iniguez bat - Revue de Médecine Vétérinaire

ARTICLE ORIGINAL
Sélection de déterminants antigéniques à partir
de banques peptidiques
Application au diagnostic de l’artérite virale équine
° P. INIGUEZ et °° S. ZIENTARA
° Institut Cochin de Génétique Moléculaire, 22 rue Méchain ,F-75014 Paris ; Tél. 33(0) 1 40 51 64 43 ; (33(0) 1 40 51 64 54 ; [email protected]
°° AFSSA, 22 rue P. Curie F-94703 Maisons-Alfort ; Tél. 33(0) 1 49 77 13 12 ; [email protected]
RÉSUMÉ
SUMMARY
Les banques peptidiques réalisées à la surface des bactériophages filamenteux permettent de rechercher parmi des millions de séquences exprimées à leur surface celles qui ont une affinité pour une (ou des) molécule(s)
donnée(s). Les applications de cette technologie sont nombreuses :
recherche de drogues à visée thérapeutique, détermination de séquences
consensus, cartographie d’épitopes, etc...
Nous nous proposons dans cet article de donner un aperçu de la potentialité de la technologie des phages recombinants en faisant une synthèse
des principales caractéristiques et des avantages apportés par l’utilisation de
cet outil. Nous illustrerons notre propos par un exemple appliqué à la
recherche de déterminants antigéniques viraux pour la mise au point de tests
de diagnostic en pathologie virale équine. Le but des expériences a consisté à sélectionner parmi les quarante millions de clones phagiques qui composent une banque, ceux qui se liaient spécifiquement aux paratopes des
anticorps dirigés contre le virus de l’artérite virale équine. Une fois identifiés, ces déterminants antigéniques ont été incorporés dans des tests ELISA.
L’utilisation de tels tests, moins coûteux et moins longs que les tests classiques de sérologie, ne peuvent certes pas encore les remplacer mais ils
constituent assurément une avancée vers le diagnostic précoce d’une infection. Il a par ailleurs été montré que les phages sont d’excellentes entités
immunogènes et plusieurs auteurs ont décrit l’obtention d’anticorps dirigés
contre des peptides étrangers insérés dans une protéine de surface phagique.
Il est donc envisageable d’utiliser en tant que molécules présentatrices d’antigènes des particules phagiques qui exposent à leur surface des épitopes
spécifiques dans le cadre d’une vaccination.
Selection of viral epitopes from phage display libraries. Application to
diagnosis of Equine Arteritis Virus. By P. INIGUEZ and S. ZIENTARA.
MOTS-CLÉS : virus - artérite équine - banque peptidique
- phage - diagnostic.
KEY-WORDS : Equine arteritis - epitope phage libraries diagnosis.
1. Introduction
blent pas forcément aux ligands naturels. Ils peuvent mimer
leur structure [9] ou bien représenter des épitopes conformationnels ou structuraux. Ces ligands sont donc sélectionnés
pour le seul critère de conformation homologue à l’épitope
initial.
L’expression de peptides ou de protéines à la surface des
bactériophages constitue un outil extrêmement puissant pour
la recherche sans a priori de ligands spécifiques d’une molécule donnée. Les banques combinatoires peptidiques phagiques (BCPP) sont largement utilisées depuis maintenant
une dizaine d’années pour la sélection de ligands à des anticorps comme les anticorps monoclonaux [1, 2, 3], à d’autres
protéines [4, 5] ou à des molécules non protéiques [6, 7, 8].
Les ligands sélectionnés à partir de ces banques ne ressemRevue Méd. Vét., 2001, 152, 5, 363-371
Peptide libraries achieved on the surface of filamentous bacteriophages
aim to discover among millions sequences those having affinity for one or
few molecules. This technology has a lot of applications : drugs discovering
applied to pharmaceutical medicine, sequences determination, epitope mapping, etc...
Our purpose in this paper is to give a global idea on recombinant phage
technology potentialities. For this, we relate the main caracteristics and
advantages of this tool. Our review will be illustrated by the example of
equine viral antigenic determinants selected from phage epitope library and
incorporated in diagnosis tests. The goal of these experiments was to select
among fourty millions of recombinant phages those who had specific affinity for antibodies directed against equine arteritis virus. Once caracterised,
these antigenic determinants were incorporated in ELISA tests. Utilization
of ELISA tests, less expensive and quicker than classical serological tests,
should replace them in the future. Another application of the displayed epitope library could be the use of phages carrying an immunogen peptide as
vaccines like it has been done for the gag gene of HIV and for the circumsporozoite protein of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.
