASE DANS LA RECONNAISSANCE DES CELLULES
TUMORALES PAR LES LYMPHOCYTES T VGAMMA9/VDELTA2
Pr Bertrand PERRET
Dr Julie DECHANET-MERVILLE
Dr Francis HARAUX
Pr Monique CAPRON
Dr Eric CHAMPAGNE
Dr Laurent MARTINEZ
Dr Xavier COLLET
JURY
Président
Rapporteuse
Rapporteur
Examinatrice
Examinateur
Invité
Invité
Ecole doctorale : Biologie - Santé - Biotechnologie
Unité de recherche : INSERM U563, Département LML, CPTP
Directeurs de Thèse : Dr Eric CHAMPAGNE, Dr Laurent MARTINEZ
« As an adolescent I aspired to lasting fame, I craved
factual certainty, and I thirsted for a meaningful vision of
human life - so I became a scientist. This is like becoming
an archbishop so you can meet girls. »
M Cartmill
A ma mère…
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier tout d’abord les membres de mon jury de thèse
Madame le Docteur Julie Déchanet-Merville pour m’avoir fait l’honneur d’être rapporteuse de
ma thèse. Je vous remercie pour vos commentaires très gentils sur mon travail de thèse ainsi
que pour la discussion lors de la soutenance qui était enrichissante. Je suis très content que
vous ayiez pu venir malgré le contretemps et j’ai apprécié nos discussions.
Monsieur le Docteur Francis Haraux pour m’avoir fait l’honneur d’être également rapporteur
de ce travail. Je vous suis très reconnaissant d’avoir accepté malgré le peu de points communs
entre vos travaux et mon sujet de thèse. Je vous remercie également pour vos commentaires,
pour la discussion très intéressante ainsi que pour votre aide sur les propriétés enzymatiques
de l’ATP synthase, qui m’a été très précieuse lors de la rédaction de mon manuscrit.
Madame le Professeur Monique Capron pour m’avoir fait l’honneur d’assister à ma
soutenance de thèse bien que l’université ne vous ait pas retenue comme rapporteuse. Je vous
remercie d’avoir fait tout ce trajet avec un timing très serré, ainsi que pour votre gentillesse et
la discussion intéressante que nous avons pu avoir au cours de et après la soutenance.
Monsieur le Professeur Bertrand Perret pour m’avoir fait l’honneur de présider mon jury de
thèse et pour vos commentaires, questions et remarques extrêmement pertinents et très utiles.
Je vous remercie également de m’avoir accueilli au sein du département LML ainsi que pour
votre gentillesse, votre implication et l’intérêt que vous avez porté à mes travaux, et votre
disponibilité.
Monsieur le Docteur Eric Champagne, mon directeur de thèse. Comme tu l’as dit nous avons
passé de nombreuses années ensemble avec des hauts et des bas dans nos recherches mais je
pense (et j’espère !) que dans l’ensemble nous avons fait du très bon travail. Je te remercie de
m’avoir fait découvert les γδ et d’avoir entretenu mon intérêt pour l’immunologie bien que ce
ne soit pas ma formation initiale. Je te suis également reconnaissant de m’avoir accordé ta
confiance dans le développement de ces projets ainsi que de m’avoir laissé une grande
autonomie qui me sera je pense très utile par la suite. Je te remercie également pour tes mots
très gentils pendant la soutenance qui m’ont beaucoup touché. J’espère que tes nouveaux
projets porteront tous leurs fruits et que les travaux que nous avons menés à bien ouvriront de
nouvelles directions fructueuses.
Monsieur le Docteur Laurent Martinez, mon co-directeur de thèse. Merci d’avoir cru en moi,
de m’avoir soutenu et de t’être grandement impliqué dans mes travaux, bien que très éloignés
de tes perspectives de recherche. Je te remercie également pour ta disponibilité de tout instant
et pour toutes les discussions que nous avons pu avoir, scientifiques ou non. Un grand merci
également pour tes commentaires très gentils lors de la soutenance. Je te souhaite le meilleur
pour ta nouvelle équipe et j’espère que la voie Ecto-F1-ATPase / P13Y2 (coquille volontaire !)
continuera de fournir des résultats toujours aussi intéressants, tout comme tes nombreux
nouveaux projets.
Monsieur le Docteur Xavier Collet pour avoir participé activement à mon jury. Je te remercie
pour toutes tes questions (nombreuses comme toujours !) très intéressantes et pour ton
implication dans ce sujet et le grand intérêt que tu lui as porté. Je te remercie également de
m’avoir accueilli pendant toutes ces années au sein de ton équipe, pour ta disponibilité de tout
instant (malgré ta double casquette !) et pour ton soutien tout au long de ma thèse. Sans
oublier ta bonne humeur et ton humour, bien sûr.
Je remercie tous les membres présents et passés du Thème A
Tous les chercheurs de l’équipe.
Je vous remercie tous pour votre gentillesse, votre disponibilité et pour votre soutien sur un
projet bien éloigné de vos thématiques de recherche. Désolé de vous avoir assomé avec toute
cette immunologie !
François pour ton humour, ta gentillesse, et désolé mais tu n’auras pas réussi à me convertir
aux Macs ! Ha, et puis désolé pour la bio mol aussi, mais tu le sais, c’est ma grande passion !
Mêmes excuses pour Ronald, et je te souhaite le meilleur dans ta nouvelle direction et j’espère
que l’aventure Cerenis sera pleine de succès.
Stéphane pour tout ton temps et ta patience pour tous ces concepts d’enzymologie qui me
semblaient bien obscurs, ainsi que ta bonne humeur permanente.
Dernière (mais pas des moindres), merci Christine pour ta gentillesse, tous tes conseils (labo
et hors labo) et pour ta disponibilité de tout instant. Je te suis infiniment reconnaissant de
m’avoir énormément aidé pendant les périodes difficiles, je ne l’oublierai jamais. Je te
souhaite de tout cœur le meilleur pour tes nouveaux projets de recherche et je suis sûr que tes
petites goutelettes t’apporteront de nombreux résultats passionants avant que tu t’envoles vers
de nouveaux horizons plus « verts » !
Tous les post-doctorants (et affiliés) du laboratoire.
Véro, un grand MERCI en Arial 56 gras souligné (oui je ne le fais pas pour de vrai sinon la
mise en page va me faire hurler). On ne se sera pas cotoyés très longtemps mais ce fut un réel
plaisir. Merci pour toutes ces soirées organisées avec brio et pour ton dévouement pour
toujours être Sam ! Un grand merci également pour tes corrections très efficaces, et pour
t’être intéressée à mon projet. Je te remercie pour ta gentillesse, ton soutien, et ton aide dans
les coups durs. J’espère que tu auras très bientôt ton poste (satané gamma factor) car tu le
mérites amplement. Je t’attends donc très bientôt à Londres, sans faute !
Gérald (saluuuuuuuut ! namasteeeee !) merci pour ton soutien et tous tes conseils. Je te
souhaite le meilleur pour la suite et j’espère que tu finiras par obtenir un poste car tu le
mérites vraiment et tu seras sans aucun doute un excellent chercheur « officiel » sur qui tout le
monde peut compter. J’ai beaucoup apprécié toutes les discussions que nous avons pu avoir
au cours de ces quelques mois.
Annelise (ma presque compatriote !) merci pour ton soutien, ton humour et ton extrême
gentillesse. Encore toutes mes félicitations pour ton nouveau bonheur, et je te souhaite le
meilleur dans ton futur parcours.
Safouane, un grand merci à toi (le seul hormis notre petite équipe à faire de l’immuno, je me
sentais moins seul !) pour tous tes conseils très avisés et l’intérêt que tu as porté à mes
travaux. Je te souhaite toute la réussite que tu mérites pour tes nouveaux projets (même s’il ne
s’agit plus d’immuno, traître !).
Michela, notre italienne préférée ! Ton passage très rapide dans l’équipe restera je pense dans
toutes les mémoires. Je n’oublierai certainement pas ton infinie gentillesse et ta bonne humeur
permanente qui ont fait partie des petits rayons de soleil du labo. Il semble que tu t éclates
dans ton nouveau poste qui est plus près de ce que tu attends et aimes. Je te souhaite le
meilleur pour cette nouvelle direction.
Finally, I would like to thank Jayati who joined our team for 2 years. It was a real pleasure to
meet you and work with you. Your everlasting good mood was very pleasant and helpful.
Thank you for all your advices and your great help on this project. I wish you and Ananda the
best for your new positions and hope you will be able to get back to India soon and find a
position there. On second thought, maybe I should have written this in French since you are
almost fluent now!
Je remercie également tous les techniciens de l’équipe.
Corinne pour ta gentillesse, pour ces bons moments de rigolade au cours des soirées (un peu
de verveine peut-être ?). Je te remercie pour ton aide inestimable (notamment ton expertise de
l’HPLC !) et ta disponibilité permanente. Et bien sûr pour avoir veillé sur nous en tant que
(ex) pro de l’hygiène et sécurité ! (je suis sûr que cette douche nécessite un contrôle
supplémentaire, il faudrait qu’on s’en occupe avant que je parte !). Je te souhaite le meilleur
pour tes nouveaux projets.
Chris, pour ta gentillesse, tes conseils, et ton moral d’acier ! Merci d’avoir été présente et
également d’avoir assuré avec perfection le bon fonctionnement de nos réserves ! A toi aussi
je souhaite le meilleur pour tes nouveaux projets et je suis sûr que tu exporteras avec brio la
hyène attitude !
Super Michel pour ta bonne humeur constante et toute ton aide, notamment à mon arrivée
dans le labo. Merci aussi pour toutes ces discussions très agréables que nous avons pu avoir
sur tous les sujets possibles et imaginables. Je te souhaite une très bonne fin de carrière et une
belle et heureuse retraite amplement méritée !
Et enfin Guillaume, merci pour ton amitié et ton soutien, ainsi que pour cette mémorable
finale de l’euro (dois-je rappeler que tu as fait une lamentable performance à l’euro-foot ?
Très décevant de la part d’un tel expert en sports !). Je te félicite pour ta persévérance malgré
la difficulté à trouver un poste, et j’espère que tu finiras par en obtenir un « pour de vrai » car
tu le mérites très largements. Je te souhaite bonne route ainsi qu’à Emilie, et si tu comptes
faire un saut à Londres à l’occasion c’est sans problème !
Je n’oublie pas les petites nouvelles du laboratoire.
Céline félicitations pour ton DEA et mes meilleurs vœux de réussite pour la poursuite de tes
études (avec l’activité clinique en plus !). Je suis sûr que tout se passera bien et j’espère que tu
pourras poursuivre la carrière de ton choix. Et que tu resteras dans la recherche, bien sûr !
Manuela (bouh !), un grand merci pour ta gentillesse, ton soutien, et ton aide à beaucoup de
niveaux. Je te félicite également pour ton DEA. A l’heure où j’écris ces lignes tu ne sais pas
encore si tu auras une bourse ministérielle mais je crois en toi et je suis sûr que tu donneras le
meilleur comme tu l’as fait pendant ton DEA (oui, je sais, on ne dit plus DEA et ça fait quatre
fois déjà que je l’écris, mais ceci est dû à mon grand âge bien sûr). Je suis sûr que tu feras une
très bonne doctorante et je te souhaite le meilleur. Tu peux bien sûr compter sur moi si tu as
besoin de quoi que ce soit, et puis je ne serai pas bien loin, tu viens quand tu veux !
Un petit chapitre spécial pour mes deux ex-thésardes préférées !
Bin oui, je n’allais pas vous placer ni dans les thésards, chères Docteurs, ni dans les post-docs
du labo, et puis vous méritez largement votre section rien qu’à vous !
Flo, merci pour tous tes conseils et ton soutien surtout ces derniers mois, pendant la
douloureuse phase d’accouchement du présent bébé. Je n’oublierai pas ton humour, ta bonne
humeur et ton côté déjanté qui te va si bien. Je suis content que tu aies pu faire ce qui te
plaisait à l’issue de la thèse et que tu aies trouvé un bon post-doc où tu t’éclates visiblement.
Tout le meilleur pour la suite, et on se voit de toute façon très bientôt à Amsterdam !
Ma petite Camcam (ou devrais-je dire Mère Noël ?), un très grand merci pour toutes ces
années passées ensemble au labo. On a suivi le même parcours (complètement atypique on
pourrait dire) et ça nous a pas trop mal réussi ! Je n’oublierai jamais ton humour, ta
gentillesse, ta bonne humeur permanente et tous tes conseils. Et tes fringues, bien
évidemment ! Il y a eu du relâchement sur la fin d’ailleurs, probablement la faute à Lilian !
Tous mes vœux de réussite pour la poursuite de ta carrière, je suis content que tu aies pu
trouver toi aussi un très bon post-doc. J’ai beaucoup admiré ta persevérance et tes facultés
d’adaptation malgré un sujet pas évident et une situation parfois très délicate. Ton petit lutin
te souhaite le meilleur, accompagnés de vœux de bonheur pour toi et le grand chef Lilian (rien
à voir avec les indiens). On se revoit très bientôt (plusieurs fois !) et vous êtes tous les deux
les bienvenus à Londres quand vous voulez, évidemment. TADAAAAAA !
Et pour finir, mes très chers compagnons, les inestimables, inimitables et irremplaçables
thésards du thème A !
Aurélie, halala le dossier… la spécialiste ès-diplomatie ! Bon bon, je plaisante… un grand
merci à toi pour ton soutien à beaucoup de niveaux, pour tous ces bons moments en soirée et
pour nos nombreuses discussions. Je suis vraiment content de t’avoir rencontrée et d’avoir
travaillé avec toi (très partiellement, mais nous avons deux articles en commun quand même,
la classe !). Hormis ta diplomatie (oui oui, j’insiste) je retiendrai de toi ta gentillesse et ta
timidité qui a très vite disparu (la faute à Véro ? Je suis sûr que les dates coïncident) pour
laisser place à « la petite » que nous aimons tous. Je te souhaite une très bonne fin de thèse ete
si tu as besoin de quoique ce soit tu n’hésites pas, c’est la tradition (j’ai suffisamment embêté
Camille pour le savoir !). Pas de faux espoirs, je participerai activement à ton anti-thèse, et
promis je serai là pour la soutenance ! Je suis sûr que tout se passera très bien pour toi et
j’espère que tu trouveras très vite un post-doc qui permettra à Fred de t’accompagner. Tous
mes vœux de bonheur à tous les deux (c’est pour quand ? OK OK j’ai rien dit !). Et quand
vous voulez vous passez me voir à Londres bien sûr !
Pequeñita Claudia ! Oui hum, bon, je vais arrêter là l’espagnol, j’ai vraiment besoin de m’y
remettre. Un grand merci pour ta gentillesse, ton humour (et tes magnifiques chansons !) et
pour ton soutien et ton aide sur tous les plans. Je te souhaite à toi aussi une très bonne fin de
thèse qui approche (t’en es oùùùùùù ? T’as fini le chapitre endothélium ???? Oui moi aussi je
fais ma Véro, y’a pas de raisons !) et bien sûr je ferai le maximum pour assister à ton
triomphe ! Et puis un très bon retour au pays et je vous souhaite à toi et Pablo le meilleur pour
la suite. Vous êtes tous les deux formidables et je suis très heureux d’avoir pu vous cotoyer !
Et si jamais vous revenez en cette bonne vieille Europe j’espère vous voir à Londres tous les
deux !
Emmanuel (cher Docteur !) merci pour ta gentillesse, ton humour et ton soutien. Je te souhaite
également une bonne fin de thèse et j’espère que tes travaux se concrètiseront bientôt. Bonne
chance pour la suite de ta carrière et j’espère que tu resteras dans la recherche car tu sembles
vraiment t’y épanouir et y être brillant.
Zeina, tu démarres tout juste ta thèse donc bon courage et accroche toi. Tout le meilleur pour
la suite.
Je profite enfin de cette partie dédiée au thème A pour remercier nos « membres invités » de
l’ICR/Chimie/Fac/etc (bon désolé mais c’est compliqué votre histoire !).
Denis (ouuuuuyaaaaah. Oui bon, je ne sais pas comment retranscrire notre salut officiel par
écrit). J’ai vraiment beaucoup apprécié de te cotoyer (à mi-temps ? enfin partiellement, enfin
bref) pendant ces quelques mois. Merci pour ta sympathie et ton soutien. Bon courage pour la
rédaction de ta thèse et je te souhaite le meilleur pour la suite.
Greg, très heureux également de t’avoir connu. On a bien rigolé et passé de bonnes soirées
ensemble. J’espère vraiment que les galères s’arrêteront vite et que tu trouveras un poste le
plus rapidement possible. Et n’oublie pas le logo de l’association internationale des toilettes,
ça peut toujours servir (ainsi que l’albatros. Ou la mouette, je ne sais plus).
Edern, rencontre très brève et sporadique mais j’ai apprécié de discuter et rigoler avec toi.
Bon courage pour la suite et j’espère que tu pourras trouver rapidement un job après ton M2.
Je remercie également tous les membres du thème B
Et plus particulièrement :
Fabienne (même si tu n’es pas venue à ma soirée de thèse !). Un immense merci pour ton
soutien, ta disponibilité et ton aide inestimable dans les périodes difficiles. Je te remercie
également pour ta bonne humeur, ton humour, et toutes nos discussions autour d’un café ou
d’une cigarette. J’ai décidé comme tu le sais de laisser tomber les macaques pour mon postdoc (oui, tu n’allais pas y couper désolé !), la souris c’est bien plus porteur… Je te souhaite du
fond du cœur le meilleur pour la suite et j’espère vraiment que nous resterons en contact.
Muriel, merci pour ta bonne humeur, ton dynamisme et tous ces bons moments à la table café.
Je te remercie également de t’être intéressée à mes travaux, et pour ton aide irremplaçable
pour les dossiers de soutenance (c’est combien de rangs A extérieurs déjà ? Et puis c’est quoi
cette histoire de prix de thèse ?!). Tout le meilleur pour la suite, pour cette nouvelle équipe
avec Laurent !
Armelle, un grand merci à toi pour tous tes conseils et ton soutien. J’espère que tes projets se
développeront et que tu seras bientôt à la tête d’une armée de thésards qui sauteront partout en
salle de culture lorsqu’ils écriront leur thèse !
Enfin je ne pense pas que cela arrivera avec Audrey… si ? Merci à toi Dreydrey (un p’tit
cookiiiiiiiie ?) pour ta gentillesse, ton écoute et ton soutien. Je te souhaite bon courage pour la
poursuite de ta thèse qui sera brillante je suis sûr. Tous mes vœux à toi et Thibault qui est
également quelqu’un de bien que j’ai eu plaisir à rencontrer bien que brièvement.
Anne, merci à toi également pour ta gentillesse, ton humour, et les nombreuses pauses clope
passées à discuter. Et un grand merci d’avoir récupéré mon PV tu as assuré ! Bon courage
pour la fin de ta thèse à toi aussi.
Clo, merci pour ta gentillesse, ta bonne humeur et ces concours endiablés de mots croisés.
Merci également pour m’avoir dépanné si souvent pour de nombreux réactifs, qu’aurais-je fait
sans toi ? Tu viens de quitter le département à l’heure où j’écris ces lignes donc je te souhaite
le meilleur pour ta nouvelle direction.
Marianne, un grand merci pour ton humour et ta bonne humeur permanente bénéfique et très
communicative. Bon courage pour la suite et j’espère que tu trouveras un vrai poste très
prochainement.
Hélène, tu es la prochaine sur la liste ! Malheureusement je ne pourrai pas assister à ta thèse,
mais je suis content que tu te sois finalement sortie des péripéties de date et autres formalités !
Je suis sûr que tout se passera bien et je te souhaite le meilleur pour ton post-doc. Peut-être en
Angleterre, qui sait ?
Jean-Phiphi, merci à toi pour tous tes conseils et nos discussions. Et toutes mes félicitations
pour ton poste, ct toutes mes félicitations pour ton poste, c’est génial !.
Pour finir tous mes remerciements également à Patrick, Nicole, Monique, Elvire, Emmanuelle
et Françoise que j’ai beaucoup moins cotoyés mais que je n’oublie pas !
Pour finir un grand merci aux autres habitants du bâtiment C (les dom-tom)
Justine et son équipe de choc du plateau de lipidomique, Véronique et Séverine. Je n’ai pas eu
à utiliser vos talents mais j’ai apprécié de vous cotoyer au cours de ces années. J’espère que le
plateau se développera et je vous souhaite le meilleur pour la suite.
Tous les membres de l’équipe de Jean-Luc Davignon, Michel, Myriam et Jean-Frédéric. Ce
fut un plaisir de vous rencontrer et de partager les locaux avec vous.
Et pour finir notre très chère Yvette qui prend tant soin de nous et sans qui nous serions
perdus ! Je te remercie pour ta gentillesse, ta disponibilité et toute ton aide dans les démarches
administratives. A bientôt à Londres alors ?
Je tiens à remercier tous les membres de l’IFR et du CPTP que j’ai rencontrés au cours
de ces 6 années
Merci à tous pour votre accueil et votre aide.
Je pense notamment aux meilleures responsables de plateau de cytométrie (ma deuxième
maison) et de d’imagerie de France (voire du monde !) Fatima (ainsi que Valérie) et Sophie.
Merci pour votre aide inestimable dans la réalisation de ces travaux, pour votre gentillesse et
pour toutes les discussions que nous avons pu avoir. Un grand merci également d’avoir
participé à ma soirée de thèse, j’ai été très touché par votre présence.
Je tiens également à remercier les autres responsables des plateaux qui ont participé
directement et indirectement à mes travaux. Hélène et Claudie, Jacques et Nordine (les
McGuyver de l’U563 !) ainsi que Joël Teyssier, notre invité spécial de la pause déjeuner !
J’ai également une pensée pour tous les gens que j’ai cotoyés depuis la fac ou mon arrivée à
l’U563. Damien, Cécile, Marinela, Hicham, Nico, Gaëtan, Frédérique Gaits, Hélène
Tronchère, Loïc Dupré et son équipe (notamment Ronan et Fanny), Bernard Payrastre et bien
d’autres personnes que je n’oublierai pas.
Un grand merci spécial à Anne Huchenc-Champagne ! Merci infiniment d’avoir été aussi
disponible le jour de ma thèse tu mérites vraiment une médaille (ou une casquette, c’est vrai).
Merci pour ta gentillesse et ton soutien.
Je remercie finalement les enseignants de l’UAG et de l’UPS qui ont grandement contribué à
mon désir de m’orienter vers la recherche.
Voilà donc pour la partie travail ! Encore merci à tous et tous mes vœux pour vos futurs
travaux. Et de tout cœur, bon courage aux futurs impétrants. Si j’ai réussi à écrire ma thèse
(moi et mon horreur de l’écriture…), vous pouvez tous le faire !
Je remercie également tous mes amis.
Djébraïl, trop longtemps perdu de vue mais récemment retrouvé, merci pour ton soutien et ton
amitié indéfectible. Tous mes autres amis de collège et lycée, Florent, Julien, Frédo, Nicolas
et tous les autres que je n’oublie pas.
Mes amis de l’université (UAG et UPS) et notamment Loïc, Charles, Arthur, Aline, Hayat,
Anne-Claire, Greg et tous les autres. Nous avons tous pris des chemins différents mais je suis
heureux d’avoir croisé votre route et je vous souhaite tout le bonheur possible.
Une mention spéciale à Donia pour être venue assister à ma thèse, ainsi qu’à toi et Magda
pour être venues à ma soirée. Merci pour votre amitié, votre gentillesse et votre soutien. Vous
venez quand vous voulez à Londres !
Mes amis de l’auberge, Jean-Pierre, Bachir (mon bro !), François, Matthieu et Mathieu
(Dupontt et Dupont), Dom le tenancier, Pascal, Reda, Arnaud et tous les autres !
Egalement mes nouveaux amis de phdcomics (dont je conseille la lecture à tout le monde !),
Catherine, Emily, Caoimhe, Fiona, Erwin, Michael, Joel, John et les autres. You all have my
deepest thanks for all your advices, help and support. I wish you the best for your PhD, postdocs or jobs. I really look forward to meeting some of you soon and I hope I will be able to
meet all of you guys one day.
Je terminerai ces remerciements par ma famille.
Un grand merci à mon papa de m’avoir aidé et accompagné pour mes études. Le résultat final
n’est pas celui originellement prévu, mais le titre est le même après tout. Merci à toi pour ton
aide et ton amour et je sais que je n’en serais pas là aujourd’hui sans toi.
A mes deux sœurs adorées, merci pour votre soutien et votre amour. Vous me manquez
beaucoup et j’espère que vous me rendrez visite à Londres.
SOMMAIRE
1
Sommaire
ABREVIATIONS ET ACRONYMES
p.5
RESUME
p.10
AVANT-PROPOS
p.11
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
p.17
Chapitre I : Le système immunitaire
p.17
1) Généralités
p.18
1.1) Organes et cellules
p.18
1.2) Molécules fondamentales du système immunitaire : quelques exemples
p.21
1.3) Déclenchement de la réponse immunitaire
p.23
2) Les lymphocytes T
p.25
2.1) Développement
p.27
2.2) Les sous-populations T conventionnelles
p.30
3) Les lymphocytes T non-conventionnels
p.33
3.1) Les lymphocytes NKT
p.34
3.2) Les lymphocytes MAIT
p.37
Chapitre II : Les lymphocytes T γδ
p.41
1) Généralités
p.42
2) Développement : la priorité aux lymphocytes T γδ
p.44
3) Fonctions des lymphocytes T γδ : multiplicité et diversité
p.48
3.1) Fonctions effectrices
p.49
3.2) Fonctions régulatrices
p.53
4) Lymphocytes T γδ et pathologies : dualité de leurs rôles
4.1) Pathogènes intracellulaires
p.55
p.55
4.1.1) Bactéries et parasites
p.55
4.1.2) Virus
p.56
4.2) Pathologies inflammatoires et auto-immunes
p.58
4.3) Cancer
p.60
5) Antigènes reconnus par les TCR γδ : une diversité déroutante
p.62
5.1) Molécules apparentées au CMH
p.63
5.2) Antigènes non-peptidiques
p.67
2
Sommaire
5.2.1) Phosphoantigènes
p.67
5.2.2) Aminobisphosphonates et alkylamines
p.70
5.3) L’Ecto-F1-ATPase
p.72
Chapitre III : L’ATP synthase
p.75
1) La F1Fo ATP synthase mitochondriale
p.76
1.1) Généralités
p.76
1.2) Structure
p.77
1.3) Mécanisme enzymatique
p.78
1.4) Pathologies liées à l’ATP synthase
p.80
2) L’Ecto-F1-ATPase
p.80
2.1) Ecto-F1-ATPase, la même enzyme que l’ATP synthase mitochondriale ?
p.81
2.2) Une localisation inattendue et toujours inexpliquée
p.84
2.3) Nouvelle localisation, nouveaux rôles
p.87
2.3.1) Métabolisme du HDL-cholestérol
p.88
2.3.2) Survie et prolifération des cellules endothéliales
p.90
2.4) Synthétiser ou ne pas synthétiser, telle est la question
p.93
3) Une fascinante enzyme qui n’a pas encore révélé tous ses secrets
p.96
RESULTATS EXPERIMENTAUX
p.99
Partie I : Interaction entre l’Ecto-F1-ATPase et le CMH-I
p.99
1) Introduction
p.100
2) Article 1
p.101
3) L’interaction est-elle spécifique d’un ou plusieurs isotypes de CMH-I ?
p.109
3.1) Introduction
p.109
3.2) Matériel et méthodes
p.110
3.3) Résultats
p.114
3.4) Discussion
p.117
Partie II : L’ApppI, un prototype de phosphoantigène nucléotidique
p.121
1) Introduction
p.122
2) Article 2 (Soumis)
p.124
Partie III : Présentation des phosphoantigènes par l’Ecto-F1-ATPase
p.141
1) Introduction
p.142
2) Article 3 (Manuscript en préparation)
p.143
3
Sommaire
3) Modulation de l’activité enzymatique de l’ATP synthase par l’ApppI
p.150
3.1) Introduction
p.150
3.2) Matériel et méthodes
p.151
3.3) Résultats et discussion
p.152
Partie IV : Etude du métabolisme nucléotidique à la surface des cellules
p.157
1) Introduction
p.158
2) Article 4
p.159
3) Rôle de l’ANT dans la conversion ADP Æ ATP à la surface des cellules
p.168
3.1) Introduction
p.168
3.2) Matériel et méthodes
p.169
3.3) Résultats et discussion
p.170
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
p.173
1) Interaction entre CMH-I et Ecto-F1-ATPase
p.174
1.1) HLA-B et autres partenaires potentiels
p.174
1.2) Implications fonctionnelles et physiopathologiques
p.175
1.3) Rôle du CMH-I dans l’expression de l’Ecto-F1-ATPase ?
p.177
2) Mécanisme de présentation des phosphoantigènes
p.178
2.1) Voie(s) de transit de l’Ecto-F1-ATPase de la mitochondrie à la surface
p.178
2.2) Protéines impliquées dans le routage/chargement de l’Ecto-F1-ATPase ?
p.179
3) Métabolisme des phosphoantigènes
p.180
3.1) Mécanisme d’internalisation de l’ApppI
p.180
3.2) Nucleotide pyrophosphatase
p.183
3.3) Autres phosphoantigènes et dérivés nucléotidiques
p.184
4) Interactions entre phosphoantigènes, Ecto-F1-ATPase et TCR Vγ9/Vδ2
p.186
4.1) Liaison de l’ApppI sur l’Ecto-F1-ATPase
p.186
4.2) Reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase par le TCR Vγ9/Vδ2
p.187
5) Spécificité d’espèce de la présentation des phosphoantigènes
p.189
BIBLIOGRAPHIE
p.191
ANNEXES (Article 5)
p.207
ABSTRACT
p.223
4
Sommaire
ABREVIATIONS ET ACRONYMES
5
Abréviations et acronymes
AA : AlkylAmines
AAC : ADP, ATP Carrier
AB : Acide Bongkrékique
ABCC5 : ATP-Binding Cassette sub-family C member 5
ADCC : Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNc : ADN complémentaire
AK : Adenylate Kinase
AMP, ADP, ATP : Adénosine mono-, di- ou triphosphate
ANT : Adenosine Nucleotide Translocase
apo : apolipoprotéine
ApppI : gamma-P-(3-méthyl-but-3-en-1-yl)-5'-adénosine disodium triphosphate
ARN : Acide RiboNucléique
ARNi: ARN interférent
ARNm : ARN messager
ARNt : ARN de transfert
β2m : beta-2-microglobuline
BCR : B Cell Receptor (récepteur B à l’antigène)
CCR : CC chemokine Receptor
CD : Cellule Dendritique (ne pas confondre avec CD suivi d’un numéro qui correspond à la
nomenclature Cluster de Différenciation utilisée pour les marqueurs de surface)
CDR : Complementarity Determining Region
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité (de classe I ou II)
CMV : Cytomégalovirus
CPA : Cellule Présentatrice d’Antigènes
CSF : Colony Stimulating Factor
CXCR : CXC chemokine Receptor
DETC : Dendritic Epidermal T Cell
DMAPP : DiMéthyl-Allyl PyroPhosphate
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DO : Densité Optique
DOXP : DeOxy-Xylulose-Phosphate
DN : Double Négatif
DP : Double Positif
6
Abréviations et acronymes
EAE : Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
EBV : Epstein Barr Virus
EEA1 : Early Endosomal Antigen 1
ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
EMAP II : Endothelial Monocyte-Activating Polypeptide II
ETP : Early T cell Progenitor
EtPP : Ethyl PyroPhosphate
FPP : Farnesyl PyroPhosphate
GFP : Green Fluorescent Protein
HDL : High Density Lipoprotein
HDMAPP : Hydroxy- DiMéthyl-Allyl PyroPhosphate (aussi appelé HMBPP)
HLA : Human Leukocyte Antigen
HMBPP : Hydroxy-Méthyl-Butényl PyroPhosphate
HPLC : High Pressure Liquid Chromatography
Hsp : Heat shock protein
HSV : Herpes Simplex Virus
HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cells
ICAM-1 : Inter-Cellular Adhesion Molecule-1
ICOS : Inducible CO-Stimulator
IFN : Interféron
Ig : Immunoglobuline
IHH : Immortalized Human Hepatocytes
IL : Interleukine
IMGT : Système d’information international en ImMunoGénéTique
IPP : Isopentenyl PyroPhosphate
ITAM/ITIM : Immunoreceptor Tyrosine-based Activation/Inhibition Motif
KGF : Keratinocyte Growth Factor
KIR : Killer Inhibitory Receptor
LAK : Lymphokine Activated Killer
LAMP-1 : Lysosomal Associated Membrane Protein-1
LB : Lymphocyte B
LDH : Lactate DesHydrogenase
LDL : Low Density Lipoprotein
LIR : Leucocyte Ig-like Receptor
7
Abréviations et acronymes
LT : Lymphocyte T
MAIT : Mucosal Associated Invariant T
MAPL : Mitochondria Anchored Protein Ligase
MICA/B : MHC class I polypeptide-related sequence A/B
MttP: Microsomal triglyceride transfer Protein
MR1 : MHC-I-Related protein 1
MRP5 : Multidrug Resistance Protein 5
MSC : Mesenchymal Stem Cell
NADH : NicotinAmide Dinucléotide (forme réduite)
NARP : Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinitis Pigmentosa
N-BP : Aminobisphosphonates
NCL : Neuronal Ceroid Lipofuscinosis
NDPK : Nucleoside DiPhosphoKinase
NK : Natural Killer
NKT : Natural Killer T
NKR : Natural Killer Receptor (aNKR : activateur, iNKR : inhibiteur)
NPP : Nucleotide PyroPhosphatase
OSCP : Olygomycin Sensitivity-Confering Protein
PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cells
PCR : Polymerase Chain Reaction
PEP : PhosphoEnol Pyruvate
PHA : PhytoHémAgglutinine
Pi : Phosphate inorganique
PK : Pyruvate Kinase
PPADS : Pyridoxal-Phosphate-6-Azophenyl-2',4'-DiSulfonate
PPD : Purified Protein Derivative
Ppt1 : Palmitoyl protein transferase 1
RAET : Retinoic Acid Early inducible Transcript
RAG1/2 : Recombination Activating Gene 1/2
RE : Réticulum Endoplasmique
RFP : Red Fluorescent Protein
ROCK-I : Rho-associated Coiled-coiled Kinase I
ROS : Reactive Oxygen Species
RPMI : Roswell Park Millenium Institute
8
Abréviations et acronymes
RPS : Résonance Plasmonique de Surface
RT-PCR : Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
SEA : Staphylococcal Enterotoxin A
SH : Sérum humain
SIDA : Syndrôme de l’ImmunoDéficience Acquise
SVF : Sérum de Veau Fœtal
SP : Simple Positif
TCR : T Cell Receptor (récepteur T à l’antigène)
TdT : Terminal deoxyribonucleotidyl Transferase
TGF : Transforming Growth Factor
TIL : Tumor Infiltrating Lymphocytes
TLR : Toll-Like Receptor
TNF : Tumor Necrosis Factor
Tom : Translocase of outer membrane
TT : Toxine Tétanique
TUBAg : TUBerculosis Antigen
ULBP : UL16-Binding Protein
VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine
9
RESUME
La biologie des lymphocytes T (LT) Vγ9/Vδ2 est encore très peu comprise. Cette souspopulation non-conventionnelle, spécifique à l’homme et certains primates supérieurs, joue un
rôle important dans la défense de l’organisme contre des pathogènes intracellulaires (tels que
mycobactéries et plasmodium). La reconnaissance des cellules infectées implique de petites
molécules, appelées phosphoantigènes, formées d’un radical alkyl et un pyrophosphate. Les
plus communs sont l’isopentenyl pyrophosphate (IPP, intermédiaire de la voie du mévalonate)
et l’hydroxy-methyl-butenyl pyrophosphate (HMBPP, intermédiaire de la voie DOXP, voie
alternative de synthèse de l’IPP chez certains organismes). Leur reconnaissance est mal
caractérisée mais requiert un contact cellulaire, suggérant qu’une structure de présentation est
nécessaire. Les LT Vγ9/Vδ2 sont également capables de lyser des lignées tumorales in vitro.
L’implication de l’IPP a été établie et l’équipe a récemment identifié l’Ecto-F1-ATPase, une
forme de l’ATP synthase mitochondriale exprimée à la surface, comme antigène participant à
la reconnaissance des cellules tumorales. Cette thèse a eu pour but de mieux caractériser le
rôle de l’Ecto-F1-ATPase dans cette reconnaissance.
Nous avons montré que l’Ecto-F1-ATPase interagit en surface des cellules avec les molécules
du Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I. HLA-B est préférentiellement impliqué
dans cette interaction et diminue fortement l’activation les LT Vγ9/Vδ2. Cette interaction joue
donc un rôle important dans le contrôle de la réactivité de ces lymphocytes et renforce le lien
entre Ecto-F1-ATPase et immunité.
Dans une deuxième partie, nous avons étudié les mécanismes de reconnaissance de l’ApppI,
un dérivé nucléotidique de l’IPP. Contrairement aux phosphoantigènes classiques, cette
molécule est résistante aux phosphatases terminales, son mécanisme de reconnaissance est
indirect et implique une activité de type Nucleotide pyrophosphatase, et elle peut être capturée
par des cellules et les rendre sensibles aux LT Vγ9/Vδ2. Pour finir, l’ApppI nous a permis de
démontrer que l’Ecto-F1-ATPase est impliquée dans la reconnaissance des phosphoantigènes.
Nos travaux représentent une avancée importante dans la compréhension des mécanismes de
reconnaissance des cellules tumorales par les LT Vγ9/Vδ2. L’Ecto-F1-ATPase représente la
première molécule directement impliquée dans la présentation des phosphoantigènes. Ces
résultats pourraient à terme permettre le développement de stratégies d’immunothérapie
anticancéreuse.
10
AVANT-PROPOS
11
Avant-propos
Le système immunitaire est composé d’un très grand nombre de populations cellulaires
différentes coopérant pour assurer la protection de l’organisme contre les pathogènes. Les
lymphocytes T jouent un rôle central dans cette protection, en participant directement à
l’élimination des pathogènes et des cellules infectées ainsi qu’à la mise en place de la réponse
immunitaire. Ils sont en effet capables de contrôler la différenciation et l’activation des autres
populations formant ce système extrêmement complexe. Le compartiment T se compose luimême d’une grande variété de cellules ayant des phénotypes et des fonctions bien distincts.
Parmi celles-ci, on distingue les lymphocytes T αβ, dits conventionnels, et les γδ, qui font
partie des lymphocytes T non-conventionnels avec des sous-populations αβ particulières, les
cellules NKT et MAIT. Découverts au milieu des années 80, ces lymphocytes restent
extrêmement mal connus à l’heure actuelle. Ceci est notamment dû aux nombreuses
différences entre les sous-populations γδ humaines et murines, ce qui rend leur étude délicate.
Ils font partie de l’immunité dite innée, et à ce titre font partie des premières lignes de défense
contre les pathogènes. Ils participent également à l’homéostasie tissulaire et jouent
probablement un rôle important dans l’immuno-surveillance de la transformation tumorale.
Chez l’homme et certains primates « supérieurs », la grande majorité des lymphocytes T
γδ circulants expriment un TCR composé d’une chaîne Vγ9 appariée à une chaîne Vδ2. Ils ont
initialement été décrits pour participer à la réponse dirigée contre Mycobacterium
tuberculosis, l’agent responsable de la tuberculose. Ils sont activés par des antigènes
particuliers appelés phosphoantigènes, qui sont des molécules de très faible poids moléculaire
(<1kDa) et dont la structure générale comprend une courte chaîne alkyl et un pyrophosphate.
Ces molécules ont été identifiées il y a 15 ans, mais le mécanisme exact permettant leur
reconnaissance par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 n’a jamais été identifié. Cette reconnaissance
fait probablement intervenir une structure de présentation antigénique. Dans le cas de toutes
12
Avant-propos
les autres sous-populations T, ce rôle est rempli par les molécules du Complexe Majeur
d’Histocompatibilité (CMH), classiques ou apparentées. Néanmoins, en ce qui concerne les
lymphocytes T γδ, il est communément admis qu’elles ne sont pas impliquées.
Ces lymphocytes sont également capables de lyser de nombreuses lignées tumorales in vitro.
De nombreuses études ont cherché à identifier l’antigène reconnu et plusieurs candidats ont
été proposés, bien qu’aucun travail n’ait pu mettre en évidence de reconnaissance directe de
ces antigènes. Récemment, les phosphoantigènes ont également été impliqués dans cette
reconnaissance.
Mon équipe d’accueil est multidisciplinaire, avec trois thématiques principales. Deux
d’entres elles sont centrées sur le métabolisme du cholestérol : les mécanismes et récepteurs
impliqués dans son absorption intestinale (thématique dirigée par Xavier Collet), et la
captation hépatique des lipoprotéines de haute densité (HDL). Récemment, les travaux de
Ronald Barbaras et Laurent Martinez ont permis l’identification de l’Ecto-F1-ATPase, une
forme de l’ATP synthase mitochondriale exprimée à la surface des cellules, comme récepteur
majeur le l’apolipoprotéine A-I, protéine majoritaire des HDL, à la surface des hépatocytes.
En collaboration avec ce groupe, la dernière thématique de l’équipe, menée par Eric
Champagne, mon directeur de thèse, a permis d’identifier l’Ecto-F1-ATPase comme antigène
participant à l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par les cellules tumorales. Les données
obtenues montrent que ce complexe enzymatique est capable d’activer spécifiquement ces
cellules et qu’il lie directement leur récepteur antigénique. Cette thèse s’inscrit dans la
poursuite de ces travaux.
