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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles /
Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis
Citation APA:
Byl, B. (2004). Application de la technique ELISPOT à l'évaluation de réponses vaccinales (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de
Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/211189/1/06fbada5-0a1a-42ca-a585-0d256b45fdbf.txt
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Université Libre de Bruxeiles
Faculté de Médecine
Laboratoire d’immunologie Expérimentale
ULB - Campus Erasme
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B- 1070 Bruxelles
Tél.: 02/555.61.70
Application de la technique EUSPOT à l’évaluation de
réponses vaccinales
Baudouin Byl
Promoteur : Professeur M. Goldman
Co-promoteur : Professeur F. Mascart
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de
Docteur en Sciences Médicales
Année académique 2003-2004
ikomL
Université Libre de Bruxeiies
Faculté de Médecine
Laboratoire d’immunologie Expérimentale
Application de la technique ELISPOT à l’évaluation de
réponses vaccinales
Baudouin Byl
Promoteur : Professeur M. Goldman
Co-promoteur : Professeur F. Mascart
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de
Docteur en Sciences Médicales
Année académique 2003-2004
Nombreux sont celles et ceux qui m'ont accueilli et aidé,
Nombreux sont celles et ceux qui m 'ont guidé,
Nombreux sont celles et ceux qui m'ont soutenu, voire supporté, tout au long de ces travaux,
Qu 'elles et ils trouvent toutes et tous ici l'expression de ma gratitude.
Je tiens également à remercier les nombreux patients et volontaires qui y ont contribué.
Je dédie, modestement, cet ouvrage aux Maîtres qui m'ont initié à l'Art Médical et plus
particulièrement dans le domaine des maladies infectieuses.
Baudouin Byl
Ces travaux ont bénéficié du soutien du Fond de la Recherche Scientifique Médicale Belge,
de la Fondation Erasme, de la Clinique des Maladies Infectieuses de l’Hôpital Erasme, de la
société OM-Pharma (Meyrin, Suisse) et d’un don de Roche Belgique.
2
Composition du Jury
Président
Pr Jacques Devière, Université Libre de Bruxelles
Secrétaire
Pr Michel Goldman, Université Libre de Bruxelles
Membres
Pr Nathan Clumeck, Université Libre de Bruxelles
Pr Jean Content, Institut Pasteur de Bruxelles
Pr Geert Leroux-Roels, Université de Gand
Pr Françoise Mascart, Université Libre de Bruxelles
Pr Michel Moutschen, Université de Liège
Pr Jean-Paul Van Vooren, Université Libre de Bruxelles
3
Table des matières
Première partie : Dissertation de thèse
e
Abréviations.............................................................................................................................................7
1.
INTRODUCTION.................................................................................................. 10
1.1. Généralités sur la réponse immune............................................................................................ 10
1.1.1. immunité naturelie ou non spécifique.................................................................................. ...10
1.1.2. Le LPS...................................................................................................................................... 13
1.1.3. Les cellules dendritiques.......................................................................................................... 16
1.1.4. Réponse spécifique et activation des lymphocytes T...............................................................24
1.1.5. Stimulation du lymphocyte B.................................................................................................... 31
1.1.6. L’anatoxine tétanique............................................................................................................... 31
1.1.7. Les superantigènes.................................................................................................................. 32
1.1.8. Les Heat Shock Proteins.......................................................................................................... 33
1.1.9. Anergie et apoptose................................................................................................................. 33
1.1.10. Réponse de type 1 et de type 2............................................................................................ 34
1.2. Modulation de la réponse lymphocytaire.................................................................................... 41
1.3. Réponse vaccinale, immunomodulation pharmacologique et adjuvants............................... 45
1.3.1. Les différentes catégories de vaccins...................................................................................... 45
1.3.2. Immunomodulation en vaccinologie - les adjuvants................................................................ 47
1.3.3. Adjuvants immunostimulateurs................................................................................................ 49
1.3.4. Adjuvants particulaires et copolymères.................................................................................... 51
1.4. Réponse vaccinale à l’administration par voie muqueuse et modulation de l’immunité
muqueuse.............................................................................................................................................. 51
2.
OBJECTIFS DU TRAVAIL................................................................................................... 55
3.
MATERIEL ET METHODES................................................................................................. 56
3.1. Analyse de la production de cytokines à l’échelon cellulaire par ELISPOT..........................56
3.2. Mise au point de la technique d’ELISPOT appliquée à l’énumération des cellules
productrices de cytokines........................
58
3.2.1. Cinétique de la production de cytokines après stimulation in vitro.......................................... 58
3.2.2. Cinétique de l’apparition de cellules productrices de cytokines au cours d’une réponse
vaccinale............................................................................................................................................. 59
4
4.
RESULTATS............................................................................................................................. 61
4.1. Analyse à l’échelon cellulaire de laréponse des cellules T spécifiques de l’anatoxine
tétanique chez des patients infectés par le VIH................................................................................61
Données complémentaires : Production d’IFN-y et d’IL-4 en réponse à une stimulation polyclonale
au cours de l’infection aiguë par le VIH............................................................................................. 62
4.2. L’extrait bactérien OM-85 BV induit une production d’IFN-y dépendante de l’IL-12 par les
lymphocytes CD4+ chez l’homme....................................................................................................... 64
4.3. Etude in vitro de l’effet adjuvant d’un analogue du Lipide A, l’OM-197..................................65
5.
DISCUSSION.........................................
66
5.1. Introduction.................................................................................................................................... 66
5.2. Suivi de la réponse immune.........................................................................................................69
5.3. Altérations de la réponse immune au cours de l’infection par le VIH..................................... 70
5.3.1. Restauration de la fonction immune......................................................................................... 75
5.3.2. Approche vaccinale.................................................................................................................. 76
5.4. Cellules dendritiques et adjuvants vaccinaux.......................................................... ................. 80
5.5. Immunisation par voie muqueuse...........................
81
5.6. Agents mimétiques du Lipide A et adjuvants.............................................................................83
6.
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES............................................................................... 87
7.
LISTE DES FIGURES...........................................................................................88
8.
REFERENCES......................................................................................................................... 89
Deuxième partie : Thèse annexe
103
1.
RÉSUMÉ.............................................................................................................. 104
2.
RÉFÉRENCES.................................................................................................... 105
Annexe : Curriculum vitae
io6
5
Première Partie : Dissertation de thèse
6
Abréviations
APC
Antigen presenting cells, cellules présentatrices d’antigènes
CD
Cellules dendritiques
CpG ODN Oligodeoxynucléotide contenant des motifs Cytosine-phosphate
Guanosine
CTL
Cytotoxic T lymphocytes
ELISPOT
Enzyme-linked immunospot assay
HLA
Human leucocyte antigen
HSP
Heat Shock Protein
LPS
Lipopolysaccharide
MHC
Major histocompatibility complex
NK
Natural killer, cellules tueuses naturelles
PAMP
Pathogen-associated molecular pattern
PBMC
Peripheral blood mononuclear cells
PHA
Phytohémagglutinine A
PPR
Pattern récognition receptor
TLR
Toll-like receptor
TNF-a
Tumor-necrosis factor-a
7
Résumé
Le développement des stratégies vaccinales a été initialement essentiellement basé sur une
approche empirique, et le monitoring de la réponse immime naturelle ou vaccinale a
longtemps reposé uniquement sur la titration des anticorps, négligeant ainsi les aspects de la
réponse cellulaire. Cette approche a néanmoins montré ses limites, soulignées par les
difficultés à mettre au point des vaccins efficaces contre une série de micro-organismes
infectieux tels que certains parasites, virus responsables d’infections chroniques ou micro­
organismes infectieux intracellulaires.
Notre objectif a été de développer l’analyse de la production de cytokines à l’échelon
cellulaire afin de l’appliquer à la réponse immune au cours de l’infection par le VIH et à la
caractérisation de l’effet d’adjuvants vaccinaux naturels et synthétiques.
La technique développée, l’ELISPOT (enzyme-linked immunospot), permet à la fois de
caractériser le phénotype et d’énumérer le nombre de cellules produisant activement des
cytokines en réponse à une stimulation antigénique.
A l’aide de cette technique, nous avons pu étudier la réponse immune à des antigènes
bactériens et des mitogènes chez des volontaires sains et des patients infectés par le virus de
l’immunodéficience humaine (VIH) investigués à différents stades de l’infection [Byl et al.
1999]. Nous avons montré que la réponse lymphocytaire à un mitogène induisait une
production comparable d’IFN-y parmi les patients infectés et les témoins, tandis que la
production d’IL-4 induite par le mitogène était profondément diminuée. Nous avons montré
que la source des deux cytokines différait et que seuls les lymphocytes CD4+ étaient capables
de produire de l’IL-4 en réponse à un mitogène. Par contre, après l’administration in vivo
d’anatoxine tétanique, il est apparu que la réponse lymphocytaire à une stimulation in vitro
par cet agent était marquée par une diminution de la production des deux cytokines analysées,
production limitée aux lymphocytes CD4+.
Nos travaux sur un extrait bactérien, l’OM-85 BV, utilisé comme agent immunostimulant,
nous ont conduits à démontrer que son effet sur la production d’IFN-y nécessitait la
présentation par des cellules présentatrices d’antigènes et requérait la présence d’IL-12 [Byl et
al. 1998]. Parmi les cellules présentatrices d’antigènes, les cellules dendritiques jouent un rôle
fondamental dans l’initiation de la réponse antigénique. Ces cellules voient leurs capacités
immunostimulatrices réduites dans de nombreuses circonstances où l’on peut mettre en
évidence une atteinte fonctionnelle du système immunitaire. Les molécules capables d’induire
8
la stimulation et la maturation des cellules dendritiques pourraient être amenées à jouer un
rôle important dans la modulation de la réponse immune, et certaines d’entre-elles pourraient
être utilisées dans des vaccins thérapeutiques ou préventifs. Nous avons dès lors étudié les
propriétés immunomodulatrices d’un analogue synthétique du LPS, l’OM-197, dépourvu des
propriétés endotoxigéniques de ce dernier [Byl et al. 2003b]. Ce produit est apparu capable
d’induire la maturation des cellules dendritiques du sang circulant ou dérivées des monocytes
circulants ainsi que la production d’EL-12. Nous avons montré que cette maturation était
efficace pour induire une réponse primaire in vitro caractérisée par la génération de
lymphocytes sécrétant de l’IFN-y spécifique à l’antigène HBs chez des sujets naïfs pour cet
antigène. Le profil de la réponse générée in vitro à l’aide de l’OM-197 correspond au profil
qui théoriquement pourrait induire une réponse immune cellulaire adéquate. En effet, de
nombreuses études ont mis en évidence que l’efficacité de la réponse immune et l’élimination
d’un agent infectieux pouvait dépendre du type de cytokines produites dans les phases
initiales de l’infection. D’autre part, les infections pour lesquelles les approches vaccinales
empiriques n’ont pas encore abouti (telles que l’infection par le VIH ou par Plasmodium, ou
la vaccination thérapeutique vis-à-vis de maladies cancéreuses) partagent la caractéristique de
devoir probablement nécessiter une réponse dite de type T helper 1 (Thl), caractérisée par la
production d’Interféron-y (IFN-y) et de lymphocytes cytotoxiques.
En conclusion, l’application de la technique ELISPOT à l’analyse à l’échelon cellulaire de
la production de cytokines par les lymphocytes nous a permis de préciser l’anomalie
fonctionnelle des lymphocytes CD4+ de patients infectés par le VIH, de mettre en évidence la
capacité d’un extrait bactérien à induire la production de cytokines de type Thl via l’action de
cellules présentatrices d’antigènes et la production d’IL-12, et de démontrer la capacité d’un
analogue synthétique du LPS à induire la maturation des cellules dendritiques et une réponse
primaire in vitro. L’ensemble de ces données souligne l’intérêt de l’analyse à l’échelon
cellulaire de la production de cytokines et suggère l’intérêt que pourrait avoir l’utilisation de
l’OM-197 pour induire une modulation de la réponse immune et l’orientation spécifique de
celle-ci vers un profil apte à maîtriser une infection virale chronique ou la prolifération de
cellules tumorales. L’OM-197 pourrait être utilisé comme adjuvant vaccinal ou pour puiser
des cellules dendritiques.
9
1.
Introduction
1.1. Généralités sur la réponse immune
L’évolution de la défense des organismes vivants vis-à-vis d’une agression par un agent
extérieur est caractérisée par le développement de deux axes complémentaires et intimement
liés : l’immunité non spécifique et l’immunité spécifique.
1.1.1. Immunité naturelle ou non spécifique
Lorsqu’un organisme étranger efffacte les barrières cutanéo-muqueuses d’un individu, il initie
en premier lieu des réponses immunes non spécifiques conduisant à la réaction inflammatoire.
Elles sont apparues les premières dans l’évolution des espèces. Elles impliquent des
médiateurs moléculaires et cellulaires. Les composants cellulaires comprennent les leucocytes
polynucléaires, les monocytes et macrophages, les cellules dendritiques, les cellules NK
{natural killer) et les lymphocytes yô. Les insectes et les vertébrés partagent une famille de
récepteurs cellulaires impliqués dans cette réponse non spécifique. Ces récepteurs sont connus
chez l’homme sous le nom de Toll-like receptors (TLR), par analogie au récepteur identifié
chez la drosophile qui porte le nom de Toll protein. Ils sont présents à la surface des
polynucléaires neutrophiles et des cellules présentatrices d’antigènes et reconnaissent des
structures moléculaires dérivées de micro-organismes, telles que le lipopolysaccharide (LPS)
de la paroi des bactéries à Gram négatif, l’acide lipoteichoique de la paroi des bactéries à
Gram positif ou les ADN et ARN bactériens.
Il est plus récemment apparu que ces TLR sont également capables de reconnaître des
molécules endogènes et que, plus largement, ils auraient un rôle de surveillance consistant à
détecter les produits de dégradation de certaines macromolécules endogènes telles que les
protéoglycans [Johnson et al. 2003]. Ceci explique que des agents exogènes qui ne sont pas
capables de stimuler directement les TLR induisent malgré tout une réponse inflammatoire.
Celle-ci prend alors son origine au niveau de ces produits de dégradation de macromolécules
endogènes.
10
Les récepteurs TLR initient une cascade d’événements intracellulaires qui conduisent à la
transcription de gènes impliqués dans le processus de l’inflanamation. Le site d’atteinte
initiale, qui le plus souvent sera épithélial, libère d’importantes quantités de cytokines
inflammatoires telles que l’Interleukine-1 et le Tumor Necrosis Factor-a (TNF-a). Ces
cytokines induisent, par action autocrine ou paracrine, plusieurs voies d’activation
intracellulaires, dont celle du nuclear factor-KB (NF-icB). Cette dernière voie d’activation
régule notamment l’expression de nombreux gènes liés à l’inflammation cutanée tels que les
gènes de l’E-sélectine, diverses chemokines et molécules d’adhésion vasculaire.
Au cours de la réaction inflammatoire, les leucocytes sont recrutés par chimiotactisme vers le
site de la réaction et activés. Les monocytes sanguins arrivés au site de l’infection, une fois
activés, se transforment en cellules effectrices puissantes, les macrophages. Ceux-ci
constituent le pont entre immunité naturelle et immunité spécifique. Dans le cadre de la
réponse immune non spécifique, les macrophages vont phagocyter et détruire les micro­
organismes présents. Ils vont également produire d’importantes quantités de cytokines
inflammatoires telles que l’fL-l, l’IL-ô, le TNF-a, et l’IL-12. Ces diverses cytokines vont
stimuler les cellules NK qui représentent une source importante d’ILN-y. Les macrophages
vont également jouer le rôle de cellules présentatrices d’antigènes aux lymphocytes et initier
ainsi la réponse immune spécifique.
Le TNF-a est produit principalement par les cellules mononucléées (monocytes et
macrophages) en réponse à une stimulation par des molécules d’origine microbienne telles
que le LPS. Cette dernière molécule est d’ailleurs l’inducteur le plus puissant de TNF-a. Les
propriétés pro-inflammatoires du TNF-a sont multiples
et comprennent notamment
l’augmentation de la perméabilité capillaire, la stimulation de l’activité phagocytaire des
polynucléaires, la stimulation de l’activité pro-coagulante et la stimulation des centres de
contrôle de la thermogenèse.
L’EL-12 est essentiellement produite par les cellules présentatrices d’antigènes telles que les
monocytes et les cellules dendritiques, mais aussi par les polynucléaires neutrophiles. L’EL-12
est une cytokine hétérodimère de 70 kD composée de 2 sous-unités liées de manière
covalente. Seul l’hétérodimère est actif Les deux composants sont régulés de façon
indépendante. Le monomère IL-12p40 est produit en large excès par rapport au dimère IL12p70. Il existe deux voies de production de l’IL-12 :
11
une voie indépendante des lymphocytes T : riL-12 est produite directement par les
cellules phagocytaires et dendritiques en réponse à une stimulation par des produits
bactériens, viraux, fongiques et parasitaires,
une voie dépendante des lymphocytes T : TEL-12 est produite par les cellules dendritiques
et phagocytaires interagissant avec des lymphocytes activés via un signal de costimulation
(le CD 40).
L’interleukine-12 joue un rôle charnière entre l’immunité spécifique et naturelle. Elle exerce
un puissant effet sur les lymphocytes T et NK en induisant notamment la production de
quantités importantes d’EFN-y. Par contre, le monomère p40 et la forme dimérique (p40)2 ont
un effet antagoniste à celui de TEL-12 par blocage de la sous-unité pi du récepteur à TEL-12.
Un effet agoniste a cependant été observé chez des souris dépourvues d’EL-12p35 [Decken et
al. 1998; Holscher e/a/ 2001].
D’autres cytokines partagent avec l’EL-12 le caractère hétérodimérique et la capacité à induire
une production d’EFN-y ; riL-23 et l’EL-27 [Trinchieri 2003]. Ces cytokines composent la
famille de TEL-12 et sont impliquées à différents stades de la réponse immune. L’EL-27 induit
la prolifération clonale des lymphocytes CD4+ naïfs mais pas celle des lymphocytes
mémoires. En cas d’infection, la nature de l’agent infectieux et la quantité présente induisent
l’expression de profils variés d’interleukines de la famille de l’EL-12. Ceci explique pourquoi,
chez un hôte spécifiquement déficient en une interleukine de la famille de riL-12, certains
micro-organismes peuvent causer une infection chronique, alors que la réponse immune à
d’autres micro-organismes est conservée [Brombacher et al. 2003].
Les lymphocytes NK participent à la réponse immune non spécifique. Doués de capacités
cytotoxiques non spécifiques, ces lymphocytes n’expriment ni le TCR {T cell receptor
spécifique des lymphocytes T), ni les immunoglobulines de surface spécifiques des
lymphocytes B. Ils expriment irrégulièrement le CD16 et le CD56. Les lymphocytes NK sont
activés par le contact avec des cellules dépourvues du complexe MHC de classe I autologue.
Avec
les
macrophages,
ils
constituent
les
composants
cellulaires
de
la
partie
phylogénétiquement la plus ancierme du système immunitaire, et jouent un rôle essentiel dans
la phase non spécifique de la réponse immune. Ils influencent également la réponse spécifique
des lymphocytes T, et, par le biais des interactions entre lymphoc}4es T et B, la réponse
humorale.
12
Les lymphocytes T yô représentent environ 10% de la population lymphocytaire. Ils se
différencient des autres populations lymphocytaires T par la structure de leur TCR, composé
des chaînes y et ô. Contrairement aux autres lymphocytes T porteurs du TCR ap, ils sont
rapidement activés par les produits bactériens et sont capables, par la production secondaire
d’IFN-y et de TNF-a, d’induire la production d’IL-12 par les cellules dendritiques et la
stimulation consécutive des lymphocytes T. Une augmentation des lymphocytes Vy9Vô2 (qui
représentent la population principale de lymphocytes yô chez l’homme) a été observée au
cours d’infections telles que brucellose, ehrlichiose, listériose, salmonellose, tuberculose ou
tularémie. Un certain nombre de composés naturels non peptidiques d’origine microbienne
induisent l’expansion de cette sous-population lymphocytaire particulière [Eberl and Jomaa
2003].
Plus récemment, on a pu mettre en évidence une régulation de la production d’EFN-y des
lymphocytes CD8+ indépendante de la production d’IL-12 ou des cellules NK dans un
modèle murin d’infection par le LCMV {lymphocytic choriomeningitis virus) précédant de
plusieurs jours l’expansion maximale de cette population CD8+ [Pien et al. 2002]. Cette voie
d’activation apparaît directement dépendante de cytokines participant à la réponse non
spécifique telles que l’IL-18 et les IFN-a et EFN-P, et illustre une autre voie de stimulation de
la réponse spécifique au départ de la réponse immune non spécifique.
Parmi les cytokines faisant le lien entre immunité innée et acquise figurent en outre le GMCSF, riL-15, l’IL-18, l’IL-1, et peut-être également TIL-2 (revu dans [Belardelli and
Ferrantini 2002]). Citons encore pour mémoire l’effet des prostaglandines impliquées dans la
réaction inflammatoire et qui agissent sur la maturation des cellules dendritiques [Morelli and
Thomson 2003].
1.1.2. Le LPS
Le LPS ou lipopolysaccharide ou endotoxine est un composant glycolipidique présent dans la
membrane externe de toutes les bactéries à Gram négatif II est une des molécules clés dans le
déclenchement de la réponse inflammatoire. En particulier, certaines espèces bactériennes
possèdent un LPS extrêmement puissant à induire une coagulopathie ou un choc circulatoire.
13
La structure de tous les LPS adhère à un principe constant : un polysaccharide attaché à un
composant lipidique appelé le Lipide A (figure 1). Le polysaccharide est composé d’un core
et d’un polymère oligosaccharidique (l’antigène O) variable d’une espèce bactérienne à
l’autre. La liaison entre le core polysaccharidique et le Lipide A se fait par l’intermédiaire
d’un radical spécifique appelé l’acide 3deoxy-D-manno-2-octulosonique (KDO).
Le Lipide A est responsable de l’expression de cytokines induite par le LPS [Netea et al.
2002], Le LPS se lie au CD 14 (liaison facilitée par un couplage préalable à la LPS-binding
protein ou LBP) et est présenté aux TLR. L’agrégation des CD14, TLR et d’autres protéines
de surface conduit à la transmission du signal intracellulaire. Un effet lié à la dose peut être
observé comme mis en évidence dans la relation entre la concentration sérique ou méningée
de LPS de Neisseria meningitidis et les conséquences cliniques [Brandtzaeg et al. 2001].