Une des applications de la technologie des BCPP a été de
les cribler avec des anticorps polyclonaux anti-viraux. Une
BCPP a été soumise au criblage de ses composants par des
immunoglobulines de type G provenant de sera de souris
immunisées avec l’antigène S de surface du virus de l’hépa-
364
INIGUEZ (P.) ET ZIENTARA (S.)
2. L’artérite virale des équidés
avortements dans la proportion de 50 à 70 % survenant dans
les deux à quatre semaines après contamination [13]. Les
avortements se produisent aussi bien chez les juments ayant
présenté des signes cliniques que chez celles ayant fait une
maladie asymptomatique. L'avortement est dû à une nécrose
du myomètre et à un œdème secondaire entre trophoblaste et
endomètre provoquant un décollement du placenta et la mort
fœtale. Les produits d'avortement peuvent être totalement ou
partiellement autolysés. Mais il n'y a pas de lésion pathognomonique chez les foetus infectés. Les juments infectées par
un étalon excréteur ne semblent pas avoir d'infertilités secondaires contrairement aux étalons qui présentent une période
temporaire de subfertilité quelques jours après la primoinfection. Des diminutions significatives de la motilité et de
la concentration des spermatozoïdes pendant 6 à 8 semaines
ont été décrites après infections expérimentales [14]. Les
caractéristiques du sperme redeviennent ensuite normales.
L’artérite virale équine, anciennement appelée "fièvre
typhoïde du cheval", est une maladie due à un virus de la
famille des Arteriviridae auparavant classé dans celle des
Togaviridae [11, 12]. Le virus de l’artérite équine (VAE) est
un petit virus enveloppé d’environ 60 nm de diamètre. Son
génome est constitué d’une molécule d’ARN simple brin de
polarité positive longue de 12,7 Kb qui code pour 7 phases
ouvertes de lecture (Figure 1).
Les signes cliniques peuvent être très variables.
Classiquement, la maladie se caractérise initialement par de
l'hyperthermie pendant 4 à 5 jours, de l'anorexie et de l'abattement ("fièvre typhoïde"), puis apparaissent des signes de
conjonctivite, de larmoiement, d'œdème des jambes ("en
chaussette") et d'œdème du scrotum chez les étalons. On
observe également du jetage et une congestion de la
muqueuse nasale. Peut parfois être observé un oedème des
fosses supra-orbitales. D'autres symptômes tels que de la
photophobie, une uvéite, de la toux, de la diarrhée mais aussi
un rash cutané, voire une stomatite ulcéreuse, ont également
été signalés.
C'est chez la jument gestante que les manifestations les
plus graves peuvent survenir ; l'infection peut entraîner des
La première souche du virus de l’artérite équine a été isolée en 1953 aux Etats unis (Ohio) dans la ville de Bucyrus
[15, 16]. Il s’agit de la seule souche dont la séquence du
génome soit connue ainsi que son organisation [11]. Il semble
exister une certaine stabilité antigénique entre les différents
isolats même si certains auteurs ont montré des différences
génétiques par analyse des profils électrophorériques des
ARN génomiques provenant de 29 isolats viraux d’origines
géographiques différentes [17] ainsi que des différences antigéniques entre protéines de différentes souches notamment
en ce qui concerne la protéine de surface GL [18]. Il n’existe
cependant qu’un sérotype du virus, les variations antigéniques observées étant mineures.
Le diagnostic sérologique de la maladie est effectué par la
mise en évidence des anticorps neutralisants (séroneutralisation). Il peut également être réalisé par le test de fixation du
complément, utile pour détecter une infection précoce (haut
titre entre deux et quatre semaines après l’infection). Les premiers tests ELISA ont employé le virus purifié de l’artérite
équine comme antigène [19]. Ils ont donné beaucoup de
résultats faussement positifs essentiellement dus à la présence parasite de composants cellulaires et tissulaires réagis-
tite B (VHB). Il a été identifié à partir de ces expériences des
séquences reconnues spécifiquement par des séra anti-VHB
et correspondant soit à des épitopes linéaires de l’antigène S
soit à des mimotopes de celui-ci [10]. Cette technique n’avait
cependant pas encore été utilisée pour identifier des ligands
d’anticorps polyclonaux dirigés contre un virus entier.