L’Introduction Bibliographique sera composée de trois grands chapitres. La première
partie sera dédiée à une vue globale du système immunitaire et particulièrement centrée sur
13
Avant-propos
les lymphocytes T, afin de fournir des éléments utiles pour la compréhension de la biologie de
la sous-population Vγ9/Vδ2. Elle s’achèvera par une description plus détaillée des souspopulations αβ non-conventionnelles qui partagent quelques caractéristiques communes avec
les lymphocytes T γδ.
Le deuxième chapitre proposera une revue des connaissances actuelles sur les lymphocytes T
γδ. Tous les aspects de leur physiologie, de leur développement aux antigènes qu’ils
reconnaissent, seront abordés.
Enfin, l’objet de cette thèse ayant été de mieux comprendre le rôle de l’Ecto-F1-ATPase dans
la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2, la dernière partie de
l’introduction sera dédiée à une brève description de l’ATP synthase mitochondriale. Elle sera
également destinée à présenter un résumé des données récentes sur l’Ecto-F1-ATPase, qui
participe à de nombreuses fonctions cellulaires en plus de son rôle dans l’immunité antitumorale.
La partie Résultats Expérimentaux présentera les données obtenues au cours de cette
thèse. Nous avons tout d’abord cherché à mieux caractériser l’expression de l’Ecto-F1ATPase à la surface d’un nombre important de lignées cellulaires et nous avons montré
qu’elle peut interagir avec les molécules de la famille du CMH-I. Cette interaction entraîne un
masquage d’épitopes de l’Ecto-F1-ATPase, ce qui indique que l’expression de ce complexe à
la surface des cellules peut ne pas être détectée par des méthodes directes. HLA-B, un des
isotypes classiques de CMH de classe I, semble préférentiellement impliqué et responsable
d’une forte inhibition de la stimulation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
Nous avons ensuite étudié les propriétés antigéniques de l’ApppI, un analogue d’ATP
nouvellement décrit et dont la structure est similaire à celle de dérivés nucléotidiques de
phosphoantigènes identifiés dans des extraits mycobactériens. Nos résultats indiquent que
14
Avant-propos
l’ApppI n’est pas un antigène au sens propre du terme puisqu’il n’active pas directement les
lymphocytes T Vγ9/Vδ2. En revanche, il possède des propriétés uniques qui le différencient
des phosphoantigènes classiques et suggèrent que les dérivés nucléotidiques pourraient jouer
un rôle important dans le mécanisme de présentation des phosphoantigènes.
L’ApppI nous a également permis de réconcilier les données impliquant les phosphoantigènes
et l’Ecto-F1-ATPase dans la reconnaissance des cellules tumorales. En effet, nous avons pu
montrer qu’elle est capable de présenter des phosphoantigènes aux lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
Ces données sont également en faveur d’une implication majeure des dérivés nucléotidiques
dans les mécanismes de reconnaissance des phosphoantigènes, puisque l’ApppI est capable de
lier l’ATP synthase de façon stable.
Pour finir, la dernière partie présentera les données obtenues en collaboration avec la
thématique développée par Laurent Martinez sur le métabolisme nucléotidique à la surface
des cellules. Cette collaboration m’a permis de développer des connaissances théoriques et
pratiques sur l’activité enzymatique de l’ATP synthase et s’est avérée utile pour l’étude des
propriétés de l’ApppI. Elle ouvre également des perspectives potentiellement intéressantes
pour l’étude du métabolisme des dérivés nucléotidiques des phosphoantigènes.
Enfin, la partie Discussion et Perspectives sera consacrée à une conclusion générale de
nos résultats, placés dans le contexte des données de la littérature. De futurs travaux, visant à
caractériser de façon plus précise les mécanismes impliqués dans l’expression et la
reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase ainsi que dans la présentation des phosphoantigènes par
ce complexe, seront proposés.
Bonne lecture…
15
16
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I
LE SYSTEME IMMUNITAIRE
D’une vue d’ensemble
aux lymphocytes T non-conventionnels
17
Introduction I : Le système immunitaire
Ce chapitre d’introduction est destiné à offrir une vue globale du système immunitaire. Il
sera concentré sur la description succincte du système immunitaire des vertébrés supérieurs
(les organismes les précédant dans l’évolution ne disposant généralement que de certains de
ses éléments ou de systèmes « primitifs ») et des partenaires cellulaires et moléculaires
participant à son organisation. Il fait intervenir de nombreux organes et une incroyable
diversité de populations cellulaires, qui interagissent avec la totalité des cellules de
l’organisme. Son rôle premier est fondamental : défendre l’organisme (le soi) contre les
agents pathogènes (le non soi), ainsi que l’épurer des cellules stressées, endommagées ou
cancéreuses (le soi modifié). Il participe également au maintien de l’intégrité des tissus en
régulant leur homéostasie. Ses caractéristiques le rendent malheureusement responsable
d’effets secondaires indésirables comme le développement de pathologies telles que les
maladies auto-immunes ou inflammatoires, ainsi que le rejet de greffes. L’objet de cette thèse
étant l’étude d’une sous-population lymphocytaire T non-conventionnelle particulière, les
lymphocytes T Vγ9/Vδ2, nous partirons d’une vision globale et succincte des différentes
composantes du système immunitaire pour finalement atteindre la description plus détaillée
des lymphocytes T non-conventionnels, introduction au chapitre II qui portera sur les
lymphocytes T de type γδ.
1) Généralités
1.1)
Organes et cellules
Les organes impliqués dans la genèse et le fonctionnement du système immunitaire sont
généralement divisés en deux catégories : les organes lymphoïdes primaires (ou centraux) et
secondaires (ou périphériques). Les organes primaires (moelle osseuse et thymus)
correspondent aux lieux de développement et de différenciation des cellules du système
immunitaire alors que les organes secondaires (rate, ganglions lymphatiques et formations
18
Introduction I : Le système immunitaire
lymphoïdes associées aux tissus telles que les amygdales ou les plaques de Peyer) sont des
centres fonctionnels, assurant la rencontre des lymphocytes avec les antigènes et le
développement de la réponse immunitaire dite adaptative.
Les cellules du système immunitaire (Figure 1) comprennent deux lignées majeures
(myéloïde et lymphoïde) et sont séparées en deux groupes fonctionnels, formant l’immunité
innée et l’immunité adaptative. L’immunité innée est caractérisée par une réponse rapide et
directe. C’est la première ligne de défense cellulaire de l’organisme contre les pathogènes et
elle est de ce fait souvent associée aux tissus exposés au milieu extérieur. Elle regroupe les
cellules phagocytaires (telles que les polynucléaires neutrophiles, les monocytes/macrophages
et les cellules dendritiques), les cellules dites « autres » (polynucléaires éosinophiles et
basophiles, mastocytes, cellules Natural Killer ou NK) et enfin les lymphocytes nonconventionnels (Natural Killer T cells ou NKT, lymphocytes T γδ, et les Mucosal Associated
Invariant T cells ou MAIT), même si ces derniers peuvent être considérés comme étant à la
frontière innée / adaptative.
L’immunité adaptative est caractérisée par une réponse plus lente, mais disposant d’une
mémoire, c’est-à-dire que des cellules spécifiques d’un antigène préalablement activées vont
persister, ce qui permettra une réponse plus rapide en cas de nouvelle rencontre avec
l’antigène. La mémoire du système immunitaire est la base de la vaccination. Le système
adaptatif comprend les lymphocytes T αβ (dits conventionnels) et les lymphocytes B.
Il existe de nombreuses interactions entre l’immunité innée et l’immunité adaptative, la
principale étant la capacité de certaines cellules de la première à activer celles de la seconde
via le mécanisme de présentation d’antigènes. Ce mécanisme implique généralement les
phagocytes (macrophages et cellules dendritiques principalement) d’une part, et les
lymphocytes T d’autre part.
19
Introduction I : Le système immunitaire
Figure 1. Les cellules du système immunitaire. Adapté de (1)
Le système immunitaire comporte de très nombreuses sous-populations cellulaires, dont les
principales familles sont décrites ici. En teintes bleues, les membres de la lignée lymphoïde,
en teinte verte, ceux de la lignée myéloïde. A noter que les populations les plus différenciées
de cet arbre comportent également de nombreuses sous-populations différentes pouvant se
distinguer par des phénotypes moléculaires très variés.
Quelques cytokines importantes pour leur différenciation sont mentionnées.
LB : Lymphocyte B, LT : Lymphocyte T, NK : Natural Killer, IL : Interleukine, CSF : Colony
Stimulating Factor (G : Granulocyte, M : Monocyte).
20
Introduction I : Le système immunitaire
1.2)
Molécules fondamentales du système immunitaire : quelques exemples
Le système immunitaire s’appuie sur une grande variété de molécules indispensables à
son fonctionnement. Nous verrons ici quelques exemples principaux pertinents pour les sujets
traités au cours des prochains chapitres, cette liste n’étant bien évidemment pas exhaustive
mais visant à donner une base moléculaire pour la compréhension du fonctionnement général
du système immunitaire.
Les cellules de l’immunité adaptative, ainsi que certaines cellules de l’immunité innée,
sont caractérisées par l’expression de récepteurs dédiés à la reconnaissance de molécules
précises. C’est le cas des lymphocytes B qui expriment un récepteur B à l’antigène (B Cell
Receptor ou BCR) ainsi que des anticorps, et des lymphocytes T exprimant un récepteur T (T
Cell Receptor ou TCR). Ces récepteurs sont extrêmement spécifiques d’un antigène donné et
font l’objet d’une incroyable variabilité. On trouve également des récepteurs moins
spécifiques, appelés Toll-Like Receptors (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires
généraux. Par exemple, certains vont être spécialisés dans la reconnaissance d’ARN viraux,
ou de polymères bactériens. Tous ces récepteurs jouent un rôle central dans l’activation des
cellules du système immunitaire et sont complétés par de nombreux corécepteurs, molécules
d’adhésion, de co-stimulation, etc.
Comme mentionné précédemment, il existe des cellules spécialisées dans la présentation
des antigènes. Ces cellules vont donc capturer un pathogène, et apprêter les antigènes pour les
présenter aux lymphocytes T. Ce mécanisme fait intervenir d’une manière générale des
structures présentatrices, les plus connues et les mieux caractérisées étant les molécules du
Complexe Majeur d’Histocompatibilité « classique ». Ces protéines, regroupées en deux
familles (classe I et classe II) lient des antigènes peptidiques et sont reconnues par le TCR des
21
Introduction I : Le système immunitaire
lymphocytes T αβ conventionnels. Chez l’homme, le CMH-I regroupe les isotypes HLA-A, B, et -C (dits classiques ou CMH-Ia) et -E, -F et -G (non-classiques ou CMH-Ib),
généralement reconnus par le TCR des lymphocytes T cytotoxiques et/ou les NKR (Natural
Killer Receptors) ; le CMH-II regroupe HLA-DP, DQ et DR et il est reconnu par le TCR des
lymphocytes T auxiliaires. Le CMH est extrêmement polymorphe, permettant ainsi au
système immunitaire de réagir contre une grande variété de pathogènes, et d’assurer la survie
globale d’une espèce en permettant à une proportion non négligeable d’une population de se
défendre contre un large spectre de pathogènes. Cette grande variabilité est par ailleurs la
cause principale du rejet de greffe, comme le terme « Histocompatibilité » l’indique.
Les molécules du CMH-I, ainsi que d’autres protéines qui leur sont apparentées, ont
également la propriété de moduler l’activation de la quasi totalité des lymphocytes T
(conventionnels et non-conventionnels) ainsi que des cellules NK, via leur interaction avec
des récepteurs appelés Natural Killer Receptor (ou NKR) qui peuvent transduire des signaux
inhibiteurs ou activateurs selon le récepteur considéré. Par exemple, l’hétérodimère
CD94/NKG2A reconnaît HLA-E et transmet des signaux inhibiteurs. L’absence d’expression
de molécules du CMH-I à la surface d’une cellule étant généralement, hormis cas particuliers,
le signe d’une infection ou d’un « soi modifié » (les virus par exemple ont tendance à inhiber
l’expression de ces molécules pour échapper aux lymphocytes T cytotoxiques), il n’y aura
plus de signaux inhibiteurs ce qui peut favoriser l’activation d’une cellule effectrice. Au
contraire, CD94/NKG2D reconnaît des molécules apparentées au CMH-I et dites « de stress »
telles que MICA/B, et transmet des signaux activateurs. L’activation d’une cellule effectrice
est donc déterminée par le bilan de signaux transmis par une grande variété de récepteurs.
Les cytokines et chimiokines jouent également un rôle central dans l’organisation des
défenses immunitaires. Elles sont regroupées en plusieurs superfamilles (telles que les
22
Introduction I : Le système immunitaire
interleukines, interférons, etc) pouvant compter des dizaines de membres. Elles assurent de
nombreux rôles fondamentaux et indispensables au fonctionnement du système immunitaire :
différenciation et activation cellulaires, migration, communication entre cellules, etc. Les
cytokines sont classées en 2 groupes antagonistes, pro-inflammatoires (Th1) ou antiinflammatoires (Th2), et la plupart des cellules sont spécialisées dans la production d’un seul
de ces groupes. La grande majorité des cytokines a des effets pléiotropes, synergiques et
redondants.
1.3)
Déclenchement de la réponse immunitaire
D’une manière générale, les barrières naturelles de l’organisme protègent contre la très
grande majorité des pathogènes, de manière physique (en s’opposant simplement à leur
entrée), biochimique (pH, enzymes) ou biologique (par exemple, la présence d’une flore
microbienne naturelle, non pathogène, limite le développement de populations pathogènes par
simple compétition pour les ressources disponibles). Les réponses rapides et à large spectre,
bien que peu spécifiques, des cellules de l’immunité innée contrôlent ensuite la majorité des
pathogènes ayant pénétré les barrières mentionnées précédemment.
En cas d’échec de ces deux systèmes, la réponse immunitaire adaptative va se déclencher.
Elle implique de nombreux acteurs et se déroule en plusieurs phases précises et ordonnées
aboutissant à l’activation, la prolifération et la mise en route des fonctions effectrices de
cellules spécifiques du pathogène ciblé, les lymphocytes T et B (Figure 2).
La peau et les muqueuses sont colonisées par de nombreuses cellules dendritiques résidant en
permanence dans ces tissus, dans un état immature. L’entrée d’un pathogène déclenche
rapidement une réponse inflammatoire locale se traduisant par l’expression de molécules
d’adhésion
par
l’endothélium
vasculaire,
23
de
chimiokines
et
de
cytokines.
Introduction I : Le système immunitaire
Figure 2. Vue générale de la réponse immunitaire. Adapté de (1)
(1) Une cellule dendritique (CD) capture un pathogène et migre vers un ganglion lymphatique
proche, en passant d’un phénotype phagocytaire à « présentateur ».
(2) La CD active les lymphocytes T (LT). Les CD8 migrent vers la zone infectée, comme les
CD4 qui participent également à l’activation des lymphocytes B (LB). Ces derniers sortent
du follicule primaire (zone B) après reconnaissance et phagocytose du pathogène pour
rencontrer les LT CD4 de même spécificité, puis y retournent pour finir leur
différenciation et sécréter des anticorps.
(3) Les lymphocytes atteignent la zone infectée balisée par des molécules d’adhésion et un
gradient de cytokines et chimiokines. Les CD8 détruisent les cellules infectées, les CD4
participent à l’activation des macrophages. Les anticorps neutralisent les pathogènes, et
facilitent leur élimination via la phagocytose ou le complément.
24
Introduction I : Le système immunitaire
Dès qu’une cellule dendritique capture un pathogène, elle migre vers le ganglion
lymphatique le plus proche et effectue sa maturation au cours de son trajet. Les protéines du
pathogène seront clivées en peptides courts chargés sur les molécules du CMH. Ainsi, la
cellule dendritique activera les lymphocytes T naïfs qui vont proliférer et exprimer des
récepteurs pour certaines chimiokines et molécules d’adhésion, leur permettant de migrer vers
le lieu de l’infection et de traverser l’endothélium pour éliminer les pathogènes.
Les lymphocytes B quant à eux peuvent être activés soit par les lymphocytes auxiliaires
exprimant le corécepteur CD4, soit par des antigènes solubles, polymériques, dits « thymoindépendants » (car ne nécessitant pas l’intervention des lymphocytes T). Ils comprennent eux
aussi diverses sous-populations qui ne seront pas détaillées ici. Ils sécrèteront les anticorps à
distance du site d’infection, en restant dans les organes lymphoïdes secondaires.
Cette description succincte de la réponse immune est bien évidemment très simplifiée et
restreinte aux phénomènes principaux. Elle fait intervenir de nombreux autres types
cellulaires et des mécanismes bien plus variés et complexes.
2) Les lymphocytes T
Quel que soit leur sous-type, tous les lymphocytes T sont caractérisés par l’expression du
TCR, qui ne se limite pas au récepteur antigénique seul, mais comprend également les
molécules de signalisation γ, δ, ε et ζ formant le complexe CD3 (Figure 3). Le type de
récepteur antigénique (αβ ou γδ), l’expression (ou non) des corécepteurs CD4 ou CD8, ainsi
que d’autres récepteurs, détermine le sous-type général ainsi que les fonctions d’un
lymphocyte T donné. On sépare cette population en deux groupes, les lymphocytes T
conventionnels (αβ), et les lymphocytes T non-conventionnels qui comprennent les
lymphocytes T γδ, ainsi que les lymphocytes αβ de type NKT et les MAIT.
25
Introduction I : Le système immunitaire
Figure 3. Structure générale du TCR : Exemple du TCR αβ d’un lymphocyte T CD8+
On parle souvent du TCR comme étant l’association de deux chaînes αβ ou γδ, mais le TCR
dans son ensemble comprend également les sous-unités CD3 (γ, δ, ε et ζ) portant des motifs
de type ITAM et participant à la transduction du signal, en association avec de nombreuses
kinases. Le TCR peut être également couplé (en fonction du type de lymphocyte T considéré)
à un corécepteur de type CD4 ou CD8 renforçant l’interaction avec le CMH (de classe II ou I,
respectivement).
Ici, le TCR d’un lymphocyte T CD8 reconnaît un peptide antigénique (en rouge) présenté par
le CMH-I composé d’une chaîne lourde (CL) formée de trois domaines immunoglobuliniques
α1, α2 et α3, et de la beta-2-microglobuline (β2m).
Le corécepteur CD8 interagit avec le domaine α3 (très conservé) tandis que le TCR reconnaît
à la fois le peptide antigénique et les domaines α1 et α2 (présentant une importante
variabilité) du CMH-I via des domaines appelés boucles CDR pour Complementarity
Determining Region (CDR3 pour le peptide et CDR1 et 2 pour le CMH-I). La chaîne α du
TCR reconnaît le domaine α2 du CMH-I ; la chaîne β, le domaine α1.
Encadré : structure tridimensionnelle du complexe TCR / CMH-I. Vert : CMH-I, Jaune :
Peptide, Bleu et Rose : Chaînes β et α du TCR (2).
Les populations non-conventionnelles faisant l’objet de la section suivante, nous nous
concentrerons ici sur des généralités sur les lymphocytes T et sur les sous-populations de
lymphocytes T conventionnelles αβ.
26
Introduction I : Le système immunitaire
2.1)
Développement
Les lymphocytes T se développent dans le thymus, à partir de progéniteurs lymphoïdes
pluripotents (ETP, Early T cell Progenitors) provenant de la moelle épinière ou du foie. Ils
sont appelés thymocytes une fois qu’ils sont entrés dans le cortex thymique, et qualifiés de
Double Négatifs (DN) à ce stade car ils n’expriment pas les corécepteurs CD4 et CD8. Ce
développement s’effectue par étapes clés, comprenant deux points de contrôle majeurs, les
sélections positive et négative, pour former un répertoire T efficace et tolérant, c’est-à-dire
qu’il ne doit pas reconnaître le « soi » comme étranger.
L’évènement initiant la différenciation des thymocytes est le réarrangement des gènes du
TCR. Ces gènes sont morcelés et se composent de très nombreux segments géniques,
appartenant à plusieurs groupes : V (Variable), D (Diversité), J (Jonctionnel) et C (Constant).
Cette propriété est identique pour les TCR αβ ou γδ (les segments D n’existant néanmoins
que pour les chaînes β et δ), et le BCR (et par extension les immunoglobulines). Les gènes du
TCR étant morcelés, leur expression nécessite un mécanisme de remodelage génique
irréversible particulier et unique aux gènes des récepteurs antigéniques, appelé recombinaison
somatique (Figure 4). Dans tous les cas, elle fait intervenir les recombinases RAG-1 et -2
(Recombination Activating Gene) qui vont aléatoirement assembler un gène fonctionnel à
partir d’un segment V, D, et J, dans l’ordre D+J puis V+DJ (ou V+J directement pour les
chaînes α et γ). Le segment C ainsi que le peptide signal (L) seront quant à eux assemblés aux
autres segments par épissage après la transcription (3). Ce processus étant aléatoire et basé sur
une grande variété de segments géniques (Tableau 1), il permet d’obtenir une incroyable
diversité de TCR différents. D’autres processus de la recombinaison introduisent une
variabilité supplémentaire, en ajoutant ou en retirant des nucléotides au niveau des jonctions
entre les segments V, D et J.
27
Introduction I : Le système immunitaire
Figure 4. Structure et recombinaison d’un locus TCR : Exemple de la chaîne β.
Adapté de (1)
Les recombinases RAG 1 et 2 effectuent la recombinaison des gènes du TCR dans l’ordre
indiqué. Les autres segments J, D et C ainsi que les introns sont éliminés par épissage. Au
niveau des jonctions, des endonucléases ainsi que des ADN polymérases et la Terminal
deoxyribonucleotidyl Transferase (TdT) retirent ou ajoutent respectivement des nucléotides,
ce qui contribue à la variabilité du TCR. Les segments sont assemblés aléatoirement et toutes
les combinaisons sont possibles, bien que ne codant pas forcément pour un TCR fonctionnel.
Locus
Localisation chromosomique
V
D
J
C
α
14q11.2 *
54 **
0
61
1
β
7q34
64-67
2
14
2
γ
7p14
12-15
0
5
2
δ
14q11.2 *
8 **
3
4
1
Tableau 1. Organisation des loci TCR
Ce tableau récapitule le nombre de segments géniques pour chaque locus TCR.
* Le locus δ est situé dans le locus α ** 5 segments V sont communs aux loci α et δ
Source : Base de données de l’IMGT (système d’information en ImMunoGénéTique)
28
Introduction I : Le système immunitaire
Une fois la recombinaison de la chaîne β effectuée, elle sera exprimée en surface avec une
chaîne α provisoire et invariante (appelée pTα) et les thymocytes vont également exprimer les
deux corécepteurs CD4 et CD8 ; ils seront alors qualifiés de « Double Positifs » (DP). Le
réarrangement chromosomique de la chaîne α va ensuite avoir lieu, et les thymocytes
pourront alors subir les sélections positive puis négative (Figure 5).
La sélection positive, qui se déroule également dans le cortex thymique, fait intervenir des
cellules épithéliales qui vont présenter des peptides du soi aux thymocytes. Cette étape va
permettre d’une part de déterminer si le TCR exprimé reconnaît le CMH de classe I (auquel
cas le thymocyte deviendra CD8+CD4-) ou de classe II (CD8-CD4+) mais aussi d’éliminer les
cellules incapables de reconnaître le CMH (4).
La sélection négative va quant à elle se faire au niveau de la medulla et implique des cellules
présentatrices d’antigènes spécialisées (macrophages, cellules dendritiques, et cellules
épithéliales thymiques). Elle permet l’élimination des thymocytes exprimant un TCR
reconnaissant des peptides du soi, qui représenteraient un danger pour l’organisme en étant
activés par des cellules normales. A la différence de la sélection positive, la mort des cellules
T auto-réactives au cours de la sélection négative est donc un processus actif (5).
Une fois ces points de contrôle passés, les lymphocytes T matures vont sortir du thymus grâce
à l’expression du marqueur de surface S1P1 et entrer dans la circulation sanguine puis
lymphatique (6). Ils vont circuler en permanence entre les différents ganglions lymphatiques
de l’organisme, jusqu’à rencontrer un antigène présenté par une cellule dendritique. Ils
exprimeront alors des récepteurs aux chimiokines différents leur permettant d’atteindre le site
de l’infection, tandis qu’ils perdront l’expression du récepteur CCR7, récepteur principal de la
migration vers la zone T des ganglions lymphatiques.
29
Introduction I : Le système immunitaire
Figure 5. Principales étapes du développement des lymphocytes T et sélection thymique.
(1) Les cellules souches hématopoïetiques destinées à se différencier en lymphocytes T (Early
T cell Progenitors ou ETP) entrent dans le thymus à la jonction cortico-médullaire. Les
thymocytes transitent à travers le cortex thymique en passant par les divers stades DN au
cours desquels les gènes du TCR sont réarrangés, pour aboutir au stade DP.
(2) Les thymocytes DP traversent alors un réseau de cellules épithéliales pour subir la
sélection positive, les cellules incapables de reconnaître le CMH étant éliminées car elles
ne reçoivent pas de signaux de survie.
(3) Les thymocytes passent alors au stade SP (Simple Positif, CD4 ou CD8) et migrent dans
la medulla où ils interagissent avec des cellules présentatrices d’antigènes spécialisées
(cellules dendritiques, macrophages…) pour passer la sélection négative, ceux
reconnaissant le complexe peptide/CMH trop fortement étant éliminés.
(4) Enfin, les lymphocytes T terminent leur maturation environ quatre jours après l’entrée
dans la medulla et quittent le thymus via la circulation lymphatique ou sanguine grâce à
l’expression du marqueur S1P1.
Adapté de (6).
2.2)
Les sous-populations T conventionnelles
Comme mentionné précédemment, les lymphocytes T αβ conventionnels sont séparés en
fonction du corécepteur qu’ils expriment (CD4 ou CD8) en deux groupes, qui sont dédiés à la
reconnaissance d’une classe de CMH donnée (II ou I respectivement). L’expression de ces
30
Introduction I : Le système immunitaire
corécepteurs est indispensable car elle renforce entre autres rôles l’interaction entre le TCR et
le CMH.
Les lymphocytes T αβ CD4+ reconnaissent des peptides antigéniques présentés par le
CMH de classe II, provenant de protéines produites par des pathogènes extracellulaires. Ces
lymphocytes, qualifiés d’auxiliaires (ou helpers) participent à la réponse immunitaire en
modulant l’activation des autres populations via la sécrétion de cytokines. Ils peuvent par
exemple stimuler l’activation des macrophages ou participer à la différenciation des
lymphocytes B en plasmocytes sécrétant des anticorps.
Ils sont également classés en sous-populations en fonction du type de cytokines qu’ils
produisent, appelées Th1 (généralement pro-inflammatoires comme l’IFN-γ), ou Th2
(généralement anti-inflammatoires comme l’IL-4). Ces deux sous-populations s’antagonisent,
c’est-à-dire que les cytokines produites par les Th1 inhibent la différenciation des Th2, et
inversement (7). Cette caractéristique fait qu’une réponse immunitaire est généralement très
polarisée. Les lymphocytes T CD4+ Th1 activent généralement les macrophages, les
neutrophiles (stimulation de la phagocytose) et les lymphocytes T CD8+, donc favorisent
plutôt une réponse contre les pathogènes intracellulaires. Les lymphocytes T CD4+ Th2
activent plutôt les réponses dirigées contre les pathogènes extracellulaires, via les
lymphocytes B, les éosinophiles et les mastocytes.
Plus récemment, une nouvelle sous-population, les lymphocytes Th17, a été identifiée.
Leur développement est distinct et antagonisé par celui des sous-types Th1 et Th2. Ils
sécrètent entre autres cytokines de l’IL-17, interviennent dans les réponses inflammatoires et
participeraient également au développement de pathologies liées au système immunitaire,
mais leur rôle exact est toutefois encore très mal connu (8, 9).
31
Introduction I : Le système immunitaire
Enfin, il existe un autre type distinct de lymphocytes T CD4+, appelés Treg (pour régulateurs),
caractérisés par une forte expression du marqueur CD25 et par le facteur de transcription
FoxP3 qui leur est spécifique (10, 11). Ces lymphocytes jouent un rôle dans l’induction de la
tolérance périphérique (complétant la tolérance centrale mise en place par la sélection des
lymphocytes T dans le thymus) et pourraient être un outil utile dans le traitement de l’allergie,
ou pour prévenir le rejet de greffe. Ces lymphocytes sont par ailleurs probablement impliqués
dans le développement tumoral, en inhibant les réponses immunitaires dirigées contre les
cellules cancéreuses (12). Les lymphocytes Th17 et Treg pourraient également présenter des
liens fonctionnels importants mais encore mal connus (13).
De nombreux pathogènes intracellulaires sont capables d’échapper à la destruction directe
après leur phagocytose par les cellules de l’immunité innée. Le seul moyen d’éliminer ces
pathogènes est donc de détruire la cellule infectée. Ce rôle est rempli en grande partie par les
lymphocytes T CD8+ (dits cytotoxiques), qui sont pourvus d’une machinerie de lyse
cellulaire, le système perforine/granzyme. Les protéines le composant sont stockées dans des
vésicules dérivées des lysosomes dont le contenu est exocyté par les lymphocytes après
reconnaissance du peptide dont ils sont spécifiques, présenté par le CMH de classe I. Le
système perforine/granzyme conduit au final à une activation des caspases et donc à
l’apoptose des cellules ciblées. Les lymphocytes T CD8+ sont également capables d’induire
l’apoptose en exprimant FasL, qui active son récepteur Fas s’il est exprimé par la cellule cible
(14). Ces lymphocytes sécrètent également de nombreuses cytokines pro-inflammatoires
telles que l’IFN-γ favorisant donc la réponse dirigée contre les pathogènes intracellulaires.
Pour finir, les lymphocytes T CD8+ disposent eux aussi d’une sous-population régulatrice
encore mal caractérisée, dont le rôle serait d’éliminer les lymphocytes T CD4+ auto-réactifs
(15).
32
Introduction I : Le système immunitaire
Cette description des lymphocytes T conventionnels, bien que très résumée, montre leur
rôle central dans la réponse immunitaire ainsi que leur grande diversité. Ils sont souvent
considérés comme les chefs d’orchestre du système immunitaire de par leur capacité à
communiquer avec les autres populations mais aussi à réguler leur activation ou leur
différenciation en sécrétant de très nombreuses cytokines. Les lymphocytes T comptent
également dans leurs rangs des populations particulières qualifiées de non-conventionnelles,
plus rares, mais jouant un rôle extrêmement important au sein du système immunitaire.
3) Les lymphocytes T non-conventionnels
On regroupe dans les lymphocytes T dits « non-conventionnels » des sous-populations
lymphocytaires se situant à la frontière entre immunité innée et adaptative. Elles possèdent en
effet des caractéristiques des deux systèmes, et représentent un pont fonctionnel important
entre les deux composantes du système immunitaire. Ces lymphocytes comprennent des souspopulations très différentes, mais possédant un certain nombre de caractéristiques communes
les démarquant nettement des lymphocytes T αβ classiques : ils sont souvent oligoclonaux ; la
reconnaissance d’antigènes (qui ne sont d’ailleurs pas de nature peptidique, hormis dans des
cas très rares et particuliers) par ces lymphocytes n’est pas restreinte par le
CMH « classique » ; enfin ils sont très souvent associés à différents tissus déterminés par le
type de récepteur T qu’ils expriment. L’ensemble des sous-populations T exprimant un TCR
de type γδ fait partie des lymphocytes T non-conventionnels. Chez les lymphocytes T αβ, on
trouve les NKT (Natural Killer T cells) ainsi que les MAIT (Mucosal Associated Invariant T
cells), découvertes plus récemment.
33
Introduction I : Le système immunitaire
3.1)
Les lymphocytes NKT
Décrits pour la première fois au milieu des années 80, ces lymphocytes T expriment un
marqueur originellement identifié sur les cellules NK (d’où leur nom) : NK1.1 (aussi appelé
NKRP1 ou CD161). Ces lymphocytes ont un phénotype Double Négatif ou CD4+ (et plus
rarement CD8+ mais chez l’homme uniquement) présentant des fonctions légèrement
différentes, notamment au niveau de leur profil d’expression de cytokines.
Les NKT se développent dans le thymus probablement à partir du stade DP, selon le même
schéma que les T conventionnels. En revanche, il est généralement admis que les NKT
quittent le thymus avec un phénotype activé, exprimant des marqueurs de cellules mémoire.
Cette caractéristique pourrait être en relation avec leur capacité à effectuer des réponses très
rapides.
Les lymphocytes NKT sont relativement rares (moins de 1% des lymphocytes T matures
totaux) et sont concentrés préférentiellement au niveau de certains tissus tels que le foie ou la
rate. Ils ont généralement un rôle régulateur, en sécrétant très rapidement une large variété de
cytokines (de type Th1 comme l’IFN-γ mais aussi de type Th2 comme l’IL-4). Bien qu’ils
expriment des marqueurs des cellules NK et soient dans certains cas capables d’effectuer des
réponses cytotoxiques, il ne semble pas que ce soit leur fonction effectrice principale (16).
La sous-population NKT la mieux connue à l’heure actuelle est dite de type I et appelée iNKT
(i pour invariant). Elle exprime un TCR comportant toujours une chaîne α du TCR porteuse
d’un segment variable Vα14 chez la souris, et Vα24 chez l’homme. La chaîne β est quasi
exclusivement de type Vβ11 chez l’homme et de type Vβ2, 7 ou 8 chez la souris (17, 18).
Chez l’homme, ces lymphocytes reconnaissent la molécule CD1d qui est apparentée au
CMH-I et associée à la beta-2-microglobuline. Cette molécule est principalement exprimée
sur les cellules présentatrices d’antigènes ainsi que les hépatocytes et diverses cellules
34
Introduction I : Le système immunitaire
épithéliales. Les autres membres de la famille CD1 (a, b, c et e) forment un groupe distinct
(groupe 1) et seraient eux reconnus par des lymphocytes T αβ conventionnels ainsi que
certaines sous-populations γδ, exception faite de CD1e qui n’est pas exprimé en surface et
participerait au chargement des lipides sur les autres molécules du groupe 1. Chez la souris il
n’existe que deux gènes CD1 (1.1 et 1.2), orthologues de CD1d dérivant probablement d’un
même gène ancestral dupliqué (19).
Contrairement au CMH-I classique, CD1d présente des antigènes de nature glycolipidique qui
peuvent être exogènes (issus de pathogènes) ou endogènes. L’antigène le plus couramment
utilisé pour stimuler ces cellules est l’α-galactosylcéramide, qui n’est pas un antigène
« naturel » dans le sens où il est produit par une éponge marine. Il a néanmoins permis une
avancée considérable des connaissances sur les lymphocytes NKT. Cet antigène était à
l’origine utilisé pour ses propriétés anticancéreuses, mais ce n’est que plus tardivement que sa
capacité à activer les lymphocytes NKT a été découverte (20).
Récemment, le mécanisme de présentation des antigènes glycolipidiques par CD1d a été
caractérisé plus précisément (Figure 6). Il fait intervenir deux voies distinctes en fonction du
type d’antigène considéré. Dans le cas des antigènes endogènes, il fait intervenir la
Microsomal triglycéride transfer Protein (MttP), une enzyme classiquement impliquée dans le
transfert de lipides sur l’apolipoprotéine B (la protéine majoritaire des lipoprotéines de basse
densité ou LDL). Cette protéine charge l’antigène sur la molécule CD1d au niveau du
Réticulum Endoplasmique (21, 22). Dans le cas des antigènes exogènes, il se déroule au
niveau des endosomes tardifs et fait intervenir les saponines (23).
35
Introduction I : Le système immunitaire
Figure 6. Les deux voies de présentation antigénique par CD1d.
Une fois entré dans le Réticulum Endoplasmique (RE), CD1d peut soit être chargé avec un
antigène endogène par la MttP (Microsomal triglycéride transfer Protein) et être exprimé
directement en surface (voie de gauche), soit lier la chaîne invariante Ii et être adressé dans les
endosomes, où il sera chargé avec un antigène exogène par une saponine (voie de droite).
Dans ce dernier cas, les antigènes ont été transportés par l’apolipoprotéine E (apoE),
internalisée majoritairement via le récepteur aux LDL (LDLR).
Ce double mécanisme rappelle la présentation d’antigènes par les CMH de classe I et II. Il n’y
a à l’heure actuelle aucune donnée précisant si ces deux voies de présentation parallèles
activent plus particulièrement des sous-types de lymphocytes NKT différents.
Ag : Antigène ; exo. : exogène ; endo. : endogène ; CPA : Cellule Présentatrice d’Antigène.
De plus, CD1d peut interagir avec la chaîne invariante Ii, classiquement impliquée dans la
biogenèse des complexes peptides/CMH-II, ce qui permet son routage au niveau des
endosomes (24). Par ailleurs, l’apolipoprotéine E (apoE) a récemment été montrée comme
étant impliquée dans le mécanisme de capture d’antigènes glycolipidiques par les cellules
présentatrices d’antigènes (25). Ce rôle de l’apoE dans l’activation des NKT est relativement
paradoxal. En effet, de nombreux travaux ont démontré une forte implication des NKT dans le
développement de l’athérosclérose, chez des souris invalidées pour l’apoE (26), un modèle
classique d’étude de l’athérosclérose chez la souris. Ceci apparaît donc contradictoire avec le
fait que cette apolipoprotéine participe à leur activation. Une hypothèse possible est que
36
Introduction I : Le système immunitaire
l’accumulation de lipides « exogènes » dans les macrophages, un des processus initiateurs de
la pathologie, pourrait entraîner une forte activation des NKT, de manière indépendante de
l’apoE.
Généralement, les lymphocytes NKT jouent un rôle protecteur dans de nombreux
processus physiopathologiques, notamment certaines pathologies auto-immunes comme le
diabète de type I (27). En revanche, ils ont tendance à exacerber l’athérosclérose (28). Ils
influencent également le développement des tumeurs, avec des effets différents en fonction du
sous-type de lymphocytes NKT considéré (29). Généralement, les NKT de type I ont des
fonctions anti-tumorales. Les NKT de type II, exprimant un TCR plus diversifié (30),
favoriseraient plutôt le développement des tumeurs. Leurs rôles exacts sont encore très mal
connus, et ils s’opposeraient en général à ceux des NKT de classe I (31). Cette population est
elle aussi restreinte par CD1d mais ne reconnait pas l’α-galactosylcéramide (32).
3.2)
Les lymphocytes MAIT
Population non-conventionnelle la plus récemment découverte, ces lymphocytes de type
αβ ressemblent beaucoup aux lymphocytes NKT. Ils expriment en effet un TCR peu
diversifié (Vα19 chez la souris, Vα7.2/Jα33 chez l’homme) et reconnaissent une molécule
apparentée au CMH-I, MR1 (MHC-Related molecule 1). Ils sont situés quasi exclusivement
au niveau de la lamina propria de l’intestin. Leur phénotype peut être DN, CD8+, voire CD4+
mais de façon beaucoup plus rare (33).
Le développement des cellules MAIT reste encore très mal caractérisé. Elles sont absentes
chez les souris nude (athymiques), et sont très peu nombreuses dans le thymus. En revanche,
l’expression de MR1 par les cellules épithéliales thymiques ne semble pas requise. Son
expression sur les lymphocytes B est probablement importante pour l’accumulation des MAIT
dans l’épithélium intestinal, ainsi que la présence d’une flore commensale. Ces deux éléments
37
Introduction I : Le système immunitaire
ne semblent pas indispensables à la sélection thymique de ces cellules, dont le développement
est probablement régulé par d’autres populations intra-thymiques d’origine hématopoïétique.
Pour finir, et contrairement aux NKT, les MAIT sortent du thymus avec un phénotype naïf, et
n’acquièrent un phénotype mémoire qu’après avoir atteint l’intestin, probablement après
contact avec certains lymphocytes B et la flore commensale (33).
Le mécanisme global de l’activation des MAIT par MR1 est encore très peu caractérisé.
Des travaux récents indiquent que, de la même façon que pour CD1d et les NKT, une
surexpression de MR1 est suffisante pour activer les MAIT, ce qui indique que l’antigène
présenté peut être endogène (34). Il faut par ailleurs noter que jusqu’à présent, une telle
surexpression artificielle est requise pour permettre la détection de MR1 à la surface des
cellules. Par ailleurs, cette expression ne semble être dépendante d’aucune molécule
classiquement impliquée dans les mécanismes de présentation antigénique, telle que TAP (un
transporteur important les peptides antigéniques dans le RE pour leur chargement sur le
CMH-I) ou la chaîne invariante Ii. En revanche, la chaîne Ii et HLA-DM (une molécule de
CMH-II non-classique ne présentant pas de peptides mais qui participe elle aussi à
l’expression du CMH-II) jouent un rôle important pour l’activation des MAIT, probablement
en facilitant le trafic de MR1 dans les endosomes tardifs, qui devraient donc être le lieu où
MR1 rencontre son ligand (35). Il apparaît donc que deux voies d’adressage existent, comme
pour CD1d, mais pour MR1 la voie Ii-indépendante ne semble pas être impliquée dans la
présentation antigénique. La nature de l’antigène présenté par MR1 est toujours totalement
inconnue. L’analyse de la poche peptidique de MR1 indique qu’elle est beaucoup plus
hydrophile que celle de CD1d (36), donc plus proche du CMH-I classique et lierait à priori
plutôt un peptide, bien que des travaux récents indiquent que des antigènes glycolipidiques
sont capables d’activer les MAIT (37).