Des expériences in vitro ont démontré une grande variation dans la capacité des LPS
d’espèces bactériennes différentes d’induire la production de cytokines. Ainsi, le LPS de E.
coli, Salmonella sp., ou N. meningitidis est beaucoup plus puissant que le LPS de
Rhodobacter sp.. Cette différence est liée notamment à la conformation tridimensionnelle du
Lipide A. Cette conformation dépend de la longueur et de l’asymétrie des chaînes acylées et à
la distribution des charges négatives (figure 2) [Seydel et al. 1993; Seydel et al 2003]. A
l’état monomérique, le LPS stimule nettement moins efficacement les récepteurs qu’à l’état
polymérique, mais c’est la structure monomérique qui induit la conformation supramoléculaire des agrégats de LPS. La structure supra-moléculaire est lamellaire pour les
formes cylindriques de LPS, et cubique ou hexagonale pour les formes coniques. Les Lipides
A adoptant une conformation conique sont de puissants inducteurs de production de
cytokines. Les Lipides A adoptant une conformation cylindrique ont un effet antagoniste sur
les TLR par rapport aux formes coniques. Les cytokines produites en réponse au LPS
dépendent ainsi de son origine. Par exemple, Porphyromonas gingivalis n’induit la production
ni d’IL-12 p40 ni d’fFN-y mais induit par contre une production supérieure d’IL-5, EL-10 ou
IL-13 à celle induite par le LPS d‘‘E. coli [Netea et al 2002]. Certains LPS (tels que celui de
E. coli) stimulent préférentiellement TLR4, tandis que le LPS de Neisseria meningitidis
stimule tant TLR4 que TLR2, et que d’autres LPS stimulent préférentiellement TLR2.
Il est utile de noter que certaines préparations purifiées de LPS sont sensiblement contaminées
par diverses lipoprotéines qui, agissant sur d’autres TLR que le LPS, peuvent potentiellement
14
Figure 1 : Représentation schématique de la structure du LPS
Lipide A
Inner core
r
Chaîne O-spécifique
^-------- s/-------- ^
0
O phosphate
Outer core
O
glucosamine
heptose
Le LPS comporte une partie lipidique, le lipide A, composé quasiment toujours de 2 glucosamines phosphatées portant un
nombre variable de radicaux acylés, et auxquelles sont fixés Yinner core (comprenant le KDO), l'outer core, et la chaîne 0spécifique constituée d'unités répétitives de 3 à 8 sucres. Ces trois dernières structures composent la partie polysaccharidique
du LPS,
Figure 2 : Conformation spatiale du Lipide A
Le nombre de chaînes acylées du lipide A contribue à déterminer sa conformation spatiale en formes plus ou moins
cylindriques (schéma extrait de [Netea et al 2002]).
LPS d’E. coff
LPS de P. glngivalls
Précurseur tétraacylé du
hexaacylé
pentaacyté
LPS
■
r ■
Æ)
■-
O**.
) (
k
fo,
) N-Ü
(
)
Vl
15
H
/
U
r-OH
perturber certains résultats sur lesquels sont basées les connaissances actuelles de l’affinité
entre les TLR et les différentes molécules de LPS [Hellman et al. 2003].
1.1.3. Les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques (CD) sont les seules capables de stimuler les lymphocytes T naïfs
quand elles sont pulsées avec des antigènes peptidiques et sont donc les cellules initiatrices de
la réponse immune spécifique. Les cellules dendritiques humaines représentent un ensemble
hétérogène de cellules dérivées de deux lignées distinctes, de phénotypes, de localisations et
de missions différentes [Steinman et al. 1997; Banchereau et al. 2000].
La première lignée est celle des CD myéloïdes descendantes de progéniteurs médullaires. Ces
cellules portent le marqueur CDl le et se différencient en cellules dendritiques épithéliales, les
cellules de Langerhans (CDla
et non-épithéliales ou interstitielles (CDla
Ces
cellules portent des marqueurs de surface communs aux macrophages et granulocytes. Les
cellules interstitielles et de Langerhans diffèrent notamment par :
une meilleure capacité des cellules interstitielles à capturer les antigènes,
une meilleure activité lysosomiale des CD interstitielles,
une capacité limitée aux CD interstitielles de stimuler les lymphocytes B,
un profil de production de cytokines différent : alors que ces deux sous-populations
produisent de riL-12, seules les cellules dendritiques interstitielles produisent de l’IL-lO
et sont capables d’induire la maturation des lymphocytes B.
Une deuxième lignée comprend les CD plasmacytoides (CDl le négatives). Ces cellules
produisent d’importantes quantités d’IFN-a en réponse à une stimulation par des antigènes
viraux. Elles sont essentiellement localisées dans la médullaire des ganglions et pourraient
avoir une fonction dans le phénomène de tolérance immune par sélection négative et
élimination des lymphocytes CD4+ par apoptose via Pas / Fas-ligand [Suss and Shortman
1996; Steinman and Inaha 1999].
(1) Recrutement des cellules dendritiques
Les CD s’accumulent très rapidement au site où se dépose un antigène et sont parmi les
premières cellules à coloniser le site d’une inflammation muqueuse [MeWilliam et al. 1994].
Cette aecumulation est le fruit du recrutement des précurseurs médullaires. Ceux-ci migrent
dans un premier temps vers les tissus périphériques. La migration vers les différents sites est
16
dirigée par l’expression de récepteurs aux chemokines tels que CCRl, CCR5 et CCR6 et par
des molécules d’adhésion. Ces différents récepteurs sont exprimés de façon variable à la
surface des différents types de CD et ont une affinité variable pour les ligands que sont
notamment les différentes chémokines MIP, RANTES (Regulated on Activation, Normal T
cell-Expressed and Secreted),...
(2) Capture des antigènes
Pour capturer les antigènes, les CD immatures utilisent la macropinocytose, l’endocytose via
les C-type lectine receptors ou le récepteur Fcy de type I, la phagocytose de particules telles
que des débris cellulaires résultant de nécrose ou apoptose, et également le couplage des
peptides aux heat shock proteins (HSP) de la membrane cellulaire. La capture d’antigènes
induit le phénomène d’activation et de maturation des CD.
(3) Activation des cellules dendritiques
Pour être aptes à présenter un antigène aux lymphocytes, les cellules dendritiques doivent être
activées. Cette activation est induite par l’action de cytokines de la famille du TNF telles que
le TNF-a, Fas ligand, CD40 ligand et TRANCE et par la stimulation des pattern-recognition
receptors (PRR) par les composants d’origine microbienne appelés pathogen-associated
molecular pattern (PAMP). La plupart des PRR récemment identifiés appartiennent à la
famille des récepteurs Toll. Dix TLR sont actuellement identifiés. La partie extracellulaire de
ces récepteurs, composée d’un domaine riche en résidus leucines, a pour ligand un ensemble
de molécules d’origines variées parmi lesquelles: les lipopeptides et lipoprotéines des
mycoplasmes, mycobactéries et spirochètes (TLR2) ; les lipoprotéines et peptidoglycans de la
paroi des bactéries à Gram positif (TLR2) ; les ARN viraux (TLR3) ; les acides
lipoteichoiques des bactéries à Gram positif et le LPS des bacilles et coques à Gram négatif
(TLR4) ; FHSP60 d’origine endogène ou exogène (TLR4) ; les flagellines bactériennes
(TLR5) ; ou les CpG ODN (TLR9) [Kaisho and Akira 2002]. Le CD 14, quand il est exprimé,
comme à la surface des monocytes, facilite l’interaction entre le LPS et le récepteur TLR4 ou
TLR2. Le TLR4 est de plus couplé à une autre molécule indispensable à la recormaissance de
ses ligands, le MD-2. Les récepteurs TLR forment des homodimères au niveau de la
membrane cellulaire. Le TLR2 possède la particularité de nécessiter une dimérisation avec un
autre TLR (TLR6 et TLRl notamment) pour déclencher l’activation intracellulaire. Les TLR
possèdent une partie intracellulaire (TIR pour Toll/interleukinl receptor homology domain).
Cette partie intracellulaire interagit avec le myeloid différentiation factor 88 (MyD88).
17
Figure 3 : Voies de signalisation des TLR
Illustration schématique des voies de signalisation des récepteurs TLR4, TLR9 et TLR2 et de leur stimulation par les différents
PAMP (d’après [O'Neill 2002; Kaisho and Akira 2002; UnderhIII and Ozinsky 2002; Akira 2003]).
Ligands
LPS coniques
HSP60
Taxol
ADN bactérien
CpG ODN
;
TLR9
IFN-p
IL-12p70
i
IL-ip , TNFkx,
IL-e
LPS cylindriques
lipopeptides
peptidoglycan
i
Maturation
CD40, CD80,
CD86
18
IL-8, IL-12p40
IL-13, IL-5, IL-10
L’activation des TLR induit une voie de stimulation commune conduisant, via le MyD88,
IRAK {IL-1 receptor associated kinase) et NF-kB, à la production d’IL-1, d’IL-6 et de TNFa. Cette voie d’activation est cruciale pour la production de cytokines en réponse à une
stimulation par le LPS comme en témoigne l’abolition de cette réponse des macrophages
déficients en MyD88. Cette déficience n’influence pas
l’expression des molécules
costimulatrices CD40, CD80 et CD86 à la surface de la CD. Le contrôle de cette expression
semble emprunter une autre voie, celle du TIR domein-adaptingprotein / MyD88-adapter-like
(TERAP / Mal) [Kaisho and Akira 2002], Il semble que Ton ne soit qu’au début de
l’identification des TLR adapters et d’autres molécules apparaissent potentiellement
impliquées dans la voie d’activation des TLR [O'Neill et al. 2003]. Le TLR4 induit en outre
spécifiquement la production d’EL-12 p70, et, ainsi que le TLR3, peut induire Vinterferon
regulated factor 3 (IRF-3), un facteur de transcription essentiel à la production d’IFN-p. Les
ligands de TLR2 induisent plus spécifiquement la production d’BL-4 et d’IL-5, d’EL-12p40 et
de moins de TNF-a, probablement par l’activation d’une autre voie impliquant notamment la
PI3 kinase et Racl [Akira 2003] (figure 3).
Au-delà du signal généré par la stimulation spécifique de l’un ou l’autre TLR, il est probable
qu’un degré supérieur de complexité est obtenu par différentes combinaisons de stimulations
de récepteurs TLR distincts [Underhill and Ozinsky 2002; Lorenz et al. 2002; Jouault et al.
2003]. La régulation fine de la réponse immune tant dans son orientation vers un profil Thl
ou Th2 que dans le contrôle de l’intensité de la réponse pourrait ainsi reposer principalement
sur l’interaction entre les CD et les différents micro-organismes pathogènes (revu dans
[Pulendran et al. 2001]). Cette régulation est d’ailleurs parfois détournée par le micro­
organisme infectieux. Ainsi, Plasmodium falciparum et le virus rougeoleux bloquent la
maturation des CD, tandis que Schistosoma mansoni en bloque la migration.
Les CD expriment également une série de lectines qui comprennent un ou plusieurs
carbohydrate récognition domain médiant la reconnaissance des carbohydrates autologues ou
dérivant de structures pathogènes. Ces lectines interagissent avec les glycoprotéines du soi
pour médier les réactions cellulaires telles que la différenciation et la migration des CD.
Après liaison aux antigènes, les lectines contribuent également à l’internalisation de ceux-ci
par le biais de leur région cytoplasmique qui régule l’endocytose. L’interaction entre lectines
et micro-organismes infectieux peut contribuer à la pathogénie de l’infection comme c’est le
cas dans l’infection par le VIH : celui-ci se lie spécifiquement à la lectine DC-SIGN {DCspecifîc intercellular adhesion molecule-grabbing nonintegrin), et, non seulement, échappe à
19
la dégradation endosomiale mais de plus peut être de nouveau extemalisé et contribue à
l’infection ultérieure d’un lymphocyte CD4+ [Geijtenbeek et al. 2000], De même, certains
antigènes tumoraux expriment de multiples résidus carbohydrates et peuvent, par liaison
simultanée à de nombreuses molécules de lectines, bloquer la dégradation de l’antigène et sa
présentation [Engering et al. 2002],
(4) Migration et maturation des cellules dendritiques
L’activation des cellules dendritiques induit un ensemble de modifications dans l’expression
de récepteurs de surface des CD, augmentant les capacités migratoires selon des profils
différents en fonction du territoire concerné (localisation muqueuse, espaces interstitiels ou
muscles et peau) (revu dans [Steinman and Pope 2002]). Durant leur migration vers les
organes lymphoïdes secondaires, elles subissent des modifications phénotypiques et
fonctionnelles reprises sous le nom de maturation. Ce processus conduit à l’augmentation de
l’expression à la surface des molécules impliquées dans le recrutement et la costimulation des
lymphocytes T (CD54, CD86), du CD83, des molécules MHC I et MHC H, de la production
de cytokines (dont l’IL-12) et de diverses chemokines. On voit également une régulation
négative de l’expression de certains récepteurs aux chémokines (CCRl et CCR5), tandis que
d’autres voient leur expression augmenter (CCR7, CXC, CXCR4,...). A ce stade de
maturation, les CD perdent leur capacité à phagocyter et processer des antigènes. Quand elles
atteignent les zones T-dépendantes des organes lymphoïdes, les CD ont par contre acquis les
capacités d’immunostimulation et de recrutement des lymphocytes T naïfs par présentation au
niveau du MHC des épitopes antigéniques [Reis e Sousa et al 1997].
(5) Le complexe MHC
Le complexe MHC {major histocompatibility complex) est un ensemble de protéines
membranaires dont le rôle consiste à présenter les antigènes aux lymphocytes. Les protéines
constituant le MHC appartiennent à la superfamille des immunoglobulines. Deux structures
différentes existent : le MHC de classe I et le MHC de classe E. Trois loci du chromosome 6
codent principalement pour le MHC de classe I (désignés HLA-A, -B, -C) tandis que 3 autres
codent pour des protéines dites de classe I b. Les molécules de classe E principales sont les
molécules HLA-DR, -DQ, et -DP.
Le nombre d’allèles pour chaque molécule est variable. La présence de deux allèles pour
chaque locus HLA contribue à la diversité de la réponse immune, et les populations
présentant un moindre polymorphisme dans les allèles HLA semblent présenter une relative
20
limitation de leux capacité à présenter des antigènes. De la même façon, l’absence de réponse
à certains vaccins ou la rapidité de l’évolution de l’infection par le ’VIH sont corrélées au
génotype des allèles MHC de l’individu [Carruth et al. 1999],
MHC de classe I
Le complexe de classe I est composé d’une chaîne lourde polymorphique liée de façon non
covalente à une chaîne légère invariante : la p2 microglobuline. Les peptides présentés par le
MHC de classe I sont généralement dérivés de protéines cytoplasmiques ou nucléaires, qui
subissent une dégradation enzymatique par un complexe nommé le protéosome. Ils sont
ensuite transportés au niveau du réticulum endoplasmique où ils sont couplés au dimère MHC
de classe I. Le complexe formé est ensuite transporté via l’appareil de Golgi au niveau de la
membrane cellulaire ou il est assemblé en tétramères.
Les molécules de classe I sont exprimées par toutes les cellules nucléées, à l’exception des
cellules dérivées des crêtes neuronales et du tissu trophoblastique.
MHC de classe II
Le complexe de classe II
est constitué d’un hétérodimère ap
de glycoprotéines
transmembranaires synthétisées au niveau du réticulum endoplasmique, couplé à un troisième
constituant nommé la chaîne invariante, qui empêche la fixation de peptides endogènes dans
la cavité formée par les domaines a et p. Ce complexe forme une structure polymérique
exportée du réticulum endoplasmique vers l'appareil de Golgi et ensuite vers le compartiment
lysosomial. A ce niveau, la chaîne invariante subit une dégradation progressive tandis que le
complexe MHC acquiert la capacité de se lier à un peptide provenant de l’internalisation
d’une protéine extracellulaire en cours de dégradation enzymatique à l’intérieur de la vésicule
de pinocytose.
La transcription des gènes MHC de classe II, incluant celui de la chaîne invariante (li) est
largement dépendante de l’expression de CIITA {class II trans activâtor).
Les protéines MHC de classe El et le CIITA sont exprimés constitutivement par les cellules
thymiques épithéliales et les APC. Les cellules dendritiques et de Langerhans en présentent
les plus fortes densités, tandis que les macrophages et lymphocytes B matures présentent des
densités plus faibles.
21
Modulation de l’expression des molécules du MHC
L’expression des molécules du MHC est modulée par les cytokines. L’EFTSl-y stimule
l’expression de molécules de classe II sur les APC, et peut également induire l’expression de
molécules de classe II sur des cellules épithéliales, endothéliales, endocrines ou stromiques.
Par contre, l’induction des molécules de classe D peut être antagonisée par la présence de
certains produits bactériens tels que le LPS, les prostaglandines ou les corticoïdes. Les
molécules de classe I peuvent être induites par l’IFN-y, l’IFN-a, l’BFN-P et le TNF-a.
(6) Présentation des antigènes parles cellules dendritiques
Présentation via le MHC de classe I
La présentation de l’antigène via le MHC de classe I est nécessaire pour activer une réponse
générant des lymphocytes CD8+ cytotoxiques (CTL). Deux voies de présentation sont
connues. La voie endogène permet la présentation d’un antigène consécutive à l’infection de
la CD. Après infection, la CD synthétise les protéines de l’agent infectieux. Ces protéines sont
clivées au niveau du protéosome, et des fragments peptidiques sont transportés au niveau de
l’appareil de Golgi où ils sont couplés au MHC de classe I qui est ensuite extériorisé,
conduisant à l’expression des protéines virales à la surface de la cellule présentatrice. La voie
exogène de la présentation via le MHC de classe I permet l’endocytose de protéines d’origine
infectieuse, par exemple par le biais de leur couplage avec les HSP, qui sont ensuite clivées
dans le cytoplasme et subissent le même transport vers l’appareil de Golgi [Wang et al. 2002].
Cette voie exogène permet aux CD de présenter des antigènes qui ne se répliquent pas (tels
que par exemple les antigènes vaccinaux) aux CD8+. Elle permet également la présentation
de fragments peptidiques internalisés par la CD alors qu’ils sont déjà intégrés dans des
complexes immuns (via le FcyR), ou qu’ils sont présents à la surface de cellules nécrotiques.
Présentation via le MHC de classe II
La même séquence exogène que décrite ci-dessus via des récepteurs de la CD tels que le
CD205, et l’endocytose vers le compartiment lysosomial induit la présentation du peptide
couplé au MHC II et au CD86.
Présentation via le CDl
Les CD expriment diverses molécules de la famille du CDl en fonction notamment de leur
origine (ainsi, les cellules de Langerhans d’origine épidermique expriment le CD la, tandis
que les mêmes d’origine dermique expriment le CDlb).
22
Contrairement aux MHC de classe I auxquels les récepteurs CDl sont structurellement
apparentés et aux MHC de classe H, les récepteurs CDl sont spécialisés dans la présentation
de lipides et de glycolipides aux lymphocytes T.
Ç7) Différenciation des celiules dendritiques et tolérance
La production d’IL-12 et d’IL-4 lors de la réponse immune non spécifique et l’activation
suivie de la maturation des cellules dendritiques constituent le processus qui finalement
aboutit à la polarisation de la réponse immune en réponse de type 1 ou de type 2 tels que
définis plus loin. La nature des composants d’origine microbienne va induire par le biais des
TLR une polarisation de la réponse des CD. Ainsi, une stimulation par le LPS ou les CpG
ODN induit des CD capables d’orienter les lymphocytes T vers une réponse de type Thl, on
les appelle DCl, par opposition aux CD stimulées par des antigènes glycoprotéiques dérivés
de nématodes ou de la toxine cholérique etc. qui orientent la CD vers un profil Th2 (DC2).
L’activation de CD qui sécrètent de l’IL-10 mais pas d’IL-12 {Tr-driving DC ou DCr) oriente
les lymphocytes T naïfs vers un profil de lymphocytes T régulateurs (lymphocytes Tr).
En l’absence d’un signal de costimulation et en présence d’APC produisant de l’IL-lO, les
lymphocytes induits sont également de type Tr. Les cellules dendritiques jouent par ce biais
un rôle important dans le phénomène de tolérance en maintenant la tolérance périphérique
quand elles sont stimulées par un antigène en l’absence de molécule adjuvante [Hawiger et al.
2001; Lutz and Schuler 2002].
Certains éléments suggèrent également que les CD immatures induisent des phénomènes de
tolérance. Ainsi, des CD immatures pulsées avec un peptide du virus de l’influenza induisent
une diminution de la réponse des lymphocytes CD8+ spécifiques de cet antigène produisant
de l’IFN-y au profit des lymphocytes CD8+ producteurs d’IL-10 [Dhodapkar et al. 2001].
Il semble que ces différents types fonctionnels de CD soient le fruit d’une différenciation
dépendant des antigènes présents plutôt que de lignées différentes.
(8) Génération de cellules dendritiques in vitro
Les CD peuvent être générées au départ de plusieurs types cellulaires et plusieurs cytokines
peuvent être utilisées pour induire leur maturation (revu dans [Nestle et al. 2001]).
Les cellules mononucléées du sang périphérique cultivées en présence de GM-CSF et d’IL-4
génèrent des cellules dendritiques myéloïdes de phénotype immature ressemblant aux cellules
dendritiques interstitielles. Elles nécessitent une étape de maturation obtenue par divers
23
stimuli tels que le LPS pour exprimer ensuite les marqueurs de cellules matures capables de
stimuler les lymphocytes.
Une autre source de CD repose sur l’expansion in vitro des précurseurs médullaires. Cultivés
en présence de GM-CSF et de TNF-a, ces précurseurs mènent à une population composée des
deux sous-types de cellules dendritiques : intersitielles et de Langerhans. De plus, ces cellules
dendritiques ne requièrent pas de maturation ultérieure, dans la mesure où le TNF-a a déjà
induit celle-ci. Enfin plus récemment des CD myéloïdes ont été générées à partir de
monocytes humains cultivés en présence d’IL-3 et d’IFN-p.
1.1.4. Réponse spécifique et activation des lymphocytes T
Le développement d’une réponse inflammatoire non spécifique induit secondairement une
réponse spécifique aux antigènes détectés. Cette réponse spécifique est le friait de la
présentation des antigènes aux lymphocytes T et B. Les cellules présentatrices d’antigènes
sont les cellules dendritiques, les monocytes et leurs dérivés activés que sont les
macrophages, et, pour les antigènes polysaccharidiques uniquement, les lymphocytes B. En
outre, les cellules infectées peuvent également présenter des épitopes antigéniques du micro­
organisme infectieux via le MHC de classe I.
(1) Structure du TCR
L’activation des lymphocytes T est une étape essentielle du développement d’une réponse
immune spécifique. Seuls les lymphocytes qui expriment le TCR aP sont capables de générer
une réponse immune spécifique après activation. Le TCR est associé à un complexe de faible
poids moléculaire appelé CD3, lui-même composé de 5 chaînes polypeptidiques. Le TCR
détermine la spécificité antigénique du lymphocyte, tandis que le CD3 est impliqué dans la
transduction du signal délivré au niveau du TCR lors de la reconnaissance antigénique.
Le complexe TCR / CD3 est associé à un autre site, soit CD4 soit CD8, qui interagit
respectivement avec les molécules MHC de classe II ou de classe I.
(2) Présentation de l’antigène aux lymphocytes et costimulation
Les antigènes accèdent directement aux organes lymphoïdes via les canaux afférents, à la rate
via le sang, et au MALT {mucosal associated lymphoid tissué) via les cellules M qui
transportent les antigènes au travers de l’épithélium des muqueuses, ou indirectement, par la
24
migration des cellules dendritiques. Celles-ci se localisent dans les aires T du tissu lymphoïde
sous la forme de cellules dendritiques interdigitées.