L’identification de déterminants antigéniques spécifiques
d’un pathogène comme le virus de l’artérite équine pourrait
fournir de nouvelles classes de molécules utilisables pour le
diagnostic des pathologies virales. Il serait également très
intéressant de pouvoir discriminer grâce à ces molécules
entre des animaux infectés et des animaux vaccinés. De plus,
les phages porteurs de ces molécules antigéniques sont susceptibles de servir par la suite d’entités vaccinales.
FIGURE 1. — Structure du virus de l’artérite équine.
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SÉLECTION DE DÉTERMINANTS ANTIGÉNIQUES À PARTIR DE BANQUES PEPTIDIQUES
sant avec des anticorps présents en grande quantité dans le
sérum de cheval [20]. Un autre test ELISA a par la suite été
mis au point en utilisant cette fois-ci comme antigène un
fragment de la glycoprotéine GL long de 43 acides aminés
[21]. Ce test pourrait remplacer avantageusement le test de
séroneutralisation virale notamment en terme de sensibilité.
La recherche de déterminants antigéniques encore plus courts
du virus, externes mais aussi internes au virus, voire l’identification d’épitopes, représente une voie très intéressante car
elle pourrait conduire à améliorer la spécificité et la sensibilité d’un tel test. La mise en évidence d’épitopes internes
ouvrirait une voie vers la différenciation des sérums d’animaux infectés de ceux d’animaux vaccinés.
3. Les banques combinatoires
biologiques de fusion
Les banques combinatoires (appelées aussi aléatoires) de
peptides sont comme de grandes bibliothèques dans lesquelles chaque livre représente un peptide. Mario GEYSEN a
été le premier à introduire le concept de mimotope [9] c’està-dire la recherche de la séquence peptidique minimale pouvant mimer un déterminant antigénique d’une protéine, d’un
polypeptide ou de toute autre molécule susceptible de posséder un pouvoir antigénique. Par une méthode de synthèse chimique récurrente de peptides formés à partir d’un mélange
aléatoire d’acides aminés, il a trouvé des peptides mimant la
structure de l’épitope d’un anticorps monoclonal.
Les banques peptidiques peuvent être classées en quatre
catégories selon la façon dont elles sont construites ou présentées. Les deux premiers types de banques sont basés sur la
synthèse chimique des acides aminés. Celle-ci est réalisée
soit sur un support solide comme des billes de résine sur lesquelles les peptides sont présentés [22] soit elle s’effectue
directement en solution [23]. Les deux autres types de
banques peptidiques sont réalisés dans des systèmes biologiques, soit à la surface de bactéries [24, 25] soit à la surface
de bactériophages filamenteux en fusion avec des protéines
de capside [2]. Nous ne traiterons dans cet article que de cette
dernière catégorie.
A) HISTORIQUE
PARMLEY et SMITH [26] ont décrit une première
approche de la construction d’une banque peptidique aléatoire réalisée dans un système biologique, le bactériophage
filamenteux fd. SCOTT et SMITH [2] ont par la suite amélioré le système, notamment le vecteur de clonage. Les
banques phagiques sont parmi toutes les banques peptidiques
de loin les plus utilisées pour la sélection de ligands vis-à-vis
de diverses molécules. Elles sont construites soit dans la protéine mineure d’enveloppe pIII soit dans la protéine majeure
d’enveloppe pVIII. Ce système a fait ses preuves depuis
maintenant une dizaine d’années et, sans parler des peptides,
de nombreuses protéines ont dejà été exprimées de façon
fonctionnelle à la surface des bactériophages (Tableau I). Les
peptides aléatoires présents dans les banques de fusion biologiques proviennent tous de la synthèse d’oligonucléotides
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dégénérés. Ces oligonucléotides sont synthétisés chimiquement puis insérés dans un vecteur de type phagique ou plasmidique, ou alors convertis en ARN pour être exprimés par
un système de traduction in vitro. La puissance des systèmes
d’expression biologiques réside dans la capacité à pouvoir
propager leurs clones à chaque étape de sélection. De plus,
les banques peptidiques biologiques peuvent être réamplifiées presque à volonté, contrairement aux banques peptidiques synthétiques.