38
Introduction I : Le système immunitaire
Au niveau de leur fonction, les cellules MAIT sont encore assez énigmatiques. Elles
seraient probablement des cellules de type régulateur. Des travaux récents suggérent qu’elles
pourraient participer au contrôle de la production des anticorps de type IgA (38) qui sont
associés aux muqueuses. Ceci est en accord avec le fait que les MAIT interagissent avec les
lymphocytes B et siègent principalement au niveau de l’intestin. Par ailleurs, ces cellules
auraient un rôle dans les pathologies auto-immunes inflammatoires, comme suggéré par des
travaux récents sur l’EAE (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) chez la souris (39),
modèle d’étude pour la sclérose en plaque chez l’homme.
A l’heure actuelle, les lymphocytes MAIT sont donc probablement, avec les lymphocytes T
γδ, une des populations T les moins bien connues.
39
40
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE II
LES LYMPHOCYTES T γδ
Des lymphocytes à part
et toujours méconnus
41
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Découverts il y a maintenant 25 ans suite au clonage du gène de la chaîne γ du TCR (40),
ces lymphocytes restent pourtant extrêmement méconnus, particulièrement chez l’homme. Ils
représentent la sous-population non-conventionnelle T la plus diversifiée, comprenant de
nombreux sous-types cellulaires caractérisés par l’expression de TCR distincts. Ce chapitre
sera dédié à une revue la plus complète possible des données actuelles. Le compartiment γδ
étant extrêmement diversifié, il est important de garder en mémoire que les caractéristiques
décrites ici ne s’appliqueront pas forcément à l’ensemble des sous-populations.
1) Généralités
Comme leur nom l’indique, les lymphocytes T γδ expriment un TCR composé d’une
chaîne γ et d’une chaîne δ, associées comme pour les lymphocytes T αβ au complexe CD3. A
l’instar des NKT et des MAIT, ils sont généralement associés à des tissus bien déterminés, et
ce en fonction des régions variables du TCR qu’ils expriment. Par exemple, dans le sang
périphérique humain, on trouve majoritairement des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, alors que les
lymphocytes T de type Vδ1 sont concentrés dans les tissus. Chez la souris, l’épiderme est
quasi exclusivement colonisé par les lymphocytes T Vγ5/Vδ1, l’épithélium utérin par les
Vγ6/Vδ1, etc. Cette spécificité tissulaire est d’ailleurs beaucoup plus marquée chez la souris
que chez d’autres espèces. Les loci codant pour les chaînes γ et δ du TCR comportent
globalement la même organisation et présentent les mêmes mécanismes de recombinaison que
les loci α et β, avec toutefois quelques particularités. Globalement, on considère que la
diversité combinatoire potentielle du TCR γδ, malgré un nombre beaucoup plus restreint de
segments géniques (voir Tableau 1, p.28), est plus élevée que celle du TCR αβ. En effet la
recombinaison peut associer plusieurs segments D, ce qui n’est pas le cas pour le TCR αβ. La
diversité du TCR γδ est donc concentrée au niveau du CDR3. Toutefois, la variabilité
42
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
effective du TCR des lymphocytes T γδ matures est plus restreinte, ce qui est probablement
dû à des évènements de sélection thymique et périphérique intensifs. La structure
tridimensionnelle du TCR γδ, bien que similaire à celle du TCR αβ, comporte également des
différences intéressantes mais dont la signification reste une question ouverte. Par exemple,
l’angle formé par les domaines V et C est beaucoup plus prononcé pour le TCR γδ (Figure 7).
Pour finir, le répertoire du TCR γδ est également biaisé. En effet, on trouve quasiexclusivement des associations préférentielles entre des chaînes γ et δ particulières, comme
Vγ9 avec Vδ2 chez l’homme, ou Vγ5 avec Vδ1 chez la souris.
Figure 7. Comparaison des structures tridimensionnelles des TCR γδ et αβ.
L’angle formé par les domaines V et C est beaucoup plus prononcé pour le TCR γδ, ce qui le
rapproche d’une immunoglobuline. Il s’agit ici d’un TCR humain de type Vγ9/Vδ2 (clone
G115). La surface du TCR γδ est également plus irrégulière avec certaines boucles CDR
(flèches) plus prononcées ce qui suggère que le TCR γδ (au moins pour cet exemple de TCR)
reconnaît une structure très différente du CMH, qui a une surface plate (Figure 3 p. 26).
Tiré de (41).
Les lymphocytes T γδ ont donc quelques traits en communs avec les lymphocytes T αβ
mais représentent une population bien à part qui a divergé il y a plusieurs millions d’années
(on les retrouve chez les requins) et poursuivi une évolution indépendante et constante
43
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
marquée par l’émergence des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 chez les primates « supérieurs ». Ils
sont extrêmement diversifiés, tant au niveau phénotypique que fonctionnel, ce qui ne facilite
pas leur étude. En effet, contrairement aux autres lymphocytes T, il semble exister
d’importantes différences entre les lymphocytes T γδ murins et humains. Par exemple, il ne
semble pas exister d’équivalent des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, sous-population γδ humaine
majeure et caractérisée par sa capacité à répondre à des antigènes particuliers (voir section 5.2
de ce chapitre, p.67), chez d’autres espèces à l’exception de certains primates non-humains.
De plus, un nombre restreint de ligands des TCR γδ a été identifié. Bien qu’ils fassent l’objet
de nombreuses études et que leur découverte précéde celle des autres sous-populations T non
conventionnelles, il est donc clair qu’à tous les niveaux, ces lymphocytes restent largement
méconnus.
2) Développement : la priorité aux lymphocytes T γδ.
Les connaissances actuelles sur le développement des lymphocytes T γδ sont beaucoup
plus limitées que celles acquises sur les lymphocytes T αβ. Les lymphocytes T γδ dérivent
des mêmes progéniteurs que les lymphocytes T αβ et effectuent eux aussi leur maturation
dans le thymus. Leur développement est le plus précoce et se déroule par vagues successives
(au moins chez la souris), correspondant à l’émergence de sous-populations exprimant un
TCR particulier qui vont résider dans des tissus déterminés. Les lymphocytes T γδ exprimant
un TCR Vγ5/Vδ1 (aussi appelés Dendritic Epidermal T Cells ou DETC) sont les premiers à
quitter le thymus et migrent vers la peau, entre les jours 14 et 17 du développement
embryonnaire (E14 à E17) (42). Ils sont suivis par les Vγ6 (poumon, utérus, cavité buccale),
puis les Vγ4 (poumons et périphérie) et enfin les Vγ1 (périphérie). Ce développement par
vagues successives semble exister chez l’homme et serait dû à un changement précoce de
potentialité des progéniteurs (43). Les lymphocytes T Vγ7 résident quant à eux dans l’intestin
44
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
et pourraient se développer en dehors du thymus au niveau de structures lymphoïdes
intestinales appelées cryptopatches. Cette particularité a été décrite pour des souris
athymiques (44) mais pourrait être le résultat d’un mécanisme d’adaptation, aucune activité
du promoteur de la recombinase RAG-2 n’ayant été détectée dans l’intestin de souris
normales (45).
Comme mentionné précédemment (Chapitre I, section 2.1, p.27), les thymocytes ont
d’abord un phénotype DN, c’est-à-dire n’exprimant pas les corécepteurs CD4 ou CD8. Ce
phénotype regroupe quatre phases successives de différenciation dinstinguées par l’expression
des marqueurs CD44 et CD25 (DN1 : CD44+CD25-, DN2 : CD44+CD25+, DN3 : CD44CD25+, DN4 : CD44-CD25-). La scission entre les lignages γδ et αβ s’effectue au stade DN3
(46), après la recombinaison des loci γ, δ et β, initiée au stade DN2 (Figure 8). L’expression
d’un TCR γδ fonctionnel détermine l’orientation d’un thymocyte DN3 vers le lignage γδ ; la
différenciation en lymphocyte T αβ pourrait donc être vue comme une « voie de secours ».
Contrairement aux lymphocytes T αβ, la majorité des lymphocytes T γδ ne va en revanche
pas exprimer les corécepteurs CD4 et CD8 au cours de cette différenciation.
Les lignages γδ et αβ se distinguent par l’expression de gènes différents (47), comme certains
facteurs de transcription tels que la famille Notch, dont le rôle reste assez obscur et complexe
(48). Néanmoins Notch1 n’est pas indispensable pour le développement des lymphocytes T γδ
(49), contrairement à celui des αβ. Inversement, l’expression de Sox13 serait favorable au
développement du lignage γδ au détriment des αβ (50). Cette apparente opposition entre
lymphocytes T αβ et γδ est néanmoins nuancée par des phénomènes de trans-régulation.
45
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Figure 8. Développement des lymphocytes T : La scission γδ / αβ.
L’orientation vers le lignage γδ versus αβ est déterminée au stade DN3, après expression du
TCR γδ. La sélection des lymphocytes T γδ est encore mal connue et pourrait dépendre des
sous-populations considérées. Néanmoins en fin de différenciation les lymphocytes T γδ
présentent un répertoire limité et biaisé, composant des sous-populations distinctes et bien
déterminées ayant des fonctions et des localisations tissulaires très différentes.
Quelques acteurs moléculaires de la différenciation γδ / αβ sont indiqués.
Ces deux sous-populations lymphocytaires T seraient en effet capables de moduler leurs
développements respectifs. Les thymocytes αβ DP peuvent par exemple réguler positivement
le développement des lymphocytes γδ via l’expression de la lymphotoxine β (51).
La sélection des lymphocytes T γδ reste encore extrêmement mal connue. Le fait que,
malgré une diversité combinatoire théorique plus importante, le répertoire γδ mature soit plus
restreint et biaisé que celui des αβ, suggère qu’une telle sélection existe, au moins pour une
partie des sous-populations γδ. Si l’on prend l’exemple de la sous-population γδ majoritaire
chez l’homme, la très large majorité des cellules expriment un TCR composé des segments
Vγ9 et Jγ1.2, préférentiellement associés à une chaîne Vδ2. Ce biais d’associations
46
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
préférentielles est probablement déterminé en périphérie (52). En revanche, la diversité
jonctionnelle du TCR Vγ9/Vδ2 est plus importante, ce qui explique peut être leur capacité à
répondre à des antigènes ayant une structure relativement variée (voir section 5.2.1 de ce
chapitre, p.67). Comment la sélection thymique se déroule et quelles sont les molécules
impliquées restent des questions ouvertes. Récemment, plusieurs travaux ont fourni de
nouvelles perspectives intéressantes sur le développement des lymphocytes T γδ.
Chez la souris, une sous-population non négligeable de lymphocytes T γδ reconnait les
molécules T10 et T22, qui sont des antigènes de CMH-I non-classiques associés à la β2m.
Cette sous-population peut se développer en l’absence de ligand, ce qui a été montré dans un
modèle de souris invalidées pour la β2m n’exprimant pas les molécules T10/T22. Cette
sélection serait rendue possible grâce à une auto-activation du TCR par dimérisation. Il faut
néanmoins noter que l’existence d’un ligand alternatif, ne dépendant pas de la β2m, ne peut
pas être totalement exclue. Les cellules sélectionnées par T10/T22 sécrètent de l’IFN-γ alors
que celles qui se sont développées en l’absence de reconnaissance de ces molécules sécrètent
de l’IL-17 (53). Cette sous-population γδ possède donc deux groupes différant par leur mode
de développement et ayant des fonctions effectrices distinctes. Cette dichotomie fonctionnelle
pourrait par ailleurs être caractéristique d’autres sous-populations γδ (principalement Vγ1 et
Vγ4) chez la souris et dépendre de l’expression du marqueur CD27 ((54) et B. Silva-Santos,
communication personnelle).
Les connaissances sur les acteurs moléculaires de la sélection des lymphocytes γδ ont
progressé récemment, suite à l’identification d’une nouvelle famille de gènes dont un des
membres, Skint1, joue un rôle essentiel dans la sélection des lymphocytes T Vγ5/Vδ1 (ou
DETC) résidant dans la peau. Les souris porteuses d’un gène skint1 déficient sont dépourvues
de lymphocytes T Vγ5/Vδ1. Le produit de skint1 n’étant à priori pas exprimé en surface, il ne
47
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
s’agit très probablement que d’un acteur indirect, intervenant peut-être dans la régulation de
l’expression du ligand du TCR (55, 56).
Globalement, le développement des lymphocytes T γδ laisse encore beaucoup de
questions sans réponses, et s’avère être difficile à étudier, surtout pour les populations
humaines présentant de nombreuses différences avec les modèles murins. La possibilité
qu’ont certains lymphocytes T γδ de se développer en l’absence de sélection positive dans le
thymus les démarque nettement des autres sous-populations T. Le fait que le répertoire γδ soit
extrêmement biaisé et restreint suggère néanmoins que cette propriété est limitée à certaines
populations dont le TCR a tendance à former spontanément des dimères, ce qui n’est pas le
cas des DETC par exemple (53).
3) Fonctions des lymphocytes T γδ : multiplicité et diversité.
La diversité de phénotypes, localisations, et spécificités antigéniques des lymphocytes T
γδ est à l’origine d’une multitude de fonctions. Contrairement aux lymphocytes T αβ
conventionnels, les lymphocytes T γδ re-circulent rarement en permanence dans le réseau
lymphatique. Ils restent associés préférentiellement à leur tissu de résidence, et sont souvent
activés directement sans dépendre réellement des cellules présentatrices d’antigènes
spécialisées. Ils effectuent donc des réponses effectrices très rapides qui jouent un rôle
important dans le maintien de l’intégrité de l’organisme. Comme les autres cellules de
l’immunité innée, ceci leur permet également de jouer un rôle important dans le contrôle du
développement de la réponse adaptative. Il faut par ailleurs noter qu’une population γδ
donnée, définie par un TCR particulier, peut également se composer de sous-populations
ayant des phénotypes différents associés à des fonctions distinctes. Par exemple, comme
mentionné précédemment, le marqueur CD27 chez certaines sous-populations murines définit
48
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
un biais pour la production d’IFN-γ ou d’IL-17. Ce même marqueur, en association avec
CD45 permet de distinguer plusieurs sous-populations au sein des lymphocytes T Vγ9/Vδ2
humains (57).
3.1)
Fonctions effectrices
Les sous-populations γδ sont, comme les lymphocytes T CD8, les populations αβ nonconventionnelles et les cellules NK, dotées d’une machinerie de cytotoxicité leur permettant
de lyser leurs cellules cibles par induction de l’apoptose. Cette machinerie présente deux
composantes principales : les granules lytiques faisant intervenir principalement le couple
perforine/granzyme, et le système Fas/FasL (Figure 9). Chez les lymphocytes T γδ, comme
les cellules NK, les granules lytiques sont préformés, ce qui leur permet une cytotoxicité
immédiate. Ceci les distingue des lymphocytes T CD8 qui ne sont « armés » qu’après avoir
été activés par une cellule présentatrice d’antigènes. La spécificité pour la cellule ciblée est
assurée par un relargage vectoriel des granules (58). Après reconnaissance de l’antigène, les
granules vont en effet être orientés directement au niveau de la synapse immunologique
formée entre cellule effectrice et cellule cible par les interactions entre le récepteur activateur
(TCR dans le cas des lymphocytes T) et de nombreuses molécules d’adhésion et de costimulation.
Les granules cytotoxiques, dérivés des lysosomes, contiennent de nombreuses protéines
majoritairement impliquées dans l’activation des voies d’apoptose, mais certaines d’entre
elles, comme la granulysine, pourraient également avoir des activés microbicides (59). Le
mécanisme exact d’action du couple perforine/granzyme est encore mal connu et les données
actuelles ont principalement été obtenues in vitro dans des modèles simplifiés où les cellules
cibles sont incubées en présence de ces protéines.
49
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Figure 9. Mécanismes de cytoxicité : induction de l’apoptose de la cellule cible.
La reconnaissance de l’antigène induit la polarisation et le relargage des granules
cytotoxiques vers la synapse immunologique, et potentiellement l’interaction Fas/FasL. Les
granzymes sont internalisées par endocytose et libérées dans le cytoplasme sous l’action de la
perforine. Le rôle principal des granzymes et du couple Fas/FasL est d’induire l’apoptose des
cellules cibles, via l’activation des caspases, mais aussi en activant directement certaines
cibles des caspases. Ces voies cytotoxiques sont communes aux lymphocytes T CD8 et nonconventionnels ainsi qu’aux cellules NK.
Adapté de (14).
Si la perforine était à l’origine vue comme un canal permettant l’entrée des autres protéines
dans la cellule cible, des données plus récentes suggèrent que le mécanisme est plus complexe
et fait intervenir une endocytose des protéines effectrices (60), pouvant également impliquer
des récepteurs aux granzymes tels que le récepteur au mannose-6-phosphate (61). Les
granzymes sont des sérine-protéases activant les voies apoptotiques des cellules cibles via
plusieurs mécanismes dépendants ou non des caspases. En effet, il semblerait que les
50
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
granzymes soient capables de remplacer les caspases dans de nombreux processus de
l’apoptose (14).
Le deuxième mécanisme majeur de cytotoxicité par les lymphocytes T γδ fait intervenir le
couple Fas/FasL. FasL (pour Fas Ligand) est une protéine homotrimérique membranaire de la
famille du TNF et son récepteur Fas est couplé à des voies de signalisation pro-apototiques
induisant la mort de la cellule cible, principalement via l’activation des caspases.
L’interaction Fas/FasL est, de la même façon que la polarisation des granules cytotoxiques,
facilitée par la formation de la synapse immunologique.
En plus de ces fonctions effectrices de lyse de la cellule cible, les lymphocytes T γδ sont
également une source importante de cytokines permettant l’activation d’autres souspopulations du système immunitaire. Globalement, les lymphocytes T γδ ont un profil de
sécrétion de cytokines qui est plutôt biaisé vers une réponse de type Th1 (62) ce qui est en
accord avec une implication préférentielle dans des réponses dirigées contre des pathogènes
intracellulaires, ou dans l’immunosurveillance des cellules stressées ou transformées.
Certaines sous-populations particulières peuvent toutefois secréter des cytokines de type Th2,
comme l’IL-4 ou l’IL-10.
Bien que reposant essentiellement sur la reconnaissance antigénique par le TCR, les
mécanismes d’activation de la cytotoxicité ou de la sécrétion de cytokines par les
lymphocytes T γδ peuvent également impliquer l’ADCC (Antibody-Dependent Cell
Cytotoxicity), comme pour les cellules NK. Cette propriété est toutefois restreinte aux souspopulations exprimant le marqueur CD16 (aussi appelé FcγRIII), un récepteur de basse
affinité pour le fragment constant des immunoglobulines. CD16 ne joue probablement qu’un
51
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
rôle secondaire, complétant l’activation par le TCR (63, 64). De la même façon, les
lymphocytes T γδ expriment certains TLR ayant un rôle principalement co-stimulant (65).
Jusqu’à présent, les ligands des TCR γδ décrits sont principalement de nature endogène,
ce qui pourrait entraîner une auto-réactivité de ces lymphocytes. Leur activation est donc
finement régulée par des récepteurs pour les antigènes du CMH ou apparentés, les NKR (pour
Natural Killer Receptor car initialement décrits sur les cellules Natural Killer) pour empêcher
toute réaction auto-immune (66). Ces récepteurs peuvent être divisés en deux groupes, de type
activateur ou inhibiteur. Le rôle des récepteurs de type inhibiteur (iNKR) est d’antagoniser la
signalisation des récepteurs activateurs (dont le TCR) via la reconnaissance des molécules du
CMH-I. En cas de diminution d’expression du CMH-I, fréquente dans les infections virales ou
au cours de la transformation tumorale, ces récepteurs ne transmettront donc plus leurs
signaux inhibiteurs (hypothèse du « soi manquant »). Les récepteurs activateurs (aNKR)
reconnaissent généralement des molécules apparentées au CMH-I telles que MICA/MICB ou
les protéines de la famille RAET (aussi appelées ULBP) dont l’expression est initiée en cas de
stress cellulaires. Comme pour le CMH-I, de nombreuses protéines virales sont impliquées
dans l’inhibition de l’expression de ces marqueurs de stress notamment pour échapper à la
cytotoxicité des cellules NK.
Pour les lymphocytes T γδ, cette caractéristique a été principalement étudiée dans le cas de la
sous-population Vγ9/Vδ2 humaine. La très grande majorité des cellules de cette souspopulation exprime des récepteurs de type inhibiteurs (67) jouent un rôle majeur dans la
régulation de leur activation, notamment le couple CD94/NKG2A qui reconnaît
principalement HLA-E. Cependant, cette régulation reste un phénomène très complexe et
multifactoriel dépendant de l’intégration des signalisations induites par de nombreux
récepteurs activateurs et inhibiteurs (68).
52
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Plus récemment, une nouvelle fonction effectrice a également été décrite pour les
lymphocytes T humains de type Vγ9/Vδ2. Cette sous-population, une fois activée,
présenterait en effet les caractéristiques d’une cellule présentatrice d’antigènes : activation de
l’expression de CCR7 (favorisant une migration vers les ganglions lymphatiques) et des
antigènes des CMH-I et II, comparable au phénotype des cellules dendritiques ; induction de
la capacité d’internalisation et de présentation d’antigènes solubles ; forte capacité à activer
des lymphocytes T CD8 naïfs (69, 70). Ces caractéristiques soulignent une fois de plus la
position des lymphocytes T γδ à l’interface entre immunité innée et immunité adaptative.
3.2)
Fonctions régulatrices
Faisant partie de la première ligne de défense contre les pathogènes, les lymphocytes T γδ
participent à la régulation des autres sous-populations du système immunitaire. Ce rôle est
principalement rempli par leur capacité à sécréter rapidement de nombreuses cytokines. Un
des rôles importants dans le passage de relai entre immunité innée et adaptative par les
lymphocytes T γδ pourrait résider dans leur forte capacité à stimuler les cellules dendritiques
immatures. Cette propriété a principalement été décrite pour les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 et se
déroule via la sécrétion de diverses cytokines, notamment l’IFN-γ et le TNF-α (71, 72).
Récemment, ils ont également été décrits comme antagonisant les lymphocytes T CD4
régulateurs dans le cadre de la réponse contre les mycobactéries (73).
Les lymphocytes T γδ sont généralement associés à une réponse de type Th1. Néanmoins
certaines sous-populations pourraient également avoir un rôle voisin des Th2, par exemple en
activant les lymphocytes B, participant ainsi à l’immunité humorale. C’est le cas d’une souspopulation Vγ9/Vδ2 chez l’homme, définie par le marqueur CXCR5, qui potentialise la
sécrétion d’anticorps par les lymphocytes B. Ce mécanisme fait intervenir principalement
deux cytokines, l’IL-4 et l’IL-10, ainsi que CD40L et ICOS, des molécules de co-stimulation
53
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
classiquement impliquées dans l’activation des lymphocytes B (74). De façon similaire, les
lymphocytes T γδ intra-épithéliaux de l’intestin chez la souris (Vγ7) sécrètent du TGF-β,
cytokine jouant un rôle important dans la production des IgA, anticorps classiquement
associés aux muqueuses (75).
Certains lymphocytes T Vγ1 pourraient intervenir en fin de réponse immunitaire en
participant à l’arrêt de la réaction inflammatoire (via la secrétion de cytokines comme l’IL-4)
et l’élimination de cellules activées, comme les macrophages (76). Enfin, de nombreuses
études in vivo ont montré que les lymphocytes T γδ participent également à l’induction de la
tolérance périphérique, mais les mécanismes sous-jacents sont peu connus (77).
En complément de ces rôles de modulation du système immunitaire, les sous-populations
γδ intra-épithéliales jouent également un rôle très important dans le maintien de l’intégrité des
tissus auxquels elles sont associées. Cette propriété a particulièrement été étudiée pour les
lymphocytes T Vγ5/Vδ1 chez la souris. En plus de leur implication dans les mécanismes de
défense contre des pathogènes ou dans l’immuno-surveillance, ces lymphocytes sont
également une source importante de facteurs de croissance notamment pour les kératinocytes
(Keratinocyte Growth Factor, KGF), favorisant ainsi la régénération du tissu endommagé
suite à une blessure ou une infection (78). Cette capacité a également été décrite pour les
lymphocytes T γδ intra-épithéliaux de l’intestin (79).
Ces fonctions très variées (Figure 10) suggèrent que les lymphocytes T γδ, bien que plus rares
que les lymphocytes T conventionnels, jouent un rôle primordial dans le maintien de
l’intégrité de l’organisme, en participant directement ou indirectement aux réponses
immunitaires, ainsi qu’.à l’homéostasie tissulaire. Ceci est validé par de nombreux modèles
murins déficients pour tout ou partie des sous-populations γδ et des données décrivant le rôle
de plusieurs de ces sous-populations dans des pathologies diverses décrites ci-après.
54
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Figure 10. Fonctions des
lymphocytes T γδ.
Les principales fonctions
décrites des lymphocytes T
γδ sont schématisées. Elles
sont en général restreintes à
des populations particulières.
Voir le texte pour le détail.
LB, LT : Lymphocytes B et
T. CD : cellule dendritique.
4) Lymphocytes T γδ et pathologies : dualité de leurs rôles.
Compte tenu de leur grande variété de fonctions et de leur localisation préférentielle au
niveau des épithéliums, donc en première ligne de défense de l’organisme, les lymphocytes T
γδ jouent un rôle important dans le contrôle des infections. Ayant souvent des propriétés
cytotoxiques et un profil de cytokines plutôt de type Th1, ils sont impliqués dans la défense
contre divers pathogènes intracellulaires. Ils pourraient également moduler le développement
de diverses pathologies auto-immunes et inflammatoires. Enfin, ils jouent un rôle primordial
dans l’immuno-surveillance des cancers. Les lymphocytes T γδ contribuent à la protection de
l’organisme, mais ils peuvent également avoir des effets néfastes.
4.1)
Pathogènes intracellulaires
4.1.1) Bactéries et parasites
Un des tout premiers rôles des lymphocytes T γδ dans la réponse dirigée contre les
pathogènes a été suggéré par leur capacité à être activés par des extraits issus de préparations
55
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
mycobactériennes (Purified Protein Derivative ou PPD). Ceci a été montré chez la souris aussi
bien que chez l’homme et originellement l’antigène impliqué dans cette activation a été
identifié comme étant un homologue mycobactérien de la protéine Hsp60 (Heat shock protein
de 60kDa) (80-82). La réponse contre les mycobactéries a par la suite été restreinte, chez
l’homme, à la sous-population Vγ9/Vδ2, qui est largement majoritaire au niveau du sang
périphérique (83, 84). Les antigènes mycobactériens principalement responsables de
l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 humains n’ont été caractérisés que plus tard, et
correspondent à de petits alkyls phosphorylés appelés phosphoantigènes (85) (voir Chapitre
II, section 5.2, p.67). Ces antigènes ont par la suite été décrits comme produits par de
nombreuses autres bactéries intracellulaires, ce qui explique la large réactivité des
lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Cette sous-population joue également un rôle important dans la
défense contre l’infection par diverses souches de Plasmodium, l’agent pathogène responsable
du paludisme, toujours via l’activation par des phosphoantigènes (86).
Enfin, les lymphocytes T γδ sont, aussi bien chez l’homme que chez la souris, impliqués dans
la réponse contre d’autres pathogènes intracellulaires tels que les leishmanies ou Listeria
monocytogenes (87, 88).
4.1.2) Virus
Le rôle primordial des lymphocytes T αβ cytotoxiques (CD8+) ainsi que des cellules NK
dans l’immunité anti-virale est connu depuis de nombreuses années. Les lymphocytes T γδ
présentant les caractéristiques de ces deux types de cellules immunitaires, il n’est pas étonnant
qu’ils participent très largement aux défenses de l’organisme contre les virus. De nombreux
travaux chez la souris ont décrit l’activation des lymphocytes T γδ lors d’infections virales
variées (89) comme le virus de la leucémie murine (MuLV), certains virus de la famille de
l’Influenza, ou le virus de Sendaï pour en nommer quelques uns. Cette large réactivité est
56
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
probablement due à la reconnaissance des cellules infectées via les NKR plutôt que grâce à
des antigènes spécifiques (90). Chez l’homme, les deux virus principalement étudiés dans le
contexte des lymphocytes T γδ sont le Cytomégalovirus (CMV) et le Virus de
l’Immunodéficience Humaine (VIH).
L’infection par le CMV est généralement bénigne chez les individus immunocompétents.
En revanche, les patients recevant une greffe d’organe étant généralement sous traitement
immunosuppresseur, une infection par le CMV induit de nombreuses manifestions
inflammatoires pouvant mettre en jeu le pronostic vital. C’est dans ce cadre que l’activation
des lymphocytes T γδ, et plus particulièrement des sous-populations humaines Vδ1 et Vδ3, a
originellement été identifiée (91). L’infection par le CMV induit une expansion durable de ces
sous-populations γδ, ainsi qu’un biais vers un phénotype de type effecteur cytotoxique et
mémoire, avec une nette sélection de sous-types de TCR particuliers (92, 93). L’antigène
reconnu par les sous-populations γδ impliquées dans la réponse contre le CMV n’a à l’heure
actuelle pas été identifié, mais comme souvent dans les réponses non-conventionnelles antivirales, il s’agit probablement d’un ligand endogène de stress, exprimé en réponse à
l’infection. Il est peu probable que le mécanisme principal fasse intervenir uniquement les
NKR, puisque dans ce cas les lymphocytes T Vγ9/Vδ2, majoritaires, devraient largement
participer à la réponse contre le CMV, ce qui n’est pas le cas.
La relation entre le VIH et les lymphocytes T γδ est complexe et fait intervenir différentes
sous-populations. Comme mentionné précédemment, la population majoritaire dans le sang
périphérique est de type Vγ9/Vδ2, représentant environ 80% des lymphocytes T γδ circulants
chez la plupart des individus sains. Lors de l’infection par le VIH, il y a une expansion des
lymphocytes T γδ caractérisée par une inversion complète du rapport entre les populations
57
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Vδ2+ et Vδ1+ (94). Bien que les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 soient capables de répondre de
manière efficace aux cellules infectées par le VIH in vitro (95, 96), leur nombre est
dramatiquement réduit au cours de la progression de la maladie et le faible pourcentage
restant présente des déficiences fonctionnelles importantes au niveau de leur prolifération et
de leurs fonctions effectrices. Les raisons de cette déplétion sélective ne sont pas claires, mais
elle pourrait être due à un épuisement du répertoire Vδ2 suite à une activation chronique (97).
Certaines sous-populations Vδ2 exprimant le marqueur CD4, on peut émettre l’hypothèse que
le VIH est capable d’infecter ces cellules avec des conséquences négatives pour l’ensemble
des sous-populations.
Les raisons de l’inversion Vδ2/Vδ1 sont encore discutées. L’idée qu’une réponse anti-VIH
médiée par des sous-populations Vδ1 se développe, supportée par le fait que ces cellules sont
capables de détruire des cellules infectées (98), est envisageable. Néanmoins, il semble clair
que cette réponse est relativement inefficace in vivo, et des données expérimentales indiquent
qu’il n’y a pas de sélection de TCR Vδ1 particuliers (99), ce qui suggère qu’il n’y a pas
réellement de développement d’une réponse spécifique des lymphocytes T Vδ1 contre le VIH.
Pour finir, la déplétion des sous-populations Vγ9/Vδ2 participe largement au développement
des pathogènes opportunistes, notamment les mycobactéries.
Les travaux sur les relations entre lymphocytes T γδ et VIH représentent donc des voies
potentiellement importantes dans l’étude de la physiopathologie du SIDA.
4.2)
Pathologies inflammatoires et auto-immunes
Le fait que les lymphocytes T γδ modulent de nombreuses autres populations du système
immunitaire et qu’ils aient un potentiel auto-réactif important suggère qu’ils pourraient
participer au contrôle aussi bien qu’au développement de pathologies auto-immunes.
Plusieurs travaux chez la souris vont dans ce sens. Dans plusieurs modèles animaux, comme
58
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
ceux de la myocardite (100), de l’arthrite réactive (101), de l’uvéite (102), ou du lupus (103),
les lymphocytes T γδ semblent capables de diminuer ou d’exacerber les symptômes.
Néanmoins, de nombreux travaux ont montré que les lymphocytes T γδ sont capables de
réduire l’inflammation et les dommages tissulaires en contrôlant la sur-activation des
lymphocytes T αβ. Les biais pro- ou anti-inflammatoires pourraient dans certains cas être le
résultat de l’utilisation de lignées murines différentes. Ces effets divergents pourraient
dépendre des sous-populations γδ mises en jeu. En effet, dans plusieurs cas les populations
pathogéniques sont CD8+, ou sécrètent de l’IL-17 (104).
Chez l’homme, l’implication des lymphocytes T γδ dans le développement de pathologies
auto-immunes et inflammatoires a également été étudiée. Des variations des populations γδ
ont par exemple été observées dans le diabète gestationnel et le lupus (105, 106). La
pathologie la plus étudiée dans ce cadre est probablement la sclérose en plaques. De
nombreux travaux ont pu mettre en évidence un lien entre le développement de cette
pathologie et les lymphocytes T γδ, qui pourraient participer activement à la formation des
lésions. Deux mécanismes sont principalement en cause : une cytotoxicité directe dirigée
contre certaines cellules du système nerveux central (principalement les oligodendrocytes), et
une forte production d’IL-17, cytokine ayant le plus grand potentiel pro-inflammatoire et qui
est impliquée dans de nombreuses pathologies auto-immunes et inflammatoires telles que la
polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, ou la maladie de Crohn (107). Ces résultats
sont par ailleurs confirmés dans des modèles murins d’EAE, reproduisant la pathologie
humaine assez fidèlement. Encore une fois, l’intervention des lymphocytes T γδ dans cette
pathologie est assez complexe, puisqu’ils pourraient également s’avérer protecteurs. De très
nombreux facteurs pourraient influencer leur rôle exact, comme les sous-types de populations
59
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
étudiés, le modèle murin considéré, ou même le stade de la maladie auquel ils interviennent
(108).
Enfin, une forte infiltration de lymphocytes T γδ a été observée dans les lésions
athérosclérotiques, et serait probablement liée à la surexpression d’Hsp60 (109), protéine dont
l’expression à la surface des cellules a été rapportée comme influençant la réactivité des
lymphocytes T Vγ9/Vδ2 humains (110). Ceci a également été décrit dans le développement
de la maladie de Behçet, une vascularite systémique (111).
Globalement, les liens entre lymphocytes T γδ et pathologies inflammatoires ou autoimmunes apparaissent extrêmement complexes et sont encore mal compris, surtout chez
l’homme, mais méritent certainement des travaux plus approfondis.
4.3)
Cancer
Les premières études fonctionnelles sur les lymphocytes T γδ ont très vite mis en évidence
leur capacité à lyser in vitro des cellules tumorales, que ce soit des lignées (112) ou des
tumeurs autologues (113). Globalement, cette capacité est étendue à tous les sous-types γδ et
fait intervenir les NKR, les cellules tumorales perdant souvent l’expression du CMH-I (leur
permettant d’échapper aux lymphocytes T CD8+) ou présentant une surexpression de
molécules de stress liant les aNKR. Il n’y a donc pas nécessairement reconnaissance d’un
antigène spécifique des tumeurs ni de restriction à un type γδ particulier. Ces cellules ont donc
un potentiel de réactivité très large, ce qui fait leur immuno-manipulation dans le traitement
des cancers une perspective séduisante. L’association courante des lymphocytes T γδ avec des
tissus déterminés est également une propriété intéressante mais qui reste peu caractérisée chez
l’homme. Les études sur des sous-populations particulières et leur réactivité anti-tumorale ont
été extrêmement nombreuses, et plusieurs antigènes tumoraux ont été proposés, dont les
60
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
phosphoantigènes, des protéines de la famille des Hsp, ou des molécules de stress (voir
Tableau 2, p.64).
La participation importante des lymphocytes T γδ dans l’immunosurveillance des cancers
a également été mise en évidence dans de nombreux modèles murins et pour différents types
de cancers, que ce soit par utilisation de lignées invalidées pour toutes les sous-populations
(114) ou pour une sous-population particulière. Par exemple, l’invalidation des lymphocytes T
Vγ5/Vδ1 (DETC), spécifiques de la peau, entraîne une forte susceptibilité à la carcinogénèse
chimique (115). Par ailleurs, cette étude montre que bien que des lymphocytes γδ exprimant
un TCR différent remplacent les DETC en cas de déficience, ils sont incapables de fournir
une protection efficace. Ceci indique donc qu’il y a malgré tout une certaine spécificité de la
réponse anti-tumorale en fonction des sous-populations γδ considérées, et reflète peut-être la
capacité naturelle de ces sous-populations à interagir de manière spécifique avec un type de
cellules épithéliales donné.
Chez l’homme, de nombreuses études chez des patients ont pu montrer une proportion
importante de lymphocytes T γδ parmi les lymphocytes infiltrant des tumeurs (appelés TIL
pour Tumor Infiltrating Lymphocytes), par exemple dans le cas du mélanome (116) ou de
l’hépatocarcinome (117). Associé au fait que ces lymphocytes sont capables de lyser des
cellules tumorales in vitro, ceci a donc encouragé le développement de protocoles précliniques et cliniques utilisant les lymphocytes T γδ comment agent thérapeutique (118-120).
De même que les lymphocytes T γδ ont parfois des effets opposés dans certaines
pathologies auto-immunes ou inflammatoires, un travail chez la souris montre que ces
lymphocytes pourraient jouer un rôle pro-tumorigène (121). De plus, deux études récentes ont
montré que les cellules souches mésenchymateuses (MSC), qui infiltrent très souvent les
61
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
masses tumorales, sont capables de réguler négativement l’activation des lymphocytes T γδ de
type Vγ9/Vδ2, principalement via la production de prostaglandine E2 (122, 123). Cette
propriété des MSC pourrait en revanche s’avérer utile dans le traitement de pathologies autoimmunes ou inflammatoires impliquant les lymphocytes T γδ.
Les lymphocytes T γδ sont donc une cible très intéressante dans le développement de
traitements pour des pathologies extrêmement variées. Néanmoins, ceci reste encore très
limité du fait des connaissances toujours très restreintes sur ces sous-populations
lymphocytaires non-conventionnelles. Comme mentionné plusieurs fois au cours de cette
introduction, le principal facteur limitant est le manque cruel de connaissances sur les
antigènes que ces lymphocytes reconnaissent via leur TCR.
5) Antigènes reconnus par les TCR γδ : une diversité déroutante.
A l’heure où les techniques d’études de biochimie et d’identification des protéines ont fait
des progrès considérables (l’HPLC, la spectrométrie de masse, et le séquençage, pour ne citer
qu’elles, étant quasiment devenues des pratiques de routine) il peut paraître étonnant que les
antigènes activant les lymphocytes T γδ soient totalement inconnus pour la majorité des souspopulations. Ceci est probablement dû à plusieurs facteurs, notamment une apparente
divergence entre les sous-populations humaines et murines. L’utilisation fréquente de clones
cellulaires, pouvant avoir des réactivités particulières et non représentatives d’une souspopulation γδ dans son ensemble, a probablement contribué à une accumulation de données
n’étant pas forcément pertinentes. Evidemment, ce dernier point est longtemps resté un cercle
vicieux. Comment étudier une sous-population précise si l’on n’a aucun moyen de l’amplifier
de manière spécifique ? L’utilisation d’anticorps spécifiques et de méthodes de purification
permet néanmoins aujourd’hui de pallier à ce problème dans certains cas.
62
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Par ailleurs, les quelques antigènes identifiés jusqu’à présent (Tableau 2) sont tellement
différents que la recherche d’autres molécules activant les lymphocytes T γδ de façon
spécifique ne peut à priori pas se baser sur les découvertes précédentes. Ces antigènes ayant
souvent été identifiés à partir d’un nombre très limité de clones, ils pourraient représenter des
cas particuliers anecdotiques plutôt qu’une règle générale applicable à des sous-populations
entières. Nous nous concentrerons sur les antigènes les mieux caractérisés et activant des
proportions importantes de sous-populations γδ.
5.1)
Molécules apparentées au CMH
La reconnaissance antigénique par les lymphocytes T γδ n’est pas restreinte par le CMH,
au sens strict, conventionnel, du terme. A part pour certains clones décrits (voir Tableau 2), ils
ne reconnaissent donc généralement pas d’antigènes peptidiques présentés par le CMH. Par
exemple, il a clairement été établi que les antigènes activant la sous-population humaine
Vγ9/Vδ2 peuvent être présentés par des cellules déficientes pour l’expression de ces
molécules (124). En revanche, le CMH, et plus particulièrement de classe I, n’est pas
totalement étranger aux lymphocytes T γδ. Comme nous l’avons vu, il est capable de réguler
leur activité par interaction avec les NKR. De plus, un certain nombre de sous-populations ont
été très étudiées pour leur capacité à reconnaître des molécules apparentées au CMH.
L’exemple le mieux caractérisé correspond aux molécules murines T10 et T22, qui sont
apparentées au CMH-I, associées à la β2m, mais ne présentent pas de peptides. Leur
expression est augmentée en cas de stress cellulaire. Originellement identifiées comme
ligands activant deux clones γδ, KN6 et G8 (125, 126), leur reconnaissance a pu être étendue
à une proportion non négligeable de lymphocytes T γδ chez la souris (0.3 à 0.6% des γδ
présents dans la rate, et environ le même pourcentage dans l’intestin) (127).