La nature de la cellule présentatrice et le type d’antigène présenté détermineront le
lymphocyte auquel le complexe MHC / antigène sera présenté:
•
présentation à un lymphocyte cytotoxique (CD8+) via le complexe MHC de classe I,
•
présentation à un lymphocyte T helper (CD4+) via le complexe MHC de classe n.
Cependant, on a pu également mettre en évidence des lymphocytes cytotoxiques de
phénotype CD4-I- dans une série d’infections virales telles que l’infection à virus herpes
zoster, la rougeole, l’hépatite B, et l’influenza [Kundu and Merigan 1992].
Le phénomène conduisant à la présentation de l’antigène est initié par des interactions non
spécifiques entre différents récepteurs lymphocytaires et leurs correspondants au niveau des
cellules présentatrices; ICAM et CD2 à la surface du lymphocyte d’une part, et récepteurs de
la famille LFA {leucocyte-function-associated antigen) sur les APC d’autre part. Ces
interactions non spécifiques stabilisent transitoirement l’adhésion entre APC et lymphocytes.
La recormaissance du complexe MHC-peptide par le TCR constitue le premier signal
d’activation du lymphocyte et induit l’expression de CD40 ligand (CD40L ou CD154) à la
surface
du
lymphocyte
T.
Le
CD40L
interagit
ensuite
avec
le
CD40,
exprimé
constitutivement par les APC et dont l’expression est notamment augmentée par le GM-CSF
et riL-3, deux cytokines produites par les lymphocytes dont le TCR est engagé dans une
interaction avec le MHC.
La voie d’activation CD40-CD40L représente un système clé dans la régulation de la
présentation d’antigènes par les APC, l’activation des lymphocytes T, l’activation des
macrophages, et l’extravasation des leucocytes par le biais de l’interaction avec l’endothélium
vasculaire (revu par [Grewal et al. 1997]).
La liaison CD40-CD40L induit l’expression sur F APC de molécules stimulatrices B7-1
(CD80) et B7-2 (CD86), ligands de deux molécules présentes à la surface des lymphocytes T,
le CD28 et le CTLA-4 (CD152). Stimulé par ces molécules, le CD28 délivre un co-signal, le
deuxième signal d’activation du lymphocyte, qui entraîne l’activation complète de celui-ci.
L’interaction du CD28 du lymphocyte T avec le B7-1 de l’APC est indispensable, en
particulier pour la réponse immune primaire. L’absence de ce signal de costimulation entraîne
l’anergie du lymphocyte T. Les cellules dendritiques expriment constitutivement B7-1, tandis
que les monocytes et les lymphocytes B, T et NK doivent préalablement être activés pour
l’exprimer. L’interaction entre le CD40 et son ligand entraîne également au niveau de la
cellule présentatrice une stimulation de la production d’IL-la et IL-ip, IL-6, IL-8, IL-10, EL25
12, TNF-a, Mff-a, et une augmentation de l’expression des ICAM-1 (CD54), LFA-3
(CD58).
Par le biais de la stimulation des APC via l’interaction CD40-CD40L entre lymphocytes T
CD4+ et APC s’exerce l’effet helper des CD4+ sur la stimulation des lymphocytes CD8+ : les
APC engagés dans une interaction CD40-CD40L augmentent fortement leur capacité de
présentation aux CD8+. A contrario, l’altération de cette interaction, comme démontré sur des
souris déficientes en CD40-L, entraîne une diminution de l’induction des CD8+ mémoires
impliqués dans la CTL [Borrow et al. 1996]. L’activation du TCR est également favorisée par
la coaggrégation du complexe TCR-CD3 avec le CD4 ou le CD8, et l’interaction entre ces
structures et le MHC. Enfin, il semble que le CD45 sous l’une ou l’autre de ses isoformes soit
également indispensable à l’activation du TCR. L’activation du TCR conduit à la
transmission d’un signal transmembranaire induisant l’augmentation de Ca^"^ intracellulaire,
l’activation de la tyrosine kinase et de la protéine kinase C. Une cascade de réactions
enzymatiques conduit ensuite à la transcription des composants nucléaires contribuant à
Tactivation du gène de l’IL-2 et à l’induction de la prolifération cellulaire.
La stimulation adéquate des lymphocytes T et B par les monocytes implique im contact
cellulaire entre ces différentes cellules et un effet paracrine des différentes cytokines.
L’activation des lymphocytes T par des antigènes dits de rappel tels que l’anatoxine tétanique
se fait essentiellement par la voie des molécules présentatrices de classe II et des lymphocytes
CD4+. D’autres antigènes parmi lesquels les allo-antigènes HLA sont capables d’induire une
activation des lymphocytes CD4+ par le biais soit d’auto-APC ou d’allo-APC, mais
également une activation des lymphocytes CD8+ après présentation par des allo-APC [Via et
al. 1990].
Au cours d’une stimulation immunitaire, en plus de la réponse spécifique à l’antigène
présenté, on peut mettre en évidence une activation lymphocytaire non spécifique. C’est
notamment le cas au cours de diverses infections virales [Tough and Sprent 1996]. Cette
stimulation résulte de l’action des cytokines induites, et notamment parmi celles-ci des IFN de
type 1 (a et P), et ne nécessite aucune activation du TCR .
Le CD80 et le CD86 se lient également au CTLA-4, récepteur dont la présence à la surface du
lymphocyte T est induite dans la phase tardive de l’activation (environ 48 heures). Il en
résulte ime régulation négative [Lenschow et al. 1996],
26
{3} Réponse primaire
La réponse primaire, résultant d’une première exposition à un antigène, implique des
lymphocytes T qui n’ont jamais été activés au travers de leur TCR. Lors de l’activation
cellulaire et la prolifération, les cellules naïves produisent essentiellement de riL-2, mais
elles enclenchent la différenciation qui leur permettra plus tard de produire d’autres cytokines
après restimulation antigénique [Ehlers and Smith 1991; Picker et al. 1995].
Après activation par la cellule présentatrice, les lymphocytes expriment désormais les
marqueurs d’activation et de différenciation en cellules effectrices ou mémoires [Esser et al.
2003]. Ils expriment également des marqueurs les différenciant en fonction de la zone
épithéliale correspondant au ganglion où ils ont été activés. Les cellules provenant du tractus
gastro-intestinal portent notanunent le marqueur de l’intégrine a4p7, tandis que les cellules
provenant de l’épithélium cutané portent le marqueur CLA (cutaneous lymphocyte antigen).
Après immimisation ou exposition à un agent infectieux, la première phase de la réponse est
caractérisée par l’expansion considérable de la population lymphocytaire spécifique de
l’antigène. Au niveau des lymphocytes CD8+, il semble exister une certaine proportionnalité
entre la charge antigénique et la proportion de cellules spécifiques de cet antigène induites.
Généralement, l’infection naturelle induit une réponse de plus grande amplitude que celle
induite par une immunisation vaccinale. Très rapidement, une seconde phase va conduire à
l’apoptose la toute grande majorité des cellules activées, tandis que certains lymphocytes vont
évoluer au cours d’une troisième phase en lymphocytes mémoires CD4-I- et CD8-I-.
L’amplitude de cette phase « mémoire » est généralement déterminée par celle de la phase
d’expansion initiale. L’expression du récepteur aux chémokines CCR7 et du CD62L permet
de différencier parmi les lymphocytes mémoires deux sous-populations : l’une exprime le
CCR7 et le CD62L et n’a pas de capacité effectrice immédiate {central memory T cells - Tcm)
(prédominant dans le tissu lymphoïde) tandis que l’autre sous-population, qui n’exprime pas
ces récepteurs, est pourvue d’une capacité effectrice immédiate {effector memory T cells Tem) et prédomine dans les tissus périphériques [Sallusto et al. 1999]. Le maintien de
lymphocytes mémoires tant CD8-H que CD4+ nécessite la présence de cytokines, en
particulier pour les lymphocytes CD8+. L’IL-15 joue un rôle important dans celte fonction.
En outre, le maintien d’une CTL par le biais de lymphocytes mémoires nécessite également la
présence de lymphocytes CD4+ helper, ce qui est illustré par la perte de la réponse des
lymphocytes CD8+ en cas de déplétion en lymphocytes CD4+ dans plusieurs modèles
27
d’infection ou au décours de l’infection par le VIH [Shedlock and Shen 2003; Sun and Bevan
2003]. Les lymphocytes mémoires représentent environ 40% des lymphocytes CD4+ circulant
chez l’homme. Les mécanismes de régulation des populations de lymphocytes CD4+ et CD8+
semblent différents et conduisent à une diminution plus précoce des lymphocytes CD4+.
Cette différence justifie l’importance des rappels dans le maintien d’une réponse des
lymphocytes CD4+, elle-même indispensable au maintien de la CTL.
Un ensemble de données expérimentales suggère que les sous-populations Tcm et Tem ne
sont pas indépendantes l’une de l’autre et qu’une différenciation de Ton en Tem est possible
au niveau des lymphocytes CD4+ et CD8+. La différenciation en l’une ou l’autre des souspopulations peut être modulée en fonction des cytokines présentes. Il semble que la balance
entre ces deux sous-populations dépende également de la quantité d’antigènes présente et
qu’elle pourrait se déterminer très tôt dans les premiers jours de l’infection, peut-être selon
une évolution linéaire des cellules effectrices d’abord vers les lymphocytes Tem et ensuite
Ton. Les conséquences que pourrait avoir la persistance de l’antigène sur cette balance sont
actuellement inconnues.
(4) Réponse secondaire ou de rappel
Le phénotype du lymphocyte mémoire reste modifié par rapport au lymphocyte naïf II
conserve une taille supérieure, un contenu plus riche en ARN, et exprime plus de récepteurs
impliqués dans l’adhésion aux APC ou à l’endothélium vasculaire. Des différences
fonctionnelles importantes existent entre les lymphocytes naïfs et les lymphocytes mémoires
lors de leur activation. Les lymphocytes mémoires sont doués d’une plus grande capacité à
proliférer de façon spécifique, à répondre à des stimuli chémotactiques, à migrer et adhérer
aux endothéliums vasculaires. Par contre, ils prolifèrent moins bien en réponse à des
mitogènes. Leur production de cytokines n’est pas non plus la même. On note en particulier
une production d’IL-2 moindre, et une plus grande production d’IL-4 et peut-être d’IFN-y
[Picker et al
1995]. L’acquisition d’altérations permanentes dans l’expression d’adhésines
semble être responsable de l’orientation vers un circuit de circulation différent de celui des
cellules naïves. En réponse à une activation, une synergie se développe entre les lymphocytes
naïfs et les lymphocytes mémoires, chacun des deux phénotypes induisant l’amplification de
la réponse de l’autre population via les cytokines produites [Akbar et al. 1991].
La persistance de
la mémoire immunitaire
fait actuellement
l’objet
de beaucoup
d’interrogations. Si la persistance de l’antigène n’apparaît pas indispensable pour le maintien
d’une réponse humorale, plusieurs éléments suggèrent que, par contre, le maintien d’une
28
réponse Thl par des lymphocytes CD8+ nécessite la persistance de l’antigène, et la présence
continue d’IL-12 pourrait également être requise [Seder and Hill 2000],
A ce titre, il est intéressant de noter que si l’on a cra que des réponses cellulaires pouvaient
persister à vie malgré l’élimination présumée définitive de l’antigène et que l’on citait
volontiers l’exemple de la rougeole, du génome rougeoleux a été identifié par PCR chez des
patients âgés, signant une persistance à bas bmit de l’antigène [Katayama et al. 1995].
(5) La réponse immune cellulaire
La réponse immune cellulaire comporte la participation des lymphocytes T helper et des
lymphocytes cytotoxiques (CTL), essentiellement de phénotype CD8+. L’activation des
lymphocytes CD8+ requiert, dans la plupart des cas, l’interaction de trois types cellulaires
distincts ; les lymphocytes CD4+, les lymphocytes CD8+ et les APC. L’aide apportée par les
lymphocytes CD4+ l’est en fait par l’intermédiaire de l’activation des APC. L’engagement du
CD40L à la surface du lymphocyte CD4+ activé avec le CD40 présent sur l’APC augmente
fortement la capacité de présentation des antigènes par les APC et la costimulation permettant
l’activation des lymphocytes CD8+. Cet engagement séquentiel permet ainsi au départ de
l’activation de quelques lymphocytes CD4+ d’activer un grand nombre de lymphocytes
CD8+. Les lymphocytes CTL utilisent essentiellement deux mécanismes : l’exocytose de
granules de perforine et de granzyme, et le mécanisme d’apoptose par la voie de Pas / FasL.
En plus de leur action cytotoxique, les lymphocytes cytotoxiques produisent de grandes
quantités de cytokines telles que l’rPN-y et le TNF-a. La qualité de la réponse cytotoxique
dépend de l’avidité du lymphocyte pour l’antigène cible, mais au-delà de l’avidité du TCR,
l’avidité fonctionnelle du lymphocyte peut varier au cours de l’infection suite à une variation
de l’efficience de la transduction du signal d’activation au départ du TCR [Berzofsky et al.
2001].
(6) Les lymphocytes T régulateurs
Plusieurs
catégories
de
lymphocytes
T
régulateurs
possédant
des
caractéristiques
phénotypiques et des modes d’action distincts ont été identifiées [McGuirk and Mills 2002;
Mittrucker and Kaufinann 2004].
On distingue :
•
Les lymphocytes Tri, lymphocytes CD4+ caractérisés par un profil de production de
cytokines distinct des profils Thl et Th2 car produisant de l’IL-lO, de l’IL-5 mais ni IL-4,
ni TGF-p. Leur caractère régulateur semble médié par la production d’BL-lO.
29
•
Les lymphocytes Th3, lymphocytes CD4+ dont l’action est médiée par le TGF-p.
•
Les lymphocytes CD4+CD25+. Leur effet régulateur semble dépendre à la fois de la
production de cytokines régulatrices (parmi lesquelles l’lL-10 et le TGF-P), et également
de contacts cellulaires, notamment probablement par le biais du CTLA-4 {cytotoxic Tlymphocyte antigen 4). Le même épitope peut d’ailleurs induire en parallèle une réponse
de type helper et une réponse de type « régulation » caractérisée par une production d’IL10 en l’absence d’IL-4 comme décrit dans l’infection chronique à HCV [MacDonald et al.
2002],
Chez la souris, la sous-population lymphocytaire CD4+CD25+ provient essentiellement du
thymus mais des études réalisées chez la souris thymectomisée suggèrent une possible
différenciation en lymphocytes régulateurs au niveau des tissus périphériques.
La différenciation en lymphocytes régulateurs semble être le fruit de l’activation par un soustype spécifique de cellules dendritiques. Les lymphocytes régulateurs présentent différents
profils d’expression de récepteurs aux chemokines (de la famille CCR). Ces récepteurs jouent
un rôle important dans la régulation de la fonction suppressive et la relation entre
lymphocytes régulateurs et APC. En particulier, les lymphocytes CD25+ expriment en
abondance le CCR4 dont un ligand est abondamment produit par les CD myéloïdes mais pas
par les CD plasmacytoïdes. Cette collaboration facilitée avec les CD myéloïdes, impliquées
dans la capture d’antigènes du soi vers les ganglions lymphatiques, pourrait contribuer au
mécanisme de la tolérance [D'Ambrosio et al. 2003].
Les lymphocytes régulateurs jouent un rôle important dans le contrôle de la réponse immune
notamment par le biais de la production d’IL-10 et de TGF-(3. Il est intéressant de noter que
de nombreux micro-organismes infectieux, parmi lesquels de nombreux agents d’infections
chroniques, modulent la production de ces deux cytokines, avec en plus parfois une
dérégulation de la production d’LL-12, ou possèdent des homologues de l’IL-10 (revu dans
[McGuirk and Mills 2002]).
Des lymphocytes T régulateurs spécifiques de Bordetella pertussis ont été mis récemment en
évidence. La FHA {filamentous hemagglutinin A) de cette bactérie induit une augmentation de
la production d’IL-10 et une réduction de celle d’IL-12 par les cellules dendritiques, dont la
résultante est l’expansion d’une sous-population de lymphocytes régulateurs de phénotype
CD4+ CD25+. Ceci est le premier exemple d’une stratégie des micro-organismes favorisant
spécifiquement la réponse suppressive au site de l’infection [McGuirk et al. 2002].
30
1.1.5. Stimulation du lymphocyte B
Selon leur capacité à induire une réponse immune au niveau des lymphocytes B en l’absence
ou non de lymphocytes T, les antigènes sont séparés en thymo-indépendants de type 1
(capables d’induire une activation de tous les lymphocytes B tant matures qu’immatures),
thymo-indépendants de type 2 (requérant la présence de macrophages et d’un minimum de
lymphocytes T, et capables de stimuler uniquement des lymphocytes B matures) et thymodépendants. Cette dernière catégorie comporte essentiellement les antigènes protéiques, dont
l’anatoxine tétanique.
Lors de la réponse primaire à un antigène thymo-dépendant, l’antigène est présenté par les
CD interdigitées aux lymphocytes T qui, une fois activés, interagissent par la voie de CD40CD40L avec des lymphocytes B exprimant un récepteur membranaire pour un épitope du
même antigène. L’activation du lymphocyte B qui en résulte conduit à la différenciation en
plasmocytes d’une part et à la migration de lymphocytes B spécifiques vers les centres
germinatifs du tissu lymphoïde d’autre part. Ils y prolifèrent rapidement en centroblastes et en
centrocytes. En présence d’une liaison du récepteur du lymphocyte B à l’antigène présenté par
les CD folliculaires, un processus de sélection en faveur des centrocytes exprimant des
anticorps de forte affinité se met en place. Les centrocytes échappant à ce processus de
sélection subissent une apoptose.
La réponse secondaire spécifique aux antigènes thymo-dépendants est caractérisée par une
mobilisation plus rapide des lymphocytes B mémoires exprimant des récepteurs de haute
affinité pour l’antigène et permettant d’atteindre rapidement un pic élevé d’anticorps. Au
cours de cette réponse, le lymphocyte B peut jouer le rôle de cellule présentatrice. L’antigène
internalisé subit un processus de dégradation analogue à celui décrit pour les autres cellules
présentatrices. Les fragments d’épitopes sont alors présentés aux lymphocytes T. Il s’ensuit
une séquence d’activation mutuelle du lymphocyte B et du lymphocyte T impliquant les
interactions successives des divers récepteurs de surface et leurs ligands respectifs, parmi
lesquelles la liaison CD40-CD40L joue un rôle essentiel.
1.1.6. L’anatoxine tétanique
L’anatoxine tétanique, dérivée de la toxine tétanique par inactivation, conserve de celle-ci ses
déterminants antigéniques. C’est un antigène T-dépendant [Geha et al. 1973] nécessitant une
31
présentation par les cellules présentatrices [Alpert et al. 1981; Demotz et al. 1989] et
induisant une réponse de type clonale [Adams et al. 1991], caractérisée par la production
essentiellement d’IgGl [Rubin et a/. 1986],
En réponse à l’administration d’une dose de rappel d’anatoxine tétanique, les lymphocytes T
de volontaires, dont la stimulation in vitro avant le rappel n’est que peu ou pas efficace,
produisent essentiellement de l’EFN-y, IL-2 et TNF-P [Fernandez et al. 1994], La source de
ces cytokines est principalement représentée par les lymphocytes CD4+ (cinq pour cent au
maximum des cellules sécrétrices sont cependant des lymphocytes CD8+). Le pic de
production d’IFN-y par mesure de la concentration intracellulaire de celui-ci est d’environ 96
heures, tandis que les rares cellules produisant de l’IL-4 présentent un pic plus précoce (24
heures) [elGhazali et al. 1993; Fernandez et al 1994],
1.1.7. Les superantigènes
Les superantigènes sont des molécules susceptibles de se lier à des molécules MHC de classe
n sur la face externe de l’hélice a d’une part et à des séquences caractéristiques de certaines
familles des chaînes (3 du TCR en dehors des zones de contact du peptide et des molécules de
classe n d’autre part. Ils ne nécessitent donc pas de reconnaissance antigénique par le TCR.
Par cette caractéristique, les superantigènes sont capables d’activer un grand nombre de
clones de lymphocytes T. Le prototype du superantigène est représenté par T enterotoxine B
du staphylocoque (SEB). L’effet de la SEB sur les lymphocytes dépend du degré de
maturation de ceux-ci. Les lymphocytes naïfs subissent une expansion suivie d’apoptose,
tandis que les lymphocytes mémoires subissent une expansion sans anergie secondaire. La
SEB a démontré sa capacité adjuvante à la réponse immune tant humorale que cellulaire dans
des modèles animaux [Torres et al. 2002]. De nombreux micro-organismes infectieux
contiennent des superantigènes. C’est le cas par exemple du rétrovirus murin de la tumeur
marnmaire de type C. Le VIH ne semble pas en posséder. Par contre, le cytomégalovirus,
agent ubiquitaire et co-infectant fréquent du VIH semble induire la réplication préférentielle
du VIH dans un sous-répertoire particulier, le sous-répertoire Vpi2, par un effet sélectif
conduisant à l’expansion de ce sous-répertoire. Ceci pourrait conduire à la persistance d’un
réservoir de lymphocytes infectés par le VIH [Dobrescu et al. 1995].
32
1.1.8. Les Heat Shock Proteins
Les Heat Shock Proteins (HSP) sont des protéines présentes dans toutes les cellules de
procaryotes ou d’eucaryotes, où elles jouent un rôle essentiel dans l’assemblage ou le
transport d’autres molécules. Leurs séquences d’acides aminés sont largement conservées de
la bactérie à l’espèce humaine. Elles sont la cible d’une réponse immune dans de nombreuses
infections. Elles activent les macrophages pour produire les cytokines inflammatoires et les
chemokines, et induisent l’expression des molécules costimulatrices. Les cellules nécrotiques
humaines induisent par exemple la stimulation des CD par le biais de la libération d’HSPVO.
L’HSPVO d’origine mycobactérienne est également capable d’induire la maturation des CD.
L’effet sur la production de chemokines et cytokines de l’HSPVO réside dans le fragment Cterminal de la protéine [Wang et al 2002]. Ce même fragment est impliqué dans la liaison
entre HSP et protéines exogènes permettant le transport de celles-ci vers la voie du MHC I.
Au niveau des cellules dendritiques, à l’intérieur d’un complexe qui associe le TLR4, le
CXCR4 et un ensemble d’autres protéines de surface, les HSP70 et 90 constitutives des CD
semblent jouer un rôle dans l’activation du TLR par le LPS [Triantafilou and Triantafilou
2002].