B) CONSTRUCTIONS DES BANQUES PEPTIDIQUES
Les phages filamenteux ont représenté et représentent toujours le matériel de choix pour la construction de banques
peptidiques de surface aléatoires. Les peptides aléatoires sont
la plupart du temps présentés en surface fusionnés aux protéines d’enveloppe pIII ou pVIII du phage (Figure 2). Les
phages filamenteux (fd, M13, f1) représentent un groupe de
virus apparentés qui infectent spécifiquement les bactéries E.
coli à Gram négatif mâles (F+) en s’adsorbant sur leurs pilis.
Ils ont l’aspect en microscopie électronique de longs filaments flexibles de longueur environ 1 µm et de largeur environ 10 nm. Ils contiennent une molécule d’ADN simple brin
circulaire longue de 6,4 Kb recouverte d’une enveloppe composée d’environ 2700 copies d’une protéine, la protéine
majeure d’enveloppe pVIII. Il existe également quatre autres
protéines d’enveloppe mineures, présentes à environ cinq
copies chacune, les protéines pIII (responsable de l’adsorption du phage sur les pilis bactériens) et pVI localisées à une
extrémité du virion et les protéines pVII et pIX localisées à
l’autre extrémité.
Les banques peptidiques réalisées à la surface de bactériophages ont été initialement utilisées pour isoler des ligands se
liant à une région donnée d’une protéine. Elles ont prouvé
leur efficacité dans un premier temps pour la recherche de
sites de liaison à des anticorps monoclonaux [1, 27, 28] puis
à des protéines ou à des domaines protéiques [4] ainsi qu’à
des molécules non protéiques [7] et maintenant à des anticorps polyclonaux [3, 10]. Les études préliminaires sur les
phages filamenteux en tant que vecteurs de clonage ont
débuté en 1980 avec ZACHER et SMITH. Leur construction,
nommée fd-tet, a été à l’origine de nombreux vecteurs d’expression phagique (Tableau II), notamment la série des vecteurs fUSE [29]
C) STRATÉGIES D’EXPRESSION DES PEPTIDES
En 1985, SMITH a donné les bases de la technique de sélection des phages recombinants, le biopanning [30] dont le
principe est résumé par la figure 3. Idéalement, durant la
phase de biopanning, seul le peptide recombinant exposé à la
surface du phage devrait être en interaction avec la matrice
sur laquelle est fixée la molécule pour laquelle on recherche
un partenaire ligand. Cela étant évidemment irréalisable, il
faut optimiser les chances d’obtention d’interactions entre le
peptide exposé en surface phagique et la molécule immobilisée sur la matrice. Pour cela, l’accessibilité du peptide doit
être maximale tout en réduisant les interactions entre les
autres régions du phage et la matrice. Plusieurs paramètres
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INIGUEZ (P.) ET ZIENTARA (S.)
TABLEAU I. — Protéines fonctionnelles et peptides exprimés à la surface de bactériophages.
pV
pVIII
pIII
FIGURE 2. — Stratégies d’expression de peptides à la surface de phages filamentaux.
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SÉLECTION DE DÉTERMINANTS ANTIGÉNIQUES À PARTIR DE BANQUES PEPTIDIQUES
TABLEAU II. — Vecteurs d’expression phagique.
FIGURE 3. — Biopanning.
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a protéine de capside phagique dans laquelle est cloné le peptide aléatoire.
b nombre d’acides aminés du peptide aléatoire
c nombre de transformants de la banque
d en minuscules, les acides aminés de la protéine sauvage ; en majuscules,
cc = banque contrainte
les acides aminés ajoutés provenant du
clonage
X = un acide aminé aléatoire
TABLEAU III. — Banques aléatoires peptidiques phagiques.
sont donc à prendre en compte lors de la construction d’une
banque phagique. Tout d’abord la nature du vecteur phagique
à utiliser (voir Tableau II), ensuite la protéine phagique à
laquelle sera fusionné le peptide, puis la longueur du peptide
aléatoire et enfin le choix des résidus invariants flanquant
celui-ci. La liste des banques aléatoires peptidiques phagiques est importante selon les besoins que leur utilisation
requiert (Tableau III).
4. Applications : recherche de
déterminants antigéniques du
virus de l’artérite équine
Les banques peptidiques phagiques aujourd’hui expriment
à leur surface des peptides dont la palette de longueur varie
entre 6 et 36 acides aminés (Tableau III). Il existe donc un
large éventail de choix et désormais nous disposons d’un
recul significatif pour évaluer la puissance des banques phagiques en tant qu’outils moléculaires pour la recherche de
ligands de nature peptidique vis-à-vis de molécules cibles.