63
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Sous-populations
Antigène
Références
Vγ1
Hsp60
(128)
Vγ2/Vδ5 (clone LBK5)
I-Ek
(129)
Vγ2/Vδ8 (clone TgI4.4)
HSV-gI
(130)
Vγ1, Vγ4, Vγ7
T10/T22
(131)
Vγ1 (2 hybridomes)
CL et apoH
(132)
Vδ1 (IEL)
MICA/B
(133)
Vδ1 (clones)
Lipohexapeptides
(134)
Vδ1 (clones)
HLA-A2, -A24
(135, 136)
Vδ1 (clones)
CD1c
(137)
Vγ9/Vδ2
Phosphoantigènes
(85, 138)
Vγ9/Vδ2
Aminobisphosphonates
(139)
Vγ9/Vδ2 (clones)
SEA
(140)
Vγ9/Vδ2
Alkylamines
(141)
Vγ9/Vδ2 (clones)
Peptides Hsp/TT + HLA-DRw53
(142)
Vγ9/Vδ2
Hsp60
(143)
Vγ9/Vδ2
Ecto-F1-ATPase/apoA-I
(144)
Murines
Humaines
Tableau 2. Les antigènes activant les lymphocytes T γδ.
Ce tableau résume les antigènes décrits dans la littérature. Ils témoignent de la grande
diversité de la nature des ligands reconnus par des TCR γδ. Néanmoins la plupart d’entre eux
restent décrits pour un petit nombre de clones cellulaires. La sous-population la mieux connue
à l’heure actuelle à ce sujet reste les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 humains.
Hsp60 : Heat shock protein de 60kDa ; I-Ek: Isotype de CMH-II murin ; HSV-gI: protéine gI
du virus de l’herpès (Herpes Simplex Virus) ; T10/T22 : Molécules apparentées au CMH-I
chez la souris ; CL : Cardiolipine (lipide principalement retrouvé dans la membrane interne de
la mitochondrie) ; apoH : apolipoprotéineH ; IEL : Intra-Epithelial Lymphocytes ; MICA/B :
MHC class I polypeptide-related sequence A/B ; HLA-A2, -A24 : Allèles de l’isotype HLA-A
(CMH-I humain) ; SEA : Staphylococcal Enterotoxin A ; TT : Toxine Tétanique ; HLADRw53 : Allèle de l’isotype HLA-DR (CMH-II humain) ; apoA-I : apolipopréotéineA-I.
Adapté de (62)
64
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
La reconnaissance de T22 est commune à des sous-populations exprimant des TCR portant
des régions variables différentes. En effet, la caractérisation des sous-populations réactives a
montré qu’elles exprimaient un TCR de type Vγ1, Vγ4 (majoritaires en périphérie) et Vγ7
(présentes dans l’intestin). Néanmoins, tous les TCR réactifs identifiés ont la propriété
marquante de porter un motif précis au niveau de la boucle CDR3 de la chaîne δ (131). Enfin,
la reconnaissance de T22 par le TCR du clone G8 a pu être montrée de manière directe
(Figure 11 et (145)) par ce qui reste à l’heure actuelle le seul cas de co-cristallographie d’un
TCR γδ avec son ligand.
Chez l’homme, deux cas de reconnaissance de molécules apparentées au CMH ont été
rapportés. MICA a été identifié comme étant le ligand de certains TCR de type Vδ1 (133).
Comme mentionné précédemment, cette molécule est également reconnue par certains NKR
tels que NKG2D. On peut alors se demander pourquoi une sous-population reconnaissant la
même molécule via un deuxième type de récepteur se serait développée. Toutefois, la
redondance est une caractéristique fréquente du système immunitaire et pourrait permettre un
meilleur contrôle de l’immuno-surveillance en cas de dysfonctionnement d’un des deux
systèmes. Une étude consécutive par les mêmes auteurs a d’ailleurs montré que des cellules
n’exprimant pas NKG2D, et transfectées par un TCR isolé à partir d’un clone réactif,
acquéraient la capacité d’être activées par MICA (146). La possibilité que les clones identifiés
reconnaissent MICA par le biais d’autres récepteurs a également été exclue par un travail plus
récent montrant une interaction directe entre un TCR γδ et MICA (147).
Enfin, certains clones, toujours de type Vδ1, sont capables de reconnaître des lipides
présentés par CD1c (148) qui est principalement exprimé par les cellules dendritiques et les
lymphocytes B. Ces lipides peuvent d’ailleurs être d’origine endogène ou exogène.
65
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Figure 11. Structure tridimensionnelle d’un TCR γδ et de son ligand, T22.
(A) Le contact entre les deux molécules est uniquement assuré par la chaîne δ du TCR et plus
particulièrement la boucle CDR3 qui interagit avec le plateau (feuillets β représentés par des
bandes fléchées) et le domaine α1. Le type d’interaction est radicalement différent de la
reconnaissance du CMH-I par un TCR αβ (B).
Tiré de (145).
Les lymphocytes T γδ sont donc complémentaires d’autres sous-populations T
(conventionnelles ou non) et participent à la complexité de la biologie des molécules CD1. En
revanche, aucune donnée démontrant une interaction directe n’a été obtenue, et tous les
lymphocytes Vδ1+ ne reconnaissent pas CD1c. Il devrait en théorie s’agir de sous-populations
différentes de celles reconnaissant MICA, et la reconnaissance de ces deux groupes de
molécules fait peut-être intervenir, par analogie avec T10/T22, des TCR relativement divers
mais portant des motifs structuraux conservés.
66
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
5.2)
Antigènes non-peptidiques
Ce terme relativement vague désigne différentes classes d’antigènes activant les
lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Il doit son origine au fait que le potentiel stimulateur d’extraits
mycobactériens pour les lymphocytes T γδ humains, d’abord attribué aux protéines de type
Hsp, a par la suite été montré comme étant résistant à diverses activités protéasiques (149).
Les antigènes majoritairement responsables de l’activation de cette sous-population γδ ont par
la suite pu être purifiés et caractérisés.
5.2.1) Phosphoantigènes
Les phosphoantigènes représentent une classe de molécules de très petite taille (inférieure
à 1kDa) et dont la structure globale principale est celle des isoprénoïdes, comportant une
courte chaîne hydrocarbonée (le plus souvent à 5 carbones) ainsi qu’un groupement
pyrophosphate (Figure 12). Ils ont à l’origine été isolés à partir d’extraits de Mycobacterium
tuberculosis. TUBAg 1 et 2 sont des antigènes de type pyrophosphate alors que TUBAg3 et 4
correspondent à des dérivés nucléotidiques de TUBAg2 et 1, respectivement (85). Des
travaux indépendants ont identifié le même type d’antigènes, synthétiques comme l’Ethyl
PyroPhosphate (EtPP), ou naturels comme l’Isopentenyl PyroPhosphate (IPP) et son isomère
le DiMéthyl-Allyl PyroPhosphate (DMAPP) (138, 150). Leur reconnaissance est dépendante
du TCR comme suggéré par le transfert de la réactivité pour ces antigènes par transfection des
chaînes du TCR Vγ9/Vδ2 dans un variant de la lignée Jurkat, déficient pour l’expression du
TCR αβ (151). Il a été montré que la réactivité aux phosphoantigènes est déterminée par
l’expression d’un segment Jγ de type 1.2 (aussi appelé JγP) et que la boucle CDR3 de la
chaîne γ est donc essentielle (152, 153).
67
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Figure 12. Exemples de phosphoantigènes.
Les phosphoantigènes les plus utilisés sont indiqués
ici, et classés dans l’ordre croissant de leur bioactivité
(le moins actif étant l’EtPP). Le DMAPP et l’IPP sont
des isomères et sont produits par toutes les cellules
vivantes. L’EtPP est synthétique. L’HDMAPP est un
précurseur du DMAPP chez certaines plantes, la
plupart des bactéries et quelques parasites.
A l’heure actuelle, l’antigène naturel le plus efficace qui ait été identifié est l’HydroxyDiMéthyl-Allyl PyroPhosphate (HDMAPP, aussi appelé HMBPP pour Hydroxy-Méthyl
Butényl PyroPhosphate), environ 1000 fois plus efficace que l’IPP ou le DMAPP. Cet
antigène est un intermédiaire de la voie du DeOxy-Xylulose-Phosphate (DOXP), voie
alternative de la synthèse du cholestérol chez certaines plantes, la majorité des bactéries et
archées, et quelques parasites. Tous les eucaryotes (végétaux exclus) n’utilisent que la voie
classique du mévalonate pour synthétiser le cholestérol (également utilisée par la plupart des
organismes utilisant la voie DOXP). Ceci explique probablement la très forte activation des
lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par l’HDMAPP par rapport à l’IPP puisqu’il est un antigène
totalement étranger à l’organisme humain. Comme mentionné précédemment, ces antigènes
sont impliqués dans la reconnaissance d’un large spectre de pathogènes intracellulaires, et
l’IPP a également été impliqué dans la reconnaissance des cellules tumorales par les
lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (154).
68
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Plusieurs travaux ont décrit les caractéristiques requises pour l’antigénicité de ces
molécules (155, 156). Globalement, plusieurs points semblent importants : la chaîne
hydrocarbonée doit être courte (5 carbones ou moins) et ne pas comporter de cycle ; les
versions mono- ou triphosphate d’un antigène sont généralement très peu actives ; le
traitement de ces antigènes par des phosphatases élimine complètement leur activité ; enfin la
liaison entre les deux atomes de phosphore doit être assurée par un oxygène, et si celui-ci est
remplacé par un carbone par exemple, l’antigène perd toute son activité. De plus, la
conformation tridimensionnelle de ces molécules est importante pour leur bioactivité, les
stéréoisomères Z de ces molécules étant quasiment inactifs (157). Les raisons de cette
spécificité des propriétés physico-chimiques restent encore obscures mais sont probablement
le reflet d’une nécessité de compatibilité structurale avec le TCR et une hypothétique
molécule de présentation. Enfin, si les dérivés nucléotidiques des phosphoantigènes ont été
parfois utilisés, aucun travail n’a vraiment étudié leurs propriétés de façon précise.
La reconnaissance des phosphoantigènes est indépendante de tous les types de molécules
de présentation connues (CMH-I et -II, CD1, etc) (156). De plus, elle ne dépend pas de
cellules présentatrices d’antigènes spécialisées. En revanche, un contact cellulaire, qui peut
être effectué entre deux lymphocytes T Vγ9/Vδ2, est indispensable à l’activation par ces
antigènes (124), ce qui suggère qu’une structure de présentation est très probablement requise.
Bien qu’il puisse y avoir des variations d’efficacité, la plupart des cellules sont capables de
présenter les phosphoantigènes, ce qui indique que la structure en question est exprimée de
façon ubiquitaire et probablement non polymorphe. En revanche, ces cellules doivent être
d’origine humaine (158). Des travaux récents indiquent par ailleurs que cette structure de
présentation est de nature protéique, puisque sensible à la trypsine (159). Bien que la structure
tridimensionnelle du TCR Vγ9/Vδ2 suggère qu’il puisse lier des phosphoantigènes (41),
69
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
aucune étude n’a pu mettre en évidence de liaison directe. Ceci est probablement dû au fait
que la reconnaissance dépend de la liaison du phosphoantigène sur sa molécule présentatrice,
de la même façon qu’un TCR αβ conventionnel ne peut lier son peptide spécifique en dehors
du contexte du CMH par exemple. Bien que ces phosphoantigènes soient connus depuis 15
ans, le mécanisme exact de leur reconnaissance est toujours mal caractérisé.
5.2.2) Aminobisphosphonates et alkylamines
Ces deux types de molécules ont été décrits pour leur capacité à activer les lymphocytes T
Vγ9/Vδ2 et à l’origine leur mode de reconnaissance était considéré comme équivalent à celui
des phosphoantigènes classiques. Néanmoins, il s’est vite avéré que leur reconnaissance
comporte des différences fondamentales, notamment une dépendance stricte de cellules
présentatrices d’antigènes (pas forcément spécialisées) ainsi qu’une réponse beaucoup moins
rapide. En d’autres termes, leur potentiel activateur est dépendant de leur capture et leur
« apprêtement » par des cellules cibles a été évoqué. Leur structure (Figure 13) est également
différente de celle des phosphoantigènes classiques et ne présente pas les caractéristiques
décrites plus haut.
Figure 13. Structure générale des aminobisphosphonates et des alkylamines.
Le radical R des aminobisphosphonates actifs (A) comporte toujours une fonction amine (les
bisphosphonates sont inactifs). Les plus utilisés sont le zoledronate (R = cycle pentavalent
C3N2H3) et le pamidronate (R = -CH2-CH2-NH2). Les alkylamines actives comportent un
radical alkyl court (entre 2 et 5 carbones).
70
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Les aminobisphosphonates sont des drogues couramment utilisées depuis de nombreuses
années dans le traitement de diverses pathologies osseuses comme l’ostéoporose. Leurs
propriétés anti-tumorales ont été découvertes plus tardivement et peuvent en partie être dues à
leur capacité à activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (139). L’identification du mécanisme exact
d’activation par les aminobisphosphonates a été rendu possible par l’identification de leur
capacité à inhiber la Farnésyl PyroPhosphate synthase (FPP synthase), enzyme en aval de
l’IPP dans la voie du mévalonate (160). Après internalisation par une cellule cible, par
exemple une cellule tumorale, ces composés vont donc inhiber la FPP synthase et entraîner
une accumulation d’IPP, responsable de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (154). Ces
travaux ont confirmé l’implication de la voie du mévalonate dans le potentiel stimulant de
lignées tumorales, en montrant que les statines par exemple, qui inhibent l’HMG-CoA
Reductase en amont de l’IPP, réduisent fortement ce potentiel (Figure 14).
Les alkylamines ont été identifiées à partir d’extraits de la bactérie Proteus morganii, dont
le potentiel stimulant s’est avéré résistant, contrairement aux phosphoantigènes, au traitement
par des phosphatases (141). Par la suite, la capacité de ces molécules à activer les
lymphocytes T Vγ9/Vδ2 a été attribuée à leur inhibition de la FPP synthase (161).
Globalement, les alkylamines sont de moins bons inhibiteurs que les aminobisphosphonates,
ce qui est reflété par leur potentiel activateur moindre.
Il est donc à présent clair que les aminobisphosphonates et les alkylamines ne sont pas des
antigènes au sens propre du terme, mais qu’ils induisent la production des phosphoantigènes
classiques par les cellules traitées avec ces composés.
71
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Figure 14. La voie du mévalonate.
Cette voie représente chez les espèces
animales la seule voie de biosynthèse du
cholestérol et de multiples composés
(vitamines, cytochromes), et des dérivés de
farnésylation et géranylation des protéines,
essentiels pour de nombreuses fonctions
cellulaires. L’IPP et le DMAPP (encadrés en
bleu) sont des intermédiaires centraux de
cette voie, et sont par ailleurs les seuls à avoir
un potentiel antigénique significatif. Les
variations de la quantité de ces antigènes par
traitement avec les aminobisphosphonates et
les alkylamines (augmentation, en vert) ou les
statines (diminution, en rouge) influencent le
potentiel stimulant de la cellule cible traitée.
N-BP : aminobisphosphonates
AA : Alkylamines
5.3)
L’Ecto-F1-ATPase
L’implication des phosphoantigènes dans la reconnaissance des cellules tumorales par les
lymphocytes T Vγ9/Vδ2 a été établie récemment, mais de nombreuses études antérieures ont
postulé que cette reconnaissance pourrait faire intervenir un antigène différent. Les protéines
de la famille Hsp ont longtemps été les candidates principales, mais des évidences directes de
leur implication n’ont jamais pu être réellement fournies.
Récemment, l’équipe a identifié l’Ecto-F1-ATPase, une forme de l’ATP synthase
mitochondriale exprimée à la surface des cellules (voir Chapitre III, p.75) comme antigène
72
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
reconnu par le TCR Vγ9/Vδ2. La spécificité de cette reconnaissance a été démontrée par
l’étude de la liaison du TCR sur de l’ATP synthase bovine purifiée par Résonance
Plasmonique de Surface (RPS) et par ELISA, ainsi que la capacité de cette dernière à activer
les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. De plus l’apolipoprotéine A-I (apoA-I, protéine majoritaire des
lipoprotéines de haute densité ou HDL) est capable de lier à la fois l’Ecto-F1-ATPase et le
TCR, renforçant probablement l’interaction entre ces deux complexes. Toutefois, cette
caractéristique pourrait dépendre de séquences particulières portées par le TCR, puisque
certains clones montrent une réactivité équivalente en présence ou non d’apoA-I (144).
L’intervention de l’apoA-I dans la biologie des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 rappelle celle de
l’apoE pour les lymphocytes NKT et souligne l’importance des liens entre l’immunité et le
métabolisme lipidique ((162) et Annexes, Article 5, p.209), bien que les fonctions précises de
ces deux apolipoprotéines ne probablement soient pas équivalentes.
Ces données pourraient également être reliées à l’implication souvent suggérée des
protéines de la famille Hsp (notamment Hsp60) dans la reconnaissance des tumeurs par les
lymphocytes T Vγ9/Vδ2 et dans les réponses inflammatoires faisant intervenir les γδ en
général (163, 164). Hsp60 est en effet une des principales chaperonnes mitochondriales
participant à la conformation des nombreuses protéines, dont des sous-unités de l’ATP
synthase (165) mais elle peut être également exprimée à la surface de divers types cellulaires
(166). Dans ces circonstances, l’Ecto-F1-ATPase pourrait être un de ses récepteurs (167). On
peut donc émettre l’hypothèse que cette liaison pourrait, comme celle de l’apoA-I, améliorer
la reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase. Ceci réconcilierait ainsi les travaux récents sur la
reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 avec l’implication
souvent décrite mais largement inexpliquée des protéines Hsp dans ce phénomène. Les
fonctions précises de l’apoA-I et Hsp60 restent cependant à élucider.
73
Introduction II : Les lymphocytes T γδ
Mes travaux de thèse ayant eu pour objet l’étude du rôle de l’Ecto-F1-ATPase dans la
reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2, le dernier chapitre de
cette introduction bibliographique sera dédiée à quelques notions sur l’ATP synthase
mitochondriale et à la revue des connaissances actuelles sur l’Ecto-F1-ATPase.
74
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE III
L’ATP SYNTHASE
De la mitochondrie
à la surface cellulaire
75
Introduction III : L’ATP Synthase
L’ATP synthase est une fascinante machine moléculaire et le parfait exemple d’un
nanomoteur. C’est l’une des enzymes les plus étudiées depuis les 40 dernières années et a
valu aux Professeurs P.D. Boyer et Sir J.E. Walker le prix Nobel de Chimie en 1997 pour
leurs travaux sur la compréhension de son mécanisme enzymatique et sur la détermination de
sa structure tridimensionnelle (168-170). Son rôle central dans la production d’énergie est
fondamental, une personne active synthétisant son propre poids en ATP chaque jour. Ce rôle
essentiel est à présent complété par de nouvelles implications dans divers processus
cellulaires, dues à une localisation inattendue de cette enzyme à la surface des cellules. Ce
dernier chapitre d’introduction sera dédié à une brève description de l’ATP synthase
mitochondriale, et à la revue des données actuelles sur l’ATP synthase de surface, aussi
appelée Ecto-F1-ATPase.
1) La F1Fo ATP synthase mitochondriale
1.1)
Généralités
La F1Fo ATP synthase, l’enzyme terminale de la voie de la phosphorylation oxydative, est
un moteur moléculaire complexe responsable de la très large majorité de la synthèse d’ATP
chez tous les organismes vivants, à l’exception des archéobactéries qui utilisent une enzyme
similaire, l’A1Ao ATP synthase (171). Elle est située au niveau de la membrane interne des
mitochondries, de la membrane thylakoïde des chloroplastes chez les plantes, et de la
membrane plasmique des bactéries. L’ATP synthase est concentrée au niveau des crêtes de la
membrane interne, où elle fait partie d’un complexe appelé “ATP synthasome” en association
avec un transporteur de phosphate inorganique (Pi) et l’Adenosine Nucleotide Translocase
(ANT) qui permet l’échange entre ADP et ATP (172). Des résultats expérimentaux suggèrent
que l’ATP synthase est organisée en dimères (173) voire même en oligomères (174). Cette
76
Introduction III : L’ATP Synthase
organisation supramoléculaire est impliquée dans la génération des crêtes et dépend de
certaines sous-unités transmembranaires (175).
1.2)
Structure
En dépit de quelques différences dans la composition en sous-unités, la structure générale
de l’ATP synthase (Figure 15) ainsi que les séquences de ses sous-unités sont extrêmement
conservées au cours de l’évolution. Dans les cellules eucaryotes, elle se compose de 16 sousunités différentes (les sous-unités α, β, et c étant présentes en plusieurs exemplaires dans le
complexe entier). Elle comprend :
-
un domaine catalytique portant l’activité enzymatique composé de trois hétérodimères αβ.
-
un rotor formé des sous-unités γ, δ, ε et de l’anneau de sous-unités c (d’un nombre
variable en fonction de l’espèce)
-
un stator comprenant les sous-unités a, b, d, e, f, g, A6L, F6 et OSCP, dont le rôle est de
maintenir les dimères αβ immobiles et ancrés à la membrane, et dont la sous-unité a fait
partie du canal à protons.
L’ATP synthase est également divisée en deux grands domaines : le domaine F1 soluble (α, β,
γ, δ, ε) portant l’activité catalytique et le domaine Fo associé à la membrane interne qui sert de
canal à protons.
La biogenèse de l’ATP synthase suit un mécanisme complexe se déroulant par étapes bien
précises (176) qui implique au moins 5 facteurs d’assemblage identifiés chez la levure :
Atp10p, Atp11p, Atp12p, Atp22p et Fmc1p (177-180). A l’heure actuelle seuls les
orthologues humains d’Atp11p et Atp12p ont été identifiés (181).
77
Introduction III : L’ATP Synthase
Figure 15. Structure de l’ATP synthase mitochondriale.
Le domaine F1 comprend les trois hétérodimères αβ ainsi que les sous-unités γ, δ et ε ; le
domaine Fo comprend toutes les sous-unités du stator (en vert) ainsi que l’anneau de sousunités c. Les sous-unités A6L, e, f et g n’ont pas été positionnées avec précision mais sont des
protéines intramembranaires très probablement associées à la sous-unité a. Lors de la synthèse
d’ATP, les protons passent au travers de la sous-unité a, intègrent l’anneau c, puis gagnent la
matrice en repassant par la sous-unité a. Ils entraînent la rotation du rotor (en orange). Le
mouvement de la chaîne γ change la conformation des sites catalytiques situés aux interfaces
α/β et permet la liaison de l’ADP et du Pi ainsi que la synthèse et la libération de l’ATP,
alternativement.
1.3)
Mécanisme enzymatique
Le domaine Fo utilise le gradient de protons créé par les quatre autres complexes de la
chaîne respiratoire. Les données actuelles indiquent que le flux de protons passe à travers la
sous-unité a pour rejoindre l’anneau de sous-unités c et entraîner sa rotation. Les autres sousunités du rotor étant solidaires de l’anneau c, la chaîne γ va elle aussi tourner sous l’action du
flux de protons. Elle interagit alternativement avec les hétérodimères αβ et change leur
conformation, permettant la synthèse d’ATP à partir d’ADP et de Pi. Dans le cas de l’ATP
78
Introduction III : L’ATP Synthase
synthase des eucaryotes, le passage de 10 protons par l’anneau c entraîne un tour complet du
rotor, et la synthèse de trois molécules d’ATP.
La synthèse et l’hydrolyse d’ATP impliquent un mécanisme de « liaison-modification »
(182, 183) dans lequel les sites catalytiques sont soumis à des modifications
conformationnelles par interaction avec la sous-unité γ. Le domaine F1 porte également trois
sites non-catalytiques dont le rôle proposé est de stabiliser l’enzyme et améliorer la synthèse
ou l’hydrolyse d’ATP en liant des nucléotides (184). Toutefois, le mécanisme enzymatique
exact est toujours débattu ; plusieurs résultats expérimentaux sont en faveur d’un mécanisme
bi-site, pour lequel un des sites catalytiques est vide à tout moment (185), ou d’un mécanisme
tri-site pour lequel tous les sites sont remplis (186). Le mécanisme rotationnel de l’ATP
synthase a été visualisé par microscopie, grâce à un couplage de la chaîne γ à un filament
d’actine fluorescent et une immobilisation des hétérodimères αβ (187).
En l’absence d’un gradient de protons, ou si le domaine F1 est artificiellement découplé du
domaine Fo, l’enzyme va se comporter comme une hydrolase d’ATP. Cette perte potentielle
d’énergie est régulée par le peptide IF1 lorsque le gradient de protons décroît, par exemple en
cas d’hypoxie qui entraîne un arrêt de la chaîne respiratoire. Dans des conditions normales,
IF1 se présente sous la forme d’un homotétramère qui se change en homodimère lorsque le pH
de la matrice mitochondriale diminue (188). Cette modification lui permet de se lier fortement
à l’ATP synthase en interagissant à la fois à l’interface des dimères αβ et avec la chaîne γ,
verrouillant ainsi la rotation de l’ATP synthase et empêchant l’hydrolyse d’ATP (189). En
plus de dépendre du pH (donc de son oligomérisation), la liaison de l’IF1 dépend de l’activité
catalytique de l’enzyme (190).
La structure et le mécanisme rotationnel de l’ATP synthase ont fait l’objet de très nombreux
travaux mais comportent toujours des éléments peu connus, tels que la localisation de
79
Introduction III : L’ATP Synthase
certaines sous-unités et le mécanisme catalytique exact. De nombreuses revues détaillent les
connaissances actuelles de façon très complète (191-193).
1.4)
Pathologies liées à l’ATP synthase
Etant donné son rôle essentiel et central dans la synthèse de l’ATP, les déficiences en ATP
synthase sont impliquées dans des pathologies graves et souvent mortelles puisqu’elles
entraînent une très forte réduction de la production d’ATP ainsi qu’une accumulation de
composés extrêmement toxiques pour la cellule tels que les espèces réactives de l’oxygène
(Reactive Oxygen Species ou ROS) (194, 195).
Ces déficiences peuvent être dues à des mutations dans les gènes des sous-unités de l’ATP
synthase, les plus fréquemment décrites touchant le gène atp6 (situé dans le génome
mitochondrial) correspondant à la sous-unité a. Ces mutations sont responsables de
pathologies neurodégénératives graves, à transmission maternelle, telles que le syndrome
NARP (Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinitis Pigmentosa) ou le syndrome de Leigh
(encéphalopathie sévère et fatale), en fonction du nombre de mutations hétéroplasmiques. Des
défauts de la biogenèse de l’ATP synthase, dus à des mutations de gènes codant pour ses
facteurs d’assemblage par exemple, ont également été décrits (196).
Pour finir, des accumulations anormales de sous-unités de l’ATP synthase ont été trouvées
dans diverses maladies neurodégénératives, par exemple la sous-unité c dans la céroïdelipofuscinose neuronale (Neuronal Ceroid Lipofuscinosis, NCL) (197, 198) ou la sous-unité α
dans la maladie d’Alzeihmer (199).
2) L’Ecto-F1-ATPase
Au cours des dernières années, de nombreux travaux réalisés par différentes équipes ont
démontré la présence à la surface de cellules de mammifères de diverses sous-unités de l’ATP
80
Introduction III : L’ATP Synthase
synthase (qui sera par la suite appelée Ecto-F1-ATPase). Bien que la structure exacte de cette
ATP synthase exprimée de façon ectopique ne soit pas encore déterminée, il existe un certain
nombre de données expérimentales indiquant qu’il s’agit probablement de la même entité que
l’ATP synthase mitochondriale.
2.1)
Ecto-F1-ATPase, la même enzyme que l’ATP synthase mitochondriale ?
Le premier travail décrivant une expression en surface d’une sous-unité de l’ATP synthase
a été publié par Das et al. (200). Ils ont montré que la sous-unité β est exprimée à la
membrane plasmique de cellules tumorales et est impliquée dans la lyse de ces cellules par les
cellules Natural Killer (NK) et Lymphokine Activated Killer (LAK). Depuis, de nombreux
travaux, incluant ceux de notre laboratoire, ont décrit la présence de nombreuses sous-unités
de l’ATP synthase à la surface d’une grande variété de cellules tumorales et normales.
Bien que la plupart de ces travaux se soient focalisés sur les sous-unités α et β, quelques
uns ont décrit la présence d’autres sous-unités à la surface de cellules. C’est le cas d’une
publication récente qui a démontré l’expression à la surface des sous-unités FoI-PVP (un
autre nom de la sous-unité b), γ et OSCP en surface d’hépatocytes de rat (201), et d’un autre
travail montrant, par une approche protéomique, que toutes les sous-unités de l’ATP synthase
étaient retrouvées au niveau des radeaux lipidiques isolés à partir de la lignée HepG2, un
hépatocarcinome humain (202). Le peptide inhibiteur IF1 a également été détecté à la surface
cellulaire (203).
Il faut noter que la préparation de membranes plasmiques pures est extrêmement difficile
à accomplir car facilement contaminée par des membranes issues d’autres organites
intracellulaires. Des quantités très faibles de matériel mitochondrial pourraient expliquer la
81
Introduction III : L’ATP Synthase
présence de sous-unités de l’ATP synthase dans ces préparations. Néanmoins, de nombreux
travaux se sont basés sur des techniques de cytométrie de flux et de microscopie, sur cellules
intactes, montrant une nette expression de ces sous-unités, et certains laboratoires utilisant des
méthodes biochimiques ont inclus des contrôles de l’absence d’autres protéines
mitochondriales dans leurs échantillons, éliminant de ce fait une possible contamination par
du matériel mitochondrial (201, 204).
Pour finir, la spécificité des anticorps utilisés pour la détection de l’Ecto-F1-ATPase pourrait
être remise en question, si ces anticorps reconnaissent des protéines portant des épitopes
communs avec l’ATP synthase (les sites nucléotidiques par exemple sont relativement
conservés dans d’autres enzymes hydrolysant l’ATP). Plusieurs travaux ont néanmoins
clairement montré que l’Ecto-F1-ATPase et l’ATP synthase mitochondriale ne sont qu’une
seule et unique entité, en utilisant des techniques de spectrométrie de masse et de séquençage
peptidique (200, 202, 205).
La présence de sous-unités autres qu’α et β n’est d’ailleurs pas complètement inattendue. En
effet, ces sous-unités ne comportant aucun domaine transmembranaire, l’expression d’autres
protéines du complexe (notamment du domaine Fo) à la surface des cellules est à priori
requise pour permettre une telle localisation de l’enzyme.
En résumé, bien qu’une preuve formelle et définitive manque toujours, il semble à présent
très probable que l’Ecto-F1-ATPase soit une forme exprimée en surface de l’ATP synthase
mitochondriale. La liste des types cellulaires exprimant l’Ecto-F1-ATPase suggère par ailleurs
que cette localisation ectopique n’est pas restreinte à un nombre limité de lignées cellulaires,
mais apparaît comme très fréquente (Tableau 3). Parmi tous les types cellulaires que nous
avons étudiés en utilisant diverses approches, seule la lignée 721.221 (une lignée B
82
Introduction III : L’ATP Synthase
immortalisée par l’EBV) semble ne pas exprimer l’Ecto-F1-ATPase, ou du moins à des
niveaux trop faibles pour être réellement détectables (204).
Cellules / Tissus
Sous-unités
Méthodes Références
K562, A549, Raji
β
B, CF, S
(200)
HUVEC
α, β, IF1
(203, 206)
HepG2, IHH, Hépatocytes humains
α, β
(205)
3T3-L1
α, β
CF, MC
RPS, CF,
MC
B, MC
Jurkat
β
PR + SM
(208)
Hepatocytes de rat
α, β, δ, γ, b, d, e, F6,
OSCP
MC
(202)
HaCat, peau humaine
β
PR + SM,
MC
(209)
CF
(144)
Daudi, RPMI-8226, U937, SK-NEP, G401,
α et/ou β
G402
Awells, ST-EMO, HeLa, fibroblastes, Rmaα, β
S
Amygdale de rat
β
(207)
B, MC, CF (204)
MP
(210)
Neurones (hippocampe), neuroblastome et
astrocytome
α
B, MC
(211)
Ostéosarcome
α, β, d
MC
(212)
Tableau 3. Sous-unités de l’Ecto-F1-ATPase à la surface de divers types cellulaires.
Les principaux tissus et lignées cellulaires exprimant l’Ecto-F1 sont résumés ici.
Les méthodes expérimentales utilisées sont précisées. B : biotinylation de protéines de
surface ; CF : Cytométrie de Flux ; S : Séquençage ; MC : Microscopie Confocale ; RPS :
Résonance Plasmonique de Surface (Biacore) ; PR + SM : Purification de Radeaux lipidiques
et Spectrométrie de Masse ; MP : préparations de Membranes Plasmiques.
Les lignées cellulaires sont d’origine humaine, sauf mention contraire.
K562 : Erythroleucémie ; A549 : Adénocarcinome pulmonaire ; RPMI-8226 : Myélome B ;
Raji, Daudi : Lymphomes de Burkitt ; Jurkat : Lymphome T ; HUVEC : cellules endothéliales
humaines de veine du cordon ombilical ; HepG2 : Hépatocarcinome ; IHH : Hépatocypes
immortalisés ; 3T3-L1 : fibroblastes murins (différenciés en adipocytes) ; HaCat :
Kératinocytes immortalisés ; U937 : Leucémie monocytaire ; SK-NEP, G401, G402 :
Adénocarcinomes rénaux ; Awells, ST-EMO : lymphocytes B immortalisés par l’EBV (STEMO provenant d’un patient atteint d’une déficience en CMH-I) ; HeLa : Adénocarcinome du
col de l’utérus ; Rma-S : Lymphome T murin.
83
Introduction III : L’ATP Synthase
2.2)
Une localisation inattendue et toujours inexpliquée
Bien que des localisations subcellulaires multiples aient été décrites pour de nombreuses
protéines, une expression de protéines mitochondriales à la surface des cellules est
relativement rare et intrigante. A notre connaissance, il n’y a pas à l’heure actuelle de travaux
décrivant le mécanisme utilisé par l’ATP synthase pour atteindre la surface cellulaire.
Deux hypothèses sont envisageables :
a) Les sous-unités de l’ATP synthase sont adressées à la membrane plasmique au lieu de la
mitochondrie. Le concept de localisation multiple d’une protéine est relativement établi de
nos jours et de nombreux mécanismes peuvent être impliqués (voir (213) pour une revue
complète). Le premier impliquerait des isoformes différentes d’ARNm des sous-unités de
l’ATP synthase, portant un peptide signal différent. C’est le cas de la sous-unité c bovine,
pour laquelle deux isoformes ont été identifiées (214) mais ceci représente un cas isolé et à
notre connaissance il n’y a pas de données expérimentales indiquant que ces différents
peptides adressent l’ATP synthase à des destinations différentes.
Une autre explication possible serait que les peptides signaux des sous-unités de l’ATP
synthase soient ambigus, ce qui conduirait à une expression dans la mitochondrie ou à la
surface des cellules. L’analyse des peptides signaux de l’ATP synthase à l’aide du programme
SignalP (215) montre que certains portent des similarités avec des peptides d’adressage à la
membrane plasmique, mais ce n’est le cas que pour un nombre très limité de sous-unités.
Pour finir, certaines protéines portent deux peptides signaux distincts, les adressant à des
localisations différentes, comme par exemple la Catalase A chez la levure (216). Cette
dernière possibilité semble peu probable étant donné que les séquences des sous-unités de
l’ATP synthase sont bien connues et ne semblent pas porter de peptide signal en plus de celui
d’adressage à la mitochondrie.
84
Introduction III : L’ATP Synthase
Même si cette première hypothèse ne peut pas être définitivement exclue, elle est à priori
la moins probable, pour un certain nombre de raisons. Tout d’abord, elle impliquerait que
toutes les sous-unités de l’ATP synthase portent des peptides signaux ambigus, ou qu’il existe
différentes isoformes, et il n’y a à l’heure actuelle aucun élément dans ce sens, malgré une
connaissance très précise des séquences de ces sous-unités. De plus, deux sous-unités (a et
A6L) sont codées par des gènes mitochondriaux, et il semble peu probable qu’elles soient
adressées à la membrane plasmique au lieu de rester dans la mitochondrie. Pour finir, les
facteurs d’assemblage de l’ATP synthase devraient également avoir une autre localisation
pour permettre l’expression du complexe entier et sa conformation correcte.
b) L’hypothèse la plus simple, et donc la plus tentante, est qu’une fois assemblée dans la
mitochondrie, l’ATP synthase est exportée à la membrane plasmique. Comme un « simple »
routage de l’ATP synthase par des transporteurs semble peu probable étant donné la taille du
complexe (environ 600kDa et 19x11nm), cela signifierait que l’enzyme atteindrait la surface
cellulaire via un transport vésiculaire ou une fusion des membranes mitochondriales avec la
membrane plasmique.
Dans des conditions normales, les mitochondries forment un réseau complexe et
dynamique, constamment remodelé par des évènements de fusion et de fission. Ce
phénomène implique diverses protéines récemment identifiées telles que les mitofusines ou
Drp1 (217, 218). Une fusion directe des membranes mitochondriales avec la membrane
plasmique est difficile à envisager, les mitochondries possédant deux membranes et l’ATP
synthase étant localisée au niveau de la membrane interne, à moins que la fusion se déroule au
niveau des points de contact. Ces derniers sont des structures distinctes, où membrane interne
85
Introduction III : L’ATP Synthase
et externe sont fusionnées, et jouent un rôle important dans le métabolisme mitochondrial et
l’apoptose (219).
Toutefois, des données expérimentales récentes indiquent que les mitochondries peuvent
communiquer avec d’autres compartiments intracellulaires. C’est le cas du Réticulum
Endoplasmique (RE), et cette interaction fait intervenir la mitofusine 2, permettant l’échange
de calcium entre ces organelles (220). Bien qu’aucun travail à notre connaissance n’ait encore
montré un échange de protéines entre RE et mitochondrie, ceci reste une hypothèse tentante
qui pourrait permettre à des protéines mitochondriales d’atteindre la surface cellulaire en
transitant par la voie de secrétion classique RE-golgi.
D’autres travaux ont identifié une nouvelle protéine, MAPL (Mitochondria Anchored
Protein Ligase), caractérisant des vésicules émergeant de la mitochondrie et adressées aux
peroxysomes. De plus, ces mêmes travaux ont décrit d’autres vésicules, caractérisées par le
marqueur Tom20 (Translocase of Outer Membrane 20, un membre du complexe d’import des
protéines mitochondriales codées par des gènes nucléaires) ne fusionnant pas avec les
peroxysomes. Leur destination est à l’heure actuelle en cours d’étude (221).
Par ailleurs, il a été montré que la chaperonne mitochondriale Hsp60 est alternativement
localisée dans des vésicules distinctes des organelles majeurs qui pourraient communiquer
avec la membrane plasmique (222). De façon notable, Hsp60 a été décrite en surface de
différents types cellulaires.
Dans les deux cas, ces vésicules (toujours non caractérisées) pourraient représenter un
système de transport assurant la communication et le routage de protéines entre la
mitochondrie et la membrane plasmique, permettant l’expression en surface de protéines
mitochondriales spécifiques.
86
Introduction III : L’ATP Synthase
Un autre élément discuté de l’expression de l’Ecto-F1-ATPase est sa sous-localisation au
sein de la membrane plasmique. Certaines de ses sous-unités, ainsi que quelques autres
protéines mitochondriales, ont été identifiées dans les radeaux lipidiques à l’aide de méthodes
de protéomique (202, 208). Toutefois, un récent travail suggère que ces protéines
mitochondriales, dont l’ATP synthase, seraient dans le meilleur des cas des contaminants des
préparations de radeaux lipidiques. Ceci est surtout basé sur le fait que dans cette étude les
protéines mitochondriales en question se sont avérées résistantes à la déplétion du cholestérol
par la Methyl-β-cyclodextrine, alors que les protéines résidant dans les radeaux lipidiques y
sont habituellement sensibles (223).
Néanmoins, la détection de l’ATP synthase par microscopie confocale révèle généralement un
profil en patchs, ce qui peut être le cas pour des protéines résidant dans les radeaux lipidiques
(204, 205). Nous possédons également des éléments expérimentaux montrant une colocalisation au moins partielle de l’Ecto-F1-ATPase avec des marqueurs de radeaux lipidiques
(données non publiées). Ceci pourrait indiquer que la présence de l’Ecto-F1-ATPase dans les
radeaux lipidiques n’est pas absolue et pourrait être variable en fonction du type cellulaire, et
dépendre de la méthode de purification des radeaux lipidiques. La sous-localisation précise de
l’Ecto-F1-ATPase au niveau de la membrane plasmique est donc toujours très débattue, et le
mécanisme conduisant à cette expression ectopique reste énigmatique.
2.3)
Nouvelle localisation, nouveaux rôles
Le terme « moonlighting proteins » (« to moonlight » est une expression anglaise
désignant le cumul d’emplois) a été introduit en 1999 par C.J. Jeffery pour désigner des
protéines pouvant avoir de multiples fonctions bien distinctes. Celles-ci peuvent dépendre de
différents facteurs : localisations multiples, expression dans des cellules différentes pouvant
créer un contexte différent, concentration en ligand, etc. (224). L’ATP synthase est un parfait
87
Introduction III : L’ATP Synthase
exemple de « moonlighting protein ». En effet, certaines de ses sous-unités sont impliquées
dans des mécanismes cellulaires très différents de son rôle classique dans la synthèse d’ATP.
La sous-unité α, par exemple, a été décrite comme participant à un complexe d’import d’ARN
de transfert (ARNt) cytosoliques dans la mitochondrie (225). La sous-unité F6 (ou CF6) a été
détectée dans le plasma et serait impliquée dans l’hypertension, en se liant à l’Ecto-F1ATPase sur les cellules endothéliales (226), mais le mécanisme précis régissant ce
phénomène n’a pas encore été caractérisé. De plus, il apparaît clair à présent que l’expression
ectopique de ce complexe enzymatique est impliquée dans de nombreux phénomènes
physiologiques, en fonction du ligand et du type cellulaire (Tableau 4).