1.1.9. Anergie et apoptose
La nécessité de la présence d’im signal coactivateur afin d’activer les lymphocytes T permet
de garantir la spécificité de la réponse aux antigènes du «non soi » [Janeway, Jr. 1992]. En
effet, le signal de coactivation est dépendant de la présence de produits bactériens ou viraux
tels que le LPS. En l’absence de ce signal, situation qui prévaudrait en cas de présentation au
TCR d’un antigène du soi, il n’y aurait pas d’activation possible des APC et donc pas de
coactivation des lymphocytes T mais au contraire, anergie et absence de production d’IL-2
après stimulation du TCR. On sait cependant que l’apport exogène d’IL-2 peut induire une
réversibilité de cet état. L’anergie semble un mécanisme sélectivement réservé aux
lymphocytes de type Thl.
L’apoptose ou mort cellulaire programmée joue un rôle important dans de nombreux
phénomènes physiologiques tels que l’embryogenèse mais aussi dans la régulation immune
[Golstein et al. 1991; Cohen 1991; Ameisen 1994]. C’est notamment ce mécanisme qui
conduit à l’élimination des cellules T immatures spécifiques du soi. L’apoptose est contrôlée
33
par plusieurs voies et interactions entre la cellule et son environnement, principalement la
voie de Fas et la voie des molécules de la famille bcl-2. Les contrôles des phénomènes
d’apoptose par ces deux voies sont indépendants [Memon et al. 1995; Strasser et al. 1995].
Certains facteurs de croissance sont nécessaires pour empêcher l’induction de l’apoptose tels
que l’IL-2 ou l’IL-4 pour les lymphocytes T. Les produits des gènes de la famille bcl-2
contrôlent également celle-ci. Certains membres de cette famille ont un effet protecteur (tels
que le bcl-2), tandis que d’autres ont l’effet inverse. En outre, certains récepteurs
membranaires tels que le Fas ou le récepteur au TNF de type I induisent un signal d’apoptose.
Au cours de l’activation lymphocytaire, l’expression de bcl-2 est diminuée par rapport aux
cellules non activées, suggérant que l’activation des lymphocytes conduit à une population
destinée à l’apoptose en l’absence d’une restimulation par l’IL-2 [Akbar et al. 1993]. De plus,
la stimulation du TCR induit l’expression de Fas et contribue donc également à favoriser
l’apoptose. Cependant, alors que l’induction de l’expression de Fas se produit dans les
premières heures de la stimulation, l’apoptose médiée par Fas ne peut pas intervenir avant
plusieurs jours [Strasser 1995]. Par l’apoptose, le système immunitaire dispose d’un
mécanisme pour détruire rapidement les cellules activées après élimination de l’agent
pathogène activateur [Russell 1995]. Le mécanisme d’apoptose conduit à l’activation des
endonucléases cellulaires qui clivent l’ADN. Ce mécanisme a bien été démontré dans
certaines infections virales telles que la mononucléose ou la varicelle.
1.1.10. Réponse de type 1 et de type 2
Les travaux de Mossman chez la souris ont mis en évidence une polarisation fonctionnelle des
lymphocytes T, en fonction des cytokines qu’ils produisent. Ces travaux sont essentiellement
basés sur l’analyse de la production de cytokines par des clones de lymphocytes T [Mosmann
et al. 1986]. Les cellules dites Thl produisent de l’EFN-y, de TEL-2 et du TNF-p. Les cellules
dites Th2 produisent de riL-4, IL-5, IL-10, et IL-13. Ces dernières cytokines sont essentielles
à la stimulation des lymphocytes B et à leur maturation en plasmatocytes. Les deux types de
cellules orientent la production d’anticorps vers des isotypes différents ; IgGl, IgA et IgE
pour la stimulation Th2, et IgG2a pour la réponse de type Thl. De plus, une réponse Thl
puissante serait capable d’induire une réaction d’hypersensibilité retardée (DTH) sans mener à
la production d’anticorps [Mosmann et al. 1991]. Par ailleurs, les cytokines Th2 sont capables
d’inhiber plusieurs fonctions macrophagiques.
34
Les cytokines présentes influencent la différenciation en profil Thl ou Th2 selon un feedback
positif [Seder and Paul 1994], Ainsi, on peut stimuler la différenciation vers un profil Th2 en
cultivant des lymphocytes T en présence d’EL-4, tandis que 1’IFN-y et l’IL-12 induisent la
différenciation des précurseurs des cellules Th en Thl [Rocken et al 1992b]. L’interaction
entre le TCR et son ligand joue également un rôle important, puisqu’une occupation
prolongée du complexe CD3 / TCR semble critique pour l’induction d’un phénotype Th2
[Rocken et al. 1992a]. Un feed-hack négatif existe entre ces deux différentes populations.
Ainsi, les lymphocytes CD8+ orientent préférentiellement les lymphocytes CD4+ vers un
profil Thl, tandis qu’en l’absence de lymphocytes CD8+, on assiste à l’apparition de
lymphocytes CD4+ produisant de l’IL-4 et induisant l’apparition d’IgE [Holmes et al. 1997].
La polarisation Thl / Th2 ne résulte pas tant dans l’expansion de clones spécifiques que dans
une modification de l’expression des gènes des diverses cytokines à l’échelle de la population
concernée. Ainsi, des clones dérivés de lymphocytes CD4+ expriment des ARNm de
cytokines de type 1 et 2 répartis de façon aléatoire, avec donc un certain nombre de clones
exprimant des cytokines de chacun des types [Kelso et al. 1995]. Parmi les 5% environ de
lymphocytes produisant de l’IL-4, seul un quart ne produit que cette cytokine. Le reste produit
en proportion variable également soit de l’IL-2 soit de l’IFN-y en réponse à une stimulation
polyclonale [Picker et al 1995]. De même, Andersson et al ont montré qu’en stimulation
polyclonale par ionomycine et PMA, 50% et 25% du faible pourcentage de cellules
produisant de l’IL-4 (1 à 3%) produisent également respectivement de l’IL-2 et de l’EFN-y
[Andersson et ai. 1990]. Ils ont mis en évidence un pic d’IL-4 intracellulaire après environ 6
heures de stimulation, en même temps qu’un premier pic d’IL-2 et d’IFN-y. Cependant un
deuxième pic de ces dernières cytokines survient environ 24 heures plus tard. Les deux
populations de lymphocytes T proviennent de la même population de précurseurs et, si les
cytokines présentes influencent de façon importante la différenciation en lymphocytes Thl ou
Th2, on sait également qu’il ne faut que quelques jours pour parvenir, à partir d’une cellule
indifférenciée, à une cellule polarisée vers l’un ou l’autre type.
La réalité de cette polarisation Thl / Th2, d’abord clairement démontrée chez la souris, n’est
apparue que progressivement en immunologie humaine. Ainsi, on a pu générer des clones de
lymphocytes CD4+ de type Thl dans les maladies auto-immunes thyroïdiermes ou Th2 chez
des patients atopiques [Romagnani 1991]. Des phénomènes de dérégulation de la production
35
de cytokines impliquant une modification de l’équilibre Thl / Th2 sont évoqués dans un
grand nombre de pathologies infectieuses, néoplasiques ou inflammatoires [Lucey et al. 1996;
Spellberg and Edwards, Jr. 2001], Si les cytokines produites par les deux types de clones sont
essentiellement les mêmes chez l’homme et la souris, une différence notable est rencontrée en
ce qui concerne l’IL-10 : outre son origine monocytaire, chez l’homme, cette cytokine est
produite tant par les clones Thl que Th2 [Del Prete et al. 1993], On décrit également des
cellules T ayant un profil ThO, produisant des cytokines des 2 types.
Plusieurs études ont contribué à étendre ce concept de polarisation de la production de
cytokines à d’autres types cellulaires que les lymphocytes T helper, avec notamment des
clones de lymphocytes CD8+ exprimant un profil de type 2 [Maggi et al. 1994], Pour cette
raison, on parle plus volontiers de cytokine ou effet de type 1 ou 2.
Les prototypes des cytokines de type 1 ou 2 sont respectivement 1’IFN-y d’une part, et TIL-4
et riL-13 d’autre part. Leurs propriétés sont résumées ci-dessous.
(1) Interféron-y
Les lymphocytes représentent la source la plus importante d’IFN-y. Au stade initial de la
réponse immune, seules les cellules NK produisent une quantité significative d’fFN-y, mais au
cours d’une réponse spécifique, les autres populations lymphocytaires contribuent largement à
cette production en réponse à l’IL-12. L’IFN-y est le principal facteur d’activation des
macrophages. Il induit l’expression des récepteurs pour le fragment Fc des immunoglobulines
et facilite la cytotoxicité dépendante des anticorps (ADCC pour antibody-dependant
cytotoxicity). Il induit également la production de monoxyde d’azote (NO) impliqué dans la
destruction des micro-organismes phagocytés, et l’expression des molécules MHC de classe II
à la surface des cellules présentatrices.
Il agit également au niveau des lymphocytes en induisant :
•
l’inhibition de la prolifération des cellules Th2,
•
la promotion de la prolifération des lymphocytes B et de la synthèse de la chaîne légère
des immunoglobulines,
•
la stimulation des cellules NK.
(2) lnterleukine-4 et lnterleukine-13
L’IL-4 est sécrétée par les lymphocytes Th2 mais également par les mastocytes. Parmi ses
effets principaux, on note :
•
la promotion de la croissance des lymphocytes B et de leur différenciation,
36
•
la régulation de la production d’immunoglobulines en particulier en favorisant la
production d’IgE et d’IgG4,
•
la régulation de la différenciation des lymphocytes T en favorisant la différenciation en
lymphocytes Th2,
•
l’inhibition de la production d’fFN-y par les lymphocytes T,
•
la promotion de l’expression du CD23 à la surface des lymphocytes B, ce qui induit
l’inhibition de l’activation des macrophages et la potentialisation de l’effet de l’IL-lO sur
ceux-ci.
L’IL-4 et riL-13 partagent de nombreuses propriétés et utilisent toutes deux la partie a du
récepteur à l’IL-4. L’IL-13 se différencie de riL-4 principalement sur les points suivants : elle
n’agit pas sur les lymphocytes T et elle induit la production d’IFN-y par les lymphocytes NK
en synergie avec l’IL-2. L’IL-4 est plus impliquée dans l’induction de la production d’IgE,
tandis que l’IL-13 joue im rôle prépondérant dans les mécanismes de fibrose liés aux
infections parasitaires et dans la pathogénie du bronchospasme [Chomarat and Banchereau
1998; Mckenzie 2000; Foster et al. 2002; Wynn 2003].
D’autres caractéristiques différencient les lymphocytes Thl des lymphocytes Th2. Les
lymphocytes Thl expriment des récepteurs aux chémokines de type CXCR3 et CXCR5 tandis
que les lymphocytes Th2 expriment préférentiellement des récepteurs de type CCR4 et dans
une moindre mesure CCR3 [Bonecchi et al. 1998]. Ce point est particulièrement important
dans la physiopathologie de l’infection par le VIH. En effet, l’affinité du VIH vis-à-vis de ces
différents récepteurs pourrait influencer sa capacité à infecter plus un type de lymphocytes
que l’autre et contribuer à l’orientation de la réponse immune. La famille des chémokines joue
un rôle important dans le chémotactisme des lymphocytes et chacune d’entre-elles possède
une affinité variable pour les différents récepteurs. La polarisation de l’expression des
récepteurs sur les deux types de lymphocytes intervient donc probablement dans le
recrutement spécifique de ceux-ci au niveau des sites inflammatoires. De plus, il n'est pas
impossible que l’action des chémokines au niveau du lymphocyte induise une modulation de
la production de cytokines. Ainsi, un ligand du CCR2 (le MCP-1) semble préférentiellement
induire la production d’IL-4 et bloquer celle d’IL-12.
En outre, l’expression de ligands des sélectines P et E (protéines fortement exprimées au
cours des réactions inflammatoires) diffère entre lymphocytes Thl et Th2. Cette différence
induit un comportement différent des deux phénotypes de lymphocytes : les lymphocytes Thl
37
voient leur capacité de fixation nettement favorisée par rapport aux lymphocytes Th2 dans les
zones épithéliales sièges d’une réaction inflammatoire [Austrup et al. 1997],
Expression clinique des réactions de type 1 et de type 2
La réaction de type 1 induit typiquement la réaction d’hypersensibilité retardée. Cette réaction
représente le prototype de la réaction à médiation cellulaire dans laquelle les cytokines
produites par les lymphocytes de type 1 activent les macrophages et les lymphocytes
cytotoxiques,
et
induisent
la
production
préférentielle
de
certains
isotypes
d’immunoglobulines. Cette stimulation conduit préférentiellement à l’élimination des agents
intracellulaires.
La réaction de type 2 est caractérisée par l’induction de réponses immunitaires à médiation
humorale en favorisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs
d’anticorps neutralisants (IgE, IgGl).
Hypothèse de la différenciation linéaire des lymphocytes
La plupart des considérations sur la différenciation de la réponse immune en type 1 et type 2
ont envisagé cette différenciation comme branchée sur le profil ThO.
Plus récemment, une nouvelle hypothèse a été émise : les cellules évoluent linéairement d’un
profil de type 2 vers un type 0 et ensuite vers un type 1. Les observations suivantes sont en
faveur d’une telle voie de différenciation ;
persistance d’une réponse efficace de type 2, caractérisée par la présence d’un titre élevé
d’anticorps, au cours d’une réponse cellulaire de type 1,
-
nécessité d’une production initiale d’EL-4 dans la génération d’une réponse de type 1 dans
des modèles d’infection à Leishmania major ou de malaria,
perte concomitante des réponses de type 1 et 2 en cas de déplétion en cellules productrices
d’EL-4.
Un ensemble de travaux (revus dans [Perussia and Loza 2003]) ont mis en évidence que si la
plupart des lymphocytes T et NK du sang périphérique sont de phénotype ThO, une petite
population est de profil Thl (produisant de l’IFN-y) tandis qu’une autre est de profil Th2
(produisant essentiellement de l’IL-13). La sous-population de type 2 est de profil immature
38
et prolifère en lymphocytes de type 2 en réponse à l’lL-2 ou riL-4. Par contre, en réponse à
une stimulation par l’IL-12, ces lymphocytes évoluent vers un type 0 (IL-13 low et IPN-y low)
et ensuite vers un type 1 (IFN-y high).
Après stimulation via le TCR, les cellules évoluent selon les conditions vers une prolifération
suivie de mort cellulaire ou directement vers une mort cellulaire programmée. Dans ces deux
conditions, on observe une production d’IL-10. Cette évolution vers la mort cellulaire des
lymphocytes de type 1 stimulés via leur TCR est inhibée par TIL-4 [Loza and Perussia 2002],
contrôlée par les cytokines provenant des APC (IL-12, IL-18, IFN-y), et accélérée par
l’engagement du TCR ou des récepteurs de surface des NK pour ces derniers. La plupart des
lymphocytes de type 2 résident probablement dans la moelle osseuse pour les NK et dans le
thymus pour les lymphocytes T. Il est intéressant de noter que les lymphocytes de type 2
produisent de grandes quantités de cytokines qui activent une série de composants de
l’immunité non spécifique (tels que les éosinophiles, les mastocytes, les basophiles).
Il apparaît ainsi que les lymphocytes T de type 2 pourraient jouer un rôle important dans
l’initiation de la réponse immune. Ce serait dans un second temps que les cellules NK et les
lymphocytes T se différencieraient vers le type 1 en réponse aux IFN-y, EL-12 et IL-18.
Alors qu’initialement on supposait que la différenciation de cellules naïves en lymphocytes de
type Th2 nécessitait la présence préalable d’IL-4 produite par exemple par des mastocytes,
des travaux plus récents ont mis en évidence que des lymphocytes CD4-I- peuvent se
différencier en producteurs d’IL-4 même en l’absence d’IL-4 ou de stimulation par le
récepteur à l’IL-4. Si certains parasites orientent activement la différenciation vers un profil
Th2, il semble que la présence de ces « adjuvants Th2 » ne soit pas indispensable. La voie
Th2 pourrait donc être considérée comme la voie par défaut en l’absence de constituants
microbiens capables d’orienter la réponse vers un profil Thl. Dans d’autres modèles, il
apparaît effectivement que la réponse immune obtenue par le blocage des TLR est de type
Th2 [Jankovic et al 2002].
Par contre, la différenciation vers le profil Th2 semble dépendante des molécules
costimulatrices et en particulier de la liaison B7-CD28. En effet, le blocage de cette liaison
annihile la réponse Th2 tout en maintenant une certaine réponse Thl dans des modèles
d’infections helminthiques [Jankovic et al. 2001].
La dépendance de la réponse Th2 aux molécules costimulatrices pourrait expliquer en partie
l’hypothèse selon laquelle la réponse Th2 serait favorisée en présence d’une quantité élevée
39
d’antigènes. Dans ces conditions, un grand nombre de lymphocytes seraient stimulés, y
compris les lymphocytes dont le TCR n’aurait qu’une affinité réduite pour l’antigène. La
réponse Thl est associée aux lymphocytes T exprimant un TCR de haute affinité pour
l’antigène, haute affinité dont le rôle prépondérant apparaît en cas de faible concentration
antigénique (revu dans [Jankovic et al 2001]). Notons enfin que l’avidité des peptides pour le
MHC influence également la balance Thl/Th2, dans le sens d’une induction d’un profil Thl
par l’augmentation de l’avidité [Pfeiffer et al. 1995; Singh et al. 1998].
Considérés ensembles, ces différents éléments peuvent conduire au schéma suivant :
en présence de composants microbiens capables de stimuler les TLR, les cellules
dendritiques produisent d’importantes quantités d’IL-12 orientant les cellules naïves
CD4+ vers un profil de type 1,
en l’absence de composants activant les TLR, l’absence d’induction d’lL-12 induit une
réponse par défaut de type Th2, éventuellement favorisée par certains adjuvants Th2.
(3) Conséquences de la polarisation de la réponse lymphocytaire en type 1
et type 2
Divers études et modèles animaux ont mis en évidence que le succès dans l’élimination de
certains agents infectieux était dépendant de la nature de la réponse immune offerte par
l’individu. Ainsi, Leishmania major induit une réponse de type Thl chez les souris CBA/J, et
une réponse de type Th2, létale, chez les souris BALB/c.
Chez l’homme infecté p2ir Mycobacterium leprae, des lymphocytes Thl prédominent dans les
lésions de lèpre tuberculoïde et procurent une réponse immune efficace. Cette réponse est
accompagnée
d’une plus
grande
production
de cytokines
inflammatoires
d’origine
macrophagique telles que l’EL-ip et le TNF-a. Une réponse de type 2 prédomine dans la lèpre
lépromateuse et s’accompagne d’une immunité non efficace [Yamamura et al. 1991]. Par
contre, le nématode Trichuris mûris induit une réponse inefficace de type Thl chez les souris
sensibles et une réponse de type Th2 efficace chez les souris résistantes [Lise et al. 1992].
Dans de nombreux modèles d’infections helminthiques, une réponse Th2 est essentielle à
l'élimination ou au contrôle de l’infection [Cause et al. 2003].
40
1.2. Modulation de la réponse lymphocytaire
La mise en évidence de l’importance du type de réponse immune dans l’éradication du micro­
organisme infectieux justifie l’intérêt à identifier les paramètres impliqués dans l’orientation
de cette réponse.
Plusieurs éléments influencent la différenciation des lymphocytes vers l’un ou l’autre des
profils.
•
Les cytokines présentes au moment de la phase précoce de la réponse immune. Comme
mentionné plus haut, elles jouent un rôle important [Seder and Paul 1994]. Plusieurs
mécanismes déclenchent la réponse Th2 via l’induction préliminaire d’IL-4. Les sources
identifiées de cette EL-4 sont les basophiles et les lymphocytes T NK1+ [Seder et al. 1991;
Seder et al 1991; Yoshimoto and Paul 1994; Pearce and Reiner 1995]. La préexistence
d’une réponse d’un type donné semble empêcher l’expression de la réponse opposée. Ceci
est illustré notamment par l’influence que peut avoir chez l’animal la préexistence d’une
infection helminthique induisant un climat de type 2 sur les réponses de type 1 [Pearce et
al. 1991; Actor et al. 1993; Robinson et al. 2003]. Actor et al. ont ainsi induit une
diminution de la réponse Thl attendue au virus de la vaccine chez la souris préalablement
infectée par S. mansoni, et une diminution de la vitesse de clearance virale [Actor et al
1993]. L’IL-10 semble également jouer un rôle modulateur dans l’initiation de la réponse
immune. Dans une série d’infections virales, essentiellement causées par des virus à ARN,
dont le VIH, la production d’anticorps spécifiques induit une augmentation de la capacité
à infecter les macrophages qui semble corrélée à un effet facilitant sur la production d’EL10 par le biais de la liaison des anticorps aux récepteurs FcyR des macrophages (revu dans
[Suhrbier and Linn 2003]).•
•
Le délai écoulé par rapport à l’exposition à l’antigène. Dans plusieurs modèles
expérimentaux, une réponse initiale de type Thl est soit accompagnée soit suivie d’une
réponse Th2 [Sander et al. 1995; Bamard et al. 1996; Jiao et al. 2003]. Ce même
phénomène est retrouvé dans une étude de vaccination contre le VIH chez l’homme
[Evans et al. 1998b]. L’évolution au cours du temps du profil de la réponse pourrait être la
conséquence de l’évolution constatée dans le profil des cytokines produites par les cellules
41
dendritiques après stimulation, où l’on constate d’abord une production de cytokines de
type Thl suivie ensuite de cytokines de type Th2 [Langenkamp et al. 2000].
•
La fréquence à laquelle l’antigène est proposé. La répétition de l’exposition à l’antigène
est associée à une efficacité accrue dans la production d’anticorps spécifiques. Ceci est
peut-être la conséquence d’une orientation induite préférentiellement vers ime réponse de
type Th2.
•
Le niveau de maturation du système immunitaire. Le système immunitaire du nouveau-né
présente une immaturité relative. Parmi les déficits identifiés, on note une difficulté à
induire une réponse de type Thl et des réponses de type cytotoxique, en même temps que
l’on observe une réponse Th2 importante. On a également pu mettre en évidence une
diminution de la réponse des CD plasmacytoïdes du nouveau-né à une stimulation par les
CpG ODN [De Wit et al. 2003]. Parmi les conséquences de ces perturbations, on peut
citer l’absence de production d’IgG2 résultant de la non-maturation de la lignée des
lymphocytes B et induisant une sensibilité accrue à l’infection par les bactéries
encapsulées.
•
La quantité d’antigène présente. Plusieurs études ont suggéré que l’administration de
quantités élevées d’antigènes induit une réponse humorale, tandis que des doses plus
faibles induisent une réponse cellulaire [Constant and Bottomly 1997]. Il semble
cependant que non seulement la quantité d’antigène mais également sa capacité à être
dégradé par les APC et être présenté aux lymphocytes influencent cette réponse.•
•
La nature des APC, des ligands et des signaux coactivateurs utilisés influence l’orientation
de la réponse lymphocytaire [Gajewski et al. 1991; DeKxuyff et al 1992; Constant and
Bottomly 1997]. Par exemple, la présentation de KLH par des lymphocytes B chez des
souris BALB/c induit la production dTL-4, tandis que par des APC spléniques, c’est de
riFN-y qui est produit. De la même façon, selon le tissu lymphoïde à l’origine des
lymphocytes CD4+ utilisés, la production de cytokines est également modifiée [DeKruyff
et al
1992]. L’orientation préférentielle de l’antigène vers les scavenger receptors,
présents à la surface des macrophages, cellules dendritiques et lymphocytes B, a permis
de convertir une réponse de type Th2 en une réponse de type Thl dans un modèle murin
42
[Bhatia et al. 2002], L’originalité de ce dernier travail réside dans la modification
chimique de l’antigène (perte des groupes e-aminés par traitement par l’acide maléique à
pH 15) le rendant susceptible de devenir un ligand pour ces scavenger receptors. Ces
récepteurs orientent spécifiquement la réponse vers un profil de type Thl probablement
par le biais d’une augmentation de la densité des complexes peptides-MHC de classe II
[Abraham et al. 1995; Singh et al 1998].