Ces dernières sont diverses et infinies dans la mesure où un
ligand peptidique semble pouvoir être trouvé à n’importe
quelle molécule, qu’elle soit de nature protéique, glucidique
ou autre.
A) OBJECTIFS DE L’ÉTUDE ET STRATÉGIE EMPLOYÉE
La banque peptidique a été utilisée pour le diagnostic
médical ou vétérinaire. Plus précisément, dans notre laboratoire, les banques phagiques sont utilisées pour la mise au
point de tests de diagnostic des maladies virales du cheval
plus rapides, plus sensibles et plus spécifiques que ceux existants qui ont recours aux méthodes de sérologie classique. La
stratégie générale employée pour répondre à notre objectif
est résumée dans la figure 4.
B) BANQUE AYANT SERVI À NOTRE ÉTUDE
La banque peptidique choisie pour notre étude est une
banque aléatoire d’hexapeptides réalisée dans le phage fd à
partir du vecteur fUSE5 [2], (Tableau II). Elle a été construite
à partir de 200 millions de transformants indépendants et
contient 69 % des 64 millions d’hexapeptides possibles. La
stratégie de clonage est représentée figure 5.
C) SÉLECTION DE DÉTERMINANTS ANTIGÉNIQUES
DU VIRUS DE L’ARTÉRITE ÉQUINE (VAE)
Une banque combinatoire d’hexapeptides a été criblée à
l’aide d’anticorps polyclonaux anti-VAE. L’analyse des peptides portés par les phages sélectionnés a montré que l’on
pouvait les classer par homologies de séquences dans sept
groupes différents. 25 % des phages sélectionnés ont été
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SÉLECTION DE DÉTERMINANTS ANTIGÉNIQUES À PARTIR DE BANQUES PEPTIDIQUES
FIGURE 4. — Objectifs et stratégie employée.
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INIGUEZ (P.) ET ZIENTARA (S.)
reconnus spécifiquement dans un test ELISA par un mélange
de séra positifs vis-à-vis du VAE. Cinq de ces phages ont
détecté plus de 50 % de séra (n = 30) testés individuellement.
Lorsque ces phages ont été mélangés pour servir d’antigènes
en ELISA, ils ont été reconnus par 100 % des séra. La sensibilité et la spécificité du test ELISA par rapport au test de
séroneutralisation ont été établis respectivement à 99 et 71 %
(n = 200) (Tableau IV). Cette étude a démontré pour la première fois que les banques peptidiques phagiques avaient le
potentiel pour discriminer des déterminants antigéniques utilisables dans un test de diagnostic à partir du criblage d’anticorps anti-viraux totaux [31].
Sensibilité = [E+ SN+] / [E+ SN+] + [E- SN+]
5. Conclusion
La technologie des banques peptidiques construites à partir
de phages recombinants constitue un outil extrêmement puissant pour la recherche de déterminants antigéniques viraux
(voire d’épitopes) à partir d’anticorps polyclonaux et doit
être utilisée de façon optimale dans ce sens. Les phages
exprimant à leur surface des épitopes immunodominants
peuvent être testés en tant que vecteurs potentiels vaccinaux
car ce sont d’excellentes molécules immunogènes [32]. Ils
doivent aussi pouvoir être utilisés comme des outils diagnostiques. Les résultats obtenus à partir du virus de l'artérite
virale illustrent parfaitement la potentialité des banques
Spécificité = [E- SN-] / [E+ SN-] + [E- SN-]
TABLEAU IV. — Test ELISA de l’artérite équine.
FIGURE 5. — Construction de la banque utilisée.
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SÉLECTION DE DÉTERMINANTS ANTIGÉNIQUES À PARTIR DE BANQUES PEPTIDIQUES
d’hexapeptides phagiques à fournir des ligands spécifiques
pour des molécules cibles correctement présentées. A partir
d’une population aussi complexe que celle représentée par
les IgG d’un sérum polyclonal, la réalisation de quelques
cycles de criblage d’une banque aléatoire peptidique peut
conduire à l’obtention de phages potentiellement candidats à
exprimer des déterminants antigéniques possédant la spécificité d’un épitope ou d’un mimotope.
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