A l’heure actuelle, les fonctions les mieux caractérisées de l’Ecto-F1-ATPase sont : son
implication dans l’endocytose des lipoprotéines de haute densité (High Density Lipoproteins
ou HDL) par les hépatocytes ; la survie et la prolifération des cellules endothéliales ; et enfin
la reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Ce dernier point
ayant été abordé précédemment (Chapitre II, section 5.3, p.72) et étant donné qu’il sera traité
en détail dans la partie Résultats Expérimentaux, il ne sera pas développé ici.
2.3.1) Métabolisme du HDL-cholestérol
Les travaux de l’équipe sur les lipoprotéines de haute densité (HDL) ont permis
d’identifier l’Ecto-F1-ATPase comme récepteur de l’Apolipoprotéine A-I (apoA-I, protéine
majoritaire des HDL) à la surface des hépatocytes. La liaison des HDL sur des membranes
d’hépatocytes révèle deux sites de liaison, de basse et de haute affinité (227). Le récepteur de
haute affinité, liant également l’apoA-I libre (délipidée) a été purifié par Résonance
Plasmonique de Surface (RPS) et identifié comme étant la chaîne β de l’ATP synthase.
88
Introduction III : L’ATP Synthase
Cellules/Tissus
K562, A549,
Raji
Ligands
Rôles proposés
Références
Lyse des cellules tumorales par les
cellules NK/LAK
(200)
HUVEC
Angiostatine
HDL/apoA-I
CF6
Survie cellulaire via la synthèse d'ATP.
Survie cellulaire via l'activation des
récepteurs purinergique.
Contrôle de la tension artérielle
(226, 228,
229)
Hepatocytes
HDL/apoA-I
Endocytose des HDL
(205)
Survie cellulaire ?
(207, 209)
3T3-L1, HaCat
?
?
Cellules
tumorales
TCR Vγ9/Vδ2,
apoA-I, CMH-I
Reconnaissance des cellules tumorales
par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2
(144, 204)
Amygdale
(souris)
Entérostatine
Régulation de la prise alimentaire ?
(210)
Neurones
APP, Amyloid
β-peptide
Régulation de la plasticité synaptique ?
(211)
Tableau 4. Rôles et ligands de l’Ecto-F1-ATPase.
Les principaux rôles décrits de l’Ecto-F1-ATPase, et les ligands associés, sont résumés.
NK : Natural Killer ; LAK : Lymphokine Activated Killer ; HDL : Lipoprotéines de Haute
Densité ; apoA-I : apolipoprotéine A-I ; CF6 : Coupling Factor 6 ; ATP : Adénosine
TriPhosphate ; APP : Amyloid Precursor Protein.
Sauf mention contraire les types cellulaires référencés sont d’origine humaine.
K562 : Erythroleucémie ; A549 : Adénocarcinome pulmonaire ; Raji : Lymphome de Burkitt ;
HUVEC : Cellules endothéliales de veine du cordon ombilical ; 3T3-L1 : Fibroblastes murins
(différenciés en adipocytes) ; HaCat : Kératinocytes immortalisés.
L’apoA-I étant capable d’activer l’endocytose de la particule HDL entière par les sites de
basse affinité, l’équipe a émis l’hypothèse que l’activité enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase
joue un rôle dans ce processus. En effet, l’ajout d’ADP dans le milieu est également capable
de stimuler l’endocytose des HDL, avec une amplitude comparable à celle de l’apoA-I.
La liaison de l’apoA-I sur l’Ecto-F1-ATPase entraîne une augmentation de son activité
hydrolase et mène à une stimulation de l’internalisation des HDL. A l’inverse, l’inhibiteur de
l’activité hydrolase de l’ATP synthase, IF1, induit une diminution de cette internalisation
(205). Le récepteur purinergique P2Y13 a par la suite été identifié comme étant la cible de
89
Introduction III : L’ATP Synthase
l’ADP produit par l’Ecto-F1-ATPase (230) et les travaux récents de l’équipe ont montré que la
petite GTPase RhoA et son effecteur ROCK I sont activés en aval de la voie Ecto-F1-ATPase
/ P2Y13 (231).
Plus récemment, nous avons montré que cette voie d’endocytose peut également être régulée
par une activité de type Adenylate Kinase qui consomme l’ADP généré par l’Ecto-F1-ATPase
après liaison de l’apoA-I, diminuant ainsi de façon constitutive l’activation du récepteur
P2Y13 et donc la captation des HDL par les hépatocytes ((232), Résultats IV, Article 4,
p.159). Les travaux les plus récents de l’équipe sont focalisés sur l’étude de cette voie dans
des modèles murins et ont pour but de développer de nouveaux traitements améliorant le turnover des HDL, ce qui pourrait représenter une méthode efficace de traitement et de prévention
de l’athérosclérose.
2.3.2) Survie et prolifération des cellules endothéliales
L’Ecto-F1-ATPase a également été caractérisée par le groupe de S.V. Pizzo comme étant
le récepteur de l’angiostatine, un inhibiteur de l’angiogénèse issu de la protéolyse du
plasminogène (233). Les travaux suivants de ce groupe ont établi que l’Ecto-F1-ATPase en
surface des cellules endothéliales est capable de synthétiser de l’ATP. Cette propriété
participerait à la prolifération des cellules, particulièrement en conditions d’hypoxie qui
compromettent la survie cellulaire notamment par l’inhibition de la phosphorylation
oxydative. L’angiostatine serait capable d’inhiber cette activité de synthèse, prévenant ainsi la
génération d’ATP et diminuant la prolifération. Les auteurs proposent également que cette
inhibition empêche l’extrusion de protons par l’Ecto-F1-ATPase, ce qui diminuerait le pH
intracellulaire et donc compromettrait la survie des cellules (206, 228, 234).
90
Introduction III : L’ATP Synthase
Les HDL et l’apoA-I sont également connues pour leur rôle protecteur contre le
développement de dysfonctionnements de l’endothélium, un des premiers évènements dans la
pathogenèse de l’athérosclérose, en améliorant la survie des cellules endothéliales. Le
mécanisme impliqué dans cette « athéroprotection » est mal connu. Etant donné que les HDL
ainsi que l’apoA-I lient l’Ecto-F1-ATPase l’équipe a émis l’hypothèse que l’effet protecteur
de ces lipoprotéines dépend de l’activité de l’Ecto-F1-ATPase.
D’une façon similaire aux mécanismes d’endocytose des HDL discutés précédemment (205),
l’activité hydrolytique de l’Ecto-F1-ATPase en surface des cellules endothéliales peut être
augmentée par l’apoA-I, stimulant ainsi la prolifération des cellules endothéliales d’une
manière dose-dépendante. A l’inverse, l’inhibition de l’Ecto-F1-ATPase par IF1, l’angiostatine
ou des anticorps dirigés contre la chaîne β de l’ATP synthase augmente l’apoptose et bloque
la prolifération en conditions basales, mais également en compétition avec l’apoA-I (229).
Les résultats obtenus ont donc démontré pour la première fois un effet direct de l’activité
enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase sur la survie des cellules endothéliales, via une production
extracellulaire d’ADP. Les récepteurs et les voies de signalisation en aval ne sont pas encore
caractérisés mais les récepteurs purinergiques sensibles à l’ADP pourraient être impliqués.
L’Ecto-F1-ATPase a donc des rôles divers (dont les principaux sont schématisés en Figure
16), dépendant du type cellulaire considéré ainsi que du ligand impliqué. Il est probable
qu’elle puisse intervenir dans de nombreuses autres fonctions cellulaires. A l’exception de la
reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (même si nous ne
l’excluons pas de façon définitive pour l’instant) ces rôles semblent impliquer l’activité
enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase. Alors qu’une activité de type ATP hydrolase est largement
envisageable puisqu’elle ne requiert ni flux de protons, ni la présence de toutes les sous-unités
de l’ATP synthase, la possibilité d’une activité synthase est très débattue.
91
Introduction III : L’ATP Synthase
Figure 16. Quelques rôles de l’Ecto-F1-ATPase.
Les rôles les mieux caractérisés de l’Ecto-F1-ATPase sont schématisés ici.
(1) Endocytose des HDL par les hépatocytes. La liaison de l’apoA-I sur l’Ecto-F1-ATPase
augmente son activité hydrolase. L’ADP formé active P2Y13, qui stimule l’endocytose des
particules HDL entières via un récepteur non caractérisé (HDLR). Ce mécanisme dépend
d’une voie de signalisation RhoA/ROCK-I. Une activité de type Adénylate Kinase (AK)
peut réguler de façon négative cette endocytose en consommant l’ADP produit.
(2) Survie des cellules endothéliales. En milieu acide, la production d’ATP par l’Ecto-F1ATPase améliore la survie et la prolifération en régulant le pH intracellulaire et en
fournissant une source d’ATP alternative en cas de dysfonctionnement de la chaîne
respiratoire.
(3) Survie des cellules endothéliales. La production d’ADP stimulée par l’apoA-I (ou les
HDL) active probablement un récepteur purinergique (P2Y?). Les voies de signalisation
en aval passent par Akt, connue pour inhiber l’apoptose et favoriser l’expression de gènes
favorisant la survie.
(4) Reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Ces lymphocytes
reconnaissent les cellules tumorales via l’interaction de leur TCR avec l’Ecto-F1-ATPase,
qui peut être augmentée par l’apoA-I. Ceci entraîne une activation de la machinerie
cytotoxique et une secrétion de cytokines pro-inflammatoires. Une faible expression du
CMH-I et une production de phosphoantigènes par la cellule cible sont probablement
nécessaires pour une activation optimale des lymphocytes.
92
Introduction III : L’ATP Synthase
2.4)
Synthétiser ou ne pas synthétiser, telle est la question
De nombreux groupes, incluant notre équipe, ont étudié les propriétés enzymatiques de
l’Ecto-F1-ATPase. Puisqu’elles semblent impliquées dans de nombreux rôles physiologiques,
leur caractérisation est un point important de l’étude de ce complexe enzymatique exprimé à
la surface des cellules. A l’heure actuelle, il existe de nombreuses contradictions entre les
résultats de différents groupes. Certains travaux montrent que l’Ecto-F1-ATPase est capable
de synthétiser ou d’hydrolyser de l’ATP, tandis que d’autre résultats, incluant ceux de
l’équipe, n’ont pu mettre en évidence qu’une activité de type hydrolase. Plusieurs éléments
théoriques sont à prendre en compte. Le potentiel moyen de la membrane plasmique des
cellules « non-activables » (excluant donc les neurones, ou les cellules musculaires par
exemple) est de -40mV, alors qu’il est de -200mV environ pour la membrane interne de la
mitochondrie. Il est donc peu probable que le potentiel de la membrane plasmique soit
suffisant pour générer un flux de protons pouvant entraîner la synthèse d’ATP.
De plus, dans ces deux configurations, l’orientation des sous-unités de l’ATP n’est pas la
même par rapport au potentiel. Dans le cas de la membrane plasmique, le domaine F1 est donc
situé du côté chargé positivement. Il faudrait une inversion complète et suffisamment forte du
potentiel de membrane pour que l’Ecto-F1-ATPase soit capable de synthétiser de l’ATP.
Les travaux du groupe de S.V. Pizzo, repris par différents groupes dans des modèles
cellulaires différents, ont montré qu’une activité de type synthase peut être observée par
simple ajout d’ADP dans le milieu extracellulaire (206, 207, 209). Or, ceci n’est pas
compatible avec les points discutés précédemment. L’implication de l’Ecto-F1-ATPase dans
cette production d’ATP a généralement été démontrée par l’utilisation de l’oligomycine, un
inhibiteur classique de l’ATP synthase mitochondriale. Toutefois, l’oligomycine pourrait agir
sur d’autres enzymes, telles que la H,K ATPase non-gastrique (235). Son utilisation pour la
93
Introduction III : L’ATP Synthase
démonstration d’une activité de type synthase par l’Ecto-F1-ATPase apparaît donc
compromise étant donné son manque de spécificité.
Des travaux plus récents ont montré que la diminution du pH extracellulaire améliore la
production d’ATP par l’Ecto-F1-ATPase et il a été proposé que cette synthèse améliorerait la
survie des cellules tumorales en milieu acide (228, 234) en pompant des protons indésirables
hors de la cellule. Ceci serait analogue au rôle de l’ATP synthase dans la survie des bactéries
en conditions acides (236). Toutefois, l’orientation de l’ATP synthase bactérienne est inversée
(par rapport à celle de l’Ecto-F1-ATPase) et donc dans ce cas l’extrusion de protons
consomme de l’ATP. Le fait que l’Ecto-F1-ATPase puisse synthétiser de l’ATP tout en
pompant des protons depuis un compartiment neutre vers un compartiment acide défie la
notion établie que le transport actif allant à l’encontre d’un gradient consomme de l’énergie,
comme c’est le cas pour l’ATP synthase bactérienne.
Les travaux récents du groupe de S. Papa sont également en faveur d’une activité de type
synthase. En revanche, dans leur étude, Mangiullo et al. (201) ont montré que l’augmentation
du pH extracellulaire entraîne une amélioration de la synthèse d’ATP. Ceci paraît à priori plus
logique et en accord avec les notions de dynamique des flux, si l’Ecto-F1-ATPase est
effectivement capable de synthétiser de l’ATP. Ils ont également pu observer que cette
activité est corrélée à un flux de protons sensible à l’oligomycine entre le cytoplasme et le
milieu extracellulaire (201). Une quantification plus précise du flux de protons serait
nécessaire pour déterminer s’il est suffisant pour assurer une synthèse d’ATP par l’Ecto-F1ATPase. Comme discuté précédemment, l’oligomycine étant potentiellement capable
d’inhiber d’autres pompes à protons, le rôle réel de l’Ecto-F1-ATPase dans la création de ce
flux reste très incertain. Pour finir, ils suggèrent qu’une acidification du cytoplasme en
activant la glycolyse par ajout de glucose permet également d’augmenter la synthèse d’ATP
94
Introduction III : L’ATP Synthase
par l’Ecto-F1-ATPase. Néanmoins, il n’est pas certain que cette acidification soit
suffisamment forte pour permettre cette activité. Dans des conditions relativement similaires,
mais sur des modèles de neurones, les concentrations de glucose utilisées entrainent au mieux
une réduction du pH intracellulaire de l’ordre de 0,3 unités, ce qui n’est probablement pas
suffisant pour permettre une synthèse d’ATP (237).
Nos travaux, ainsi que ceux d’autres laboratoires, ont déterminé que l’Ecto-F1-ATPase est
dépourvue d’activité synthase. Yegutkin et al. ont montré que la production d’ATP après
ajout d’ADP sur cellules endothéliales n’est pas améliorée par l’ajout de Pi, ce qui devrait être
le cas puisque l’Ecto-F1-ATPase synthétise l’ATP via la réaction ADP + Pi Æ ATP. Ils en ont
conclu que la phosphorylation de l’ADP en ATP est principalement due à des activités
extracellulaires de type Adenylate Kinase (AK, qui produit de l’ATP et de l’AMP à partir de
deux molécules d’ADP) et Nucleoside DiPhospho Kinase (NDPK, qui transfère le phosphate
terminal entre un nucléotide triphosphate et un nucléotide diphosphate) (238). Ces
conclusions concordent avec nos propres résultats montrant qu’en surface des hépatocytes et
des cellules endothéliales, l’ajout d’ADP tritié et de
32
Pi n’entraîne aucune synthèse d’ATP
doublement marqué, et produit uniquement de l’ATP tritié. Nous n’avons également jamais
observé de diminution de la production d’ATP en présence d’oligomycine dans nos modèles
cellulaires (205, 229, 232).
En conclusion, l’activité synthase de l’Ecto-F1-ATPase est loin d’être établie et des études
plus poussées, ainsi qu’une ré-évaluation des techniques et inhibiteurs utilisés par le passé,
sont clairement indispensables.
95
Introduction III : L’ATP Synthase
3) Une fascinante enzyme qui n’a pas encore révélé tous ses secrets.
Quinze ans après les premiers travaux montrant l’expression d’une sous-unité de l’ATP
synthase en surface de cellules tumorales par Das et al. (200), les données provenant de très
nombreux laboratoires ont confirmé cette expression ectopique d’une enzyme jusqu’alors
considérée comme résidant en permanence dans la mitochondrie. Il y a toujours un grand
besoin d’une caractérisation définitive de son activité enzymatique, de sa structure exacte,
ainsi que de données sur son mécanisme d’expression en surface.
L’activité synthase de l’Ecto-F1-ATPase est toujours fortement discutable que ce soit au
niveau théorique ou expérimental. Il s’agit d’un point fondamental qui requiert des travaux
additionnels et pourrait dépendre du développement de nouvelles techniques plus spécifiques
et plus sensibles que celles utilisées à l’heure actuelle. A l’heure actuelle la mesure de la
production d’ATP doublement marqué à partir d’ADP tritié et de
32
Pi par HPLC est
probablement la meilleure méthode pour déterminer si l’Ecto-F1-ATPase est réellement
capable de synthétiser de l’ATP, puisqu’il s’agit de la seule enzyme capable de générer de
l’ATP à partir d’ADP et de Pi libre. Il devrait donc s’agir de la méthode de choix pour toute
tentative de détermination des propriétés enzymatiques de l’Ecto-F1-ATPase.
Comprendre le mécanisme d’expression de l’Ecto-F1-ATPase en surface est également un
point crucial, mais très délicat. Etant donné que l’utilisation d’ARN interférents dirigés contre
des sous-unités de l’ATP synthase est difficilement envisageable puisque cela entraînerait une
mort rapide des cellules, inhiber son expression en surface devrait se révéler plus simple,
efficace, et à priori moins destructeur pour la cellule cible. A notre connaissance, à l’heure
actuelle un seul travail a montré que l’expression de la sous-unité α à la surface de neurones
peut être inhibée par la Brefeldine A, un inhibiteur classique du transport transgolgien (211).
96
Introduction III : L’ATP Synthase
Un travail récent a montré qu’une déficience en Palmitoyl protein transferase 1 (Ppt1),
responsable du syndrome de ceroïde-lipofuscinose neuronale infantile, est liée à une
augmentation de l’expression de l’Ecto-F1-ATPase par les neurones (239). Ceci suggère que
Ppt1 pourrait être impliquée dans la régulation de la localisation subcellulaire de l’ATP
synthase. De plus, il a récemment été montré que la niacine (vitamine B3) était capable
d’inhiber l’expression de l’Ecto-F1-ATPase. De façon notable, la niacine est connue depuis de
très nombreuses années pour augmenter le taux de HDL circulantes (240). Ceci confirme
donc, bien qu’indirectement, les résultats de l’équipe sur l’implication de l’Ecto-F1-ATPase
dans l’endocytose des HDL. Toutefois, ces deux derniers travaux n’ont fourni aucune donnée
sur le mécanisme de l’expression de l’Ecto-F1-ATPase. Des études poussées sont donc
définitivement nécessaires pour caractériser ce mécanisme.
Pour finir, la manipulation de l’activité enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase au lieu de son
expression en surface pourrait également être d’un grand intérêt. A ce sujet, plusieurs options
sont possibles. Des ligands régulant son activité, tels que l’apoA-I, IF1, CF6 ou l’angiostatine
peuvent être utilisés. Des moyens indirects sont également envisageables ; il a par exemple
été montré que la calmoduline interagit avec l’IF1, et pourrait diminuer sa disponibilité en
surface des cellules, augmentant donc l’activité de l’Ecto-F1-ATPase (241, 242).
L’ATP synthase est donc impliquée, en plus de son rôle central dans la production de
l’ATP et grâce à son expression à la surface des cellules, dans de très nombreuses fonctions
cellulaires faisant intervenir des ligands très différents. Nous n’en sommes qu’aux premiers
pas de la compréhension de ces nouvelles fonctions. Elle pourrait s’avérer être une cible
intéressante dans le traitement de pathologies variées comme le cancer ou l’athérosclérose.
97
Introduction III : L’ATP Synthase
Les chapitres suivants détailleront les résultats expérimentaux obtenus au cours de ma thèse
portant sur la caractérisation du rôle de l’Ecto-F1-ATPase dans la reconnaissance des cellules
tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
98
RESULTATS EXPERIMENTAUX
Partie I
Interaction entre l’Ecto-F1-ATPase et
le Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I
99
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
1) Introduction
La reconnaissance de cellules infectées ou tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2,
hormis quelques cas particuliers mentionnés précédemment (Tableau 2, p.64) n’est pas
restreinte au sens strict du terme par le CMH. Leur activation est toutefois finement régulée
par le CMH-I via sa reconnaissance par de nombreux récepteurs inhibiteurs et activateurs, les
NKR.
A l’origine décrite à la surface de quelques lignées cellulaires, l’expression de l’Ecto-F1ATPase a été étendue à d’autres types cellulaires très différents. Pourtant, nos résultats
initiaux indiquent que des lignées très proches peuvent différer. Par exemple, les sous-unités
α et β sont détectables par cytométrie de flux sur la lignée Daudi mais pas sur Raji, deux
lignées B issues de lymphomes de Burkitt (144). De plus, Daudi diffère principalement de
Raji du fait qu’elle n’exprime pas le CMH-I, le gène de la β2m étant muté dans cette lignée.
L’analyse de la détection de l’Ecto-F1-ATPase à la surface de plusieurs lignées cellulaires
par cytométrie de flux nous a suggéré qu’elle était corrélée négativement à celle du CMH-I.
En effet, hormis le cas de 721.211, toutes les lignées sur lesquelles l’Ecto-F1-ATPase peut être
détectée n’expriment que peu, voire pas du tout, les molécules du CMH-I.
Nous avons donc cherché à comprendre cette corrélation inverse et nous avons pu montrer
que l’Ecto-F1-ATPase interagit avec les molécules de CMH-I à la surface des cellules. Cette
interaction masque les épitopes reconnus par les anticorps commerciaux dirigés contre les
sous-unités α et β et d’ATP synthase et pourrait donc participer au contrôle de l’activation des
lymphocytes T Vγ9/Vδ2. L’expression de l’Ecto-F1-ATPase apparaissant à présent comme un
phénomène ubiquitaire, ceci permettrait donc de contrôler une potentielle auto-réactivité des
ces lymphocytes cytotoxiques.
100
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
2) Article 1
101
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
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Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
3) L’interaction est-elle spécifique d’un ou plusieurs isotypes de CMH-I ?
3.1)
Introduction
Le CMH-I regroupe de nombreux isotypes différents, classés en deux groupes : les
isotypes classiques (HLA-A, -B et -C) et non classiques (HLA-E, -F, -G et les molécules
apparentées comme CD1). Nous avons donc cherché à savoir si l’Ecto-F1-ATPase interagit
avec toutes ces molécules, ou avec des isotypes particuliers.
Le rôle principal des isotypes classiques est de présenter des peptides aux lymphocytes T
αβ CD8+ et ils sont également reconnus par divers NKR. Les molécules non-classiques ont
des spécificités et des fonctions diverses. HLA-E lie le plus souvent des peptides issus des
séquences d’adressage des autres isotypes de CMH-I à la membrane plasmique. Il est
principalement reconnu par CD94/NKG2A, un NKR hétérodimérique de type inhibiteur (243)
et exprimé par la plupart des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Tous ces isotypes sont donc des
candidats potentiels.
HLA-F étant très peu détecté à la surface des cellules qui l’expriment (244) et l’expression
d’HLA-G étant excessivement restreinte, peut-être même aux cellules du trophoblaste seules
(245), nous avons exclu ces deux isotypes. Nos résultats précédents indiquant que les
molécules de CMH-I impliquées sont dépendantes de la β2m et reconnues par l’anticorps
W6/32, nous avons également exclu les molécules telles que MICA/B et CD1. Ceci ne
signifie néanmoins pas que ces molécules n’interagissent pas avec l’Ecto-F1-ATPase, mais
que dans les modèles cellulaires que nous avons utilisé, ce ne sont à priori pas elles qui sont
impliquées dans le masquage d’épitopes que nous avons observé.
Nous avons donc cloné les isotypes -A, -B, -C et -E à partir de la lignée Raji dont
l’expression de l’Ecto-F1-ATPase en surface n’est détectable qu’après dénaturation des
109
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
molécules du CMH-I. Les ADNc ont été transfectés dans la lignée K562 qui exprime l’EctoF1 mais pas le CMH-I. Nos résultats indiquent que l’Ecto-F1-ATPase interagit
préférentiellement avec HLA-B. L’expression de ce dernier entraine une forte diminution de
l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. En revanche, bien que la diminution de l’expression
d’HLA-B par utilisation d’ARNi sur ces transfectants permette à nouveau une détection
partielle de l’Ecto-F1-ATPase, elle n’est pas capable de restaurer la capacité de stimulation de
ces cellules. Ceci suggère donc qu’une faible expression d’HLA-B ou que d’autres molécules
non identifiés sont capables d’inhiber les lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
3.2)
Matériel et méthodes
Lignées et culture cellulaires.
Les lignées K562 et Raji proviennent de l’ATCC et ont été cultivées en RPMI 1640
Glutamax complémenté par 10% de Sérum de Veau Fœtal décomplémenté (SVF), du
pyruvate de sodium et de la pénicilline/streptomycine (RPMI complet). Tous les réactifs de
culture proviennent d’Invitrogen.
Les lignées Vγ9/Vδ2 ont été obtenues à partir de PBMC (Peripheral Blood Mononuclear
Cells) purifiés par gradient de centrifugation (Ficoll) à partir de « buffy coats » provenant de
L’Etablissement Français du Sang de l’hôpital Purpan, Toulouse. Brièvement, 108 PBMC ont
été cultivées en présence d’IPP, 5µM (Isoprenoids LC), et d’IL-2 (Sanofi-Synthélabo),
400U/mL, pendant 20 à 24 jours en milieu RPMI complet, le SVF étant remplacé par du
sérum humain (SH, PAA Laboratories), puis congelées. Les lignées obtenues par ce protocole
sont généralement >90% Vδ2+. Les cellules sont décongelées la veille de leur utilisation et
incubées en RPMI complet (avec SH) sur la nuit sans ajout d’IL-2.
110
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
Anticorps et réactifs.
Le pamidronate, le G418 et les amorces PCR ainsi que les ARNi proviennent de Sigma
Aldrich. Les anticorps anti-Vδ2-FITC et anti-IgG de souris-FITC (anticorps polyclonal de
chèvre) proviennent de Beckman-Coulter, l’anticorps anti-CD107a-PE de BD Pharmingen,
l’anticorps W6/32 correspond à un surnageant d’hybridome gracieusement fourni par le Dr.
Philippe Lebouteiller (INSERM U563, Toulouse) et l’anticorps anti-β ATP synthase (3D5)
provient d’Invitrogen. Tous les réactifs de biologie moléculaire proviennent d’Invitrogen.
Amorces.
Des séquences publiées ont été utilisées pour HLA-A, -B et -C (246).
HLA-A :
5’-TATAAAGCTTGATTCTCCCCAGACGCCGAGG-3’ (sens)
5’-ATATGCGGCCGCACAAGGCAGCTGTCTCACA-3’ (anti-sens)
HLA-B :
5’-TATAAAGCTTCACCCGGACTCAGRTCTCCT-3’ (sens)
5’-ATATGCGGCCGCATCTCAGTCCCTCCACAAGA-3’ (anti-sens)
HLA-C :
5’-TATAAAGCTTTTCTCCCCAGACGCCGAGA-3’ (sens)
5’-ATATGCGGCCGCGTCTCAGGCTTTACAAGCGA-3’ (anti-sens)
(R = A ou G)
Les séquences des amorces pour HLA-E ont été déduites d’alignements du consensus HLA-E
avec le consensus A, B, C et les séquences strictement spécifiques d’HLA-E ont été choisies.
HLA-E :
5’-TATAAAGCTTTCTCAGGACTCAGAGGCTGG-3’ (sens)
5’-ATATGCGGCCGCGGCTTTACAAGCTGTGAGACT-3’ (anti-sens)
Les séquences soulignées correspondent aux sites de restriction HindIII et NotI ajoutés sur les
amorces sens et anti-sens respectivement pour simplifier le sous-clonage des ADNc.
111
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
Clonage de HLA-A, -B, -C et E et transfection dans K562.
Les ARN ont été isolés à partir de la lignée Raji par la technique classique d’extraction au
Trizol. Brièvement, 2x107 cellules ont été lysées dans 4mL de Trizol, et 800µL de
chloroforme ont été ajoutés. Après centrifugation (12000g, 5min, 4°C) la phase aqueuse
(~2mL) a été récupérée et l’ARN a été précipité par ajout de 1,4mL (0,7 volume)
d’isopropanol froid et centrifugation à 12000g pendant 15min à 4°C. Les culots d’ARN ont
été lavés en éthanol 70% et la quantité obtenue a été estimée par mesure de la densité optique
à 260nm.
Les ADNc ont été obtenus par RT-PCR en utilisant les amorces anti-sens spécifiques de
chaque isotype (l’utilisation d’amorces de type oligo-dT donnant des résultats peu
satisfaisants). La spécificité de l’amplification a été vérifiée par digestion enzymatique
(données non montrées). Les ADNc ont été clonés directement après PCR dans le vecteur
TOPO (Invitrogen) selon les recommandations du fournisseur, puis séquencés. Les isotypes
isolés correspondent aux allèles A*0301, B*1510, Cw*0304, Cw*0401 et E*0101, ce qui
concorde avec les données de l’IMGT pour le typage de la lignée Raji. Ces allèles seront
notés A, B, Cw3 et Cw4 par la suite, par simplification.
Les ADNc ont ensuite été sous-clonés dans le vecteur d’expression eucaryote pcDNA3.1
(Invitrogen) par les enzymes HindIII et NotI. Les cellules K562 ont été tranfectées par
nucléofection (Amaxa) selon les instructions du fournisseur puis cultivées et clonées (dilution
limite) en RPMI complet en présence de G418 (1mg/mL) après vérification de l’expression
des isotypes par cytométrie de flux. Brièvement, les cellules ont été lavées en PBS 5% SVF,
incubées avec l’anticorps W6/32 puis avec l’anticorps secondaire pendant 45min. Les
données ont été acquises sur un FACScan (BD) et analysées avec le logiciel WinMDI 2.9
(The Scripps Research Institute). Après clonage et expansion des transfectants, l’expression
du CMH-I et de la sous-unité β de l’ATP synthase a été mesurée par cytométrie de flux.
112
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
Interférence ARN.
Les séquences des ARNi ont été déterminées par alignement des isotypes HLA clonés,
sélection des séquences spécifiques d’HLA-B puis analyse des séquences pouvant être
potentiellement ciblées, en utilisant le logiciel disponible sur le site internet de la compagnie
Applied Biosystems (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html).
Les séquences des ARNi contrôles ont été déterminées par réarrangement aléatoire des
nucléotides. Pour chaque séquence les ARN sens et anti-sens ont été synthétisés et appariés.
Séquences cibles :
hla-b1 :CACACAGATCTGCAAGACC et GGTCTTGCAGATCTGTGTG
hla-b2 :GACCAACACACAGACTTAC et GTAAGTCTGTGTGTTGGTC
Contrôles :
scr1
:ATCCAAAGGCGCATCAACC et GGTTGATGCGCCTTTGGAT
scr2
:AACACCTAACGATACACCG et CGGTGTATCGTTAGGTGTT
Les ARNi ont été transfectés de la même façon que les vecteurs contenant les ADNc (voir cidessus). La diminution d’expression a été contrôlée par cytométrie de flux 24h après
transfection selon la méthode décrite précédemment.
Test d’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
Un test d’expression du marqueur CD107a (aussi appelé LAMP-1, protéine lysosomale
exprimée en surface lors de la libération des granules cytotoxiques) décrit précédemment a été
utilisé (247). Brièvement, les cellules K562 transfectées ont été incubées ou non pendant 16h
avec du pamidronate (50µM), lavées et co-cultivées avec les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (rapport
1:1) en présence de l’anticorps anti-CD107a-PE (dilution 1/25ème) pendant 5h à 37°C. La
bréfeldine A, utilisée dans le protocole publié, a été omise après avoir vérifié qu’elle ne
modifiait pas les réponses obtenues. Les cellules ont ensuite été lavées, marquées par
l’anticorps anti-Vδ2-FITC (dilution 1/20ème) pour différencier les cellules effectrices des
113
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
cellules cibles, et les données ont été acquises sur un FACScan (compensations : Fl1-0.8%
Fl2 et Fl2-18,8% Fl1), analysées avec le logiciel WinMDI et traitées avec Excel.
3.3)
Résultats
L’Ecto-F1-ATPase est préférentiellement masquée par HLA-B.
L’expression des isotypes de CMH-I n’étant pas homogène après transfection, nous avons
cloné les cellules et conservé les clones présentant la plus forte expression. HLA-E a
originellement été co-transfecté avec HLA-B qui présentait l’expression la plus forte dans nos
premiers essais. Le marquage par l’anticorps W6/32 n’est toutefois pas augmenté et le
marquage à l’aide d’un anticorps spécifique anti-HLA-E s’est avéré négatif (données non
montrées).
Figure 17. Expression des isotypes HLA et effet sur la détection de l’Ecto-F1-ATPase.
Les isotypes mentionnés ont été clonés à partir de la lignée Raji et transfectés dans la lignée
K562. L’expression du CMH-I (ligne pointillée) et de la chaîne β de l’ATP synthase (ligne
pleine) a été vérifiée par marquage avec les anticorps W6/32 et 3D5 respectivement, et
l’anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé FITC. Histogramme grisé : contrôle
isotypique. Le contrôle correspond aux cellules transfectées avec le vecteur pcDNA3.1 vide.
114
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
Les résultats présentés en Figure 17 montrent une expression relativement modérée des
isotypes transfectés. De plus l’expression de Cw4 est plus faible que celle des autres isotypes.
Comme le même vecteur d’expression a été utilisé, et que ce résultat est resté le même pour
tous les clones analysés, cela suggère que cette caractéristique est inhérente à HLA-Cw4. Il
est possible qu’il présente des peptides moins fréquents, ou qu’il soit moins bien reconnu par
W6/32. Par ailleurs, ces données indiquent également que seul HLA-B induit un masquage de
la chaîne β l’Ecto-F1-ATPase. HLA-E ayant été co-transfecté avec HLA-B, et n’étant pas
détectable en surface (données non montrées), l’abolition de la détection observée pour ce
clone est probablement due à HLA-B uniquement. Ces résultats suggèrent que, des trois
isotypes de CMH-Ia testés, il est celui qui contribue majoritairement à l’interaction avec
l’Ecto-F1-ATPase. On ne peut en revanche rien conclure sur la capacité ou non d’HLA-E à
interagir avec l’Ecto-F1-ATPase.
HLA-B diminue fortement l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
Nous avons voulu savoir si l’expression de ces différents allèles modifiait le potentiel
stimulateur naturel ou induit des cellules K562. Les transfectants ont donc été traités ou non
par
le
pamidronate,
un
aminobisphosphonate
induisant
une
surproduction
de
phosphoantigènes et augmentant la réponse cytotoxique des lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
La Figure 18 indique que dans les deux cas, HLA-B induit une diminution quasi-totale de
l’activation des lymphocytes. Les isotypes HLA-C entrainent par ailleurs une légère baisse de
la stimulation de la lignée GDL6, alors que seul Cw4 semble légèrement moduler la lignée
GDL9. HLA-B apparaît donc comme l’isotype majeur dans le contrôle de la réactivité des
lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par le CMH-I classique.
115
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
Figure 18. Modulation de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
Les cellules K562 transfectées avec le vecteur vide (contrôle) ou les différents isotypes HLA
ont été traitées ou non pendant 16 heures avec du pamidronate (50µM) puis incubées avec les
lignées de lymphocytes T Vγ9/Vδ2 issues de deux donneurs différents (lignée GDL6, A ;
lignée GDL9, B) en présence de l’anticorps anti-CD107a-PE. Les cellules ont ensuite été
marquées par l’anticorps anti-Vδ2-FITC. Non stim. : Lymphocytes seuls. Le pourcentage de
cellules positives pour CD107a indiqué représente la moyenne de trois puits de stimulation
+/- écart type. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Des
résultats équivalents ont été obtenus en test de secrétion d’IFN-γ.
Inhiber l’expression d’HLA-B restaure partiellement la détection de l’Ecto-F1-ATPase.
Nous avons ensuite voulu confirmer les résultats précédents en réalisant l’expérience
inverse, c’est-à-dire diminuer spécifiquement l’expression d’HLA-B. Nous avons tout d’abord
confirmé l’efficacité des ARNi en les utilisant sur les transfectants HLA-B uniquement
(Figure 19A). hla-b1 et hla-b2 montrent une capacité quasi équivalente à diminuer
l’expression d’HLA-B (~82% vs 73%). En revanche, ils ne permettent de restaurer que
partiellement la détection de l’Ecto-F1-ATPase, hla-b1 semblant légèrement plus efficace.
Nous avons ensuite utilisé ce dernier sur tous les transfectants, et seul le transfectant HLA-B
montre une diminution du marquage par W6/32, ce qui confirme la spécificité de cet ARNi
(Figure 19B). En revanche, cette diminution ne s’est pas accompagnée d’une restauration du
potentiel stimulant des cellules (données non montrées).
116
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
Figure 19. Inhibition de l’expression de HLA-B par ARN interférence.
(A) Les ARNi ciblant HLA-B (hla-b1 et hla-b2) et leurs contrôles respectifs (scr1 et scr2) ont
été utilisés sur la lignée K562 transfectée par HLA-B et les expressions du CMH-I (vert) et de
la chaîne β de l’ATP synthase (rouge) ont été contrôlées par les anticorps W6/32 et 3D5,
respectivement. L’histogramme grisé correspond au contrôle isotypique. (B) hla-b1 semblant
légèrement plus efficace, il a été utilisé sur tous les transfectants afin de vérifier sa spécificité.
L’expression du CMH-I a été contrôlée par l’anticorps W6/32. Histogramme grisé : cellules
transfectée par scr1. Histogramme en ligne pleine : cellules transfectées par hla-b1. Ces
résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes.
3.4)
Discussion
Nos résultats indiquent que l’expression d’HLA-B permet de masquer l’Ecto-F1-ATPase
et induit une diminution de la stimulation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Cette diminution
pourrait s’expliquer de deux manières :
L’interaction des molécules du CMH-I avec l’Ecto-F1-ATPase entraîne une diminution de la
stimulation des lymphocytes causée par les NKR de type inhibiteur (iNKR). Il est admis que
la proximité de ces récepteurs avec le TCR facilite son inhibition. De tous les iNKR connus à
l’heure actuelle, seuls deux sont capables de reconnaître HLA-B. KIR3DL1 (famille des KIR)
reconnaît des molécules de CMH-I portant un épitope de type Bw4 (248). L’allèle cloné à
partir de la lignée Raji portant un épitope de type Bw6, ce récepteur n’est probablement pas
en cause. Il reste donc ILT2 (famille des LIR) dont la spécificité est large puisqu’il reconnaît
117
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
le domaine α3 du CMH-I qui est conservé et peu polymorphe (249). De plus, un travail récent
a montré qu’ILT2 est exprimé en surface de divers clones Vγ9/Vδ2 et qu’il est probablement
le récepteur majoritairement responsable du contrôle de la réactivité de ces lymphocytes. Il
s’agit donc d’un candidat potentiel intéressant. Alors qu’il a été montré que le blocage du
CMH-I par l’anticorps W6/32 permet d’annuler l’effet inhibiteur d’ILT2 (68), nous n’avons
pas observé une telle inhibition dans les mêmes conditions (données non montrées). Le rôle
des iNKR reconnaissant HLA-B dans notre modèle nécessite donc des travaux
supplémentaires.
Alternativement, l’interaction entre HLA-B et l’Ecto-F1-ATPase pourrait, de la même
manière qu’elle empêche la liaison des anticorps dirigés contre les chaînes α et β de l’ATP
synthase, gêner la reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase par le TCR Vγ9/Vδ2. Ceci
préviendrait donc directement l’activation des lymphocytes sans intervention des iNKR.
La récupération partielle de la détection de l’Ecto-F1-ATPase et l’absence totale de
restauration du potentiel stimulant après traitement par ARNi suggère qu’une faible
expression d’HLA-B est suffisante pour inhiber fortement les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 malgré
un démasquage de l’Ecto-F1-ATPase. Il est possible que dans ce cas, les iNKR puissent être
impliqués dans la régulation de ces lymphocytes. Les deux mécanismes pourraient donc être
impliqués.
Nous avons également utilisé ces ARNi sur la lignée Raji, mais dans ce cas nous n’avons
observé aucune détection de l’Ecto-F1-ATPase (données non montrées). Plusieurs hypothèses
pourraient permettre d’expliquer ce résultat. L’expression du CMH-I par la lignée Raji est
extrêmement élevée et la diminution obtenue étant relativement faible (~30%), elle ne suffit
peut être pas à démasquer les épitopes. Il est possible que cette lignée exprime un autre allèle
d’HLA-B qui n’a pas été identifié par typage génomique (IMGT) et que nous n’avons pas pu
118
Résultats I : Interaction Ecto-F1-ATPase / CMH-I
cloner. Enfin, il n’est pas exclu que d’autres molécules soient capables d’interagir avec
l’Ecto-F1-ATPase.