•
Certains agents pharmacologiques diminuent la réponse immune. Outre les classiques
immunosuppresseurs, diverses molécules peuvent induire une diminution de la réponse
immune. C’est par exemple le cas de certaines molécules utilisées dans la prophylaxie
anti-malarique telles que la primaquine ou la chloroquine [Fryauff et al. 1997]. Ces
molécules inhibent la réponse à l’effet immunostimulant de produits dérivés de l’ADN
bactérien décrits ci-dessous, les CpG ODN [Manzel et al. 1999].
•
Les complexes antigènes - anticorps. Ceux-ci sont présents dans de nombreuses infections
chroniques. Ils pourraient induire une augmentation de la production de cytokines de type
2 au détriment de la production de cytokines de type 1 [Berger et al. 1996]. Par ailleurs, la
présence d’un taux élevé d’anticorps spécifiques induit une moins bonne réponse à une
nouvelle administration de l’antigène. La présence d’anticorps maternels chez le nouveauné est un facteur qui pourrait contribuer, par ce mécanisme, à la faible réponse immune de
celui-ci et au délai nécessaire à l’obtention d’une réponse vaccinale satisfaisante [Siegrist
2003; Glezen 2003].•
•
La nature de l’antigène. Chez des sujets atopiques, des clones dérivés de lymphocytes
spécifiques de Dermatophagoides pteronyssinus produisent d’abondantes quantités d’IL-4
mais peu d’EFN-y, tandis que des clones dérivés de lymphocytes des mêmes sujets
spécifiques d’antigènes bactériens tels que l’anatoxine tétanique ne produisent que de
1’IFN-y [Parronchi et al. 1991]. De même, des clones dérivés de sujets normaux
s’orientent vers un profil Thl lors d’une stimulation par le PPD, et Th2 lors d’une
stimulation par un antigène helminthique [Del Prete et al
1991]. Les mécanismes
responsables de cette orientation sont actuellement inconnus mais sont probablement
dépendants d’autres facteurs cités ci-dessus tels que par exemple le type de cellules
43
présentatrices utilisées préférentiellement [Liew et al. 1990], ou les récepteurs TLR mis
enjeu.
•
La voie d’administration de l’antigène. En particulier, le phénomène de tolérance orale
désigne l’absence de réponse systémique lors de l’administration par voie parentérale d’un
antigène préalablement administré par voie orale. Le mécanisme conduisant à cette
tolérance n’est pas cormu. Il est probable que le type de présentation aux APC et la
production locale de cytokines qui s’en suit participent à cette tolérance. En particulier, le
TGF-p, cytokine immimosuppressive, est produit en abondance au niveau de la lamina
propria du tube digestif De nombreuses études ont également démontré que, si une
réponse tant systémique que muqueuse est observée après immunisation par l’une ou
l’autre de ces deux voies, la réponse est beaucoup plus soutenue dans le temps dans le
compartiment qui a été utilisé comme porte d’entrée (revu dans [Esser et al 2003]).
L’immunisation par voie transcutanée fait également l’objet de recherches, par exemple
dans le cadre du développement d’un vaccin contre le RSV [Godefroy et al. 2003].
•
La conjugaison de l’antigène. La conjugaison d’antigènes polysaccharidiques à une
protéine porteuse permet de transformer une réponse T indépendante en une réponse T
dépendante et conduit à l’induction d’une mémoire immune et un shift vers des anticorps
protecteurs.•
•
La manipulation des épitopes. Agrégation d’épitopes, fusion à des protéines porteuses et
conjugaison avec d’autres protéines ont pour conséquence de permettre une augmentation
de leur immunogénicité (revu dans [Plotkin et al. 2002]).
•
rutilisation d’adjuvants. Le rôle des adjuvants est développé ci-dessous.
La manipulation thérapeutique de la balance Thl / Th2, quoique séduisante, doit être
envisagée
avec
prudence.
L’hypothèse
dite
« hygiénique »
suggère
en
effet
que
l’augmentation de maladies atopiques dans les pays développés pourrait trouver son origine
dans une diminution de l’exposition aux antigènes bactériens environnementaux. Cette
diminution aurait elle-même pour conséquence d’orienter la réponse immune vers un profil
Th2. De récents éléments contredisent cependant cette hypothèse. En effet, l’augmentation
44
constatée d’allergies médiées par la voie Th2 est corrélée à celle de maladies auto-immunes
de type Thl telles que le diabète [Stene and Nafstad 2001] ou les maladies inflammatoires
digestives [Sawczenko et al. 2001]. Il apparaît donc plus probable qu’une déficience générale
de la régulation immune explique cette constatation. Quoiqu’il en soit, l’association dans le
temps entre la réduction de l’incidence d’infections et l’augmentation de l’incidence de
maladies allergiques et auto-immunes dans les pays développés d’une part et certains
éléments démontrant un effet protecteur de l’infection sur certaines maladies auto-immunes
comme revu dans [Bach 2002] d’autre part, ouvrent le champ à d’autres perspectives dans le
domaine de l’immunomodulation. Des éléments tant in vitro qu’in vivo suggèrent que
l’exposition contrôlée à certains antigènes bactériens pourrait contribuer à maîtriser certaines
réponses atopiques
[Pochard et al.
2002; Kalliomaki
et al.
2003].
Par exemple,
l’administration de Lactobacillus rhamnosus à des jeunes enfants à risque atopique a induit
une réduction de l’incidence d’eczéma atopique.
En se plaçant dans la perspective d’une différenciation linéaire plutôt que branchée des
lymphocytes de type 1 et 2, les concepts de manipulation des profils de réponse immune
doivent être revus. Il apparaît alors que toute tentative de développement d’une CTL doit
passer par le maintien d’une réponse de type 2 (par exemple en maintenant une stimulation
par de petites doses d’antigènes et en l’associant à l’utilisation d’adjuvants inflammatoires).
Par contre, dans les cas où une CTL est inutile ou non souhaitée (vaccination contre une
toxine ou un pathogène extracellulaire), une dose élevée de l’antigène avec un adjuvant peu
inflammatoire (de type aluminium) se révélerait une bonne solution. C’est sur ce dernier
modèle qu’ont été conçus empiriquement un certain nombre de vaccins réputés pour leur
efficacité, comme ceux dirigés justement sur les toxines diphtériques et tétaniques.
1.3. Réponse vaccinale, immunomodulation pharmacologique et adjuvants
1.3.1. Les différentes catégories de vaccins
Parmi les vaccins utilisés en clinique humaine, on distingue actuellement les catégories
suivantes ;
45
Vaccins tués ou inactivés : préparation de micro-organismes viraux ou bactériens qui en
prineipe ont conservé leurs déterminants antigéniques lors du processus, le plus souvent
chimique, de désactivation. La réponse immune obtenue est typiquement de nature
humorale et peut donc être mesurée par le titrage des anticorps. La non-réplication de
l’agent vaccinal a longtemps été considérée comme impliquant l’incapacité à induire une
réponse cellulaire efficace.
Vaccins conjugués ; ces vaccins sont destinés à induire ime réponse efficace contre les
polysaccharides de la paroi de micro-organismes encapsulés tels que Hemophilus
influenzae ou Streptococcus pneumoniae. En effet, les antigènes polysaccharidiques sont
capables d’induire une réponse immune T indépendante en stimulant directement les
lymphocytes B. En l’absence de contribution des lymphocytes T helper, cette réponse se
limite cependant à la production d’immunoglobulines de moindre affinité et de demi-vie
plus courte. L’importante morbidité et mortalité des infections provoquées par ces
bactéries encapsulées dans la population des jeunes enfants a justifié le développement de
vaccins dans lequel le polysaccharide de paroi est conjugué à une protéine porteuse ayant
déjà été administrée à la population vaccinée, telle que l’anatoxine tétanique ou
l’anatoxine diphtérique. Cette conjugaison entraîne l’induction d’une participation des
lymphocytes helper générant à la fois des IgG et une mémoire immune. L’apparition de ce
type de vaccin a largement contribué à la réduction de la morbidité induite par les
infections à Hemophilus influenzae.
Vaccins subunitaires : ces vaccins, dont le prototype est celui de l’hépatite B, sont
produits le plus souvent par clonage de l’ADN de l’antigène vaccinal dans une espèce
bactérienne ou fungique. Ils ont l’avantage de garantir la pureté de la préparation
antigénique et la sécurité du vaccin par rapport aux préparations plus anciennes. Ils
n’offi'ent cependant aucune amélioration sur la réponse immune obtenue par rapport à
l’administration de l’antigène extrait directement d’une préparation du micro-organisme
entier.
Vaccins vivants atténués : l’atténuation de la souche vaccinale est le plus souvent obtenue
par culture sur des lignées cellulaires non humaines. Ces vaccins offrent l’énorme
avantage de reproduire à faible intensité la maladie naturelle. La réponse immune obtenue
est en général de bien meilleure qualité que la réponse obtenue par les vaccins tués. Elle
46
ne requiert en général que peu ou pas de rappel - quoiqu’un rappel de vaccin RRO
(rougeole - rubéole - oreillons) soit actuellement recommandé au vu d’une réponse
insuffisante obtenue par l’administration d’une seule dose - et induit une réponse
cellulaire. La capacité résiduelle de l’agent vaccinal à se répliquer oblige à la plus grande
prudence chez les patients immunodéprimés et conduit à une réévaluation régulière de la
balance coût - bénéfice par rapport au vaccin tué. C’est ainsi que le risque de poliomyélite
vaccinale dépasse désormais le risque de poliomyélite par la souche sauvage. Ce vaccin
atténué a donc été éliminé de l’arsenal vaccinal au profit du vaccin tué, peut-être moins
immunogène mais plus sûr. Actuellement, tous les vaccins vivants atténués sont associés à
un risque de réversion vers le type sauvage, avec le risque de développement de la
maladie dans toute son ampleur et de la transmission secondaire à d’autres sujets.
A ces différentes catégories s’ajouteront également dans le futur les vaccins à ADN, où
l’administration directe d’ADN sous l’une ou l’autre forme permet d’induire la production du
peptide correspondant et l’initiation de la réponse immune, et les vaccins orientés sur des
protéines chimériques associant plusieurs épitopes sélectionnés pour leurs propriétés
immunogènes.
1.3.2. Immunomodulation en vaccinologie - les adjuvants
Il existe de nombreuses possibilités de modifier le type de réponse vaccinale induite en jouant
sur l’un ou l’autre des paramètres évoqués précédemment. Cette réponse varie par exemple
selon la capacité de l’agent vaccinal à se répliquer (vaccins vivants atténués versus inactivés),
la structure des substrats antigéniques utilisés (polysaccharides, protéines recombinantes,
ADN,..), la voie d’administration, mais elle dépendra surtout de l’adjonction d’adjuvants. En
effet, la plupart des antigènes ne sont que faiblement immunogènes s’ils sont administrés
seuls. Plusieurs adjuvants ont été testés en médecine depuis la première démonstration de leur
utilité sur la production d’antitoxines anti-diphtériques et anti-tétaniques en 1925. Les
composés à base d’aluminium ont été longtemps les seuls adjuvants autorisés par la Food and
Drug Administration. Efficaces pour la production d’anticorps, ces différents dérivés sont
cependant de médiocres adjuvants pour la génération d’une réponse cellulaire. On distingue
les
composés
suivants;
l’oxyhydroxyde
d’aluminium
[AlOOH],
l’hydroxyphosphate
d’aluminium, où, au départ du précédent, un certain nombre de groupes hydroxyles sont
47
substitués par des groupes phosphates, et le sulfate d’aluminium potassium [AlK (804)2]
(alun). L’adsorption des antigènes repose sur l’attraction électrostatique que l’on peut
optimaliser en choisissant un adjuvant dont le point isoélectrique est opposé à celui de
l’antigène au pH désiré. L’activité biologique des adjuvants à l’aluminium est liée à la
formation d’un dépôt permettant une exposition prolongée de l’antigène. La production
d’antigènes particulaires facilite la présentation aux APC et l’activation du complément ainsi
que la stimulation des macrophages. Il est probable que les adjuvants à l’aluminium soient de
surcroît capables de stimuler directement les APC, peut-être par une voie indépendante des
TLR car un déficit en MyD88 n’inhibe pas cet effet [HogenEsch 2002]. Les sels d’aluminium
ont été incriminés comme agents étiologiques de la myofasciite macrophagique, entité
caractérisée par un tableau de myalgies chroniques attribuées pour certains à une stimulation
immune persistante de type Th2 au niveau musculaire [Gherardi 2003]. Ce tableau
nosologique reste cependant contesté dans sa réalité, et, en l’absence de démonstration de
relation de causalité, ni l’OMS ni la FDA n’ont remis en question la place des sels
d’aluminium [WHO Vaccine Safety Advisory Committee 1999]. Notons que certains
adjuvants à l’aluminium, en fonction de leur point isoélectrique, sont capables de détoxifier
l’endotoxine par liaison covalente avec les phosphates de celle-ci [Shi et al. 2001].
On admet actuellement que les propriétés biologiques d’un adjuvant sont fonction de sa
capacité à orienter la réponse immune vers l’un ou l’autre profil. Ainsi, les sels d’aluminium
orientent la réponse vers un profil Th2 tandis que l’adjuvant complet de Freund l’oriente vers
un profil Thl [Audibert and Lise 1993]. L’adjuvant complet de Freund, émulsion Huile / Eau
contenant des mycobactéries, est un puissant adjuvant dont les effets secondaires rendent
l’utilisation proscrite en clinique. L’adjuvant incomplet de Freund (émulsion Huile / Eau sans
mycobactéries), est lui aussi associé à des effets secondaires importants qui contre-indiquent
son utilisation clinique [Gilbert et al. 2003]. D’autres émulsions contenant des muramyldipeptides (sous-unités de la paroi des mycobactéries) sont en cours de développement.
Selon leur origine, quatre catégories de produits adjuvants peuvent être définies: origine
végétale (saponine, glucan,..), origine bactérienne (toxine cholérique, lipopolysaccharides,..),
origine chimique (hydroxyde d’aluminium, émulsions,..), et origine humaine (IFN-y, DHEA,
GM-CSF,..).
48
Selon leur mode d’action cette fois, on peut répartir les adjuvants en deux catégories. Une
première catégorie regroupe ceux qui facilitent la présentation de l’antigène en optimalisant la
durée de la délivrance aux cellules présentatrices ou la qualité de cette délivrance. On retrouve
dans cette catégorie les adjuvants particulaires, les copolymères, etc.
Une deuxième catégorie d’adjuvants regroupe l’ensemble des produits qui génèrent un signal
du « non-soi » via les PRR. Cette catégorie regroupe notamment le LPS, les lipoprotéines, les
peptidoglycans, les CpG ODN et leurs dérivés. Ils sont repris ci-dessous sous le terme
d’adjuvants immunostimulateurs.
1.3.3. Adjuvants immunostimulateurs
Ceux-ci sont caractérisés par leur capacité à stimuler la production de cytokines et l’activation
des lymphocytes.
Le LPS est un puissant immunostimulateur mais sa toxicité le rend inutilisable dans cette
indication. Des modifications de la structure du LPS induisent la perte de l’activité
endotoxine, telle que mesurée par le LAL {Limulus amoebocyte lysate assay), tout en
conservant des capacités adjuvantes. Un mutant de N. meningitidis produisant un LPS à 5
chaînes acylées induit beaucoup moins de TNF-a tout en conservant des capacités adjuvantes
tandis qu’un autre possédant 4 radicaux acylés perd en outre les capacités adjuvantes [van der
Ley et a/. 2001].
Certains dérivés tels que l’OM-174, un analogue du Lipide A de Escherichia coli triacylé au
lieu de la composition hexa-acylée de la molécule naturelle, sont capables d’induire une
production importante de cytokines sans induire d’effet endotoxine [Brandenburg et al. 2000].
On trouve ici également les dérivés du LPS tels que le MPL {monophosphoryl lipid A). Celuici peut générer une réponse de type Thl [Gustafson and Rhodes 1992]. Par contre, sa capacité
à induire la production d’anticorps reste réduite. Il a été testé en combinaison avec différents
constituants tels que liposomes, émulsions, alun ou QS21 (dérivé saponique) et a été
administré chez l’homme avec succès dans un vaccin contre l’hépatite B en induisant une
réponse immune plus rapide (deux doses au lieu de trois) que l’Engerix-B’^^ utilisé comme
contrôle [Thoelen et al. 1998].
Les
saponines
composent
un
second
groupe
de
molécules
immunomodulatrices
(triterphénoides glycosides dérivés de Quillaja saponaria). Le QS21 induit également la
49
production de cytokines Thl (IL-2 et IFN-y) ainsi que d’anticorps de type IgG2a [Kensil
1996]. Les saponines ont pour effet d’induire des modifications au niveau de la paroi
cellulaire en interférant avec les molécules de cholestérol. Il en résulte l’apparition de pores
qui pourraient peut-être favoriser la pénétration des antigènes au niveau cytoplasmique.
L’ADN
bactérien
a
également
un
effet
immunostimulateur.
En
particulier,
des
oligodéoxynucléotides (ODN) d’origine bactérienne, les CpG, semblent extrêmement
prometteurs. Il s’agit d’oligodéoxynucléotides dérivés de
l’ADN monocaténaire des
procaryotes contenant un profil particulier de dinucléotides Cytosine-phosphate-Guanosine
non méthylés. Les CpG ODN agissent au niveau du TLR9 [Hemmi et al. 2000]. Par cette
voie, ils ont la capacité d’activer la réponse immune en induisant notamment la synthèse
d’immunoglobulines, la prolifération des lymphocytes B, la production d’BL-12 et d’IFN-a
par les monocytes, la maturation des CD, l’expression des molécules MHC de classe II et des
CD40, CD54 et CD86 [Hartmann et al. 1999; Sester et al. 1999; Hartmann et al 1999]. Les
CpG ODN sont capables de modifier le type de réponse immune en provoquant un shift d’une
réponse Th2 à une réponse Thl au point de supprimer la production d’IgE en faveur des IgG
et IgM au départ de PBMC de sujets atopiques [Bohle et al. 1999; Jahn-Schmid et al. 1999;
Parronchi et al. 1999]. Ils peuvent également reconstituer une réponse CTL chez des animaux
dépourvus de fonction T helper par déplétion de leurs lymphocytes CD4+ [Wild et al. 1999],
ou même stimuler des lymphocytes en l’ahsence d’APC [Bendigs et al. 1999]. Les CpG ODN
ont été utilisés avec succès pour induire une réponse de type Thl lors d’une stimulation par la
gpl20 de souris en association avec l’alun, alors que typiquement une réponse de type Th2
était notée en l’absence de CpG [Demi et al. 1999], ou encore dans un modèle de vaccination
animale par la protéine gpl20 du VIH-1 [Moss et al. 2000].
Dans un modèle de vaccination contre l’hépatite C, si les CpG ODN ont permis une
augmentation de la réponse humorale, ils n’ont induit cependant aucun effet sur la réponse
cellulaire [Encke et al. 2003].
Des séquences contenant des oligodéoxynucléotides de type CpG capables d’activer les
macrophages et les lymphocytes B ont été identifiées dans le génome de plusieurs souches de
virus Srv et VIH [Lapatschek et al. 1998]. Le rôle éventuel de ces séquences dans l’activation
du système immunitaire qui caractérise l’infection par le VIH est actuellement inconnu.
Parmi les dérivés immunostimulateurs, des dérivés synthétiques de type phosphoantigène sont
capables, via la stimulation des lymphocytes yô (Vy9A^ô2T) d’induire la stimulation des CD
50
[Ismaili et al. 2002a]. Enfin, parmi les substances immunomodulatrices, on trouve les
chémokines et les cytokines. Parmi celles-ci, les EL-1, IL-2, EFN-y, IL-12, et le GMC-SF ont
fait l’objet d’investigations. Les capacités adjuvantes de l’IL-12 ont été particulièrement
étudiées (revu dans [Portielje et al. 2003]). Les cytokines possèdent des effets secondaires liés
à la dose, et diverses autres caractéristiques telles que leur courte demi-vie les rendent peu
attractives comme adjuvants, en particulier pour une administration par voie systémique.
1.3.4. Adjuvants particulaires et copolymères
Les adjuvants particulaires sont caractérisés par une dimension comparable à celle des micro­
organismes infectieux. Ils sont donc des cibles naturelles à la captation par les cellules
présentatrices d’antigènes. Une émulsion Huile / Eau, le MF59, a été ainsi testée comme
adjuvante d’antigènes tels que ceux du virus influenza, de l’hépatite B, d’antigènes
polysaccharidiques, d’antigènes des virus VIH, HSV, CMV. Le MF59 est d’ailleurs
l’adjuvant d’un vaccin anti-influenza commercialisé en Europe, le Fluad ™ (Chiron Vaccines,
Sienne, Italie). Ce vaccin pourrait être plus immunogène que les vaccins contre la grippe
utilisant des adjuvants conventionnels [Banzhoff et al. 2003]. Des liposomes ont également
été testés comme vecteurs d’antigènes ou d’adjuvants immunostimulateurs tels que le MPL.
Enfin, des structures complexes combinant un vecteur et un immunomodulateur sont
également en développement. C’est le cas par exemple des Immunostimulating eomplexes
(ISCOMS). Ces ISCOMS sont des micelles obtenues par la combinaison de cholestérol avec
des saponines telles que le Quil-A. La structure micellaire permet de réduire les effets
hémolytiques associés aux saponines.
Dans cette catégorie, on peut également citer les virus like partiales (VLP), les
polylactidecoglycolides (PLG) et autres microsphères préparées à partir de polymères
biodégradables et biocompatibles [Zhou et al. 2003], et les copolymères [Hunter 2002].
1.4. Réponse vaccinale à l’administration par voie muqueuse et modulation de
l’immunité muqueuse
Les lymphocytes activés circulant au niveau des intestins sont porteurs à leur surface d’une
molécule d’adhérence caractéristique, l’intégrine a4p?. Après exposition à un antigène
51
administré par voie orale, la toute grande majorité des lymphocytes B et T activés, suite à
l’expression préférentielle de cette intégrine, rejoignent la lamina propria intestinale par le
biais d’une adhésion préférentielle aux cellules endothéliales de ce territoire [Kantele et al.
1999], tandis que les autres rejoignent les autres sites muqueux tels que par exemple les
muqueuses respiratoires. Ce phénomène contribue à la présence d’un compartiment
fonctionnel lymphoïde séparé, le MALT {mucosal associated lymphoid tissué).