Même s’ils ne masquent pas l’Ecto-F1-ATPase, les isotypes Cw3 et Cw4 semblent
diminuer légèrement l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Cette diminution, si elle
s’avère significative, pourrait également impliquer des iNKR. Cw3 et Cw4 appartiennent à
deux groupes distincts, nommés C1 et C2, qui sont reconnus par KIR2DL2 (CD158b) et
KIR2DL1 (CD158a) respectivement. L’expression de ces récepteurs par les lymphocytes T
Vγ9/Vδ2 a été décrite (250, 251) mais elle est très hétérogène, ce qui pourrait expliquer la
faible diminution de l’activation globale d’une population polyclonale. L’absence d’inhibition
par Cw3 pour la lignée GDL9 pourrait suggérer une incompatibilité entre cet allèle HLA et les
iNKR exprimés par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 du donneur. Pour finir, le fait que cette
inhibition soit faible et que HLA-A ne modifie pas la stimulation des lymphocytes suggère
que l’interaction entre le CMH-I et l’Ecto-F1-ATPase est importante pour un contrôle efficace
de la reconnaissance de cette dernière par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
En conclusion, nos résultats montrent que l’Ecto-F1-ATPase interagit en surface des
cellules avec des molécules de CMH-I, préférentiellement HLA-B. Cet isotype inhibe
fortement l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Des travaux complémentaires sont
nécessaires pour déterminer son mode d’inhibition (iNKR et/ou encombrement stérique
prévenant la liaison du TCR). Il n’est également pas exclu que d’autres molécules puissent
interagir avec l’Ecto-F1-ATPase et moduler sa détection et/ou l’activation des lymphocytes.
119
120
RESULTATS EXPERIMENTAUX
Partie II
L’ApppI, un prototype
de phosphoantigène nucléotidique
121
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
1) Introduction
Le deuxième projet développé au cours de ma thèse a eu pour but de déterminer s’il existe
un lien entre les phosphoantigènes et l’Ecto-F1-ATPase, deux entités très différentes activant
la même sous-population γδ. En d’autres termes, ce complexe enzymatique exprimé à la
surface des cellules est-il éventuellement impliqué dans le mécanisme de présentation des
phosphoantigènes aux lymphocytes T Vγ9/Vδ2 ?
L’identification des phosphoantigènes à partir d’extraits de Mycobacterium tuberculosis a
mis en évidence l’existence de dérivés nucléotidiques naturels de ces phosphoantigènes,
TUBAg3 et TUBAg4 (85). Des travaux ont également montré que l’ajout d’un nucléotide sur
un phosphoantigène classique par synthèse chimique avait généralement peu d’effet sur sa
bioactivité (150). Toutefois, aucune étude n’a réellement étudié en détail les propriétés des
phosphoantigènes nucléotidiques.
L’ApppI, un dérivé adénylé de l’IPP, a récemment été isolé à partir de cellules traitées par
des aminobisphosphonates. Il serait produit directement à partir de l’IPP et d’AMP par une
activité de type aminoacyl tRNA synthase (252). Nous nous sommes intéressés à ce composé
pour plusieurs raisons :
-
C’est un prototype de phosphoantigène nucléotidique.
-
Il est produit de façon importante par des cellules traitées par les aminobisphosphonates,
qui augmentent la capacité de ces cellules à activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
-
Etant un analogue d’ATP, l’ApppI pourrait lier l’Ecto-F1-ATPase.
Dans un premier temps nous avons donc étudié les propriétés de l’ApppI (synthétisé en
collaboration avec l’équipe du Pr. Christian Périgaud, UMR CNRS 5247, Montpellier).
122
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
L’utilisation de ce composé pour l’étude de la présentation de phosphoantigènes sera décrite
dans la troisième partie des Résultats Expérimentaux.
Nous avons pu montrer que l’ApppI est capable d’activer spécifiquement les lymphocytes T
Vγ9/Vδ2. En revanche, il n’est pas actif directement, mais après clivage par une activité de
type Nucleotide PyroPhosphatase (NPP) qui le transforme en AMP + IPP. Cette activité peut
être fournie soit par ajout de « cellules présentatrices », soit directement (enzyme
commerciale). De plus, il possède des propriétés intéressantes qui le distinguent des
phosphoantigènes classiques tels que l’IPP :
-
Il est résistant aux phosphatases terminales telles que la phosphatase alcaline ou l’apyrase.
-
Il peut être « pulsé » sur des cellules cibles (comme des lignées tumorales ou des cellules
dendritiques), c’est-à-dire qu’il est capturé par ces cellules et leur confère une forte
activité stimulatrice similaire à celle des lignées activant spontanément les lymphocytes T
Vγ9/Vδ2.
Pour finir, nous avons pu montrer que cet antigène est produit de façon naturelle par la lignée
Daudi, une cible classique des lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
Nos résultats décrivent donc les caractéristiques uniques des phosphoantigènes
nucléotidiques. Ils suggèrent qu’ils pourraient être impliqués dans le mécanisme d’activation
des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par des cellules infectées ou tumorales, et possèdent des
propriétés qui pourraient les rendre intéressants dans le développement de protocoles
thérapeutiques.
123
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
2) Article 2
Ce travail est actuellement soumis au Journal of Immunology. Le manuscrit original est inclus
ci-dessous. Il n’a pas été modifié, hormis la mise en page afin de limiter l’espace utilisé et de
faciliter la lecture.
Title:
Specific requirements for Vγ9Vδ2 T cell stimulation by a natural adenylated phosphoantigen
Authors:
Pierre Vantourout*,¶, Jayati Mookerjee-Basu*,¶, Corinne Rolland*, Frédéric Pont#, Hélène Martin†, Christian
Davrinche†, Laurent O. Martinez*, Bertrand Perret*, Xavier Collet*, Christian Périgaud‡, Suzanne Peyrottes‡,
and Eric Champagne*,§,//.
Affiliations :
*,† INSERM, U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, *Département Lipoprotéines et Médiateurs
Lipidiques ; †Immunologie et Pathologies Infectieuses, Toulouse, F-31000, France ; Université Toulouse III Paul
Sabatier, Toulouse, F-31000, France.
#
Institut Claude de Préval (IFR150), Technical platform Interactions et Profils d'expression Protéiques,
Toulouse, F-31000, France.
‡
UMR 5247-CNRS-UM1-UM2, Equipe Nucléosides et Effecteurs Phosphorylés, Université Montpellier 2, cc
1705, Montpellier, F-34095, France.
§
To whom correspondence should be addressed
¶
Contributed equally to this work
//
Financial support
This work was financially supported by the French Association pour la Recherche sur le Cancer (PV and
contracts #3711-3913-4847) and Ligue Nationale contre le Cancer (#R07002BBA). LM and JMB are supported
by Inserm (Avenir) and FRM respectively.
Correspondence
Eric Champagne, INSERM U563, Dept. LML, CHU Purpan, BP 3028, F-31024, Toulouse, France.
e.mail: [email protected]
Running title
Nucleotidic antigens for Vγ9Vδ2 cells
Abbreviations :
ApppI: triphosphoric acid 1-adenosin-5'-yl ester 3-(3-methylbut-3-enyl) ester
HDMAPP: hydroxyl dimethylallyl pyrophosphate
IPP: isopentenyl pyrophosphate
Nano ESI-ITMS: nano electrospray ion trap mass spectrometry
NPP: nucleotide pyrophosphatase
124
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
Abstract
Human Vγ9Vδ2 T lymphocytes recognize phosphorylated alkyl antigens. Isopentenyl pyrophosphate (IPP) was
previously proposed as the main antigen responsible for Vγ9Vδ2 T cell activation by cancer cells. However
ApppI, a metabolite in which the isopentenyl moiety is linked to ATP, was reported in cells activated with
aminobisphosphonates. The contribution of this compound to tumor stimulatory activity was thus examined.
ApppI induces selective expansion of Vγ9Vδ2 T cells from PBMCs. In the absence of APCs however, ApppI
has little stimulatory activity on Vγ9Vδ2 T cells and optimal activation with ApppI requires addition of a
nucleotide pyrophosphatase releasing IPP + AMP. Thus ApppI has no intrinsic stimulatory activity.
Nevertheless, stimulation by ApppI is strengthened by the presence of APCs. Moreover, in contrast to IPP,
ApppI can be efficiently pulsed on dendritic cells as well as on non-professional APCs. Pulsed APCs display
stable and phosphatase-resistant stimulatory activity, indicative of antigen modification. HPLC analysis of tumor
cell extracts indicates that latent phosphoantigenic activity is stored intracellularly in the Vγ9Vδ2 cell-sensitive
tumor Daudi and can be activated by a nucleotide pyrophosphatase activity. The presence of ApppI in Daudi cell
extracts was demonstrated by mass spectrometry. ApppI thus represents a storage form of phosphoantigen and
nucleotidic antigens are thus a major source of phosphoantigenic activity in tumor cells. The unique properties of
ApppI may be important for the design of antigens used in anti-cancer immunotherapeutic protocols using
Vγ9Vδ2 cells.
through the deoxylulose pathway, an alternative
INTRODUCTION
The majority of human peripheral T cells of
bacterial
route
to
the
isoprenoid
precursor
the γδ type express a T cell receptor (TCR)
isopentenyl
comprising Vγ9 and Vδ2 variable regions. These
Pyrophosphorylated antigens can directly activate
usually represent 1 to 10% of circulating T
Vγ9Vδ2 T cells and do not absolutely require to be
lymphocytes, expand and release inflammatory
presented by specialized antigen presenting cells
cytokines in response to diverse infectious agents
nor to be displayed on MHC or CD1 antigens (257,
such as mycobacteria, bacteria and parasites (253).
261). Nucleotidic derivatives of phosphoantigens
They also display cytotoxicity towards diverse
have been purified from mycobacteria and have
tumor cells including laboratory tumor lines (Daudi
been found to stimulate Vγ9Vδ2 cells (85, 256).
Burkitt’s lymphoma, RPMI-8226 myeloma) and
Multiple
multiple cancer lines from patients with, among
pyrophosphorylated
others, lung, prostate, liver or kidney cancers (119,
nucleotidic variants have been studied and some of
254, 255).
them proved to be powerful stimulants of Vγ9Vδ2
Metabolites which stimulate Vγ9Vδ2 T cells in
pyrophosphate
synthetic
(IPP)
antigens
compounds
(258-260).
analogous
as
well
to
as
T cells (138, 156, 262).
a TCR-dependent manner have been purified from
The
precise
mechanism
underlying
mycobacteria and called phosphoantigens because
phosphoantigen
they consist in a short alkyl chain and a terminal
Structure-activity correlation studies of synthetic
pyrophosphate group (85, 256, 257). The most
phosphoantigens indicated that, although short
powerful natural antigen reported so far is hydroxyl
alkyls such as ethyl pyrophosphate display some
dimethylallyl
a
activity, optimal structures contain five carbon
organisms
atoms and one double bond (263). Belmant et al.
metabolite
pyrophosphate
produced
(HDMAPP),
by microbial
125
recognition
is
still
unclear.
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
β-phospho-ester
in
cells after treatment with aminobisphosphonates
be
through inhibition of the mevalonate pathway
cleavable(264) and a recent study by Boedec et al.
enzyme farnesyl pyrophosphate synthase, resulting
reported the strong stereospecificity of structural
in an increased sensitivity to Vγ9Vδ2 T cell
alkyl
cytolytic
reported
that
the
pyrophosphorylated
variants
antigens
(265).
bond
must
Whether
this
reflects
activity.
Aminobisphosphonates
also
constraints for binding to the TCR or to a putative
induce intracellular accumulation of ApppI, an
presentation molecule is unknown.
adenine
TCR gene transfer experiments indicate that
nucleotide
derivative
of
IPP
in
macrophages (252). As the structure of this
phosphoantigen recognition by Vγ9Vδ2 T cells is
compound
TCR-dependent (261). Nevertheless, a direct
phosphoantigens such as TubAg3/4 and other
interaction between the TCR and phosphoantigens
analogous synthetic nucleotide derivatives with
is only indirectly supported by structure-function
stimulatory activity, we have studied its biological
correlations
(152,
activity on Vγ9Vδ2 T cells(256). This revealed
interaction
models
266,
267)
(268).
In
and
these
molecular
studies,
unique
is
reminiscent
properties
for
of
this
bacterial
nucleotidic
aminoacids in the gamma chain complementarity
phosphoantigen, making this type of compound of
determining region-3 were found essential for
particular interest for in vivo administration. We
phosphoantigen recognition.
show evidence that nucleotidic antigens are
The presence of APCs improves direct Vγ9Vδ2
naturally produced in tumor cells and can play a
T cell responses to phosphoantigens (269) but their
major role in their stimulatory activity towards
exact contribution is only partially characterized.
Vγ9Vδ2 lymphocytes.
Analyses with strong pyrophosphorylated agonist
antigens such as bromohydrin pyrophosphate or
MATERIALS AND METHODS
HDMAPP (269-271) have shown that to some
Antibodies and other reagents
extent these antigens can be captured by APCs and
Anti-TCRVδ2-FITC (IMMU360) and CD3-PE
confer stable stimulatory activity, indicating that
(UCHT1) were from Beckman-Coulter, anti-IFNγ-
they can be somehow displayed on the cell surface
PE (25273) from R&D systems, and anti-CD107a-
as on stimulatory tumors. A mechanism for
PE (H4A3) from BD- Pharmingen. Apyrase,
phosphoantigen presentation is however supported
Crotalus
by recent experiments showing binding of soluble
pyrophosphatase (NPP) and other reagents were
Vγ9Vδ2 tetramers on APCs pulsed with HDMAPP.
from
This
antigen-specific
Pyrophosphate (Isoprenoids LC, Tampa, Florida,
recognition of the membrane of pulsed cells which
USA) and ApppI (see below). Apyrase and NPP
was dependent on a trypsin-sensitive structure (271,
were used in cellular and biochemical assays at the
272).
concentration
revealed
Tumor
a
cells
direct
such
and
as
Daudi
Burkitt’s
adamanteus
Sigma
Aldrich
of
venom
except
0.2U/ml
and
nucleotide
Isopentenyl
0.02U/ml
respectively.
lymphoma produce weak phosphoantigens through
the mevalonate pathway. The major stimulatory
Synthesis of ApppI
compound, IPP, is overproduced in some tumors
The procedure was adapted from Ryu et
following hyper-activation of the mevalonate
al.(274). Briefly, 110 mg (0.2 mmol) of ATP
pathway (154, 273). IPP can also accumulate in
(sodium salt) were converted into the corresponding
126
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
tetrabutylammonium salt then dissolved in dry
were washed and incubated with the indicated
acetonitrile (2 ml). To this mixture a solution of
concentration of IPP or ApppI for 2h or 16h,
isopentenyl tosylate (1 eq., 48 mg) was added in
washed again 4 times, pelleted by centrifugation
dry acetonitrile (2 ml). The reaction mixture was
and used in T cell stimulation assays.
stirred
at
room
temperature
overnight
and
For
polyclonal
Vγ9Vδ2
T
cell
lines
concentrated. The oily residue was purified on a
establishment, PBMCs isolated from buffy coats
DEAE sephadex column using a gradient of
from healthy donors (Etablissement Français du
triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, pH
Sang, Toulouse, France) were stimulated with 5µM
6.9, 0.2 to 1M). The fractions of interest were
phosphoantigen (IPP or ApppI) in RPMI 1640-
evaporated under vacuum, and passed through an
glutamax medium supplemented with 10% heat-
+
ion-exchange Dowex (Na form) column to give
inactivated human serum, sodium pyruvate and
ApppI (1-(adenosin-5'-yl) 3-(3-methylbut-3-enyl)
penicillin/streptomycin. 24h after stimulation, IL-2
triphosphoric diester) as sodium salt with a final
was added at a final concentration of 200U/ml. On
yield of 45%. ApppI was stored at -20°C. Aliquots
day 5, IL-2 concentration was raised to 400U/ml.
were reconstituted in molecular biology grade water
Cells were passed every 2-3 days, maintained at a
and stored at -80°C. In some preparations, HPLC
concentration of 6.105/ml and frozen after 22-24
analysis of reconstituted product revealed the
days of culture. Cell lines contained >94% Vδ2+
presence of 5-10% ADP (presumably from
cells. Upon thawing, lymphocytes were left to
spontaneous degradation). ADP does not affect
recover overnight in culture medium without IL-2
responses of Vγ9Vδ2 cells in stimulations. This was
before assessment of antigen responses.
however
checked
additionally
in
control
experiments in which this contaminating product
Generation of DCs.
was removed by apyrase treatment. To this end,
PBMCs from healthy donors were sorted for
ApppI was pre-treated for 1h with 0.2U/ml apyrase
CD14+ cells using a MACS column (Miltenyi
and the enzyme was then inactivated by heating at
Biotec). DCs were obtained by culturing CD14+
100°C for 10 minutes.
cells in six-well plates (3x106 cells/ ml) for 7 days
in
Cell culture and pulsing with phosphoantigens
human
Dusseldorf,
serum
Germany)
(PAA
(Invitrogen)
and interleukin-13 (IL-13, 50 ng /ml). Fresh IL-13
Laboratories,
was added again after 4 days of culture. The
phenotype of iDCs was monitored as described
Synthelabo, Toulouse, France). Tumor cell lines
previously (275) and was as follows: CD1a+, MHC-
were obtained from ATCC and grown in RPMI
I+, MHC-II+, CD64–, CD83–, CD80low, CD86low. For
1640 Glutamax supplemented with 10% heat-
induction of maturation, immature DCs were
inactivated
and
cultured for 48h in presence of 100ng/ml LPS and
penicillin/streptomycin, or in Hybridoma SFM
checked for maturation marker (CD83 and CD86).
medium supplemented with sodium pyruvate,
In some experiments, DCs were either pulsed with
penicillin/streptomycin and L-glutamine (Complete
pamidronate / IPP / ApppI (10μM) for 14-16h or
SFM) for pulsing experiments since pulsing was
kept untreated. After pulsing cells were washed
less efficient in presence of FCS. In this case, cells
three times with RPMI and used as antigen
sodium
IL-2
medium
(Sanofi-
FCS,
and
serum-free
supplemented with GM-CSF (100 ng /ml; Novartis)
Cell culture reagents were from Invitrogen
except
AIM-V
pyruvate
127
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
presenting cells in Vγ9Vδ2 T cell activation assay
100 μL. Brefeldin A was omitted. Cells were
using a T cell:APC ratio of 1:1.
washed twice in FACS medium and stained for
Proliferation assay
TCR-Vδ2. Data were acquired and analyzed as for
PBMCs were stimulated as described for
proliferation assays. Results are expressed as the
polyclonal Vγ9Vδ2 T cell lines establishment,
mean of triplicate microwell cultures +/-SD.
collected at the indicated times and stained for
30min at 4°C with anti-TCRVδ2-FITC and anti-
Confocal
CD3-PE antibodies (1/25 and 1/50 final dilutions,
aggregation
microscopy
analysis
of
TCR
respectively) in PBS 5% FCS (FACS medium).
K562 were either pulsed with ApppI (20µM) or
Data were acquired using a FACScan cytometer
kept untreated for 16-18h, washed twice, stained
(Becton Dickinson).
with hexidium iodide (Molecular Probes, 5µM) and
mixed with Vγ9Vδ2 T cells (1:1 ratio), centrifuged
at 1200rpm for 1 min and incubated at 37°C for
Intracellular cytokine staining
were
30min (APCs). Cells were then resuspended gently
stimulated for 5h in 96 U-bottom well plates with
and layered onto poly-L lysine-coated 8-well slides.
the indicated antigens after a brief centrifugation to
After 10 min, 0.02% NaN3 was added and slides
increase cell-cell contact. Brefeldin A (10μg/ml)
were kept at room temperature for further 15 min.
was added 1h after the initiation of culture. Cells
The wells were washed once with PBS containing
were then washed and stained with anti-TCRVδ2-
5% FBS and 0.02% NaN3. Finally cells were
FITC antibody (1/25 final dilution) in FACS
stained with anti-δ2-FITC, the slides were mounted
medium, fixed for 15min with PBS containing 2%
and observed under a Zeiss LSM 510 (Zeiss)
paraformaldehyde (w/v) at room temperature and
confocal microscope with a 63 Plan-Apochromat
then permeabilized with saponin buffer (PBS,
objective (1.4 oil), electronic zoom 3.
Polyclonal
Vγ9Vδ2
T
cell
lines
10mM HEPES, 5% FCS, 0.1% saponin) for 15min
HPLC analysis of nucleotidic compounds
at room temperature. Cells were then stained with
anti-IFNγ-PE antibody (1/100 final dilution) in
For NPP and apyrase sensitivity assays,
saponin buffer for 30min at 4°C and washed twice
reaction mixes containing nucleotidic compounds
in FACS medium. Data were acquired and analyzed
were adjusted to 200µL with water and products
as for proliferation assays. Results are expressed as
were separated by HPLC (System Gold, Beckman
the mean of triplicate microwell cultures +/-SD.
Coulter) on a PL-SAX anion exchange column
(1000Å, 5µm, 50x4.6mm from Polymer Labs
Varian, Marseille, France) using water (A) and 1M
CD107 expression assay for cytolytic function
Experiments were performed as previously
(NH4)2HPO4, pH 3.5 (B) and the following elution
described (247) with minor modifications. Briefly,
gradient: 0-1 min: 0% B; 1-11 min: 0% to 30% B;
polyclonal Vγ9Vδ2 T cell lines (105 cells) were
11-13 min: 100% B; 13-20min: 100% A. Eluted
stimulated in 96-well U-bottom plates with the
nucleotides were detected by monitoring UV
indicated antigens, antibody-coated beads or tumor
absorbance at 260nm. To evaluate phosphatase
cell lines (1:1 ratio) for 5h after a brief
sensitivity,
centrifugation, in presence of the anti-CD107a-PE
concentration) were incubated for 1h at 37°C in
antibody (1/25 final dilution) in a final volume of
20µl RPMI in the presence of 0.2U/ml apyrase or
128
ApppI
and
ATP
(100µM
final
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
0.02U/ml
nucleotide
pyrophosphatase
before
voltage was set to 700 V. Samples were analyzed in
analysis.
the negative ion mode. ApppI (m/z 574) was
For the assessment of intracellular antigens,
fragmented using the following parameters : parent
8
Daudi cells (3x10 in 250ml) were washed in PBS,
ion isolation width, 3 m/z; collision energy, 30%;
pelleted and resuspended in 600μl of ice-cold H2O
activation Qz, 0.25; activation time, 30 ms. MS3
+ 600μl of ice-cold acetonitrile. Cell lysis was
analysis of the ApppI fragment at m/z 408 was
completed using a FastPrep-24 tissue homogenizer
performed using the following parameters : parent
and lysing matrix D ceramic spheres (MP
ion isolation width, 3 m/z; collision energy, 33%;
Biochemicals, Selom, OH) set at 4m/s, with 4
activation Qz, 0.25. Analysis was performed with
pulses of 15s. The cell lysate was ultracentrifuged
the Xcalibur 1.2 software (Thermo Electron, San
(2x105g, 15min) and the supernatant (cytosolic
Jose, CA).
fraction) was lyophilized and redissolved in 200μl
of H2O. This was loaded on an anion exchange
RESULTS
cationic column (Amersham Life Sciences, type Q)
Direct stimulation of γδ T cells with nucleotidic
and bound material was eluted (2ml/min) using H20
phosphoantigens
(A) and ammonium acetate 1M, pH6.5 (B), with the
The adenylated derivative of IPP, namely
following gradient: 0 to 1min: 0% B, 1 to 17min: 0
triphosphoric acid 1-adenosin-5'-yl ester 3-(3-
to 100% B, 17 to 20min: 100% B, 20 to 25min: 0%
methylbut-3-enyl) ester, will be referred to as
B.
0.5min,
ApppI. In this compound the isopentenyl moiety is
lyophilized and redissolved in 100μl of H2O. 10 μl
linked to the γ-phosphate of ATP instead of being
of each fraction was then tested for stimulatory
linked to a pyrophosphate group (Fig.1).
Fractions
were
collected
every
activity on Vγ9Vδ2 T cell microcultures.
Mass Spectrometry
Mass spectrometry was performed using an
LCQ ion-trap mass spectrometer (Finnigan MAT,
San Jose,CA). Nano electrospray analysis was
performed using a nanospray ESI source (The
Protein
Palladium
Analysis
Co.,
Odense,
and
gold-coated
glass
Denmark).
capillaries
(Proxeon Biosystems, Odense, Denmark) were
filled with 3 µL of analyte solution and positioned
using a stereomicroscope at a distance of 1 mm to
the opening of the heated transfer capillary kept at a
Figure 1. Structure of ApppI and IPP.
NPP and Apyr indicate the cleavage sites by
nucleotide pyrophosphatase and apyrase.
temperature of 150°C. A nebulizer gas was not
necessary in this spray mode. The nanospray needle
129
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
Figure 2. Activation of Vγ9Vδ2 T
cells by ApppI.
(A,B) PBMCs were stimulated with
phosphoantigens and IL-2 before
staining for CD3 and TCR Vδ2
expression. (A) PBMC staining
before and after in vitro culture (19
days) with ApppI (5µM). Numbers
indicate the percentage of cells in
each quadrant. (B) Comparative
outgrowth of Vδ2 T cell 1 week after
PBMC stimulation with IPP or ApppI
plus IL-2. (C) Intracellular IFN-γ
staining of Vδ2+ cells following
PBMC stimulation with IPP and
ApppI. (D) A Vγ9Vδ2 T cell line was
stimulated with the indicated antigens
in the presence of anti-CD107a-PE
antibody to measure the activation of
the cytolysis machinery. Cells were
then washed and stained for
TCRVδ2. Numbers indicate the
percentage of CD107a+ cells among
Vδ2+ cells. Data are representative
≥10 experiments. (E) PBMCs were
stimulated in the presence of IPP
(10μM) plus ApppI and stained as in
C. (C,E) Results are means of
triplicate cultures +/- SD.
When added in a PBMC culture, ApppI induced the
does not compete with IPP and has no toxic activity
selective expansion of Vγ9Vδ2 T cells and the
on responder cells (Fig.2E).
culture reached homogeneity (~94%) in 3 weeks, as
Effect of phosphatases on ApppI responses
it is the case for most phosphoantigens (Fig.2A).
Although IPP and ApppI both induce proliferation
The phosphate groups of IPP are sensitive to
and intracellular IFN-γ production, ApppI required
terminal phosphatases such as alkaline phosphatase
a 5 to 10-fold higher molar concentration for a
(85, 262) or apyrase. Conversely ApppI is expected
similar effect on Vγ9Vδ2 T cell expansion from
to be resistant to degradation by the same enzymes.
PBMCs (Fig.2B). The adenylated derivative was
Indeed, treatment of ApppI with apyrase did not
also less bioactive than IPP for the stimulation of
change its HPLC profile whereas ATP used as a
lymphokine production by Vγ9Vδ2 T cell, with half
control
for
hydrolyzed
maximum responses obtained at ~30μM instead of
enzyme
in
activity
similar
is
conditions
completely
(Fig3A).
Strikingly, when added in stimulation assays,
~1μM for IPP (Fig.2C). Both compounds induced
apyrase abolished the response to ApppI in the
the cytotoxicity machinery as evidenced by the
CD107 expression assay (Fig.3B) as well as in
surface expression of the lysosomal marker
cytokine production assays (data not shown). A
CD107a although IPP induced again a stronger
toxic effect of apyrase on lymphocyte responses is
stimulation (Fig.2D). Addition of ApppI to IPP
excluded as this enzyme does not influence the
slightly increased stimulation, indicating that ApppI
responses induced by anti-CD3 stimulation.
130
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
This suggests that ApppI has no stimulatory activity
per se and requires to be converted into a
compound in which the phosphate is terminal, most
likely IPP.
The structure of ApppI indicates that it could
be hydrolysed to give IPP + AMP through cleavage
of the α-β phosphoester bond by a nucleotide
pyrophosphatase activity (276). ApppI was thus
treated
with
nucleotide
Crotalus
adamanteus
pyrophosphatase
(NPP)
venom
and
subsequently analyzed by HPLC. The profile of
NPP-treated ApppI indicates the release of a
nucleotidic moiety which elutes like AMP but not
like ADP and is compatible with the expected
cleavage of ApppI between the α and β phosphates
Figure 3. Effect of apyrase on ApppI and ApppIinduced lymphocyte response.
(A) Individual nucleotides or nucleotide mixtures
were either untreated or treated with apyrase before
analysis by anion exchange chromatography to
assess their sensitivity to the enzyme. (B) Vγ9Vδ2
T cells were stimulated with ApppI, anti-CD3
antibody-coated beads or control medium in the
presence or absence of apyrase, and the expression
of CD107a was monitored as in Fig.2D. Data are
means of triplicate stimulation experiments +/- SD.
*: p≤0.003; NS: non-significant (2-tailed Student
test).
relative to the adenosinyl group (Fig.4A). We then
evaluated the effect of NPP addition in the culture
medium of ApppI-stimulated Vγ9Vδ2 T cells. NPP
addition to the culture medium strongly increased
the stimulatory activity of ApppI.
Figure 4. Effect of nucleotide
pyrophosphatase on ApppI and
ApppI-induced responses.
(A) Individual nucleotides or
nucleotide mixtures were either
untreated or treated with NPP before
HPLC analysis as in Fig.3A. (B)
Vγ9Vδ2 T cells were stimulated
with ApppI in the presence or
absence of NPP and the expression
of CD107a was monitored as in
Fig.2D. (C) The effect of NPP and
its inhibitor PPADS was tested on
lymphocyte stimulations by ApppI
or anti-CD3 and monitored as in B.
Data (B,C) are means of triplicate
stimulation experiments +/- SD. *:
p≤0.001; NS: non-significant (2tailed Student test).
131
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
As the enzyme was deprived of any effect in the
antigens,
absence of antigen, this was not due to the presence
stimulation. Although pulsing with both antigens
of nucleotidic antigens in the cultures or to a non-
increased the stimulatory activity of tumors, pulsing
specific
enzyme
with ApppI was again more efficient than with IPP,
(Fig.4B). NPPs are sensitive to the pyrophosphatase
and ApppI-pulsed tumors were stronger stimulators
inhibitor
than cells pulsed with the same molar concentration
stimulatory
pyridoxal
activity
of
the
phosphate-6-azophenyl-2',4'-
disulfonic acid (PPADS (277)). PPADS completely
extensively
washed
and
used
for
of IPP (Fig.5B).
abolished the weak spontaneous response to ApppI
These results could be explained by an effect of
in the absence of exogenous NPP, confirming that
ApppI similar to aminobisphosphonate blockade of
this response is due to partial conversion of ApppI
farnesyl pyrophosphate synthase. If this was the
into IPP in the culture medium. PPADS had no
case, ApppI effect would be abolished by
effect on the CD3-mediated stimulation, excluding
simultaneous treatment of tumors with lovastatin,
a non-specific toxicity of this compound (Fig.4C).
preventing accumulation of endogenous IPP (154).
Altogether, these data indicate that ApppI has no
Fig.5C shows that lovastatin treatment abolishes
significant
and
Daudi spontaneous stimulatory potential and K562
requires conversion into IPP for the stimulation of
sensitization with pamidronate but has no effect on
Vγ9Vδ2 T cells in the absence of APCs.
K562 sensitization with ApppI. Thus ApppI does
intrinsic
stimulatory
activity
not act as an inhibitor of farnesyl pyrophosphate
synthase.
Effect of tumoral APCs on phosphoantigen-
In order to determine if the acquisition of
mediated stimulation
It is largely documented that Vγ9Vδ2 T cell
stimulatory activity by tumor cells required an
stimulation is increased by the presence of
active process, we studied the effect of temperature
bystander APCs(269). However, although strong
and cytoskeleton integrity on pulse efficiency. We
agonist pyrophosphorylated antigens can be pulsed
used RPMI-8226 cells and short pulsing conditions
on antigen presenting cells (270, 271), this is
(2h) which confer stable stimulatory activity
generally considered as poorly efficient even on
without
dendritic cells (278, 279). When RPMI-8226 cells,
temperature of pulse or with drug addition during
which are week stimulatory tumors were added in
pulsing. Pulsing was abrogated when performed at
cultures of Vγ9Vδ2 T cells and phosphoantigens,
4°C or on cells which were previously treated with
we observed a synergistic activation which was
the actin polymerization inhibitor cytochalasin D
more pronounced with ApppI than with IPP
(Fig.5D). This indicates that pulsing is not simply
(Fig.5A). This prompted us to compare the pulsing
due to passive adsorption, requires an active
efficiency of these two antigens on different APCs.
mechanism and involves cytoskeletal components,
We first compared the ability of IPP and ApppI to
indicative of an active process. Finally, a specific
be pulsed on tumor lines which are not professional
TCR engagement following ApppI recognition on
APCs. K562 and RPMI-8226 myeloma cell lines
K562 cells is substantiated by a massive TCR
have
aggregation on the T cell surface (Fig.5E) as well as
weak
whereas
spontaneous
Daudi
has
a
stimulatory
strong
activity,
cell
subsequent
spontaneous
alteration
TCR
downmodulation
analysis (not shown).
stimulatory activity for Vγ9Vδ2 T cells. All three
cell lines were incubated overnight with both
132
when
varying
by
the
FACS
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
Figure 5. Effect of antigen presentation on ApppI response.
Vγ9Vδ2 T cells were stimulated as indicated and CD107a expression was monitored as in Fig.2D. Data are
means of triplicate stimulation experiments +/- SD. (A) Stimulation with IPP, ApppI, RPMI-8226 cells (1:1
ratio) or RPMI-8226 plus phosphoantigens. (B) Indicated tumor cell lines were pulsed overnight with the
indicated antigens before co-culture with Vγ9Vδ2 cells. (C) Daudi and K562 cells were treated overnight with
the indicated compounds, washed and used as stimulators for Vγ9Vδ2 T cells. Lova: lovastatin (20µM); ApppI:
20µM; Pam: pamidronate (50µM). (D) RPMI-8226 cells were pulsed with ApppI (2h, 10µM) either at 37°C
(Control), 4°C, or at 37°C after a 2h-pre-treatment with cytochalasin D (10µM), and washed extensively before
addition of Vγ9Vδ2 T cells. (E) Vγ9Vδ2 T cells (surface-stained with anti-d2-FITC, green) were kept in contact
for 20min at 37°C with K562 cells loaded with hexidium iodide (red) and loaded or not with ApppI. TCR
aggregation was analyzed by confocal microscopy. (F) Tumor cells were pulsed overnight with pamidronate
(50µM) or ApppI (20µM) or left untreated, washed, and polyclonal Vγ9Vδ2 T cells were added along with the
indicated enzymes (Apyr: Apyrase, 0.2U/ml, NPP: Nucleotide Pyrophosphatase, 0.02U/ml).
133
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
ApppI-pulsed cells behave as classical Vγ9Vδ2
population
target cell lines
instead of phosphoantigen. The use of mature DC
treated
with pamidronate (50μM)
As the direct stimulation of Vγ9Vδ2 T cells by
was associated with a much lower Vγ9Vδ2
ApppI can be modulated by addition of NPP and
lymphocyte response, suggesting that antigens are
apyrase, it was important to check the effect of such
captured less efficiently after DC maturation. Thus
treatments on the stimulation by pulsed cells. These
ApppI is similarly captured with higher efficiency
enzymes were thus added in T cell stimulation
than IPP by professional and non-professional
assays using either Daudi cells or RPMI-8226 cells
APCs.
pulsed with pamidronate or ApppI (Fig.5F). In all
cases, stimulation with tumor cells was completely
resistant to treatment with apyrase and NPP
whereas
direct
simulation
was
sensitive
to
phosphatases. Thus the antigen was not recognized
in soluble form, was somehow processed to become
resistant to these enzymes and was stably presented
on the surface of tumors. This also indicates that the
Vγ9Vδ2 T cell stimulation by antigen-pulsed
tumors and their direct stimulation by soluble IPP
or ApppI result from different mechanisms and
different antigenic forms.
Pulsing of professional APCs with ApppI
Dendritic cells have previously been shown to
potentiate phosphoantigen responses(280). Based
on above observations we compared the pulsing
Figure 6. Pulsing of phosphoantigens on
dendritic cells.
(A) DC were derived from CD14+ PBMCs (iDC)
and maturation was induced by 48h LPS
stimulation (mDC). They were subsequently pulsed
with IPP or ApppI, extensively washed and cocultured with Vγ9Vδ2 cells. T cell activation was
monitored by CD107a expression.in Vδ2+ cells. (B)
Representative pattern of CD83 and CD86
expression on DC populations before and after LPS
treatment.
efficiency of IPP and ApppI on monocyte-derived
dendritic cells (DC). As immature DC (iDC) are
more prone to capture exogenous antigens than
mature DCs (mDC) we also analyzed the ability of
DC to be pulsed with IPP and ApppI and to
stimulate Vγ9Vδ2 cells following maturation by 24h LPS treatment (Fig.6). Maturation of DC was
confirmed by the increase of CD83 and CD86
Daudi cells naturally produce nucleotidic antigens
surface expression. After incubation with IPP or
Above results indicate that ApppI-pulsed cells
ApppI (10μM) and extensive washing to eliminate
are quite similar to spontaneously stimulating
passively adsorbed antigens, both iDC and mDC
tumors and that ApppI is more prone than IPP to be
populations were able to stimulate Vγ9Vδ2
captured and displayed in a stimulatory form by
lymphocytes. ApppI was however more efficiently
tumors. This suggests that nucleotidic derivatives of
pulsed than IPP and the stimulatory activity of
phosphoantigens could be produced intracellularly
ApppI-pulsed DC reached that of the same
134
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
by tumors as well as IPP. To check for the presence
Synthetic ApppI gives a m/z 574 pseudo
of nucleotidic stimulatory compounds in Daudi
molecular ion ([M-H]-). As previously described
cells,
and
(252), its fragmentation produces major ions at m/z
separated by ion exchange HPLC. After elution of
408 and m/z 227). To increase the MS signature of
bound material, fractions were collected, treated
ApppI, MS3 analysis was performed on the major
with
non-nucleotidic
ion with m/z 408 which could be further
phosphoantigens, and tested for their stimulatory
fragmented and produced an ion with m/z 273 and
activity on Vγ9Vδ2 cells in the presence or absence
the pyrophosphate related ion with m/z 159
of NPP. Stimulatory activity was barely detectable
(Fig8A). The HPLC fraction containing the putative
in the absence of NPP. However, in the presence of
natural
this
active,
analyzed using identical MS parameters. An ion
nucleotidic
with m/z 574 was present at trace levels (not
cytosolic
extracts
apyrase
enzyme,
suggesting
to
prepared
remove
several
the
were
fractions
presence
of
were
nucleotidic
shown).
phosphoantigens. A major peak of activity eluted
After
phosphoantigen
fragmentation
this
was
gave
then
the
2
with a retention time close to that of purified ApppI
characteristic ions of ApppI in both the MS and the
(10.5 to 11min) (Fig.7). This fraction was
MS3 spectra (Fig.8B). Thus, although other
subsequently analysed by electrospray ionization
stimulatory compounds may also be present in cell
ion trap mass spectrometry (ESI-ITMS MS).
extracts, ApppI is produced intracellularly by Daudi
cells.
DISCUSSION
When
studying the
inhibitory effect of
aminobisphosphonates, Monkkonnen et al. found
that these compounds induced the intracellular
accumulation of ApppI which presents proapoptotic
properties
on
macrophages
and
osteoclasts. They also provided evidence that this
nucleotidic metabolite arose in cells following
farnesyl pyrophosphate synthase inhibition and IPP
accumulation and a tRNA synthase activity was
proposed to be responsible for IPP to ApppI
conversion (252, 281). The possibility that ApppI is
somehow involved in the stimulatory effect of
tumors on Vγ9Vδ2 lymphocytes was however
Figure 7. Daudi cells produce endogenous
nucleotidic phosphoantigens.
(A) Elution profile of AMP, ADP, ATP and ApppI.
(B) Fractions eluted from Daudi cytosolic extracts
were treated with apyrase. This was then denatured
by heating and samples were assayed for Vγ9Vδ2 T
cell stimulation with or without adding exogenous
NPP. Data are means of triplicate stimulation
experiments +/- SD.
never investigated before, and although many
nucleotidic derivatives of phosphoantigens have
been studied, ApppI has never been tested.
We show here that ApppI efficiently stimulates
Vγ9Vδ2 T cells when added in PBMC cultures and
is thus comparable to other phosphoantigens.
135
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
Figure 8. Detection of ApppI in Daudi cell extracts by mass spectrometry.
(A) Nano ESI-ITMS analysis of synthetic ApppI. Top panel: full scan MS, showing the pseudo molecular ion
signal of ApppI corresponding to ([M-H]-). Middle panel: MS2 spectrum of m/z 574. Bottom panel: MS3
spectrum resulting from the fragmentation of the m/z 408 ion. (B) Nano ESI-ITMS analysis of biological extract
corresponding to HPLC fraction eluting between 10.5 and 11 min (cf. Fig.7A). Top Panel: MS2 spectrum of an
m/z 574 ion from full scan , showing the characteristic m/z 408 ion. Bottom: spectrum resulting from the
fragmentation of the m/z 408 ion showing a pattern similar to that of synthetic ApppI.
However ApppI has no intrinsic stimulatory
and this display is strongly impaired when cells are
activity on Vγ9Vδ2 T cells in the absence of APCs,
kept at 4°C or when cytoskeletal components are
requiring cleavage of the α-β phosphoester bond
altered by cytochalasin D. After exposition to
and IPP release for activity. This is apparently at
ApppI, cells behave as spontaneously stimulatory
odds
that
tumors or aminobisphosphonate-treated cells and
on
their stimulatory activity is not only stable on the
phosphoantigen activity. However, although it is
cell surface but also resistant to phosphatases which
not
pyrophosphate
normally degrade pyrophosphorylated antigens
derivatives display specific properties, in previous
(such as apyrase) or nucleotidic derivatives (such as
reports, the activity of nucleotidic antigens was
NPP), indicating antigen modification or protection.
evaluated in the presence of APCs (156, 262).