Ce compartiment suscite beaucoup d’intérêt dans la mesure où de nombreux agents infectieux
tels le VIH ou les agents responsables d’infections respiratoires, digestives et urinaires
utilisent une porte d’entrée muqueuse [Smith et al. 2003]. La circulation des lymphocytes
entre les sphères respiratoires et digestives offre en outre l’opportunité d’administrer par voie
orale des vaccins orientés vers la prévention d’infections respiratoires. De surcroît, la qualité
de la réponse immune muqueuse induite par voie muqueuse est meilleure qu’après induction
par voie systémique (revu dans [Berzofsky et al 2001]). C’est le cas par exemple dans un
modèle de vaccination contre le VIH 1 par un vaccin ADN associé à l’adjuvant QS-21 [Sasaki
étal. 1998].
Divers produits d’origine bactérienne ainsi que des cytokines ont été étudiés pour leur
capacité adjuvante lors d’une administration par voie muqueuse [Holmgren et al. 2003].
Un petit nombre de molécules d’origine bactérienne ont la propriété d’être hautement
immunogènes par contact avec les cellules muqueuses (les mucosal immunogens). Parmi
celles-ci, la toxine cholérique et la toxine heat labile de Escherichia coli (LT).
L’immunisation vis-à-vis d’un antigène protéique administré par voie orale est largement
améliorée par la co-administration de toxine cholérique et induit sélectivement une réponse de
type Th2 au niveau des muqueuses. Des dérivés non toxiques de ces molécules sont en cours
de développement [Jakobsen and Jonsdottir 2003]. Les différents dérivés induisent des
réponses immunes différentes mais la persistance d’un effet adjuvant semble nécessiter la
conservation de la capacité à induire la production d’AMP cyclique [Cheng et al. 1999].
L’induction de la production d’IL-12 est plus constante avec la toxine cholérique qu’avec la
toxine LT. De même, l’administration intranasale d'enterotoxines modifiées induit une
réponse immune locale aux antigènes associés [Kanellos et al. 2000; Pizza étal. 2001].
Les cytokines peuvent également être utilisées comme adjuvant pour une administration par
voie muqueuse. En effet, cette administration ne s’accompagne pas des effets secondaires
associés à l’administration par voie parentérale. L’administration intranasale d’IL-12 induit
une production systémique d’IL-12 et d’IFN-y (revu dans [Boyaka and McGhee 2001]),
52
tandis que l’IL-6 et riL-12 ont été administrées avec succès en adjuvant de la toxine tétanique
ou de l’antigène H INI du virus influenza. Enfin, les CpG ODN administrés par voie orale ou
intranasale sont également efficaces comme adjuvants [McCluskie and Davis 1998; Holmgren
et al 2003],
Au-delà de l’approche vaccinale classique, plusieurs préparations à base d’extraits bactériens
ont fait la preuve de capacités immunomodulatrices lors d’une administration orale.
Parmi ces préparations, l’OM-85 BV (Bronchovaxom™, OM-Pharma, Genève) est un extrait
lyophilisé obtenu par la lyse alcaline de huit micro-organismes de la flore commensale
responsables d’infections respiratoires : Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae,
Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozonae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
Moraxella catarrhalis et Streptococcus viridans. Des études in vitro et in vivo ont mis en
évidence la capacité de cet extrait à stimuler les lymphocytes T [Maestroni and Losa 1984],
activer les lymphocytes NK [Wybran et al. 1989], induire l’expression de molécules
d’adhésion à la surface des cellules phagocytaires [Duchow et al. 1992], induire la production
d’BL-6 et d’EL-8 [Keul et al. 1996] et induire l’augmentation de la concentration d’EFN-y
bronchoalvéolaire [Emmerich et al. 1990; Emmerich et al. 1992], L’administration orale
d’OM-85 BV à des rongeurs augmente la production d’IL-ip, de TNF-a et d’oxyde nitrique
au niveau des macrophages alvéolaires ainsi que la production d’IgG au niveau du sérum et
de la salive [Brough-Holub and Kraal 1996; Arafat et al. 1996]. L’OM-85 BV induit la
maturation des cellules dendritiques humaines [Zelle-Rieser et al. 2001], est capable, par
administration orale, d’induire un shift d’un profil de réponse Th2 vers un profil Thl chez des
rats nouveau-nés [Bowman and Holt 2001], et induit une augmentation de la concentration
sérique d’IgG et d’IgA dans une étude ouverte réalisée chez de jeunes enfants
hypogammaglobulinémiques [Quezada et a/. 1999].
Une revue exhaustive de la littérature clôturée en décembre 2003 identifie 38 études cliniques
orientées principalement sur l’effet de l’administration de l’OM-85 BV sur l’incidence
d’infections respiratoires. Huit études contrôlées en double aveugle à l’aide d’un groupe
placebo réalisées chez des patients adultes atteints de bronchite chronique [Cvoriscec et al.
1989], de jeunes enfants [Paupe 1991; Collet et al. 1993; Gutierrez-Tarango and Berber 2001;
Schaad et al. 2002; Rio-Navarro et al. 2003], des patients hémodialysés [Tielemans et al.
1999] ou des patients âgés institutioimalisés [Orcel et al. 1994] ont conclu à une diminution
significative de l’incidence d’infections respiratoires dans le groupe traité par l’OM-85 BV.
53
Une seule des études conduites en double aveugle, réalisée chez des patients bronchiteux
chroniques, n’a pas pu mettre en évidence d’effet de l’OM-85 BV sur l’incidence
d’exacerbation de l’affection mais a démontré une diminution du recours à l’hospitalisation et
de la durée de celle-ci [Collet et al. 1997]. Deux études pharmaco-économiques ont conclu
récemment à un rapport coût - bénéfice favorable à l’administration d’OM-85 BV tant chez
des adultes que des enfants à risque d’infection respiratoire [Collet et al. 2001; Pessey et al.
2003], L’usage clinique de l’OM-85 BV ne fait pas l’objet d’un consensus actuellement. Chez
les patients atteints de bronchite chronique, sur base des données de la littérature exposées cidessus, le consensus GOLD {Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease) de 2001
et la mise à jour de 2003 en cours de publication proposent un niveau d’évidence B (« études
randomisées contrôlées, nombre d’études limité »), identique à celui retenu pour la
vaccination anti-pneumococcique [Pauwels et al. 2001].
La même approche de modulation de la réponse immune au niveau de la sphère urinaire a
conduit à l’élaboration d’une préparation contenant l’extrait lyophilisé de 18 souches
û'Escherichia coli, l’Uro-Vaxom™. Cette préparation a fait l’objet de plusieurs études in
vitro qui ont également mis en évidence ses effets immunomodulateurs : prolifération des
lymphocytes, production d’lL-6, d’IL-2 et de TNF-a. Elle induit également la maturation des
CD [Schmidhammer et al. 2002]. Plusieurs études contrôlées par placebo ont mis en évidence
l’effet préventif de cet extrait bactérien sur l’incidence d’infections urinaires (revu dans
[Bauer et al. 2002]). Cette préparation contient des HSP baetériennes (HSP60 et HSP70) qui
jouent certainement un rôle dans ses propriétés immunomodulatrices [Polla et al. 1995;
Sedelmeier and Bessler 1995; Bloemendal et al. 1997; Wendling and Farine 1998].
Ces exemples soulignent l’intérêt de la modulation de la réponse immune au niveau des
muqueuses comme approche préventive des infections.
54
2.
Objectifs du travail
Notre objectif a été de développer l’analyse de la production de cytokines à l’échelon
cellulaire afin de l’appliquer à la réponse immune au cours de l’infeetion par le VIH et à la
caractérisation de l’effet d’adjuvants vaccinaux naturels et synthétiques.
Premier objectif
Déterminer la nature de la réponse vaccinale résiduelle à un antigène protéique chez des
patients infectés par le VIH et la comparer à la réponse à une stimulation polyclonale. Le
vaccin étudié est l’anatoxine tétanique. La caractérisation de la réponse immune est réalisée
au niveau cellulaire par l’énumération des cellules productrices de cytokines.
Cette approche permet :
•
la détermination de la réponse résiduelle en fonction du stade d’évolution de la maladie,
•
la détermination de la capacité de réponse secondaire lors d’une nouvelle exposition à
l’antigène choisi.
Deuxième objectif
Mettre à profit les méthodes d’investigation de la production de cytokines à l’échelon
cellulaire pour préciser le mode d’action d’un agent
immunomodulateur d’origine
bactérienne, l’OM-85 BV et mesurer l’effet de cet agent in vitro sur les lymphocytes du sang
circulant de sujets sains et de patients infectés par le VIH.
Troisième objectif
Evaluer par ces mêmes techniques la capacité adjuvante d’un analogue synthétique du LPS,
rOM-197, dans un modèle de réponse primaire in vitro à un antigène viral protéique,
l’antigène HBs du virus de l’hépatite B.
55
3.
Matériel et méthodes
3.1. Analyse de la production de cytokines à l’échelon cellulaire par ELISPOT
Nos travaux sont essentiellement basés sur le développement et l’utilisation de la technique
ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay), qui permet l’énumération des cellules
productrices de cytokines en réponse à une stimulation spécifique ou non spécifique.
Le principe et les étapes principales de cette technique sont illustrés dans la figure suivante
(figure 4). Brièvement, un anticorps dirigé contre la cytokine à détecter est adsorbé sur les
membranes en nitrocellulose de la plaque de culture (anticorps de capture). Les sites restés
libres sont ensuite bloqués à l’aide de sérum de veau. La suspension cellulaire est déposée
dans les puits pour une durée variable selon la cytokine investiguée. La cytokine est captée
par l’anticorps adsorbé sur la nitrocellulose dès qu’elle est produite, c’est-à-dire à proximité
immédiate du corps cellulaire. Après incubation, les cellules sont éliminées et un second
anticorps spécifique d’un autre épitope de la cytokine est incubé. Ce second anticorps est
couplé à la biotine. Dans le temps suivant, de l’extravidine couplée à une peroxydase se lie au
deuxième anticorps. Un substrat chromogénique (le 3-amino-9-ethylcarbazole [AEC]) est
ensuite ajouté. La réaction chromogène fait apparaître des spots colorés correspondant pour
chacun d’entre eux à l’empreinte d’une cellule productrice. Les spots sont ensuite comptés au
binoculaire, et le nombre de cellules énumérées est rapporté au nombre de cellules incubées.
Chacun des puits des plaques utilisées dans nos travaux (MAJHLAN 4550, Millipore ™) peut
contenir un maximum de 200.000 à 400.000 cellules. Selon le stimulus utilisé et la fenêtre de
résultats attendus, une combinaison de dilutions différentes permet de compter le nombre de
cellules productrices. Les résultats sont ensuite rapportés par million de cellules.
56
Figure 4 : Illustration de la technique d’ELISPOT
57
3.2. Mise au point de ia technique d’ELiSPOT appiiquée à i’énumération des
ceiiuies productrices de cytokines
3.2.1. Cinétique de la production de cytokines après stimulation in vitro
Nous avons observé que de nombreux paramètres influencent la sensibilité de la technique
d’ELISPOT appliquée à l’énumération des cellules productrices de cytokines. Pour
déterminer les conditions optimales pour cette énumération, des PBMC de sujets contrôles ont
été stimulés soit de façon non spécifique (PHA, PMA-ionomycine, anti-CD28) soit par de
l’anatoxine tétanique. Les PBMC ont été pré-incubés en tube de polypropylène à 37% en
présence de CO2 et ensuite placés en plaque d’ELiSPOT. Différentes combinaisons de durées
d’incubation en tube et en plaque ont été comparées. Les cinétiques observées sont très
différentes d’une cytokine à l’autre comme illustré pour la durée de préincubation en tube
(figure 5).
Pour la détection de cellules productrices d’IFN-Y, la combinaison d’une préincubation de 72
heures en tube de polypropylène suivie de 24 heures d’incubation dans la plaque d’ELiSPOT
a été retenue comme optimale pour les stimulations polyclonales et spécifiques.
Pour la détection de cellules productrices d’IL-4, vu l’absence de couple d’anticorps identifié
performant pour l’ELISPOT en stimulation antigénique, plusieurs couples d’anticorps ont été
comparés (Medgenix ™, Mabtech AB ™ et Pharmingen ™). Le couple retenu pour sa
sensibilité optimale comprend les anticorps suivants:
- Capture : anti-IL-4 clone 82-2 (lOpg/ml), Mabtech AB, Stockolm, Sweden.
- Détection : anti-IL-4 clone 12.1 (Ipg/ml), Mabtech AB, Stockolm, Sweden.
L’adjonction dans le milieu de culture d’un anticorps anti-récepteur de TIL-4 ou la
purification de sous-populations de lymphocytes par billes magnétiques n’ont pas augmenté la
sensibilité de TELISPOT à l’IL-4. Parmi les agents de stimulation polyclonale, diverses
combinaisons de PMA-ionomycine ou PMA et anti-CD28 ne se sont pas révélées supérieures
à la PHA. Les conditions d’incubation suivantes ont été retenues : 4 heures de préincubation
en tube, suivie de 48 heures d’incubation en plaque d’ELiSPOT.
58
Figure 5 : Détermination de la durée de préincubation optimale pour l’énumération de
cellules productrices d’IL-4 et d’IFN-y en réponse à une stimulation polyclonale
Cette figure illustre l'influence de la durée de préincubation des lymphocytes en présence de l’agent de stimulation en tube de
polypropyléne avant la mise en culture en plaque de nitrocellulose. Lors de 3 expérimentations représentatives, les PBMC de
donneurs de sang sont incubés en présence de phytohémagglutinine A (1 pg/ml) pendant 4, 24, 48 ou 72 heures en tubes de
polypropyléne à la concentration de 2 x 10® / ml avant d’être déposés en plaque d’ELISPOT pour 24 (IFN-y) ou 48 (IL-4) heures,
La durée optimale de préincubation en tube observée est de 4 heures pour l’IL-4 et de 72 heures pour l’IFN-y.
3.2.2. Cinétique de l’apparition de cellules productrices de cytokines au cours d’une
réponse vaccinale
Dans un premier temps, nous avons déterminé chez des volontaires sains précédemment
vaccinés contre la toxine tétanique le délai d’apparition de cellules productrices de cytokines
après l’administration d’un rappel de vaccin. Nous avons administré une dose de rappel
(Tevax
et récolté des PBMC de ces volontaires aux jours 0, 3, 7 et 21 après
l’admini.stration du rappel. L’énumération des cellules productrices de cytokines a été réalisée
par la technique ELISPOT décrite ci-dessus. Le maximum de cellules productrices d’IFN-'y
dans le sang circulant est atteint au jour 7 après le rappel (figure 6). Les prélèvements
sanguins ont ensuite été réalisés aux jours 0, 7 et 21.
59
Figure 6 : Cinétique de la réponse cellulaire à l’administration d’anatoxine tétanique
V)
0)
6000-,
.y O
5000O OQ
3
■D Q. 4000O (O
L. O
a ^
</) ~~ 3000_û)
Z Z 2000
0)
U
1000
O
Z
0
-
-
--
0
3
7
21
Délai après administration
d'anatoxine tétanique (jours)
Evolution du nombre de cellules productrices d’IFN-y par million de PBMC en fonction du délai écoulé par rapport à
l’administration d’un rappel de vaccination anti-tétanique chez 8 volontaires sains. Les rectangles représentent les interquartiles
et la médiane, et les barres horizontales supérieures et inférieures les valeurs extrêmes observées.
60
4.
Résultats
4.1. Analyse à l’échelon cellulaire de la réponse des cellules T spécifiques de
l’anatoxine tétanique chez des patients infectés par le VIH
Nous avons étudié par ELISPOT la production d’IFN-y et d’IL-4 des PBMC chez 10 patients
infectés par le VIH et 14 témoins. Tous avaient reçu antérieurement une vaccination
antitétanique complète. Les PBMC ont été isolés et stimulés in vitro soit par la PHA soit par
l’anatoxine tétanique. Les patients et les sujets contrôles ont ensuite reçu un rappel du vaccin
antitétanique et les PBMC ont été prélevés 7 et 21 jours plus tard.
Tandis que le nombre de cellules sécrétrices d’EFN-y en réponse à une stimulation par la PHA
n’était pas différent de celui des témoins chez les patients infectés, il était significativement
diminué en réponse à une stimulation par l’anatoxine tétanique tant avant qu’après
l’administration du rappel de vaccination. Des expérimentations sur des populations
lymphocytaires déplétées ont indiqué que la source principale d’IFN-y dans la réponse à
l’antigène tétanique était la population des lymphocytes CD4+. La différence observée entre
contrôles et sujets infectés par le VIH est donc le témoin d’un dysfonctionnement impliquant
les lymphocytes CD4+. En ce qui concerne la production d’EL-4, le nombre de cellules
sécrétant de l’IL-4 en réponse tant à une stimulation polyclonale qu’à la stimulation par
l’anatoxine tétanique était significativement abaissé chez les patients infectés par le VEH par
rapport aux témoins. La source principale d’IL-4 dans la réponse à la PHA et à l’antigène
tétanique était la population des lymphocytes CD4+. Ces observations sont également en
faveur d’un dysfonctionnement de la population des lymphocytes CD4+. En conclusion, la
sécrétion de cytokines tant Thl que Th2 en réponse à une stimulation antigénique spécifique
est réduite chez les patients infectés par le VIH. L’atteinte fonctionnelle des lymphocytes
CD4+ observée chez le patient infecté par le VIH entraîne donc une altération de la réponse
immune tant Tti2 que Thl.
[By\ et al 1999]
61
Cellular Immunology 192, 107-112 (1999)
Article ID cimm.1999.1462, available online at http://www,idealibrary.com on
IDEj^L®
Single Cell Analysis of Antigen-Specific T Cell Responses
in HIV-Infected Individuels^
Baudouin Byl,* t Michéle Gérard,! Myriam Libin,* Nathan Clumeck,!
Michel Goldman,* and Françoise Mascart*
* Department of Immunology and \ Department of Infectious Diseases, Hôpital Erasme, and t Department of Infectious Diseases,
Hôpital Saint-Pierre, Université Libre de Bruxelles, B-I070 Brussels, Belgium
Received September 14, 1998; accepted January 8, 1999
Antigen-specific and polyclonally induced T cell re­
sponses were analyzed in 10 HIV-infected individuals
and in 14 Controls by enumerating the nunibers of
tetanus toxoid (TT)-specific and phytohemagglutinin
(PHA)-induced IFN-y-secreting cells (SC) and IL-4-SC
using an enzyme-linked immunospot assay. Whereas
the numbers of IFN-y-SC in HIV-infected patients
were not different from those of the Controls in response to an in vitro stimulation with PHA, they were
significantly decreased in response to an in vitro stim­
ulation with TT, both before and after a TT booster.
Cell déplétion experiments indicated that this différ­
ence was related to an impairment of CD4* T-cellmediated
TT-specific
IFN-y
sécrétion.
Concerning
IL-4, the numbers of both polyclonally induced IL-4-SC
and TT-specific IL-4-SC were significantly lower in
HIV-infected patients than in the Controls. It is concluded that sécrétion of antigen-specific cytokines of
both Thl and Th2 types is depressed in HIV-infected
patients.
©
1999 Academie Press
INTRODUCTION
Infection of CD4^ T cells and antigen-presenting
cells with HIV results in a progressive loss of Thl-type
immune responses (reviewed in 1). The hypergammaglobulinemia commonly observed in AIDS patients,
sometimes associated with increased IgE sérum levels
and hypereosinophilia, led to the suggestion that T
cells preferentially secrete Th2-type cytokines in the
course of HIV infection (2). Although a dominant synthesis of IL-4 and IL-5 has been documented in CD8* T
cell clones generated from AIDS patients with a Joblike syndrome (3), the cytokine profile of CD4'^ T cells
' 1 his Work was partially presented at the Second European Con
ferenre on Experimental AIDS Research, Junc 1997, Stockholm,
Sweden (abstract 244), and was supported by the Fonds de la Re­
cherche Scientifique Médicale (Belgium) and the Fondation Erasme
(Hôpital Erasme, Bruxelles, Belgium).
in the course of HIV infection remains unclear. The
initial observation by Clerici et al. (4) of a defect in IL-2
production in response to recall antigens together with
a decreased production of IFN-y and an increased pro­
duction of IL-4 by phytohemagluttinin (PHA)-stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was
followed by several studies which failed to demonstrate
a Th2 shift (5, 6). Différences in the experimental settings used to evaluate the cytokine profiles of T cells
might explain these conflicting results. Thl/Th2 re­
sponses in HIV-infected individuals hâve so far only
been analyzed either after T cell cloning or upon poly­
clonal stimulation of peripheral blood T cells (4, 5, 711).
In the présent study, we used a sensitive enzymelinked immunospot (ELISPOT) technique to analyze at
the single cell level the sécrétion of IFN-y and IL-4 by
T cells stimulated by either PHA or tetanus toxoid
(TT). The TT-specific cytokine profile was further ana­
lyzed during an in vivo immune response induced by
the administration of a TT booster. We found that the
numbers of IFN-y-secreting cells (SC) in HIV-infected
individuals were normal after PHA stimulation but
dramatically decreased in response to TT. Cell déplé­
tion experiments indicated that this différence was
related to an impairment of CD4^ T-cell-mediated TTspecific IFN-y sécrétion. After an in vivo TT booster
dose, both TT-specific IFN-y-SC and IL-4-SC were diminished in HIV-infected subjects compared to Con­
trols.
MATERIALS AND METHODS
Subjects and Study Design
Ten HIV-infected patients (CDC classification: stage
A for 7 patients, B3 for 1, and C for 2) with a médian
age of 37 years (r ange: 28-53) and a médian CD4^ cell
count of 267/mm^ (range; 12-1224) and 14 healthy
volunteers with a médian age of 34 years (range: 2641) were included in the study after approval of the
0008-8749/99 $30.00
Copyright © 1999 by Academie Press
AU rights of reproduction in any form reserved.
108
BYL ET AL,
protocol by the ethical committee of the hospital. Nine
patients were receiving antirétroviral drugs (AZT, 5;
D4T, 4; ddC, 4; ddl, 2; 3TC, 2; louiride, 2; and saquinavir, 2) associated with mono- {n = 2), bi- [n = 2), or
tritherapy (n = 5); one patient was not receiving any
antirétroviral drug at investigation time. Both groups
received 0.5 ml of a TT vaccine im (Tevax, SmithKline
Beecham Biologicals, Rixensart, Belgium). Blood samples were collected before the TT booster and 7 and 21
days later for énumération of cytokine-SC by ELISPOT
and for détermination of anti-TT IgG sérum levels by
ELISA.
Enumération of Cytokine-SC by ELISPOT
After isolation of PBMC by density gradient centrif­
ugation on Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norway),
IFN-y-SC and IL-4-SC were enumerated using an
ELISPOT technique described elsewhere (12, 13). Preliminary experiments showed that the optimal détec­
tion of cytokine-SC required preincubation of PBMC
(2 X 10® PBMC/ml) in the presence of 20 /xg/ml TT
(Pasteur Institute, Brussels, Belgium) or of 1 p-g/ml
PHA (Wellcome, Beckenham, UK) in RPMI 1640 supplemented with 5% fêtai calf sérum (FCS). Optimal
preincubation times were 72 h for IFN-y-SC and 4 h for
IL-4-SC. After preincubation in tubes, the cells were
transferred to nitrocellulose-bottom microtiter plates
(Mahan 4550; Millipore, Eschborn, Germany) coated
with anti-IFN-y mAb (clone 1/DlK, Chromogenix,
Stockholm, Sweden) or anti-IL-4 mAb (clone 82-2,
Mabtech AB. Stockholm, Sweden). The plates were
then washed five times with PBS, blotted dry, and
blocked for 2 h at 37°C by the addition of 100 ju,l RPMI
1640 containing 10% FCS. Serial twofold dilutions of
single cell suspensions were then dispensed into the
plates in the presence of either TT (20 p-g/ml) or PHA (1
p,g/ml). The plates were incubated in a humidified 5%
CO2 atmosphère at 37°C for 16 h for the énumération
of IFN-y-SC and for 48 h for the énumération of IL-4SC. The cells were then removed by extensive washing
with PBS containing 0.25% Tween 20 before the addi­
tion of either biotinylated anti-IFN-y mAb (clone
7/B6/1, Chromogenix) or biotinylated anti-IL-4 mAb
(clone 12.1, Mabtech) for 3 h at room température.
After being washed with PBS, 2 p,g/ml ExtrAvidin
horseradish peroxidase (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) was added for 1 h before adding 3-aminoethylcarbazole (Sigma Chemical Co.). Spots appeared
after a few minutes, and the reaction was stopped by
briefly washing the plates with tap water. The spots
were counted under low magnification (x40) in the
Wells containing less than 150 to 200 spots. Different
wélls were counted for each condition so that the total
number of cells counted ranged from 375 X 10^ to 1 X
10®. The results were expressed as numbers of spots
per 10® PBMC or per 10® CD4'^ cells.
Ceii Déplétion Experiments
PBMC were depleted of CD4^ cells by using immunomagnetic beads coated with anti-CD4 mAb (Dynabeads M450 CD4, Dynal, Oslo, Norway) following the
manufacturées recommendations. After this treatment, the cell suspensions contained less than 2% of
CD4^ cells as assessed by flow cytometry.
Détermination of Anti-TT Sérum IgG Levels
Anti-TT sérum IgG levels were determined by
ELISA using polystyrène microtiter plates (Maxisorb;
Nunc, Roskilde, Denmark) coated overnight with 10
/xg/ml TT diluted in PBS. After being blocked with PBS
containing 2% BSA, 1/800 and 1/1600 sérum dilutions
were incubated in the microwells for 2 h at room tem­
pérature. After being washed with PBS, peroxidaseconjugated goat anti-human IgG (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL) was added at a
1/5000 dilution and incubated for 2 h at room tempér­
ature. Finally, the substrate ophenyldiamine in ci­
trate buffer was added, and the absorbance was measured at 490 nm using a Titertek multiscan photometer (ICN, Biomedicals, Orsay, France). Results were
expressed as lU/ml by comparison with a standard
curve established with TT-specific human immunoglobulins (Tetabuline-Croix-Rouge, Brussels, Bel­
gium).
Statistical Analyses
Statistical analyses were performed using Wilcoxon’s signed-rank test for paired data and the MannWhitney test for unpaired data.
RESULTS
Enumération of lEN-y-SC and IL-4-SC in Healthy
Controls and HIV-Infected Individuals
We first compared the responses of healthy Controls
with those of HIV-infected patients after stimulation
with PHA. As shown in Fig. 1 (top), after stimulation
with PHA the numbers of IFN-y-SC were similar in
both populations with médian (range) values of 25,905
(10,752-63,451) and 30,171 (1040-81,707) SC/10®
PBMC for healthy Controls and HIV-infected patients,
respectively. In contrast, the IL-4 response to PHA was
clearly impaired in HIV-infected patients (médian:
299, range; 11-1067 SC/10® PBMC) compared to the
Controls (médian: 1966; range 531-7533 SC/10® PBMC,
P< 0.001).
In contrast to their normal IFN-y response to PHA,
HIV-infected individuals displayed a profound defect
in their IFN-y response to TT (Fig. 1, (bottom), P <
0.001) compared to the Controls. As far as TT-specific
IL-4-SC are concerned, only low numbers could be de-
ANTIGEN-SPECIFIC CYTOKINES AND HIV
109
PHA
TT
FIG. 1. Enumération of IFN-y and IL-4-SC in response to in vitro stimulation of PBMC with PHA (top) or TT (bottom) in healthy Controls
(•) and HIV-infected individuals (O).
tected in 5 of 14 Controls and in 2 of 10 HIV-infected
individuals.
ELISPOT Analysis of Antigen-Speciüc Cytokine-SC
after in Vivo Administration of a TT Booster
Differenüal Effects of CD4* Cell Déplétion on IFN-y
Production in Response to PHA or TT
In preliminary experiments with healthy volunteers,
we observed that the numbers of IPN-y-SC and IL4-SC in peripheral blood peaked 7 days after the TT
injection (data not shown). Since the TT-specific responses were found to dépend on CD4^ T cells, the
results of these experiments were expressed as IFNy-SC and IL-4-SC per 10^ CD4^ cells. In healthy Con­
trols, the numhnrs of TT-specific IFN-y-SC luse in ali
individuals from day 0 to day 7. Tlie médian (range)
values of IPN-y-SC/lü® CD4^ cells were 2341 (100012,453) and 7637 (2658-16,197) before and 7 days af­
ter the TT injection, respectively {P< 0.001). As shown
in Fig. 2 (top), this response was dramatically lower in
To détermine the T cell population responsible for
IFN-7 or IL-4 sécrétion in response to PHA or TT,
CD4^ cell déplétion studies were carried out. As
shown in Table 1, déplétion of CD4^ T cells from
PBMC of healthy individuals abrogated the IFN-y
response to TT but had only a marginal effect on the
IFN--y response to PHA. As far as IL-4 is concerned,
cell déplétion experiments indicated a dominant rôle
for CD4* T cells for the response to both TT and
PHA.
110
BYL ET AL.
TABLE 1
DISCUSSION
Effects of CD4'^ Cell Déplétion on IFN-'y-SC
and IL-4-SC Nunibers
IFNy-SC'
IL-4-SC'
Stimulus'
Cells"
Exp 1
Exp 2
Exp 1
Exp 2
PHA
Whole PBMC
CD4 depleted
Whole PBMC
CD4 depleted
15,648
10,992
4507
16
28,440
19,200
3307
53
2074
171
72
2640
0
0
TT
220
35
" PHA was used at a concentration of 1 jxg/ml and TT at a concen­
tration of 20 txglm\.
‘ PBMC from healthy Controls were either untreated or depleted of
CD4* cells using immunomagnetic beads.
'Cytokine-SC numbers were expressed per 10“ cells.
Whereas the numbers of IFN-y-SC in HIV-infected
patients were not different from those of the Controls in
response to an in vitro stimulation with PHA, there
was a significant decrease in response to an in vitro
stimulation with TT. This was obvious before and after
in vivo administration of TT. Goncerning IL-4, the
numbers of both polyclonally induced IL-4-SG and TTspecific IL-4-SG were significantly lower in HIV-in­
fected patients than in the Controls.
The normal IFN-y response to PHA in HIV-infected
individuals most likely reflects the function of their
20000 n
HIV-infected individuals. Seven days after the TT in­
jection, the médian number of IFN-y-SC in these pa­
tients was only 1771/10® CD4'“ cells (range: 500-9525)
[P = 0.003 compared to Controls). This différence was
still évident 21 days after vaccination (data not shown).
Although TT-specific IL-4-SC numbers remained
much lower than those of IFN-y-SC after TT injection,
they rose significantly in 11 of the 14 healthy Controls
to reach a médian of 37 IL-4-SC/10® CD4^ cells on day
7 (range; 0-189) {P < 0.01 compared with preinjection
numbers) (Fig. 2, bottom). In the HIV-infected popula­
tion, only 4 of 10 patients displayed a détectable IL-4
response to the TT booster. In 2 of these patients, the
IL-4-SC numbers on day 7 postvaccination were even
higher than in the control population (250 and 1739/
10® CD4'*^ cells). However, these 2 patients also had
high numbers of TT-specific IFN-y-SC on day 7 post­
vaccination (8762 and 2551/10® CD4^ cells, respectively). Their numbers of circulating CD4^ cells were
151 and 145/mm®, respectively. None of these patients
had documented allergy or eosinophilia. These results
indicate that both Th 1-type and Th2-type responses to
TT are impaired in most HIV-infected patients,
whereas in a few patients both responses may be maintained.
IFNy
<iO>
15000 +
a
O
10000
-
O
<Dü
O)
c
<Üüw
5000
O
o°o
ego
0
Day 0
Day 7
Day 0
Day 7
Antitetanus Toxoid IgG Response
Since protection against tetanus is mainly mediated
by IgG which neutralize TT, we measured sérum anti-TT IgG before and after the TT booster. In contrast
to Controls, where the TT boost resulted in an increase
of anti-TT IgG in ail subjects, only 5 of 10 HIV-infected
patients displayed an increase in sérum anti-TT IgG
titers 21 days after vaccination. Maximum antibody
üters at the peak uf the response were therefore sig­
nificantly lower in 1 IlV-infected patients (médian: 2.89
lU; range; 0.98-16.63) compared to Controls (médian:
4.71 lU; range: 2.55-22.54) {P = 0.02) (Fig. 3). No
relationship was found between the numbers of cytokine-SG and the antibody titers.
#
Controls
w
HIV intQctoa
FIG. 2. Enumération of TT-specific IFN-7-SC and IL-4-SC before
and 7 days after a TT booster in response to in vitro stimulation of
PBMC with TT in healthy Controls (•) and HIV-infected individuals
(O). The results were expressed by 10' 004" lymphocytes.
ANTIGEN-SPECIFIC CYTOKINES AND HIV
p=0.02
•
contrais
O
HIVinfected
FIG. 3. Anti-TT-specific IgG titers before and 21 days after a TT
booster in healthy Controls (•) and HIV-infected individuals (O). The
results are expressed as lU/ml.
CD8^ or CD16'^/CD56* cells, since the production of
IFN-y was sustained in the absence of CD4^ lympho­
cytes. This is in accordance with the previously reported increased IFN-y mRNA levels and with the
increased levels of intracellular IFN-y in CD8^ cells of
HIV-infected patients (6. 11, 14). Similarly, the PHAstimulated IFN-y production of HIV-infected patients
was reported to be positively correlated with the numbers of CD8^ lymphocytes and with the numbers of
CD16^/CD56'^ natural killer cells (15).
Although there appears to be convergence among the
different studies on the production of IFN-y in HIVinfected subjects, the ability of PBMC from HIV-in­
fected patients to produce IL-4 has been controversial
and appears dépendent on techniques and the stimulating agent used (4, 5, 8, 9, 11). Most of these data
were obtained on clones or on polyclonally activated
cells. Therefore, interprétation must proceed with cau­
tion, as polyclonal activation only demonstrates the
capacity of the cells to secrete cytokines, which does
not imply that the observed response could be physiologically relevant. For this reason, we focused on the
antigen-specihc cytokine production in HIV-infected
patients in addition to their polyclonal activation. This
was made possible by using a single cell analysis tech­
nique, the ELISPOT assay, and we found that the
numbers of IFN-y-SC were primarily a reflection of the
111
cytokines produced by the CD4* population, as shown
by cell déplétion experiments. TT-specific IFN-y sécré­
tion was shown to be clearly depressed in HIV-infected
patients. The results of TT-specific IL-4 sécrétion were
more difficult to interpret due to the fact that we could
detect such cells in only 5 of the 14 Controls. Because a
decreased TT-specific IFN-7 sécrétion could be a con­
séquence of a delayed exposure to TT in some patients
or of a loss of memory T cells secondary to HIV infec­
tion, the patients were therefore further analyzed during the course of a developing immune response after
an in vivo TT booster. Our results indicate that both
the IFN-y and the IL-4 responses to TT are impaired in
most HIV-infected patients. This impairment was ob­
served even when the numbers of IFN-7 or IL-4-SC
were expressed relative to the total CD4'^ cells, and
was therefore not simply due to lower numbers of
CD4'^ cells in these patients. This observation indicates, therefore, that in HIV-infected individuals the
CD4'^ T-celTdependent TT-specific cytokine sécrétions,
both IFN-y and IL-4, décliné independently from the
disappearance of cells. In contrast to the dépréssion of
antigen-specific cytokine sécrétions, polyclonally induced IFN-y sécrétion was not affected early in the
course of HIV infection. This is consistent with previ­
ously reported lymphoproliférative responses (16).
However, in 2 of the 10 HIV-infected patients the num­
bers of both antigen-specific IFN-y-SC and IL-4-SC
were high, with IL-4-SC numbers even higher than in
Controls. These patients had no predisposing factor
known to increase the production of Th2 cytokines. The
clinical relevante of this finding is unclear. It suggests
that some patients with a low CD4^ count could develop a Th2 cytokine profile, although the majority of
HIV-infected patients displayed a generalized distur­
bance in cytokine production. Because of the heterogeneity of the administered antirétroviral treatment, we
were unable to investigate the influence of the drug
treatment on the immune response.
Since protection against tetanus is mainly mediated by
IgG which neutralize tetanus toxin, we also measured
the anti-TT IgG in the sera from the patients involved in
this study. Only half of the HIV-infected patients showed
increased anti-TT IgG titers after the booster, and this
increase was moderate with the exception of 2 patients.
The presence of these antibodies in some patients contrasted somewhat with the impaired antigen-specific cy­
tokine sécrétion. No corrélation was found between elther
IFN-y-SC or IL-4-SC and the anti-TT IgG titers, and the
2 patients with high antibody titers were not those with
high numbers of circulating antigen-specific cytokine-SC.
The.se antibodies could cnnceivably hâve been •^ynthesized within lymph nndes where T cell helper function
could be different from what we observed in the peripheral blood. Alternatively, they could hâve been derived
from a subpopulation of circulating B cells, which hâve
the capacity to synthesize anti-TT IgG in tlie absence of T
112
BYL ET AL,
cell help (17). Finally, IL-13, which bas been recently
reported to be increased in chronic HIV infection (18),
could also contribute to B cell stimulation in some pa­
tients.
In conclusion, our results do not support a shift from
Thl to Th2 in IFN-y and IL-4 sécrétions by T cells from
HIV-infected patients during a response to an antigenspecific stimulation, but they confirm the existence of a
profound disturbance in cytokine sécrétions in the majority of these patients, especially by CD4'^ T cells.
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Données complémentaires : Production d’IFN-y et d’IL-4 en réponse à une
stimulation polyclonale au cours de l’infection aiguë par le VIH
Nous avons étudié la production d’IFN-y et d’IL-4 en réponse à une stimulation polyclonale
de PBMC isolés chez 12 patients au cours de l’infection aiguë par le VIH et nous l’avons
comparée à celle observée chez des volontaires sains ou des patients chroniquement infectés
par le VIH. Au cours de l’infection aiguë par le VIH, le nombre de cellules produisant de
l’IFN-y en réponse à une stimulation polyclonale augmente de façon importante par rapport à
des sujets sains et décroît ensuite progressivement de façon linéaire dans les mois qui suivent,
tandis que le nombre de cellules productrices d’IL-4 décroît immédiatement et de façon
définitive (figure 7). L’analyse de la production de c5dokines dans des populations de
lymphocytes déplétées en lymphocytes CD4+ obtenues par cytaphérèse chez 3 des patients
présentant une infection aiguë nous a montré que seuls les lymphocytes CD4+ produisent de
l’IL-4 en stimulation polyclonale ou par l’anatoxine tétanique.
62
Figure 7 : Production d’IFN-y et d’IL-4 en réponse à une stimulation polyclonale au
cours de l’infection aiguë et chronique par le VIH
A
B
10000-1
OS
150000-
.y ü
I i
7500-
100000-
5000-
i
±
50) 3=d
C
2500-
D
Le nombre de cellules productrices d’IFN-y en réponse à une stimulation des PBMC par la PHA dans les premiers mois de
l’infection par le VIH (n=12) est significativement plus élevé que celui de sujets contrôles (n=14) ou de patients au stade
chronique de l’infection (n=18) (figure 7A) (P de Kruskal-Wallis <0.0001). Par contre, l’infection aiguë par le VIH s’accompagne
d’une diminution rapide et non réversible de la production d’IL-4 (figure 7B) (P de Kruskal-Wallis <0.0001). Les figures 7C et 7D
illustrent l’évolution du nombre de cellules productrices d’IFN-y et d’IL-4 exprimé en nombre de cellules par 10® PBMC en
réponse à une stimulation in vitro par ia PHA au décours de l’infection aiguë par le virus du VIH. On observe une importante
augmentation du nombre de cellules productrices d’iFN-y suivie d’une diminution linéaire (coefficient de régression linéaire
R^=0.757, P<0.0001 pour l’IFN-y et R^=0.379, P= 0.0581 pour l’IL-4).
63
4.2. L’extrait bactérien OM-85 BV induit une production d’IFN-y dépendante de
i’iL-12 par les lymphocytes CD4+ chez l’homme.
Afin de préciser l’effet d’extraits bactériens utilisés comme immuno-modulateurs, nous avons
utilisé la technique de l’ELISPOT pour investiguer l’un d’entre eux, l’OM-85 BV (BronchoVaxom ™) sur la production d’IFN-y. Nous avons prélevé des PBMC de 42 sujets sains et de
18 patients infectés par le VIH dont 5 patients avec plus de 500 lymphocytes CD4+ par mm3
de sang circulant et 13 avec moins de 500 lymphocytes CD4+. Nous les avons stimulés in
vitro avec de l’OM-85 BV. Par sélection positive ou négative de sous-populations
lymphocytaires à l’aide d’anticorps couplés à des billes magnétiques, nous avons analysé le
phénotype des cellules sécrétrices d’IFN-y. Nous avons également analysé l’effet de l’OM-85
BV sur la production d’IL-12 par les cellules présentatrices d’antigènes et le rôle de l’IL-12
dans la capacité des lymphocytes à sécréter de l’EFN-y. Nous avons mis en évidence que
rOM-85 BV stimule la production d’IFN-y de cellules mononucléées sanguines d’individus
normaux ou infectés par le VIH, même chez les patients ayant moins de 500 lymphocytes
CD4-I-. Les lymphocytes CD4-H représentent la source principale d’IFN-y en réponse à l’OM85 BV. Cet effet de l’OM-85 BV est dépendant de la production d’IL-12 par les cellules
présentatrices d’antigènes.
Nous
concluons
que
l’extrait
bactérien
étudié
pourrait
augmenter
les
défenses
antimicrobiennes par l’induction de la production d’IFN-y par les lymphocytes CD4+, par un
mécanisme dépendant de la production d’IL-12.
[By\ et al 1998]
64
JOURNAL OF INTERFERON AND CYTOKINE RESEARCH 18:817-821 (1998)
Mary Ann Liebert, Inc.
Bacterial Extract OM85-BV Induces Interleukin-12-Dependent
IFN-y Production by Human
T Cells
BAUDOUIN BYL,' MYRIAM LIBIN,‘ MICHÈLE GÉRARD.^ NATHAN CLUMECK,^
MICHEL GOLDMAN,’ and FRANÇOISE MASCART-LEMONE’
ABSTRACT
To obtain insight into the possible mode of action of bacterial extracts used as immunostimulants in Europe,
we used the ELISPOT technique to investigate the effects of one of them (OM85-BV, Broncho-Vaxom™) on
interferon-y (IFN-y) production by peripheral blood mononuclear cells (PBMC). We found that (1) OM85BV stimulâtes IFN-y sécrétion by PBMC from normal individuals and human immunodeficiency virus (HTV)infected patients, (2) CD4^ cells represent the major source of IFN-y produced in response to OM85-BV, and
(3) this effect of OM85-BV involves the induction of interleukin-12 (IL-12) sécrétion by accessory cells. We
conclude that bacterial extracts might enhance antimicrobial defenses by eliciting IL-12-dependent IFN-y synthesis by CD4+ T cells.
ther analyzed the effect of the bacterial extract on the sécrétion
of IL-12 by accessory cells.
INTRODUCTION
RAL ADMINISTRATION OF bacterial extracts is a common
MATERIALS AND METHODS
practice in Europe to prevent airway infections in young
children and elderly people. Although no clear consensus bas
Bacterial extract
been reached about the clinical efficacy of these products, there
OM85-BV (Broncho-Vaxom™, OM Laboratories, Geneva,
is some evidence from placebo-controlled randomized studies
Switzerland) is a bacterial extract obtained by submitting eight
that they might indeed reduce the incidence of acute respiramicroorganisms {Streptococcus pneumoniae, Haemophilus intory infections in some populations.”’^’ The mechanisms of ac­
fluenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozonae, Staphylotion of bacterial extracts remain elusive, although in vitro stud­
coccus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viriies hâve suggested that they might exert stimulatory effects on
dans, and Moraxella catarrhalis in equal numbers) to
B lymphocytes, natural killer (NK) cells, neutrophils, and
progressive alkaline lysis. The lyophilisate was dissolved in
monocytic cells.’^"^’ The latter effect does not dépend on the
stérile RPMI 1640 medium and contained 600 pg of LPS when
presence of lipopolysaccharide (LPS) and involves a CD14-inused at a concentration of 200 /zg/ml, as assessed by a limilus
dependent pathway.’^’
amebocyte lysate assay (LAL-QCL-1000, Whittacker MA BioBecause of the central rôle of interferon-y (IFN-y) in host
products, Walkersville, MD).
defenses,’’’ we analyzed the influence of bacterial extracts on
O
the production of this cytokine. For this purpose, we used a
two-site reverse enzyme-linked immunospot technique
(ELISPOT) to enumerate IFN-y-secreting cells (SC) among pe­
ripheral blood mononuclear cells (PBMC). Because interleukin12 (IL-12) is known to play a critical rôle in the induction of
IFN-y synthesis in several Systems and to be produced by
phagocytic cells in response to bacterial products,’*””’ we fur-
Blood sampling
Blood was collected on calparine from 42 healthy blood
donors and from 18 asymptomatic human immunodeficiency
virus (HTV)-infected patients (5 patients with more than 500
circulating CD4''' lymphocytes/mm* and 13 patients with less
than 500 CD4'*' lymphocytes/mm’).
‘Department of Immunology, Hôpital Erasme, Brussels, Belgium.
^Department of Infectious Diseases, Hôpital Saint-Pierre, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium.
817
818
BYL ET AL.