Altogether, these data suggest the existence of a
with
nucleotide
previous
addition
excluded
that
reports
had
indicating
little
isopentenyl
effect
ApppI can be captured by professional or non-
specific receptor and transport mechanism for
professional APCs and confers them a stimulatory
nucleotide derivatives. Is tumor cell stimulatory
activity. Strikingly, this is more efficient than
activity due to pyrophosphates or nucleotidic
pulsing with an equivalent molar concentration of
antigens? HPLC analysis of cytosolic extracts
IPP. Once captured by cells, the phosphoantigenic
reveals that nucleotidic antigens are present in
activity is stably “expressed” on the cell surface,
stimulatory tumors. Their characterization is based
136
Résultats II : Propriétés de l’ApppI
upon the fact that the stimulatory activity requires
demonstrations of cell-cell contact requirement
NPP addition for activation of Vγ9Vδ2 cells in the
(124, 278) and the recent demonstration that soluble
absence of APCs. Thus, both nucleotidic and non-
recombinant TCR constructs bind the tumor cell
nucleotidic antigens may be responsible for tumor
surface after exposition of cells to HDMAPP (271).
stimulatory activity. ApppI ultimately requires re-
Although the antigen used in the latter quoted
hydrolysis into IPP and the latter might be the only
experiments were not nucleotidic derivatives, it is
biologically relevant antigenic form for Vγ9Vδ2 T
quite possible that part of the antigen has been
cell stimulation. However, we propose that IPP to
converted into a nucleotidic derivative and exposed
ApppI conversion has two biologically important
in this form on the cell surface, either covalently
consequences. 1) ApppI represents an inactive
bound or strongly associated to a presentation
“storage” form of phosphoantigen which may bind
structure.
to carrier proteins and may be protected from
It remains that ApppI is not active directly and
degradation. Thus storage of antigens as nucleotidic
requires final conversion to IPP to activate T cells.
derivatives might prolong their half-life and
However, this process could conceivably be
immunogenicity. 2) Even if ApppI does not present
achieved by cell-surface associated and tightly
any direct stimulatory activity, it is more readily
regulated NPPs (282). Thus, nucleotidic derivatives
captured and displayed as a stimulatory antigen by
of
cells. After sensitization with ApppI, tumors
intermediates
acquire a stimulatory activity which is resistant to
processing mechanism, although direct evidence of
phosphatases and in this respect are similar to
phosphoantigens on cell membranes is still actively
naturally stimulating tumors.
searched for.
phosphoantigens
in
a
may
represent
possible
important
phosphoantigen
Based on these observations, we propose that
tumoral phosphoantigens are in fact transported and
displayed on the cell surface of tumors in the form
ACKNOWLEDGMENTS
of nucleotidic derivatives and are stably associated
We thank F. L’Faqihi, V. Duplan-Eche (technical
with a presentation structure. Such presentation
platform of cytometry of IFR150) for their
mechanism
technical
is
supported
by
classical
assistance
in
cytometry.
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139
140
RESULTATS EXPERIMENTAUX
Partie III
Présentation des phosphoantigènes
par l’Ecto-F1-ATPase
141
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
1) Introduction
Le mécanisme exact de reconnaissance des phosphoantigènes est toujours énigmatique,
bien que ces molécules aient été identifiées il y a 15 ans. Les premiers travaux sur ces
antigènes ont clairement montré qu’un contact cellulaire est requis pour qu’ils soient actifs
(124). De plus, des travaux récents ont confirmé que la présentation de l’HDMAPP est
dépendante d’une protéine de surface sensible à la trypsine (159). La présentation des
phosphoantigènes doit également être assurée par des cellules d’origine humaine (158). Cette
restriction pourrait s’expliquer de plusieurs manières : la molécule de présentation est
spécifique des primates, l’orthologue exprimé par les cellules d’autres espèces n’est pas
reconnu par le TCR Vγ9/Vδ2 (159), ou ne lie pas les phosphoantigènes. Bien que la structure
tridimensionnelle du TCR suggère que le site de liaison antigénique est fortement compatible
avec la structure générale des phosphoantigènes (41), aucune étude à ce jour n’a pu démontrer
de liaison directe, que ce soit par Biacore ou cristallographie. Il est donc très probable que
l’antigène est incapable de se lier directement au TCR sans molécule de présentation.
L’identification de l’Ecto-F1-ATPase comme antigène tumoral reconnu par les lymphocytes T
Vγ9/Vδ2 ainsi que les propriétés structurales et fonctionnelles de l’ApppI décrites
précédemment nous ont conduits à utiliser ce dernier pour explorer la possibilité que l’EctoF1-ATPase puisse présenter les phosphoantigènes. Nous avons pu observer que la lignée
721.221, sur laquelle l’Ecto-F1-ATPase est à peine détectable, n’est pas capable de présenter
des phosphoantigènes. De plus, des billes recouvertes d’ATP synthase sont capables de
présenter des phosphoantigènes aux lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Pour finir, nous disposons de
résultats expérimentaux, bien qu’indirects, confirmant la liaison stable de l’ApppI sur l’ATP
synthase.
142
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
2) Article 3 (Manuscrit en préparation)
Title:
Co-recognition of Phosphoantigens and F1-ATPase by Vγ9Vδ2 T Lymphocytes
Running head
Phosphoantigen Recognition by Vγ9Vδ2 Lymphocytes
Authors:
Jayati Mookerjee-Basu*,†,§, Pierre Vantourout*,†,§, Laurent O. Martinez*, Bertrand Perret*, Xavier Collet*,
Christian Périgaud†, Suzanne Peyrottes†, and Eric Champagne*#.
§
contributed equally to this work.
Affiliations :
* INSERM, U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Département Lipoprotéines et Médiateurs
Lipidiques, Université Toulouse III Paul Sabatier, Toulouse, France.
†
UMR 5247-CNRS-UM1-UM2, Equipe Nucléosides et Effecteurs Phosphorylés, Université Montpellier 2,
Montpellier, France.
Correspondence :
Eric Champagne, INSERM U563, Departement LML, CHU Purpan, BP 3028, F-31024, Toulouse, France.
E.mail: [email protected]
#
Financial support
This work has been financially supported by the French Association pour la Recherche sur le Cancer (PV and
contracts #3711-3913-4847) and Ligue Nationale contre le Cancer (#R07002BBA). LM and JMB are supported
by Inserm (Avenir) and FRM respectively.
Abbreviations
ApppI: triphosphoric acid 1-adenosin-5'-yl ester 3-(3-methylbut-3-enyl) ester
HDMAPP: hydroxyl dimethylallyl pyrophosphate
IPP: isopentenyl pyrophosphate
NPP: nucleotide pyrophosphatase
bF1: bovine heart mitochondrial F1/Fo-ATPase complex
ABSTRACT
Vγ9Vδ2 T lymphocytes are activated by phosphoantigens provided exogenously or produced by tumors and
infected cells. Activation requires a contact between Vγ9Vδ2 cells and neighboring cells. We previously
reported a role for cell surface F1-ATPase in T cell activation by tumors and specific interactions between
Vγ9Vδ2 TCRs and purified F1-ATPase. By monitoring calcium flux in single cells, we now show that contact of
T cells with F1-ATPase on polystyrene beads can partially replace the cell-cell contact signal during
phosphoantigen responses. ApppI, an adenylated derivative of IPP, can stably bind to F1-ATPase-coated beads
and promotes TCR aggregation, lymphokine secretion and activation of the cytolytic process provided that a
nucleotide pyrophosphatase activity is present. Our experiments support the notion that Vγ9Vδ2 T cells are
dedicated to the recognition of phosphoantigens on cell membranes in the form of nucleotide derivatives which
can bind to F1-ATPase acting as a presentation molecule.
also recognize diverse tumor cells against which
INTRODUCTION
Human lymphocytes of the Vγ9Vδ2 subset
they frequently exert cytotoxicity. The Vγ9Vδ2
represent the main pool of non-conventional T
TCR is thought to function as a pathogen-
lymphocytes in adult blood and lymph nodes. They
associated molecular pattern receptor dedicated to
expand and their effector functions are triggered
the recognition of phosphoantigens. Strong agonists
following
non-peptidic
such as hydroxy dimethyl allyl pyrophosphate
phosphorylated antigens (85, 257) in a TCR-
(HDMAPP) are produced by bacterial organisms
dependent manner (41, 261). Mature Vγ9Vδ2 cells
through the deoxyxylulose phosphate pathway
the
recognition
of
143
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
(283). However, eukaryotic cells produce a weaker
provided by the contacting cell has not been fully
Vγ9Vδ2
isopentenyl
elucidated and could involve antigen presentation,
ubiquitous
co-stimulation, or both. We reported previously that
mevalonate pathway of isoprenoid synthesis.
Vγ9Vδ2 sensitive tumors display on their surface a
Accumulation of IPP naturally occurs in tumor cells
complex similar to mitochondrial ATP synthase,
following dysregulation of this metabolic pathway
ecto-F1-ATPase (144). Recent experiments revealed
by the tumorigenesis process (154). Dysregulation
that the complex is tightly associated with MHC-I
of the mevalonate pathway in macrophages can also
antigens, an interaction which can mask antigenic
result from phagocytosis of bacteria (284). IPP
epitopes and prevent detection of the F1-ATPase
accumulation can be induced pharmacologically by
complex on many cell types expressing high levels
aminobisphosphonate drugs which inhibit farnesyl
of MHC-I antigens (204). Using soluble forms of
pyrophosphate
which
the Vγ9Vδ2 TCR and of a soluble form of bovine
normally consumes IPP in downstream isoprenoid
F1-ATPase, specific interactions between the TCR
synthesis (273). Tumor cells which accumulate IPP
of the G115 Vγ9Vδ2 T cell clone and ecto-F1
strongly activate Vγ9Vδ2 T cells and become
ATPase have been demonstrated (144).
TCR
pyrophosphate
agonist
(IPP)
antigen,
through
synthase,
the
the
enzyme
highly susceptible to their cytolytic activity in
particular
after
down-modulation
of
In the present work, we have used ApppI and
MHC-I
its non-nucleotidic analogue IPP to explore the
expression(67).
In
addition
phosphoantigens
contribution of nucleotidic antigens and F1-ATPase
to
alkyl
pyrophosphates,
also
exist
as
to phosphoantigen responses.
nucleotidic
conjugates co-produced by microorganisms (85).
MATERIALS AND METHODS
Moreover, ApppI, an adenylated derivative of IPP,
Antibodies and other reagents
accumulates in cells overproducing IPP (252, 281).
Anti-TCRVδ2-FITC (IMMU360) and CD3ε-
We found that it is naturally produced in the
PE (UCHT1) were from Beckman-Coulter, anti-
Vγ9Vδ2 tumoral target Daudi as well. ApppI
CD107a-PE (H4A3) from BD- Pharmingen. Anti-
requires cleavage into IPP+AMP to stimulate
ATP synthase α-subunit (7H10) and β-subunit
Vγ9Vδ2 cells in the absence of APCs. However, it
(3D5) were from Molecular Probes. Apyrase,
can be efficiently captured by diverse cell lines and
Crotalus adamanteus nucleotide pyrophosphatase
dendritic cells and confers a strong stimulatory
(NPP). IPP was from Isoprenoids LC (Tampa,
activity for Vγ9Vδ2 cells (PV et al, submitted).
Florida, USA). The method for ApppI synthesis is
TCR activation by phosphoantigens is not
reported elsewhere (PV, submitted). Apyrase and
completely understood. Although not absolutely
NPP were used in cellular and biochemical assays
required, antigen presenting cells (APC) increase
at the concentration of 0.2U/ml and 0.02U/ml
Vγ9Vδ2 T cell responses to phosphoantigènes
respectively. F1Fo complexes from bovine heart
(269). Nevertheless, the activation of Vγ9Vδ2
mitochondria (bF1) were kindly provided by Pr. J.E.
lymphocytes by soluble phosphoantigens requires
Walker (MRC, Cambridge, UK).
contact with a neighboring cell which does not need
Cell pulsing with phosphoantigens
to be a specialized APC, is not required to express
MHC molecules and can be a neighboring T cell
Polyclonal Vγ9Vδ2 T cell lines (>94%) were
(124, 285). However, the nature of the signal
used throughout this study and generated by IPP
144
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
stimulation of PBMCs and expansion in IL2.
cells were left to adhere for 10min to the bottom of
Control αβ T-cell lines were obtained with the
poly-D-lysine-treated
same protocol using staphylococcal enterotoxin B
chamber slides in 100μl of RPMI containing 5%
instead of IPP.
FCS and 10mM Hepes. Fluorescence measurements
(5μg/ml)
8-well
Labtek
(excitation: 340 and 380nm, emission: 510nm)
Pulsing ApppI on F1-ATPase-coated beads
were performed on a Zeiss Axiovert 200M inverted
For immobilization on beads, solubilized
microscope equipped with a CCD camera and a
bovine bF1 was diluted (5µg/ml) in 1 ml of PBS and
37°C, 5% CO2 chamber. Analysis was performed
incubated
with
10
7
6µm
polystyrene
beads
on isolated T cells. The camera output was analyzed
(Biovalley, Marne-la-Vallée, France) for 4h at room
with
temperature on a wheel. Beads were pelleted by
fluorescence ratios were converted to approximate
centrifugation, washed three times and kept in PBS
intracellular calcium concentrations (intra cellular
1% BSA. Beads were used in stimulation assays as
calcium indexes) as described (286). At each time
cultured cell lines. In control beads bF1 was
point, the ratios from 10 to 15 cells were averaged
replaced by BSA or anti-CD3ε antibody (25μg/ml).
and data were expressed as means +/- SD.
the
Metafluor
software.
340/380nm
For loading with phosphoantigens, a suitable
aliquot of beads was incubated with ApppI or IPP
Confocal microscopy
(50µM) for 2 hours at 37°C in serum-free culture
K562 or 721.221 cells were either pulsed with
medium, washed extensively, and used for Vγ9Vδ2
ApppI (20µM) or kept untreated for 16-18h,
T cells stimulation. In phosphatase sensitivity
washed twice and stained with Hexidium Iodide
assays NPP or control medium were added to the
(Molecular Probes, 5µM) and used as APCs.
beads 15 to 60min before or after pulsing the beads.
Alternatively, F1-coated beads were pulsed with
These were then washed extensively and cocultured
50µM ApppI as above and used for interaction of T
with T cells and NPP (0.02U/ml).
cells. Vγ9Vδ2 T cells were mixed with APCs at the
ratio of 1:1 or with beads (5 beads for 1 T cell) in
presence or absence of nucleotide pyrophosphatase,
T cell activation assays
CD107a expression assay for cytolytic function
centrifuged at 1200rpm for 1 min and incubated at
were performed as described (247) except that
37°C for 30min (APCs) or 50min (beads). Cells
brefeldin A was omitted. For IFN-γ release assays,
were then resuspended gently and layered onto
T cells (5x105) were co-culture with antigen or
poly-L lysine-coated slides. After 10min, 0.02%
antibody-coated beads (106) in 100 μl/well in round
NaN3 was added and slides were kept at room
bottom 96-well plates, in CM supplemented with a
temperature for further 15min. After washing, the
substimulatory dose of PMA (0.6 ng/ml) for 24h.
cells were stained with anti-δ2-FITC, the slides
Supernatants were recovered and IFN-γ was
were mounted and observed under a Zeiss LSM 510
measured using a standard ELISA assay (OptEIA,
(Zeiss) confocal microscope as described(287).
BD Biosciences).
RESULTS AND DISCUSSION
F1-ATPase promotes phosphoantigen responses
Single cell analysis of calcium mobilization
Ecto-F1-ATPase can be detected on many cell
Vγ9Vδ2 T cells were loaded with fura-2-AM
lines
(Molecular probes, 5μM, 20min), washed, and 105
145
by
surface
immuno-staining
with
the
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
antibodies 7H10 (α-subunit) and 3D5 (β-subunit)
although high MHC-I expression strongly interferes
with its detection by masking target epitopes (204).
However, it is barely detected on 721.221 cell line
as opposed to Daudi and K562 which are similarly
MHC class I-deficient (Fig.1A). In order to
evaluate the possible implication of F1-ATPase in
the delivery of a cell-cell contact signal for the
response to IPP, we tested the ability of 721.221 to
deliver it. An IPP-specific Vγ9Vδ2 T cell line was
raised by stimulation of PBMC with IPP. Live
Vγ9Vδ2 T cells were loaded with the fluorescent
calcium probe fura-2 and immobilized in culture
medium on the bottom of Labtek chamber slides in
Figure 1. 721.221 cells do not support
phosphoantigen responses.
(A) Surface expression of α (dashed lines) and β
(solid lines) subunits of human F1-ATPase
monitored on three MHC class I-deficient lines by
FACS. Shaded histograms: control IgG.
(B) Vγ9Vδ2 cells loaded with Fura-2 were attached
to the bottom of microscope chamber slides in
conditions were they made minimal intercellular
contacts. Intracellular Ca++ flux was monitored by
recording the fluorescence ratio after 340/380nm
excitation in T cells making no contact with
neighboring T cells. IPP was added when indicated.
K562 or 721.221 cells were added on top of the
medium. (n=10 to 20 cells).
(C,D) Vγ9Vδ2 T cells were co-incubated for 5h
with Daudi, K562 or 721.221 cells, either untreated
or pulsed overnight with 20μM ApppI (C) or
pamidronate at the indicated concentration (D). Cell
activation was monitored by measuring the
percentage of CD107a+ cells in Vδ2 cells.
(E) TCR aggregation in T cells (FITC, green) was
examined by confocal microscopy following 30
min contact with ApppI-pulsed or untreated K562
or 721.221 cells loaded with hexidium iodide (red).
conditions where they did not make contacts with
each other. IPP was provided in solution. Cell
contact was provided by adding unlabelled tumor
cells on top of the culture and the increase in
intracellular
calcium
concentration
was
then
monitored by recording fluorescence using videomicroscopy (Fig.1B). In the absence of cell-cell
contact, IPP did not induce intracellular Ca++ flux.
Addition of K562 cells in the presence of IPP
produced a calcium flux which was maximal a few
minutes after initial contacts with K562 cells, and
decreased gradually to reach the base line after
~15min. Calcium flux was not observed in the
absence of IPP. 721.221 cells failed to promote
IPP-mediated calcium response. Unlike K562, this
cell line was also unable to promote Vγ9Vδ2 T cell
activation and TCR aggregation after pulsing with
the aminobisphosphonate pamidronate or with the
To exclude a non-specific activation, BSA-coated
phosphoantigen ApppI (Fig.1C-E). To confirm a
beads were used as a control. The contact of bF1-
direct involvement of F1-ATPase in the co-
coated beads promoted a gradual increase of
activation signal, calcium flux analysis was
intracellular calcium when IPP was present in the
performed as above except that contacting tumor
culture medium. The calcium flux was delayed and
cells were replaced by polystyrene beads coated
increased slowly as compared with the rapid flux
with purified bovine mitochondrial F1/Fo-ATPase
triggered by whole cells expressing F1-ATPase.
complexes (bF1, Fig.2).
146
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
is specific for Vγ9Vδ2 cells as a control αβ T cell
Figure 2. Purified
provides
a
bF1
contact signal for
the response to IPP.
The
intracellular
flux
in
Ca++
individual Vγ9Vδ2
cells was monitored
as in Fig.1B except
that tumor cells were
replaced by beads
coated with bF1 or
BSA. (n=10 and 11
cells).
line was unresponsive to ApppI-loaded bF1
although it responded well to anti-CD3 stimulation.
Monitoring CD107a expression after stimulation
gave qualitatively identical results (data not
shown). bF1 loaded with ApppI also induced
calcium mobilization in the single cell assay
described above following addition of exogenous
NPP. Thus bF1 can present ApppI to Vγ9Vδ2 cells
but, in the absence of APCs, IPP must be released
from complexes by addition of exogenous NPP to
allow activation of Vγ9Vδ2 T cells.
This flux presumably resulted from multiple weak
To confirm that ApppI recognition on bF1 involved
but antigen-specific contacts with beads since it
TCR interaction, TCR redistribution on Vγ9Vδ2 T
was not seen with beads which did not carry bF1 or
cells was examined by confocal microscopy. After
with bF1 in the absence of IPP. Thus purified bF1
50min co-incubation of T cells, bF1 alone did not
can deliver at least part of the membrane contact
induce significant TCR aggregation (4.4% of T
signal normally delivered by contacting cells.
cells). On the contrary, when ApppI was loaded on
F1-ATPase
stably
binds
bF1, typical patches of TCRs were observed.
nucleotidic
Similar results were obtained when ApppI-loaded
phosphoantigens
bF1 were used with or without NPP addition (43%
We then tested the possibility that F1-ATPase
versus 39%), indicating that ApppI recognition is
could be used by cells to present phosphoantigens.
required for TCR aggregation but that hydrolysis by
To assess the stable binding of phosphoantigens to
NPP is not.
F1-ATPase, bF1-coated beads were incubated with
IPP or ApppI, extensively washed and used to
F1-ATPase protects ApppI from NPP activity
stimulate Vγ9Vδ2 T cells. As ApppI in the absence
Although tumor cells produce pyrophosphate
of APCs requires addition of exogenous nucleotide
antigens intracellularly, these are probably not
pyrophosphatase (NPP) the stimulatory activity of
recognized in solution since T cell activation by
“antigen-pulsed” beads was evaluated in the
tumors is not altered by enzymes which degrade
presence and absence of exogenous NPP (Fig.3).
pyrophosphates such as apyrase, or nucleotide
Stimulation of Vγ9Vδ2 T cells with ApppI-pulsed
pyrophosphatases which cleave their nucleotide
bF1 promoted lymphokine secretion in the presence
derivatives (PV, submitted). We wondered how
of NPP. This indicates that ApppI can be stably
NPP treatment of ApppI/bF1 complexes prior to
loaded onto bF1 and that IPP can be released from
their exposure to T cells would affect T cell
the complex by exogenous NPP. No activity could
activation. Beads carrying ApppI/bF1 complexes
be retained on IPP-pulsed beads indicating that
were thus treated with NPP for variable times and
binding requires the antigen in nucleotidic form.
washed. As a control for NPP activity, ApppI was
Non-specific binding of nucleotidic antigen on
similarly treated before its incubation with bF1-
beads is excluded since no activity is retained on
coated beads.
control BSA-coated beads. The stimulatory activity
147
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
Figure 3. Stable binding of ApppI on bF1.
(A) Polystyrene beads were coated with BSA (BSA) or bovine F1-ATPase (bF1), and incubated with IPP or
ApppI. After extensive washing, the beads were co-incubated overnight with Vγ9Vδ2 cells plus a substimulatory dose of PMA, in the presence or absence of exogenous NPP. After incubation, supernatants were
recovered and assayed for IFN-γ by ELISA. Results are from triplicate co-cultures (means +/-SD) and are
representative of more than 3 similar experiments.
(B) T cell stimulation was performed as in (A) using αβ and γδ T cell lines. Beads coated with anti-CD3ε
antibody were used as control for cell integrity.
(C) The intracellular Ca++ flux in individual Vγ9Vδ2 cells following contact with polystyrene beads coated with
bF1 and subsequently loaded with ApppI. Ca++ flux was monitored with and without addition of exogenous NPP
(n=11 cells for each panel).
(D) TCR aggregation (anti-Vδ2-FITC, green) was examined by confocal microscopy as in Fig.1E except that
tumor cells were replaced by ApppI-loaded, bF1-coated polystyrene beads, in the presence or absence of NPP.
After the loading step, the beads were washed and
As expected ApppI hydrolysis by a 30min enzyme
tested for stimulatory activity in the presence of
treatment before loading on beads abrogated
NPP, by monitoring CD107a expression (Fig.4) or
subsequent responses, due to deficient loading on
intracellular cytokine accumulation (not shown).
bF1. Nevertheless when the NPP treatment was
Figure 4. F1 protects
ApppI
from
hydrolysis by NPP.
were
bF1-beads
loaded with ApppI
and washed. ApppI
was treated with NPP
for the indicated time
before (black bars) or
after (white bars)
addition to bF1coated beads. After
washing, the beads
were co-cultured 5h with Vγ9Vδ2 cells in the
presence of NPP, and CD107a expression was
monitored (mean of triplicate cultures+/-SD).
Representative of three experiments.
performed after loading on beads, a significant
antigenic activity remained associated with beads
after 1h of treatment, indicating that ApppI is
protected from hydrolysis when loaded on bF1.
Activation by F1-ATPase/ApppI complexes in
the absence of APCs requires addition of NPP. If a
similar
mechanism
is
involved
in
tumor
recognition, it seems likely that tumor cells/APCs
provide the NPP activity. Our data suggest that
antigen (IPP) release is mediated by a specific NPP
activity occuring in a confined microenvironment at
the T-cell-APC interface or is timely controlled to
occur at the TCR contact site before a possible
148
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
action of other phosphatases. Several candidate
cannot exceed the nM range. This is several orders
NPPs have been reported on tumoral and non-
of magnitude below IPP or ApppI concentrations
tumoral tissues (282, 288).
which give detectable activation when supplied in
Single T cell responses to IPP are permitted by
solution (μM range). Thus, presentation on F1-
the co-recognition of F1-ATPase, although IPP, as
ATPase increases the efficiency of phosphoantigen
opposed to ApppI, does not stably bind to this
recognition, possibly through concentrating the
complex. We propose that this is because the
antigen in the proximity of the TCR or by providing
Vγ9Vδ2 TCR is dedicated to the recognition of
protection from surrounding phosphatases.
antigens on cell surfaces. It seems likely that this
process
is
short-circuited
by
provision
of
phosphoantigens as pyrophosphates, allowing auto-
ACKNOWLEDGMENTS
presentation by γδ cells themselves which express
We are grateful to Professor John Walker
F1-ATPase (not shown).
(Cambridge, UK) for kindly providing F1Fo
Finally, assuming 100% binding of properly
preparations. We thank F. L’Faqihi, V. Duplan-
conformed bF1 to beads and hypothesizing six
Eche (IFR-BMT, Toulouse, France, Technical
catalytic and non-catalytic nucleotide binding sites
Platform
on the complex, an estimate of the phosphoantigen
assistance in cytometry, and Sophie Allart (IFR-
(ApppI) concentration in stimulation assays with
BMT, Technical Platform Cell Imaging) for help in
ApppI/bF1 complexes and NPP indicates that it
confocal
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Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
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3) Modulation de l’activité enzymatique de l’ATP synthase par l’ApppI
3.1)
Introduction
L’ATP synthase compte 6 sites liant les nucléotides, situés au niveau des interfaces entre
les chaînes α et β. Les 3 sites situés sur les chaînes β sont les sites catalytiques alors que les
sites situés sur les chaînes α sont non-catalytiques. De nombreuses études ont montré que la
liaison de nucléotides ou de certaines autres molécules comme le pyrophosphate sur les sites
non-catalytiques est capable d’augmenter de façon significative l’activité de l’ATP synthase.
De plus, cette activité ne suit pas une loi michaëlienne, les sites catalytiques montrant une
forte coopérativité. Selon les études, l’enzyme a été décrite pour posséder 2 voire 3 Km (289).
L’ApppI étant capable de se lier de façon stable sur l’ATP synthase, nous avons donc voulu
vérifier si cette liaison induisait une modulation de son activité enzymatique. Ceci pourrait
150
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
donner des informations importantes sur les modalités de liaison des phosphoantigènes
nucléotidiques à l’Ecto-F1-ATPase. Nous avons donc utilisé deux techniques expérimentales
permettant de mesurer cette activité. La première consiste à doser l’ATP à l’aide d’un kit basé
sur la mesure de la bioluminescence de la luciférase, dépendante de l’ATP. La seconde
correspond à la mesure de l’oxydation du NADH par la méthode dite des enzymes couplées,
test classiquement utilisé dans les études de mesure d’activités d’hydrolyse d’ATP.
Nos résultats montrent que l’ApppI est capable de stimuler l’activité ATPasique de la F1ATPase in vitro et qu’il n’est pas hydrolysé par cette enzyme. Ceci suggère donc qu’il se lie
aux sites non-catalytiques.
3.2)
Matériel et méthodes
Enzymes et réactifs
La F1-ATPase bovine purifiée (préparation précipitée en sulfate d’ammonium) a été
gracieusement fournie par le Pr. J.E. Walker (MRC, Cambridge, Royaume-Uni). Tous les
autres réactifs et enzymes proviennent de Sigma Aldrich hormis le kit de dosage de l’ATP
(ATP CLSII, Roche).
Dosage d’ATP par bioluminescence
La F1-ATPase a été centrifugée (13000g, 2min) puis solubilisée en tampon d’activité
(Hepes 10mM, NaCl 150mM, KCl 5mM, MgCl2 2mM). 250ng d’enzyme ont été utilisés pour
chaque mesure. L’ATP (1µM final) ainsi que des concentrations croissantes d’ApppI (volume
final : 50µL) ont été incubés avec la F1-ATPase pendant 5min à 37°C, puis 25 µL de solution
de luciférase (ATP CLSII) ont été ajoutés. La luminescence a été lue sur un luminomètre
Berthold Orion et les données ont été traitées avec Excel.
151
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
Test des enzymes couplées
La F1-ATPase a été préparée comme décrit précédemment et pour chaque point mesuré
2µg d’enzyme ont été incubés en présence de PhosphoEnolPyruvate (PEP, 250µM),
NicotineAmide Dinucléotide (NADH, 250µM), Pyruvate Kinase (PK, 5 unités par point) et
Lactate DésHydrogénase (LDH, 1 unité par point), avec ou sans ApppI (100µM) dans un
volume final de 200µL en plaques 96 puits à fonds plats. La réaction a été démarrée par
l’ajout d’ATP à diverses concentrations et la Densité Optique (DO) mesurée à 340nm
(longueur d’onde d’absorption du NADH) pendant deux minutes sur un spectrophotomètre
Varioskan Flash (Thermo Corporation). Les données ont été traitées avec Excel.
HPLC
La F1-ATPase a été préparée comme précédemment et incubée (2µg) en présence d’ATP
ou d’ApppI (500µM) pendant 15min à 37°C en milieu RPMI. La solution a ensuite été diluée
avec de l’eau distillée, injectée sur colonne échangeuse d’anion et analysée comme décrit
précédemment (Article 2, p.128).
3.3)
Résultats et discussion
L’ajout de quantités croissantes d’ApppI augmente l’activité ATP hydrolase de la F1ATPase bovine purifiée, de façon dose dépendante, avec une activité plus que doublée pour
un ratio ApppI : ATP de 100 (Figure 20A). Le dosage par bioluminescence ne permettant pas
de mesurer des quantités importantes d’ATP (la limite étant aux environs de 1-10 µM) et donc
d’observer l’effet de l’ApppI en présence de fortes concentrations d’ATP, nous avons utilisé
la technique des enzymes couplées. Cette méthode permet de mesurer les activités
ATPasiques en temps réel et donc de calculer les vitesses d’hydrolyse. L’ajout d’ApppI
152
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
augmente cette vitesse, mais pour des concentrations faibles d’ATP uniquement (Figure 20B),
et cette augmentation tend vers un doublement de l’activité.
Figure 20. Augmentation de l’activité de la F1-ATPase par l’ApppI.
(A) La F1-ATPase (250ng) a été incubée avec des concentrations croissantes d’ApppI et
l’activité ATPasique a été déterminée en dosant par bioluminescence l’ATP restant après la
réaction (concentration initiale : 1µM). Les résultats sont exprimés en % de l’activité contrôle
(sans ApppI) et correspondent aux moyennes de trois puits +/- écart type (représentatif de
deux expériences indépendantes). (B) La vitesse d’hydrolyse de l’ATP par la F1-ATPase a été
déterminée en présence ou non d’ApppI par la méthode des enzymes couplées. Chaque point
correspond à la pente de la droite obtenue par mesure de la décroissance de la DO à 340nm
(oxydation du NADH). Encart : Rapport des vitesses d’hydrolyse en présence ou non
d’ApppI.
Dans la deuxième méthode utilisée, l’augmentation de la vitesse pourrait s’expliquer par
une lente conversion de l’ApppI en ADP par la F1-ATPase. En effet, l’ADP ainsi formé serait
régénéré par la PK et donc augmenterait « artificiellement » la vitesse d’oxydation du NADH.
Ceci ne permettrait néanmoins pas d’expliquer l’amélioration de l’hydrolyse observée par
dosage de l’ATP par bioluminescence. De plus, nous avons pu exclure toute hydrolyse de
l’ApppI en ADP par la F1-ATPase en vérifiant par HPLC les nucléotides obtenus (Figure 21).
La totalité de l’ATP est hydrolysé en ADP (voir les temps de rétention des tracés des
panneaux de gauche), alors que la F1-ATPase n’hydrolyse pas l’ApppI puisque son temps de
rétention sur colonne échangeuse d’anions n’est pas modifié.
153
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
Figure 21. La F1-ATPase
n’hydrolyse pas l’ApppI.
L’ATP et l’ApppI (25nmol) ont
été incubés (en bas) ou non (en
haut) avec 2µg de F1-ATPase
bovine pendant 15min à 37°C en
RPMI. Le produit de la réaction
a ensuite été dilué et chargé sur
colonne échangeuse d’anions.
La DO (exprimée en mUA :
milliUnités d’Absorption) à
260nm a été acquise.
Bien qu’indirectes, les méthodes que nous avons utilisées dans les expériences
précédentes (Article 3, p.143) ainsi que celles décrites ici montrent clairement que l’ApppI est
capable de se lier de façon stable à l’ATP synthase. De plus, les résultats obtenus par les
études enzymatiques sont plutôt en faveur d’une liaison de l’ApppI aux sites non-catalytiques
de l’enzyme. En effet, étant donné que l’ApppI n’est pas hydrolysé par la F1-ATPase, il
devrait inhiber l’activité ATPasique s’il se liait aux sites catalytiques. Enfin, sa capacité à
augmenter l’hydrolyse d’ATP est équivalente à celle décrite pour le pyrophosphate, qui lie les
sites non-catalytiques (289).
En conclusion, l’ApppI nous a permis de démontrer l’implication de l’Ecto-F1-ATPase
dans la reconnaissance des phosphoantigènes par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. La stimulation
154
Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase
de ces lymphocytes par l’ApppI nécessitant sa conversion en IPP, il n’est pas un antigène au
sens strict du terme. Néanmoins, les propriétés uniques de l’ApppI (notamment sa capture par
les cellules cibles, sa liaison sur l’ATP synthase, et sa production par des cibles classiques les
lymphocytes T Vγ9/Vδ2) indiquent que les dérivés nucléotidiques jouent probablement un
rôle très important dans le mécanisme global de présentation et de reconnaissance des
phosphoantigènes.
155
156
RESULTATS EXPERIMENTAUX
Partie IV
Etude du métabolisme nucléotidique
à la surface des cellules
157
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
1) Introduction
A la surface des cellules, l’ATP et d’autres nucléotides (ADP, UTP et UDP
principalement) interviennent dans de nombreux processus cellulaires impliquant notamment
les récepteurs purinergiques (P2X et P2Y). Les enzymes participant au métabolisme
nucléotidique à la surface des cellules jouent donc un rôle important dans la régulation de ces
processus (290). Comme mentionné dans le Chapitre III de l’introduction, l’Ecto-F1-ATPase
fait partie de ces enzymes mais ses propriétés enzymatiques sont toujours débattues. L’équipe
s’intéresse en particulier à son rôle dans le métabolisme des HDL et la survie des cellules
endothéliales. J’ai ainsi été amené à participer à l’étude du métabolisme nucléotidique à la
surface des hépatocytes.
Il existe à la surface des cellules plusieurs enzymes de conversion des nucléotides et nous
avons cherché à savoir si deux d’entres elles, l’Adenylate Kinase (AK, 2ADP Æ ATP +
AMP) et la Nucleoside DiPhosphoKinase (NDPK, qui transfère le phosphate terminal d’un
nucléotide triphosphate sur un nucléotide diphosphate), étaient capables de moduler les
niveaux d’ADP à la surface des cellules. Nos résultats confirment que l’Ecto-F1-ATPase est
dépourvue d’une activité de type ATP synthase. L’AK inhibe constitutivement la voie EctoF1-ATPase/P2Y13 en consommant l’ADP et elle est largement responsable de la conversion de
l’ADP en ATP à la surface des cellules. Une activité de type NDPK peut être observée mais
ne semble pas constitutivement active et ne joue donc probablement pas un rôle majeur dans
le métabolisme nucléotidique. De plus, l’Adenosine Nucleotide Translocase (ANT),
transporteur d’ADP/ATP associé à l’ATP synthase dans la mitochondrie, est également
exprimé à la surface des cellules et intervient dans l’augmentation de la quantité d’ATP
extracellulaire en réponse à l’ADP.
158
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
2) Article 4
159
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
160
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
161
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
162
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
163
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
164
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
165
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
166
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
167
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
3) Rôle de l’ANT dans la conversion ADP Æ ATP à la surface des cellules
3.1)
Introduction
Les résultats présentés ci-dessus indiquent que l’inhibition de l’AK, bien que réduisant
fortement la production d’ATP suite à l’ajout d’ADP, n’abolit pas totalement cette
conversion. Nos données indiquant que ni l’Ecto-F1-ATPase ni la NDPK ne peuvent
expliquer cette activité résiduelle, nous avons donc étudié une autre protéine, l’Adenosine
Nucleotide Translocase (ANT, aussi appelé AAC pour ADP, ATP Carrier). Nous avons
principalement réalisé ces études avec la lignée Daudi. D’une part afin de vérifier si le
métabolisme nucléotidique à la surface de ces cellules est similaire à celui étudié
précédemment (Article 4), mais aussi pour envisager les conséquences potentielles pour la
reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
L’ANT est un transporteur mitochondrial situé dans la membrane interne et ayant une
place importante dans la phosphorylation oxydative et les mécanismes de l’apoptose (291).
Son rôle principal est d’échanger l’ADP avec l’ATP au sein de la mitochondrie, afin
d’exporter l’ATP produit par l’ATP synthase et d’en assurer la synthèse permanente en
important l’ADP. Cette fonction est facilitée par son interaction avec l’ATP synthase au sein
de « l’ATP synthasome ». Ceci suggère donc que l’ANT pourrait également être exprimée à
la surface et participer à la production d’ATP observée lors de l’ajout d’ADP, mais cette
possibilité n’a à notre connaissance jamais été explorée.
Nos résultats indiquent que, comme pour les hépatocytes, une grande partie de la conversion
de l’ADP en ATP à la surface des cellules Daudi est due à l’AK. De plus l’ANT est détectable
à la surface des cellules et son inhibition diminue de façon très significative la quantité d’ATP
extracellulaire mesurée après ajout d’ADP.
168
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
3.2)
Matériel et méthodes
Culture cellulaire
La lignée Daudi provient de l’ATCC et a été cultivée en RPMI 1640 Glutamax contenant
10% de SVF décomplémenté, du pyruvate de sodium et de la pénicilline/streptomycine. Tous
les réactifs de culture proviennent d’Invitrogen. Pour les mesures de conversion de l’ADP, les
cellules ont été pré-incubées (250000 cellules par puits, 150µL) pendant une heure à 37°C,
5% CO2 afin d’équilibrer les concentrations de nucléotides dans le milieu (voir Article 4,
p.161) en milieu DMEM sans rouge phénol ni SVF.
Anticorps et réactifs
L’anticorps anti-ANT (N-19, anticorps polyclonal de chèvre) provient de Santa Cruz.
L’anticorps secondaire âne anti-IgG de chèvre-FITC provient de Beckman Coulter. Le
contrôle négatif est un anticorps polyclonal de chèvre anti-Ig de souris (Clinisciences). Le
marquage et l’analyse par cytométrie de flux ont été effectués comme décrit précédemment
(voir par exemple Résultats I, section 3.2, p.112). Le kit ATP CLSII (Roche) a été utilisé
selon les instructions du fournisseur. L’Ap5A (Diadénosine pentaphosphate, inhibiteur de
l’AK) et l’acide bongkrékique (AB, inhibiteur de l’ANT) proviennent de Sigma Aldrich.
Mesure de la conversion ADP Æ ATP
1h après le passage des cellules en milieu DMEM sans rouge phénol les cellules ont été
pré-incubées ou non pendant 10min avec les inhibiteurs séparément ou ensemble (Ap5A
10µM, AB 50µM). L’ADP (10µM) a été ajouté et les cellules ont été incubées 5min à 37°C.
50µL de surnageants ont été prélevés et 25µL de solution de luciférase ajoutés. La
bioluminescence a été acquise et analysée comme décrit précédemment (voir Résultats III,
section 3.2, p.151).
169
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
3.3)
Résultats et discussion
L’analyse par cytométrie de flux montre que l’ANT est exprimée à la surface des cellules
Daudi, bien que le marquage soit relativement faible (Figure 22A). L’ANT interagissant avec
l’ATP synthase dans la mitochondrie, son expression à la surface avec l’Ecto-F1-ATPase n’est
donc pas inattendue.
Figure 22. Expression de l’ANT en surface des cellules Daudi.
(A) Les cellules ont été marquées par l’anticorps contrôle (histogramme grisé) ou l’anti-ANT
(histogramme en ligne pleine) puis par l’anticorps secondaire et analysées par cytométrie de
flux. (B) Les cellules ont été incubées en présence des inhibiteurs (Ap5A, 10µM ; AB, Acide
Bongkrékique, 50µM) pendant 10min puis l’ADP (10µM, 150pmol) a été ajouté. Après 5min,
les surnageants ont été prélevés et l’ATP dosé par bioluminescence. Les données représentent
les moyennes de trois incubations +/- écart type et sont représentatives de trois expériences
indépendantes.
Des résultats équivalents ont été obtenus avec la lignée K562 et des hépatocytes primaires
humains.
Nous avons également étudié la fonctionnalité de l’ANT exprimée à la surface (Figure 22B).
Comme pour les hépatocytes, l’ajout d’ADP entraîne une augmentation rapide de la présence
d’ATP à la surface des cellules, qui de façon reproductible correspond à environ 10% de
l’ADP fourni. Environ 50% de cette production est inhibée par l’Ap5A, indiquant que l’AK
joue un rôle majoritaire. Elle est également réduite par l’ajout d’acide bongkrékique (AB) et
170
Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire
cette inhibition est plus marquée lorsque l’AK est inhibée, suggérant que l’inactivation de
l’ANT est partiellement compensée par l’AK. Ces résultats sont en faveur d’une expression
de l’ANT à la surface des cellules et de son implication dans la conversion de l’ADP en ATP.
Ils pourraient être confirmés par des études biochimiques, par exemple par biotinylation et
précipitation des protéines de surface. L’inhibition par l’Ap5A et l’AB n’est toutefois pas
totale. Les NDPK n’étant à priori pas actives constitutivement (Article 4, p.159), cette activité
résiduelle provient probablement d’autres enzymes ou transporteurs.
En conclusion, nos résultats sur l’étude du métabolisme nucléotidique à la surface de
divers types cellulaires confirment que l’Ecto-F1-ATPase n’est pas impliquée dans la
production d’ATP observée après incubation des cellules avec de l’ADP et qu’elle possède
donc uniquement une activité de type hydrolase. Cette conversion est majoritairement due à
une activité de type AK, et de façon moindre à l’ANT. Cette étude pourrait ouvrir des
perspectives intéressantes pour l’étude de la reconnaissance des cellules tumorales par les
lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Nous n’avons pas à l’heure actuelle de données expérimentales en
faveur d’une implication de l’activité enzymatique de l’Ecto-F1-ATPase dans l’activation de
ces lymphocytes par les phosphoantigènes. En recvanche, les données relatives à l’ANT
fournissent des éléments potentiellement intéressants pour l’étude des mécanismes de
présentation de ces antigènes. L’ApppI a originellement été décrit par les auteurs qui l’ont
identifié comme un inhibiteur de l’ANT puisqu’il diminue le transport d’ATP radiomarqué
dans des mitochondries isolées (252). On pourrait également émettre l’hypothèse que l’ApppI
est transporté par l’ANT et entre donc en compétition avec l’ATP. L’ANT pourrait ainsi être
impliquée dans l’internalisation de ce phosphoantigène nucléotidique.
171
172
DISCUSSION GENERALE ET
PERSPECTIVES
173
Discussion générale et Perspectives
Nos résultats sur l’interaction entre l’Ecto-F1-ATPase et le CMH-I ainsi que sur l’ApppI
fournissent de nouveaux éléments importants permettant une meilleure compréhension de la
reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Ils sont également les
premiers à proposer une molécule de présentation des phosphoantigènes. Les propriétés
uniques des dérivés nucléotidiques de ces antigènes en font des molécules potentiellement
intéressantes pour le développement de protocoles d’immunothérapie anti-tumorale basés sur
l’utilisation des ces lymphocytes. Nos travaux ouvrent également de nombreuses perspectives
de travail qui permettront de caractériser de manière encore plus précise les molécules et
mécanismes moléculaires impliqués dans cette reconnaissance. Ce chapitre sera destiné à la
discussion générale de nos résultats ainsi que les futurs travaux qui peuvent être envisagés.
1) Interaction entre CMH-I et Ecto-F1-ATPase
1.1)
HLA-B et autres partenaires potentiels
L’étude des isotypes impliqués dans l’interaction avec l’Ecto-F1-ATPase a été basée sur
les résultats des expériences de co-immunoprécipitation initialement obtenus (Article 1,
p.106) avec la lignée Raji. Ceci a restreint nos recherches aux isotypes de CMH-Ia ainsi qu’à
HLA-E. HLA-B est le seul isotype à masquer de façon significative les épitopes de l’Ecto-F1ATPase et à réduire fortement l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Il semble donc être
un partenaire préférentiel de l’Ecto-F1-ATPase. Le fait que nous n’ayons pas pu détecter
l’expression de l’Ecto-F1-ATPase à la surface de cette lignée après diminution de l’expression
de HLA-B à l’aide d’ARNi suggère que l’Ecto-F1-ATPase pourrait interagir avec d’autres
molécules de CMH-I ou apparentées (MICA/B ou les protéines de la famille RAET). Bien
que les données obtenues par traitement à l’acide suggèrent que les candidats potentiels sont
associés à la β2m, l’implication de ces molécules non associées à la β2m mérite d’être
174
Discussion générale et Perspectives
explorée. Ceci pourra être effectué par transfection de ces molécules dans la lignée K562 que
nous avons utilisée pour l’étude des isotypes de CMH-I et qui s’avère être un bon modèle.
HLA-E est également un candidat intéressant. Comme mentionné précédemment, il est
reconnu par CD94/NKG2A, un iNKR jouant un rôle important dans la régulation de
l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. N’ayant pu obtenir d’expression de HLA-E dans
nos transfectants, il sera nécessaire de poursuivre les expériences avec cet isotype, soit en
améliorant les taux d’expression par l’utilisation d’autres vecteurs, soit par utilisation
d’ARNi. HLA-E présentant des peptides issus des séquences d’adressage d’autres molécules
de CMH-I, il est possible que celle de l’allèle HLA-B utilisé ne soit pas compatible. Il faudra
donc envisager de co-transfecter HLA-E avec les autres isotypes clonés.
1.2)
Implications fonctionnelles et physiopathologiques
L’interaction entre le CMH-I et l’Ecto-F1-ATPase renforce le statut de cette dernière
comme « molécule immunologique » et joue probablement un rôle important dans le contrôle
de l’auto-réactivité des lymphocytes T Vγ9/Vδ2. Les conséquences fonctionnelles de
l’interaction entre l’Ecto-F1-ATPase et le CMH-I (inhibition de la stimulation des
lymphocytes T Vγ9/Vδ2) méritent donc des études approfondies. Comme mentionné
précédemment, cette inhibition pourraient être due à l’activation des iNKR (ILT2 étant un
candidat potentiel), et dans ce cas leur implication pourra être confirmée par l’utilisation
d’anticorps bloquants. Alternativement, elle pourrait également résulter de l’inhibition directe
de la liaison du TCR à l’Ecto-F1-ATPase par encombrement stérique. Nous disposons
d’ADNc codant pour des chaînes Vγ9 et Vδ2 permettant la production de TCR soluble qui
pourra être utilisé pour vérifier cette hypothèse.
175
Discussion générale et Perspectives
Le masquage d’épitopes de l’Ecto-F1-ATPase par le CMH-I suggère que l’interaction entre
ces complexes implique les chaînes α et/ou β de l’ATP synthase, auquel cas 3 molécules de
CMH-I peuvent potentiellement interagir avec un complexe d’Ecto-F1-ATPase. Ceci pourrait
expliquer que cette dernière soit détectable malgré une expression modérée du CMH-I sur des
lignées telles que RPMI-8226, HeLa ou HepG2 par exemple (Article 1, p.103). Il est donc
envisageable que les deux mécanismes proposés précédemment puissent être impliqués en
fonction de la densité de CMH-I présente à la surface des cellules.
L’interaction préférentielle entre HLA-B et l’Ecto-F1-ATPase pourrait être pertinente dans
la pathogenèse de diverses maladies auto-immunes et inflammatoires telles que les arthrites
réactives et ankylosantes, ainsi que la maladie de Crohn. Plusieurs éléments sont à prendre en
compte dans cette hypothèse : i) les personnes portant des allèles de type HLA-B27 montrent
une forte prédisposition pour ces pathologies (292); ii) HLA-B27 a été caractérisé pour sa
propension à former spontanément des dimères (293) ; iii) une implication des lymphocytes T
γδ dans le développement de ces maladies a été suggérée (294, 295). Il est donc envisageable
qu’à cause de sa tendance à former des dimères, HLA-B27 ne soit pas capable d’interagir
avec l’Ecto-F1-ATPase. Ceci pourrait faciliter l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 au
cours du développement de ces pathologies.
Il est également possible que d’autres allèles HLA-B ne soient pas capables d’interagir avec
l’Ecto-F1-ATPase. HLA-B51 par exemple est lié à une prédisposition pour la maladie de
Behçet, dans laquelle une implication des lymphocytes T γδ a été suggérée (296). Ces
hypothèses pourraient aisément être explorées en vérifiant si l’Ecto-F1-ATPase est détectable
à la surface de cellules provenant de personnes porteuses de ce type d’allèles.
176
Discussion générale et Perspectives
1.3)
Rôle du CMH-I dans l’expression de l’Ecto-F1-ATPase ?
Par analogie avec Skint1, qui est probablement impliquée dans l’expression du ligand du
TCR Vγ5/Vδ1 chez la souris (55), il est possible que le CMH-I soit directement impliqué dans
l’expression l’Ecto-F1-ATPase à la surface des cellules.
Toutefois la lignée Daudi, qui présente une forte expression de l’Ecto-F1-ATPase, n’exprime
aucune molécule de CMH-Ia ni HLA-E de par sa déficience en β2m. Elle ne semble
également pas présenter d’expression significative de MICA/B, ULBP-1, -2 ou -3 ((297) et
données non montrées). Il est donc peu probable que ces protéines soient impliquées.
En revanche, il est très intéressant de noter que la chaîne invariante Ii, classiquement
impliquée dans l’expression du CMH-II (fortement exprimé sur la lignée Daudi), joue
également un rôle dans l’expression de CD1d et l’activation des cellules MAIT par MR1
(Introduction, Chapitre I, Figure 6, p.36 et section 3.2 p.38, respectivement). Bien que l’EctoF1-ATPase n’ait pas d’homologie avec ces molécules, il est possible que par analogie avec les
autres systèmes de présentation antigénique, la chaîne Ii participe à son expression à la
surface des cellules. L’utilisation d’ARNi dirigés contre la chaîne Ii devrait permettre de
facilement vérifier cette hypothèse.
Comme discuté précédemment, la lignée 721.221 ne semble pas exprimer l’Ecto-F1ATPase, ou à des niveaux trop faibles pour être détectés malgré une expression extrêmement
faible du CMH-I (Article 1, p.103). 721.221 présente une forte expression d’HLA-F qui reste
très majoritairement intracellulaire et dont la fonction exacte est toujours inconnue (244, 298).
Si HLA-F est capable d’interagir avec l’Ecto-F1-ATPase, il pourrait retenir cette dernière dans
un compartiment intracellulaire par lequel elle transite avant son expression à la membrane
plasmique. Cette hypothèse pourrait ainsi expliquer que l’Ecto-F1-ATPase ne soit pas détectée
à la surface de 721.221. L’inhibition de l’expression d’HLA-F dans la lignée 721.221 à l’aide
177
Discussion générale et Perspectives
d’ARNi, ou le clonage et la transfection de cet isotype de CMH-I dans la lignée K562 par
exemple, devrait permettre de vérifier s’il induit une diminution de l’expression de l’Ecto-F1ATPase.
2) Mécanisme de présentation des phosphoantigènes
2.1)
Voie(s) de transit de l’Ecto-F1-ATPase de la mitochondrie à la surface
L’identification des voies impliquées dans l’export de l’ATP synthase hors de la
mitochondrie est un point important, pertinent non seulement pour le mécanisme de
présentation des phosphoantigènes, mais aussi pour ses nombreux rôles décrits plus haut.
Comme discuté précédemment (Introduction III, section 2.2, p.84) il est probable que l’ATP
synthase entière soit exportée à partir de la mitochondrie grâce à un transport vésiculaire,
plutôt que ses sous-unités soient individuellement adressées à la membrane plasmique. L’ATP
synthase pourrait transiter directement à la surface, ou inclure des étapes au niveau d’un ou
plusieurs organelles intracellulaires.
Un travail récent ayant décrit que la chaîne α de l’ATP peut être glycosylée (211), suggérant
un possible passage par le RE et l’appareil de Golgi. L’interaction de l’ATP synthase avec
Ppt1 suggère également que les peroxysomes pourraient être impliqués. Il n’est pas exclu qu’à
l’image de CD1d (Figure 6, p.36) plusieurs voies soient utilisées et permettent la présentation
d’antigènes endogènes ou exogènes. La transfection d’ADNc de chaînes de l’ATP synthase
fusionnés avec des séquences codant pour des protéines fluorescentes (GFP et RFP) devrait
permettre de déterminer, par des études de co-localisation en microscopie confocale, le(s)
compartiment(s) intracellulaire(s) par le(s)quel(s) l’ATP synthase transite pour atteindre la
surface cellulaire.
178
Discussion générale et Perspectives
2.2)
Protéines impliquées dans le routage/chargement de l’Ecto-F1-ATPase ?
De par leur interaction avec l’Ecto-F1-ATPase, les molécules du CMH-I sont des
candidates séduisantes dans l’étude des protéines impliquées dans l’expression ectopique de
ce complexe enzymatique. Alternativement, des protéines non-apparentées au CMH-I
pourraient aussi bien être impliquées dans les mécanismes de routage de l’Ecto-F1-ATPase.
721.221 pourrait être déficiente pour l’expression d’un ou plusieurs gène(s) impliqué(s) dans
ces mécanismes. La comparaison de son transcriptome avec celui de sa lignée parentale 721,
qui exprime l’Ecto-F1-ATPase à sa surface (données non montrées), pourrait permettre
d’identifier des protéines potentiellement impliquées dans cette expression.
Il est également important de déterminer si des molécules particulières sont impliquées
dans le mécanisme de « chargement » des phosphoantigènes sur l’Ecto-F1-ATPase. Des
travaux de thèse récents ont décrit une implication de MRP5 (Multidrug Resistance Protein 5,
aussi appelée ABCC5 pour ATP-Binding Cassette sub-family C member 5) dans la
présentation des phosphoantigènes par les cellules tumorales (299). De plus, MRP5 est
capable de transporter des nucléotides et contrairement aux autres membres de la famille
MRP, une proportion importante de cette protéine peut rester localisée dans des
compartiments intracellulaires, notamment dans les cellules non-polarisées (300). Il est donc
possible que MRP5 puisse participer au chargement des nucléotides sur l’Ecto-F1-ATPase
dans les compartiments intracellulaires où elle transite. Il faudra donc vérifier si MRP5 est
localisée dans ces compartiments et si l’inhibition de son expression diminue la capacité des
cellules à présenter des phosphoantigènes produits de façon endogène, par exemple après
traitement par les aminobisphosphonates.
179
Discussion générale et Perspectives
3) Métabolisme des phosphoantigènes
3.1)
Mécanisme d’internalisation de l’ApppI
Nos résultats indiquent que l’ApppI possède la propriété unique, par rapport à l’IPP, d’être
internalisé et présenté (« pulsé ») de manière très efficace aux lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par de
nombreux types cellulaires, dont les cellules dendritiques. Nous n’avons aucune donnée sur
les modalités de capture de ce composé, hormis le fait qu’elles impliquent probablement un
processus actif (Article 2, p.133). Par analogie avec la présentation de peptides antigéniques
exogènes, ce mécanisme pourrait faire intervenir une étape d’endocytose suivie d’un
processus complexe de routage intracellulaire. L’utilisation de multiples inhibiteurs de
l’endocytose et du transport vésiculaire (Brefeldine A, Monensine, Oxyde de phenylarsine,
colchicine pour en citer quelques uns) pour les expériences de « pulse » par l’ApppI peut être
envisagée pour vérifier si de tels mécanismes sont impliqués. Il faudra néanmoins vérifier que
ces inhibiteurs n’ont pas d’effet sur l’expression de l’Ecto-F1-ATPase à la surface des
cellules.
Alternativement, l’ApppI pourrait être internalisé via un ou des transporteur(s) de
nucléotides et un candidat particulier attire notre attention. L’étude du métabolisme
nucléotidique extracellulaire nous a permis de mettre en évidence une expression de
l’Adenosine Nucleotide Translocase (ANT, qui réalise l’échange entre ADP et ATP dans la
mitochondrie) à la surface des cellules. Il pourrait participer à l’augmentation du niveau
d’ATP extracellulaire après ajout d’ADP dans le milieu de culture (Résultats IV, section 3.3,
p.170). L’ApppI a originellement été décrit par les auteurs qui l’ont identifié comme un
inhibiteur de l’ANT puisqu’il diminue le transport d’ATP radiomarqué (252). Toutefois, leur
étude a décrit une inhibition de ce transport d’environ 50% pour un ratio ApppI/ATP
approchant 1. Ce résultat pourrait donc également s’expliquer par un transport de l’ApppI par
180
Discussion générale et Perspectives
l’ANT, qui entrerait donc en compétition avec celui de l’ATP. L’ANT est en effet capable de
transporter certains analogues d’ATP (291). Son implication dans l’internalisation de l’ApppI
par les cellules pourra être vérifiée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques tels que l’acide
bongkrékique.
Le devenir des phosphoantigènes nucléotidiques internalisés est un élément intéressant à
explorer. Il pourrait notamment permettre d’identifier le(s) compartiment(s) intracellulaire(s)
où la rencontre entre les phosphoantigènes et l’Ecto-F1-ATPase se déroule, et ainsi donner des
indices sur le mécanisme d’expression de l’ATP synthase à la surface des cellules, qui reste
complètement inconnu à ce jour. La synthèse d’analogues fluorescents de l’ApppI est
envisageable et pourrait être réalisée à partir de dérivés fluorescents de l’ATP tels que l’e-azaATP
ou
le
FTP
dont
les
structures
sont
très
proches
de
celle
de
l’ATP
(http://mc11.mcri.ac.uk/atpanaloguestrucs.html). Il faudra toutefois vérifier que les dérivés
fluorescents de l’ApppI synthétisés à partir de ces composés conservent les mêmes propriétés
(hydrolyse par la NPP, activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, liaison sur l’ATP synthase et
augmentation de son activité hydrolase). L’identification des compartiments intracellulaires
pourra être réalisée par des expériences de co-localisation en microscopie confocale à l’aide
de marqueurs spécifiques. Par exemple, des anticorps anti-EEA1 (Early Endosomal Antigen
1) et anti-M6PR (Mannose-6-Phosphate Receptor) pour les endosomes précoces et tardifs
respectivement, anti-LAMP-1 (Lysosomal Associated Membrane Protein-1) pour les
lysosomes, anti-calréticuline pour le réticulum endoplasmique (RE), et enfin le mitotracker,
une molécule fluorescente spécifique des mitochondries.
Nous disposons également d’un variant de la lignée K562 (nommé K562 PVD) qui
pourrait s’avérer utile pour l’identification de protéines impliquées dans l’internalisation de
181
Discussion générale et Perspectives
l’ApppI. En effet, bien que le traitement de cette lignée par des aminobisphosphonates
entraine une activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, elle n’acquiert aucun potentiel stimulant
après avoir été « pulsée » par de l’ApppI (données non montrées). Puisque ce variant exprime
l’Ecto-F1-ATPase et qu’il est capable de présenter des phosphoantigènes produits de façon
endogène, ceci suggère fortement qu’il est déficient pour l’internalisation de l’ApppI, ou son
routage intracellulaire. La comparaison des transcriptomes de K562 et K562 PVD pourrait
permettre d’identifier la ou les protéine(s) impliquée(s).
Ce variant semble également ne pas exprimer MRP5 à sa surface (données non montrées).
Bien que les protéines de la famille MRP soient généralement impliquées dans l’efflux de
molécules, il semble que certaines d’entre elles puissent également participer à l’influx de
leurs substrats (301). Ceci pourrait donc être le cas de MRP5, et son rôle potentiel dans
l’internalisation de l’ApppI devra être vérifié dans des cellules qui l’expriment (Daudi ou
RPMI-8226 par exemple). L’utilisation d’ARNi en combinaison avec des analogues
fluorescents de l’ApppI est envisageable pour démontrer le rôle de MRP5 dans
l’internalisation des phosphoantigènes nuléotidiques. Alternativement, des anticorps antiMRP5 pourraient être testés pour bloquer son activité.
Comme mentionné précédemment, l’apoA-I augmente la stimulation des lymphocytes T
Vγ9/Vδ2 par les cellules tumorales et semble augmenter l’interaction entre le TCR et l’EctoF1-ATPase (144). Par analogie avec le rôle de l’apoE dans le transport et l’internalisation des
antigènes activant les lymphocytes NKT (25) on pourrait émettre l’hypothèse que l’apoA-I
joue un rôle similaire dans le cas des phosphoantigènes. Nous avons toutefois observé que le
« pulse » de phosphoantigènes nucléotidiques est nettement plus efficace en l’absence de
sérum. Un rôle direct de l’apoA-I dans l’internalisation des phosphoantigènes est donc peu
182
Discussion générale et Perspectives
probable. Son implication dans le mécanisme de présentation des phosphoantigènes reste
donc à clarifier.
3.2)
Nucleotide pyrophosphatase
Nos résultats montrent qu’une activité de type Nucleotide PyroPhosphatase (NPP) est
absolument requise pour que l’ApppI soit capable de stimuler les lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
L’ApppI est très peu actif en l’absence de NPP exogène ou de cellules tumorales, et cette
activité « résiduelle » est largement diminuée en l’absence de sérum (données non montrées).
Ceci suggère que cette activité ne provient pas des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, mais des cellules
cibles. 7 NPP (NPP1 à NPP7) ayant des différences de spécificité de substrat ont été
identifiées jusqu’à présent (302). NPP6 et NPP7 hydrolysant des esters de phosphorylcholine,
il est peu probable qu’elles soient impliquées. Les substrats de NPP4 et NPP5 ne sont pas
connus. NPP1 à NPP4, mais pas NPP5, sont exprimées par un large spectre de tissus
différents (276). Il faudra donc vérifier l’expression de ces enzymes dans les cellules qui
internalisent et présentent l’ApppI de manière efficace, comme les lignées Daudi, K562 ou
RPMI-8226. Il n’est pas exclu que plusieurs d’entre elles soient impliquées. La participation
d’une NPP cellulaire dans le mécanisme de présentation des phosphoantigènes nucléotidiques
pourra par la suite être confirmée par l’utilisation d’ARNi.
Il faut noter que contrairement à une réponse directe, la stimulation des lymphocytes T
Vγ9/Vδ2 par des cellules tumorales prétraitées par l’ApppI n’est absolument pas modifiée par
l’ajout d’apyrase (Article 2, p.133). Ceci suggère qu’une fois la conversion ApppI Æ IPP
effectuée, nécessaire pour l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2, l’IPP est protégé des
phosphatases classiques. Cette conversion se déroule donc probablement de manière très
localisée et contrôlée. On pourrait même émettre l’hypothèse qu’elle est effectuée par l’Ecto-
183
Discussion générale et Perspectives
F1-ATPase elle-même, ou le TCR, voire la combinaison des deux. Néanmoins, nous n’avons
pas pu observer de production d’IPP à partir d’ApppI in vitro par ces molécules, seules ou en
combinaison (Résultats III, section 3.3, p.154 et données non montrées). De plus, nous
n’avons pas observé de diminution significative de la quantité d’ApppI détectée par HPLC
après son incubation avec des cellules tumorales et/ou des lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
Toutefois, nos résultats sur la présentation de l’ApppI par des billes recouvertes d’ATP
synthase (Article 3, p.148) suggèrent qu’une concentration de l’ordre du nM, très loin d’être
détectable par cette méthode, est suffisante pour activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 dans ces
conditions. L’ApppI radiomarqué, qui permettrait l’utilisation de méthodes de détection
beaucoup plus sensibles que la mesure de l’absorbance à 260nm, devrait permettre de vérifier
cette conversion par les cellules.
Enfin, il n’est pas exclu que dans le cas du « pulse », l’ApppI ne soit pas converti en IPP,
mais qu’il puisse être modifié et lié de façon stable (voire covalente) à l’Ecto-F1-ATPase
avant son expression à la surface des cellules. Ceci pourrait alors expliquer que les enzymes
(NPP et apyrase) ainsi que le PPADS (inhibiteur des NPP) n’aient pas d’effet sur la
stimulation par les cellules « pulsées », ou qui activent spontanément les lymphocytes T
Vγ9/Vδ2 (Article 2, p.133 et données non montrées). Un moyen de vérifier ou infimer cette
hypothèse sera d’utiliser de l’ApppI radiomarqué et de vérifier par immunoprécipitation,
western blot et autoradiographie si des chaînes de l’ATP synthase sont ainsi radiomarquées.
3.3)
Autres phosphoantigènes et dérivés nucléotidiques
Il sera nécessaire de vérifier si nos résultats s’appliquent à d’autres phosphoantigènes, par
exemple des dérivés de l’IPP synthétisés à partir de nucléotides différents, ou des dérivés
nucléotidiques d’autres phosphoantigènes. Les antigènes de type NpppI devraient possèder les
184
Discussion générale et Perspectives
mêmes propriétés. Ceci n’invaliderait d’ailleurs pas l’implication de l’Ecto-F1-ATPase dans le
mécanisme de leur présentation, puisque l’ATP synthase est capable d’hydrolyser (donc de
lier) d’autres nucléotides que l’ATP, bien que de manière moins efficace (303). De plus, de
nombreux analogues de nucléotides capables de lier les sites nucléotidiques sont souvent
utilisés dans les études de la structure tridimensionnelle de l’ATP synthase.
En ce qui concerne les autres phosphoantigènes, un candidat évident est l’HDMAPP (ou
HMBPP) puisqu’il semble être un antigène majeur impliqué dans la reconnaissance de
nombreux pathogènes intracellulaires et qu’il a une activité biologique bien supérieure
(environ 1000 fois) à celle de l’IPP. Ce phosphoantigène « classique » est un des rares à
pouvoir être « pulsé » de manière relativement efficace, mais ceci est très probablement dû à
son très fort potentiel activateur. Par exemple, une publication récente a montré que le
« pulse » de cellules par de l’HDMAPP permet la liaison d’un tétramère de TCR Vγ9/Vδ2
fluorescent à la surface de ces cellules (159). Néanmoins, une concentration de l’ordre de la
centaine de nM a été utilisée dans cette étude, très largement supérieure à la concentration
active de l’HDMAPP (EC50 de
l’ordre de 0.1nM). L’HDMAPP pourrait être capable,
contrairement à l’IPP, de lier l’Ecto-F1-ATPase de façon relativement stable. Nous avons
récemment obtenu cet antigène et il sera donc possible de déterminer s’il peut lier l’ATP
synthase immobilisée sur des billes afin d’activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par les
méthodes que nous avons utilisées précédemment. Il faudra également vérifier si l’HDMAPP
est capable de moduler l’activité ATPase de l’enzyme, comme c’est le cas pour l’ApppI.
Nous avons observé que la stimulation directe des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par l’IPP peut
être partiellement augmentée par l’ajout de NPP, et partiellement inhibée par l’ajout de
PPADS (données non montrées). Ceci suggère donc que l’IPP peut être partiellement converti
185
Discussion générale et Perspectives
en dérivé nucléotidique à l’extérieur des cellules. Ceci pourrait donc être également le cas de
l’HDMAPP qui serait ensuite internalisé ou se lierait à l’Ecto-F1-ATPase. L’HDMAPP étant
bien plus actif que l’IPP, leurs dérivés nucléotidiques respectifs présentent probablement les
mêmes différences d’activité biologique.
La conversion de l’IPP en ApppI a été attribuée à une activité de type aminoacyl-tRNAsynthase (252). Des travaux récents indiquent que la lysyl-tRNA-synthase peut être sécrétée et
se lier à la surface des cellules (304). De plus, EMAP II (Endothelial Monocyte-Activating
Polypeptide II), un peptide issu de p43, une protéine faisant partie des complexes aminoacyltRNA-synthase, a été décrit comme étant capable d’interagir avec l’Ecto-F1-ATPase (305).
Ceci suggère donc un lien potentiel entre ces deux complexes. L’implication de la lysyltRNA-synthase dans le métabolisme extracellulaire des phosphoantigènes pourra être
explorée par l’utilisation d’inhibiteurs, ou d’ARNi si la survie cellulaire n’est pas
compromise.
4) Interactions entre phosphoantigènes, Ecto-F1-ATPase et TCR Vγ9/Vδ2
4.1)
Liaison de l’ApppI sur l’Ecto-F1-ATPase
Nos données sur la modulation de l’activité hydrolase de la F1-ATPase par l’ApppI
(Résultats III, section 3.3, p.153) suggèrent que ce dernier se lie aux sites non-catalytiques de
l’ATP synthase. Il serait utile de vérifier si le pyrophosphate, qui lie ces sites noncatalytiques, est capable d’inhiber la liaison stable de l’ApppI sur l’ATP synthase immobilisée
sur des billes dans les tests d’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2.
Nous n’avons pas de preuve expérimentale directe de la liaison de l’ApppI sur l’Ecto-F1ATPase. L’utilisation de la Résonance Plasmonique de Surface n’est pas envisageable étant
donné le poids moléculaire très faible de l’ApppI (575Da) comparé à celui de l’ATP synthase
ou même de la F1-ATPase (environ 580kDa et 370kDa, respectivement). Deux autres
186
Discussion générale et Perspectives
méthodes pourraient être utilisées. Des études de liaison en utilisant de l’ApppI radioactif et
de l’ATP synthase/F1-ATPase purifiée sont envisageables, et permettraient par ailleurs de
mesurer les constantes d’affinité de la liaison et de déterminer le nombre de sites impliqués (3
sites en théorie). La liaison des phosphoantigènes nucléotidiques sur l’ATP synthase pourrait
également être visualisée par co-cristallographie, ce qui permettrait d’identifier les sites
d’interaction.
4.2)
Reconnaissance de l’Ecto-F1-ATPase par le TCR Vγ9/Vδ2
L’équipe a précédemment montré une liaison d’un TCR Vγ9/Vδ2 (issu du clone G115)
sur de l’ATP synthase purifiée avec un Kd d’environ 800nM, soit une interaction de même
ordre que celle décrite entre un TCR αβ et le complexe CMH-I/peptide (144). Cette
interaction pourrait être caractérisée de manière plus précise, par exemple par cocristallographie des deux complexes. Si le TCR reconnaît les phosphoantigènes liés sur les
sites nucléotidiques de l’Ecto-F1-ATPase, il devrait il devrait interagir avec l’enzyme à
l’interface des chaînes α et β, où se situent ces sites. L’angle très prononcé formé par les
domaines V et C du TCR Vγ9/Vδ2 (Figure 7, p.43) est compatible avec cette hypothèse.
La reconnaissance de ligands par les TCR (quels qu’ils soient) se fait principalement via
les boucles CDR. Si la reconnaissance des phosphoantigènes fait intervenir le CDR3 de la
chaîne γ (152, 153), l’interaction du TCR Vγ9/Vδ2 avec l’Ecto-F1-ATPase n’est pas encore
précisément caractérisée. Chen et al. ont récemment montré que la reconnaissance de cellules
tumorales par 4 TCR Vγ9/Vδ2 dépend du CDR3δ (306). Ils ont de plus pu identifier des
peptides reconnus par ces TCR. La comparaison des séquences de ces peptides avec celles des
chaînes α et β de l’ATP synthase ne montre pas d’homologie particulière (données non
187
Discussion générale et Perspectives
montrées) mais il est probable qu’il s’agisse d’épitopes conformationnels. Il serait utile de
vérifier si ces peptides sont capables d’inhiber la liaison du TCR G115 sur l’ATP synthase.
Il faut noter que les CDR3 utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir de clones de
lymphocytes T Vγ9/Vδ2 provenant de patients atteints de carcinomes ovariens, ou infectés
par le virus de l’hépatite B. Ils sont par ailleurs très différents du CDR3 de la chaîne δ du
TCR G115. Les auteurs n’ont pas précisé si ces clones répondent aux phosphoantigènes. Il est
donc possible qu’ils reconnaissent des antigènes différents de G115 qui est un clone Vγ9/Vδ2
« classique » reconnaissant la lignée Daudi et les phosphoantigènes, et qui lie l’ATP synthase
in vitro. Certains clones Vγ9/Vγ2, bien que peu nombreux, ne répondent pas à ces antigènes
(152). L’étude de la liaison de peptides dérivés des 6 boucles CDR du TCR G115 (ou d’autres
TCR issus de clones activés par les phosphoantigènes) sur l’ATP synthase devrait permettre
de caractériser plus précisément les séquences impliquées dans cette interaction.
Nous avons observé que des lignées polyclonales de lymphocytes T Vγ9/Vδ2 obtenues
après stimulation par de l’IPP ou de l’ApppI ne sont capables de répondre à des billes
recouvertes d’ATP synthase bovine qu’en présence de phosphoantigènes. En revanche, des
lignées obtenues par purification des lymphocytes T γδ et stimulation non spécifique (par
exemple avec de la PhytoHémAgglutinine ou PHA, une lectine activant tous les lymphocytes
T) sont capables de répondre à l’ATP synthase bovine seule. Ceci suggère fortement qu’en
fonction de l’antigène utilisé pour l’établissement des lignées polyclonales, des lymphocytes
T Vγ9/Vδ2 exprimant des TCR portant des séquences particulières sont sélectionnés.
L’isolement des différentes sous-populations et le séquençage de leurs TCR pourraient
s’avérer utiles pour identifier les déterminants impliqués dans la reconnaissance de l’Ecto-F1ATPase, seule ou en combinaison avec des phosphoantigènes. Ces données pourraient
permettre d’expliquer les différences de réactivité observées.
188
Discussion générale et Perspectives
5) Spécificité d’espèce de la présentation des phosphoantigènes
Un point important de l’activation des lymphocytes T Vγ9/Vδ2 par des cellules tumorales,
infectées ou traitées aux aminobisphosphonates reste totalement obscur. Il est largement
admis que des cellules non-humaines, traitées par les aminobisphosphonates par exemple,
sont incapables d’activer les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 (158). Plusieurs hypothèses
permettraient d’expliquer cette restriction. Nous prendrons l’exemple des cellules murines
pour lesquelles le plus de données et de modèles sont disponibles.
-
Les cellules de souris n’expriment pas l’Ecto-F1-ATPase. Cette hypothèse peut être
écartée puisque nous avons observé son expression sur la lignée Rma-S, un lymphome T
murin (Article 1, p.103).
-
L’Ecto-F1-ATPase ne lie pas les phosphoantigènes. Les chaînes α et β de l’ATP synthase
murines montrant 98% d’identité avec les chaînes humaines, et les quelques différences
n’étant pas situées au niveau des sites nucléotidiques, cette hypothèse est peu probable.
-
Les TCR Vγ9/Vδ2 ne reconnaissent pas l’ATP synthase murine. Une étude récente a
décrit un tétramère de TCR Vγ9/Vδ2 ne liant pas diverses lignées de cellules de souris
(159). Ce point reste discutable et pourrait dépendre du TCR considéré puisque des
expériences préliminaires nous suggèrent que le TCR G115 est capable de se lier à la
surface de la lignée Rma-S (données non montrées).
-
Il pourrait exister une incompatibilité d’espèce entre les molécules d’adhésion/costimulation et leurs récepteurs. Deux études ont montré que ICAM-1 (Inter-Cellular
Adhesion Molecule-1) et CD166 sont importants pour permettre la réponse des
lymphocytes T Vγ9/Vδ2 aux phosphoantigènes (270, 285). Bien que la transfection
d’ICAM-I dans des cellules murines n’ait pas permis de leur conférer un potentiel
stimulateur, celle de CD166 n’a pas été étudiée.
189
Discussion générale et Perspectives
-
Enfin, il est possible que les cellules d’origine non-humaine n’expriment pas une ou
plusieurs protéines impliquées dans le mécanisme de présentation des phosphoantigènes.
Ces molécules n’étant pas caractérisées, leur identification préalable dans les cellules
humaines sera nécessaire pour vérifier cette hypothèse.
Cette problématique est donc importante et nécessite des travaux supplémentaires pour tenter
d’expliquer les raisons de la spécificité d’espèce de la présentation des phosphoantigènes.
Comme nous l’avons vu, la méthode d’obtention de clones ou de lignées polyclonales peuvent
être à l’origine de biais importants dans l’interprétation de la réactivité des lymphocytes T
Vγ9/Vδ2. L’étude extensive de la réactivité de ces différents clones et lignées contre des
cellules murines est à envisager. La transfection des chaînes α et β humaines de l’ATP
synthase dans des lignées murines pourrait permettre de déterminer si elles sont en cause dans
la restriction d’espèce observée. La co-transfection de molécules d’adhésion et/ou de costimulation humaines pourrait également être nécessaire.
En conclusion, bien que nos résultats fournissent de nouveaux éléments importants,
notamment en proposant la première molécule de présentation des phosphoantigènes, la
reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2 laisse encore beaucoup
de questions en suspens. Elle met probablement en jeu des mécanismes complexes et de
nombreuses molécules qui sont très différentes de celles impliquées dans les mécanismes
classiques de présentation antigénique. De nombreux travaux seront nécessaires pour
disséquer ces mécanismes et réconcilier les données de la littérature qui peuvent parfois
présenter certaines contradictions.
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205
206
ANNEXES
Revue (Article 5)
Rôle des apolipoprotéines dans l’immunité innée
médiée par les lymphocytes NKT et γδ
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Annexes
222
ABSTRACT
The biology of Vγ9/Vδ2 T cells is still poorly understood. This unconventional
subpopulation, specific to humans and some higher primates, plays an important role in the
defence against intracellular pathogens (such as mycobacteria and plasmodium). The
recognition of these pathogens involves small molecules, termed phosphoantigens, composed
of a short alkyl chain and a pyrophosphate group. The most common are isopentenyl
pyrophosphate (IPP, an intermediate in the mevalonate pathway) and hydroxyl-methylbutenyl pyrophosphate (HMBPP, an intermediate in the DOXP pathway, an alternative IPP
synthesis pathway in some organisms). The recognition of these molecules is still poorly
characterized but requires a cellular contact which suggests that a presentation structure is
necessary. Vγ9/Vδ2 T cells are also able to lyse many tumor cell lines in vitro. The
implication of IPP has been established and our group has recently identified the Ecto-F1ATPase, a cell surface form of the mitochondrial ATP synthase, as an antigen participating in
the recognition of tumor cells. The goal of this thesis was to better characterize the role of
Ecto-F1-ATPase in this recognition.
First, we have shown that Ecto-F1-ATPase interacts with Major Histocompatibility Complex
class I molecules at the cell surface. HLA-B would be preferentially involved in this
interaction and strongly decreases the activation of Vγ9/Vδ2 T cells. While this interaction
plays an important role in the control of Vγ9/Vδ2 T cell reactivity, it provides an additional
link between Ecto-F1-ATPase and immunity.
In a second part, we have studied the recognition mechanism of ApppI, a nucleotidic
derivative of IPP. Unlike classical phosphoantigens, it is resistant to terminal phosphatases, its
recognition is indirect and involves a nucleotide pyrophosphatase activity, and it can be
efficiently captured by cells which then become sensitive to Vγ9/Vδ2 T cells. Finally, ApppI
has allowed us to show that Ecto-F1-ATPase is involved in the recognition of
phosphoantigens.
Our work represents a new and important step in the understanding of the mechanisms driving
tumor cell recognition by Vγ9/Vδ2 T cells. Ecto-F1-ATPase is the first molecule directly
involved in the presentation of phosphoantigens. These results may eventually allow the
development of very efficient anti-tumoral immunotherapy strategies.
223
Pierre VANTOUROUT
Directeurs de thèse : Dr Eric Champagne, Dr Laurent Martinez
UNIVERSITE PAUL SABATIER, LE 30 JUIN 2009
ROLE DE L’ECTO-F1-ATPASE DANS LA RECONNAISSANCE DES CELLULES
TUMORALES PAR LES LYMPHOCYTES T VGAMMA9/VDELTA2
LES
LYMPHOCYTES
MOLECULES
T VGAMMA9/VDELTA2
(PHOSPHOANTIGENES)
ONT ORIGINELLEMENT ETE DECRITS POUR ETRE ACTIVES PAR DE PETITES
ISOLEES A PARTIR DE
RESPONSABLE DE LA TUBERCULOSE CHEZ L’HOMME.
CES
MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS, AGENT PATHOGENE
LYMPHOCYTES ONT EGALEMENT UN LARGE POTENTIEL ANTI-
TUMORAL QUI POURRAIT ETRE UTILISE POUR LE DEVELOPPEMENT D’IMMUNOTHERAPIES ANTICANCEREUSES.
NOUS
NOUS INTERESSONS AUX MECANISMES D’ACTIVATION DES LYMPHOCYTES
T VGAMMA9/VDELTA2
PAR LES
CELLULES TUMORALES ET AVONS RECEMMENT IDENTIFIE L’ECTO-F1-ATPASE COMME ANTIGENE IMPLIQUE DANS LEUR
RECONNAISSANCE.
LES
TRAVAUX EFFECTUES AU COURS DE LA PRESENTE THESE METTENT EN EVIDENCE UNE INTERACTION ENTRE CETTE
MOLECULE ET LE COMPLEXE MAJEUR D’HISTOCOMPATIBILITE DE
LYMPHOCYTES.
NOUS
CLASSE I,
CONNU POUR REGULER L’ACTIVATION DE CES
AVONS EGALEMENT OBTENU DES DONNEES INDIQUANT QUE L’ECTO-F1-ATPASE PEUT PRESENTER
DES PHOSPHOANTIGENES AUX LYMPHOCYTES
T VGAMMA9/VDELTA2.
Mots clés : Immunité anti-tumorale ; Lymphocytes T gammadelta ; ATP synthase
Discipline : Physiopathologie moléculaire, cellulaire et intégrée
Ecole doctorale : Biologie – Santé – Biotechnologie
Unité de recherche : INSERM U563, Département LML, CPTP, CHU Purpan, Toulouse, France