Cell préparations
PBMC were isolated by Ficoll density gradient centrifuga­
tion on Lymphoprep (Nycomend, Oslo, Norway) and cultured
at 2 X 10® PBMC/ml in RPMI 1640 supplemented with 5% fê­
tai calf sérum (FCS) in round-bottom polypropylene tubes (Falcon 2059, Becton Dickinson, San José, CA), in the presence of
OM85-BV. Accessory cells consisting essentially of monocytes
were purified from PBMC by dumping as described.^'®)
Briefly, PBMC were incubated in ice-cold RPMI supplemented
with 20% heat-inactivated FCS for 30 min at 4°C under con­
tinuons rocking agitation. Monocytes were then sedimented by
a short centrifugation at 1000g. The pellet was resuspended in
culture medium and then subjected to a new cycle of dumping
under agitation at 4°C. After centrifugation, the cell pellet was
resuspended in fresh culture medium. The resulting cell prépa­
ration contained more than 75% CD14''' monocytic cells.
PBMC were depleted of CD4''' or CD8''' cells by incubation
with magnetic microbeads coated with antihuman CD4 or antihuman CD8 monoclonal antibodies (mAb) (Dynal, Oslo, Nor­
way), followed by removal of the beads using a magnet. Purified CD4*'' lymphocytes were obtained by incubating accessory
cell-depleted PBMC with magnetic microbeads coated with an­
tihuman CE)4 mAb, followed by detachment of the CD4“^ cells
using antimouse IgG-coated beads (Detachabead, Dynal).
For the experiment using polymyxin B as endotoxin inhibitor, polymyxin B (Calbiochem, Band Soden, Germany) was
added to PBMC at a concentration of 10 U/ml, known to neu-
FIG. 1. OM85-BV induces IFN-y sécrétion by PBMC.
PBMC from 8 healthy donors were cultured in the presence of
increasing doses of OM85-BV, and IFN-y-secreting cells were
enumerated after 3 days by the ELISPOT technique. Results
are expressed as numbers of IFN-y SC/10® PBMC and shown
as médian and percentile 25 and 75.
tralize 1000 pg/ml LPC.
RESULTS AND DISCUSSION
IFN-y ELISPOT assay
After culturing PBMC for 3 days in the presence of OM85BV, the numbers of EFN-y SC were enumerated using an
ELISPOT technique described elsewhere.O'*' Briefly, the cells
were transferred into wells of a nitrocellulose Millititer HA
plate (MAHAN 4550, Millipore, Eschbom, Germany) that had
been coated with antihuman lEN-y mAb (clone 1/DlK, Chromogenix, Môlndal, Sweden). After 16 h incubation at 37°C, the
plates were washed 10 times with PBS-0.25% Tween 20 to remove the cells, and a biotinylated mouse antihuman IFN-y mAb
(clone 7/B6/1, Chromogenix) was added as developing antibody. Finally, extravidin horseradish peroxidase (Sigma Chem­
ical Co, St Louis, MO) was added for 1 h, followed by 3-amino9-ethylcarbazole (Sigma). Spots were counted using low
magnification light microscopy, and the results were expressed
as numbers of spots per 10® PBMC.
OM85-BV induces IFN-y sécrétion by PBMC from
healthy Controls and from HPV-infected patients
Incubation of PBMC with OM85-BV for 72 h resulted in a
dose-dependent increase in the proportion of IFN-y SC, which
reached 710/10® PBMC at the optimal OM85-BV concentra­
tion (200 )ug/ml) (Fig. 1). This dose, therefore, was used for
further experiments.
The excipient of OM85-BV had no effect, as the numbers of
IFN-y SC were similar after incubation with excipient (médian
of 10 experiments 30, range 5-66) or with medium alone (mé­
dian 40, range 5-66).
Table 1. OM85-BV Stimulâtes IFN-y Synthesis
BY PBMC FROM HIV-Inpected Patients
Control medium
OM85-BV
IL-12 induction and measurement
Accessory cells were incubated with increasing doses of
OM85-BV, and culture supematants were collected after 48 h
of culture. To estimate IL-12 concentrations in culture supernatants by ELISA, commercial kits were used for measuring
the p40 subunit of IL-12 (Biosource, Fleurus, Belgium) and the
p70 heterodimeric bioactive form of IL-12 (Quantikine HS
ELISA-R & D Systems Europe, Oxon, United Kingdom).
Statistical analysis
The nonparametric Mann-Whitney test was used to déter­
mine statistical significance.
Healthy Controls
(n = 42)
HIV-infected patients
CD4''' cells/mm^
>500 (n = 5)
<500 (n = 13)
57 (0-480)“
656 (117-1930)
40 (0-330)
30 (0-325)
366 (170-2400)®
200 (0-500)“
“Results are shown as médian (range) of IFN-y SC/10®
PBMC of healthy individuals or HIV-infected patients enu­
merated by ELISPOT after 3 days of culture either in contrnl
medium or in the presence of 200 /xg/ml OM85-BV.
®p = 0.25 compared with healthy Controls (two-tailed MannWhitney test).
“p < 0.001 compared with healthy Controls.
819
OM85-BV INDUCES IL-12-DEPENDENT IFN-y PRODUCTION
Table 2.
OM85-BV Induces IFN-y SC in Presence of Polymyxin B“
Medium + polymyxin B
OM85-BV + polymyxin B
Experiment 1
Experiment 2
Experiment 3
117
723
196
835
57
305
“PBMC from 3 healthy individuals were cultured with polymyxin B (10 U/ml) in the
absence or presence of OM85-BV (200 /xg/ml). After 3 days, numbers of IFN-y SC/10®
PBMC were determined by ELISPOT.
We then compared the numbers of IFN-y SC in response to
200 /xg/ml OM85-BV in 42 healthy blood donors with those of
15 HIV-infected patients. As shown in Table 1, PBMC from
most HIV-infected patients were able to respond to OM-85 BV,
although the magnitude of the response was lower than in
healthy Controls and decreased according to the CD4''' T cell
count. When expressed by 10® CD4''‘ cells, numbers of IFN-y
SC were not significantly different between the two groups of
HTV-infected patients, médian (range) values being 813
(386-9600) and 1250 (0-4167) in patients with more than and
less than 5(X) CEM"*^ cell/mm^, respectively.
The residual concentration of LPS présent in OM85-BV (approximately 600 pg/ml) was not responsible for its effect, as
the médian number of IFN-y SC after stimulation with LPS at
a concentration of 1 ng/ml was 86 (range 26-157). Furthermore,
in experiments on 3 different donors, OM85-BV induced a clear
induction of IFN-y SC even in presence of polymyxin B added
at a concentration known to neutralize the amount of LPS pré­
sent in the OM85-BV préparation (Table 2).
Characterization of the phenotype of the IFN-y SC
To gain insight into the nature of the cells that are activated
to secrete IFN-y on OM85-BV exposure, we first determined
the effects of CD4''' cell or CD8''' cell déplétion on the num­
bers of IFN-y SC. In three independent experiments, we found
that déplétion of CD4''' T cells resulted in the complété disappearance of IFN-y SC, whereas CD8'*‘ cell déplétion had no
significant effect (data not shown). To further document the
rôle of CD4''' cells in the sécrétion of IFN-y, we performed additional coculture experiments using accessory cells and purified CD4''' T cells (more than 90% pure). As shown in Figure
2, only very low numbers of IFN-y SC were found on incuba­
tion of CD4'^ T cells alone or accessory cells alone in the pres-
IFN-y secreting cells /10® PBMC
PBMC
PBMC + control isotype
PBMC + anli-IL12
CD4+
APC
CD4 + APC
CD4-t.APC + anti-lL12
FIG. 2. Involvement of IL 12, accessory cclls, and CDI'"' T cells in OM85-BV-induced IFN-y sécrétion. Cell suspensions consisting of PBMC, purifîed CD4'*' T cells (CD4), antigen presenting cells (APC), or CD4 + APC were incubated for 3 days ei
ther in medium alone (open bars) or with 200 txg/nû OM85-BV (hatched bars), in the absence or presence of neutralizing antilL-12 mAb (2 ng/ml) or of the same amount of isotype-matched control mAb. The data shown as numbers of IFN-y-SC/10® cells
are those of one of two experiments that gave similar results.
820
BYL ET AL.
other cytokines, such as IL-18, also participate in the induction
of IFN-y synthesis by OM85-BV.
In conclusion, our results indicate that OM85-BV stimulâtes
IL-12-dependent IFN-y sécrétion by CD4'^ cells, an effect that
might resuit in enhanced antimicrobial defenses. Interestingly,
another bacterial extract (OK-432 obtained from Streptoccoccus pyogenes) used as adjuvant in cancer treatment was shown
recently to also induce IL-12 and IFN-y production.*'^* To further dissect the molecular basis of these effects, additional studies should establish the précisé nature of the molécules included
in bacterial extracts that are responsible for the induction of IL12 and of the antigens or superantigens that elicit CD4''' T cell
activation.
ACKNOWLEDGMENTS
This Work was supported by a grant from the Laboratories
OM (Meyrin, Genève, Switzerland) and by the Fonds de la
Recherche Scientifique Médicale (Belgium).
FIG. 3. OM85-BV induces IL-12 production by human accessory cells. Accessory cells isolated from PBMC by dump­
ing were incubated for 2 days with increasing doses of OM85BV, and IL-12 levels were determined in culture supematants
by an ELIS A spécifie for the p40 subunit of IL-12. The data
shown are those of one of two experiments that gave similar
results.
ence of OM85-BV. Indeed, the induction of lEN-y-secreting
cells was observed only when both cell populations were pré­
sent together.
Rôle of IL-12 in the induction of IFN-y SC
Since IL-12 is known to play a critical rôle in the induction
of IFN-y synthesis in several Systems and to be produced by
phagocytic cells in response to bacterial products/*"'^' we analyzed the effect of the bacterial extract on the sécrétion of IL12 by accessory cells isolated from PBMC. OM85-BV induced
a dose-dependent stimulation of IL-12 sécrétion by accessory
cells, the active doses of OM85-BV in this System being in the
same range as those inducing EFN-y sécrétion (Fig. 3). In these
experiments, IL-12 concentrations were determined in culture
supematants by an ELISA spécifie for the p40 subunit of IL12. When the ELISA spécifie for the p70 heterodimeric form
of IL-12 was used, a mean concentration of 3 pg/ml was measured in the presence of 200 /xg/ml OM85-BV as compared
with less than 0.5 pg/ml in the absence of the bacterial extract.
This rather low induction of IL-12 (p70) as compared with IL12 (p40) is not surprising, as PBMC were previously shown to
produce much lower levels of the p70 heterodimeric form of
IL-12 than of the free p40 form.***
Finally, to evaluate the functional rôle of IL-12 in the OM85B V-mediated induction of IFN-y SC, we added a neutralizing
anti-IL-12 mAb (2 ng/ml. Biosource, Fleurus, Belgium) or the
same amount of an isotype-matched control mAb to PBMC in­
cubated with OM85-BV. As shown in Figure 2, IL-12 neutralization resulted in a dramatic réduction in the numbers of
OM85-BV-induced IFN-y SC. Obviously, it is possible that
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Address reprint requests to:
Dr. Michel Goldman
Department of Immunology
Hôpital Erasme
808 route de Lennik
B-1070 Brussels
Belgium
Fax: 32-2-555-4499
E-mail: [email protected]
Received 24 Match 1998/Accepted 16 May 1998
4.3. Etude in vitro de l’effet adjuvant d’un analogue du Lipide A, l’OM-197
La maturation des cellules dendritiques est critique pour l’induction de la réponse antigènespécifique des lymphocytes T et pourrait être essentielle pour le développement de vaccins
visant l’immunité dépendant des lymphocytes T. Nous avons investigué l’effet sur les cellules
dendritiques humaines de l’OM-197, un analogue du Lipide A composant de l’endotoxine des
bacilles à Gram négatif L’OM-197 est un pseudodipeptide synthétique dérivé d’aminoacides,
lié à 3 chaînes acylées et dépourvu d’effet endotoxinémique.
Au départ de prélèvements de sang obtenus chez des volontaires sains, nous avons étudié
l’effet de l’OM-197 sur la production de TNF-a et d’IL-12 en sang total et sur la maturation
des cellules dendritiques myéloïdes et plasmacytoïdes en sang total. Nous avons également
mesuré son effet sur des cellules dendritiques dérivées de monocytes du sang circulant
cultivés en présence d’lL-4 et de GM-CSF. Nous avons ensuite mesuré la capacité de l’OM197 à développer un effet adjuvant dans la génération d’une réponse immune primaire in vitro
contre l’antigène de surface du virus de l’hépatite B (Ag HBs) chez des sujets naïfs pour cet
antigène.
Nous avons montré que l’OM-197 induit l’augmentation de l’expression de HLA-DR, des
CD40, CD54, CD80, CD86 et CD83, à la surface des cellules dendritiques myéloïdes
naturellement présentes dans le sang autant que des cellules dendritiques générées in vitro au
départ de monocytes à l’aide d’EL-4 et de GM-CSF. L’OM-197 induit la production d’IL-12
et de TNF-a des cellules dendritiques et inhibe la phagocytose de dextran par les cellules
dendritiques. Enfin, des cellules dendritiques incubées avec l’OM-197 après avoir été
exposées à l’antigène HBs induisent in vitro l’expansion de lymphocytes T CD4+ spécifiques
de l’antigène HBs produisant de l’fFN-y au départ de lymphocytes d’individus naïfs.
L’ensemble de ces données suggère que l’OM-197 est un adjuvant potentiel pour l’induction
de réponses de type Thl.
[Byl et al 2003b; Byl et al. 2003a]
65
International
Immunopharmacology
ELSEVIER
International Immunopharmacology 3 (2003) 417-425
www.eIsevier.com/locate/intimp
OM197-MP-AC induces the maturation of human dendritic cells
and promûtes a primary T cell response
B. Byl", M. Libin", J. Bauer^ O.R. Mal■tin^ D. De Wit^
G. Davies^, M. Goldman^’*, F. Willems^^
"Laboratoire d'Immunologie Expérimentale, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium
OM-Pharma, Meyrin, Switzerland
Received 7 November 2002; received in revised fomi 3 January 2003; accepted 6 January 2003
Abstract
Dendritic cell (DC) maturation is critical for the induction of antigen-specific T lymphocyte responses and may be essential
for the development of human vaccines relying on T cell immunity. We investigated the effects on human DC of OM-197, a
synthetic pseudodipeptide derived from amino acids, linked to three fatty acid chains and devoid of endotoxin properties. OM197 upregulated the expression of HLA-DR, CD80, CD86, CD83, CD40 and CD54 at the surface of myeloid DC naturally
présent in blood as well as of DC generated in vitro from monocytes using IL-4 and GM-CSF. OM-197 also induced the release
of IL-12 and TNF-a from DC. Finally, DC incubated with OM-197 after pulsing with hepatitis B surface antigen (HBs Ag)
induced in vitro expansion of IFN-y-secreting HBs Ag-specific 004“^ T lymphocytes from naive individuals. Taken together,
these data identify OM-197 as a potential vaccine adjuvant for the induction of Thl-type responses.
© 2003 Elsevier Science B.V. Ail rights reserved.
Keywords: Adjuvant; Dendritic cell; Lipid A; T lymphocyte; Vaccine
1. Introduction
Dendritic cells (DC) are professional antigen-presenting cells (APC) that represent an essential link
between innate and adaptive immunity [1], At the
immature State, DC are sentinels that efficiently sample their environment for foreign antigen at potential
sites of pathogen entry. The récognition of microbial
Products is mediated by a set of germ-line-encoded
* Corresponding author. Hôpital Erasme, 808 roule de Lennik,
Ki-i07ü, Brussels, Belgium. Tel.: +32-2-555 39 25; fax: +32-2-55544-99.
E-mail address: [email protected] (M. Goldman),
receptors, the Toll-like receptors (TLRs) which are
expressed at the surface of immature DC. TLRs
recognize evolutionary conserved molecular patterns
derived from microbial pathogens such as lipopoly­
saccharide (LPS), lipoproteins and bacterial DNA
(i.e., with umnethylated CpG sequences) and double-stranded RNA [2-4], During infections, TLR
triggering induces DC maturation which results in
an increase of MHC class II and costimulatory mol­
écules expression and production of several cytokines *
including IL-12, a critical factor for génération of T
hclper (Th) 1 type responses [5-7]. Haclcrial LPS, a
major intcgial cumpntienl from the outer membrane of
Gram-negative bacteria, is a prototypical pathogen-
1567-5769/03/$ - see front matter © 2003 Elsevier Science B.V. Ail rights reserved.
doi: 10.1016/S 1567-5769(03)00008-0
418
B. Byl et al. / International Immunophurmacology 3 (2003) 417-425
associated molecular pattern demonstrated to induce
myeloid DC maturation through TLR-4 engagement
[4]. While lipid A moiety of LPS acts as a potent
adjuvant, its high toxicity excludes its use as vaccine
adjuvant. Therefore, efforts are made to design lipid A
dérivatives and analogues which would be endowed
with adjuvant properties but devoid of toxicity.
OM-197-MP-AC (S,R) [OM-197], a lipid A ana­
logue, is a synthetic pseudodipeptide derived fiom
amino acids linked to three fatty acid chains. In the
présent study, we first investigated the effects of OM197 on the production of cytokines in human whole
blood. The observation that OM-197 induces the
release of IL-12 led us to détermine the influence of
OM-197 on the phenotype of myeloid DC and their
capacity to induce a primaiy T cell response.
Fig. 1. Chemical structure of OM-197-MP-AC.
2. Materials and methods
obtained by Chemical treatment of E. coli lipid A
2.1. Culture media and reagents
[8]. One milligram of OM-197 eontains less than
0.125 Endotoxin Unit measured by Limulus amoebocyte Lysate (data OM-Phanna).
Culture medium consisted of RPMI 1640 (Bio
Whittaker, Verviers, Belgium) supplemented with 2
mM L-glutamine (Bio Whittaker), gentamicin (20 pg/
ml), 50 pM 2-mercaptoethanol (Bio Whittaker), 1%
nonessential amino acids (Bio Whittaker) and 10%
fêtai bovine sérum (FBS) (HyClone, Erembodegem,
Adult peripheral fresh blood was obtained from
healthy volunteers. Peripheral blood mononuclear
cells (PBMC) were isolated from buffy coats obtained
Belgium) or 5% homemade human sérum pool.
Recombinant IL-4 (1.43 x lO’ U/ing) was purchased
inaiy immune response to HBs, PBMC were isolated
from Cellgenix (Freiburg, Gennany) and recombinant
GM-CSF (Leucomax, 16 x 10^ lU/mg) from Novartis
(Basel, Switzerland). Lipopolysaccharide (LPS) from
Escherichia coli (0128;B12) was purchased from
Sigma (Bomem, Belgium). Hepatitis B virus surface
antigen (HBs Ag) was purchased from Aldevron
(Fargo, ND, USA).
OM-197-MP-AC-(S,R) [OM-197] (OM-Pharma,
Meyrin, Switzerland) is the code naine of a synthetic
acylated pseudodipeptide [(35',97î)-3-[(7?)-3-dodecanoyloxytetradecanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3hydroxytetradecanoylamino]-decan-l ,10-diol 1-dihydrogeno-phosphate 10-(6-aminohexanoate)] (Fig. 1)
(molecular weight: 1047.46; exact mass: 1046; molec­
ular formula: CJ5H107N4O12P; molecular composi­
tion: C 63.07%, H 10.30%, N 5 35%, O 18.33%, P
2.96%). The Chemical structure of the threc fatty acid
chains is similar to OM-174, a lipid A analogue
2.2. Blood samples and DC préparations
from healthy donors. For in vitro génération of prifrom heparinized blood obtained from selected vol­
unteers négative for anti-HBs, HBs antigen and antiHBc (exclusion of both hepatitis B infection or
vaccination). PBMC were prepared from ail samples
by centrifugation over Ficoll-Hypaque gradients
(Nycomed, Oslo, Noway) and DC were generated
as described by Romani et al. [9]. Briefly, PBMC
were first suspended in culture medium and allowed
to adhéré onto large Falcon flasks. After 2 h at 37 °C,
non-adherent cells were removed and adhèrent cells
were cultured in 20 ml of medium containing GMCSF (800 U/ml) and interleukin-4 (IL-4) (500 U/ml).
Every 3 days, 800 U GM-CSF and 500 U IL-4 were
added to the cultures. After 6 days of culture, nonadherent cells con'esponding to the DC fraction were
liuivcslccl. The lesulting cell préparations contaiiied
>90% DC as assessed by morphology and FACS
analysis.
B. Byl et ai / International Immunopharmacology 3 (2003) 417-425
2.3. Whole blood and DC cultures
Heparinized whole blood saioples (1 ml diluted 1:1
in medium per condition) were incubatcd at 37 °C
with 20 ^g/ml OM-197 or 10 ng/ml LPS. Whole
blood cultures were stopped after 4 h for flow cytometry analysis and after 16 h for détermination of
cytokine levels in plasma. Monocyte-derived DC
(5 X 10^/ml) were cultured ovemight at 37 °C with
20 pg/ml OM-197 or 1 [tg/ml LPS and then assessed
for flow cytometry analysis. Culture supematants
were harvested for ELISA.
2.4. Cytokine détermination
IL-12 (p40) and TNF-a concentrations were measured by two-site sandwich ELISA Systems using
antibodies (Flexia kits) from Biosource (Nivelles,
Belgium). The détection limit for these assays was
20 pg/ml. IL-12 (p70) levels were measured by
ELISA kits (Endogen, Erembodegem, Belgium).
The détection limit for this assay was 2 pg/ml).
2.5. Flow cytométrie analysis
To analyze the phenotype of circulating DC,
whole blood cells were incubated for 30 min at 4
°C with 7 pl cocktail of FITC-conjugated mAbs
spécifie for CD3, CD14, CD16, CD19, CD20,
CD34 and CD56 receptors, 5 pl allophycocyanin
(APC)-conjugated anti-CDllc mAb, 5 pl PerCPconjugated anti-HLADR niAb and one of the following PE-conjugated mAb: anti-CD80 IgGl mAb, antiCD54 IgG2b mAb (Becton Dickinson, Mountain
View, CA), anti-CD86 IgG2b mAb, anti-CD40
IgGl mAb (Biosource), anti-CD83 IgG2b mAb
(ImmunoTech, Marseille, France). As Controls, cells
were stained with comesponding isotype-matched
control mAbs. After this first incubation, blood cells
were incubated for 5 min at room température in the
dark with 2.5 ml of FACS Lysis IX (Becton Dick­
inson). Cells were then centrifuged at 1500 rpm for
10 min and resuspended in 200 pl FACS buffer (PBS
supplemented with 0.5% bovine sérum albumin).
Blood samples were then analyzed using a four-color
cytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson). Acqiiisition was based on a number of 5000 events in the
lineage cocktail-negative and FlLA-DR-positive cells
419
gâte. Monocyte-derived DC were analyzed as previously described [10].
2.6. Induction of HBs-specific CD4^T cell response
and énumération of IFN-y-secreting CD4^ T cells
To monitor HBs-specific CD4'^T cell primary
response, DC and CD4^T lymphocytes were isolated
from PBMC of healthy individuals naive for hepatitis
B viras. Stimulator cells were DC generated from
adhèrent PBMC as described previously. Responder
cells were CD4'^T lymphocytes obtained from the nonadherent fraction of PBMC and were purified by a
négative sélection using a cocktail of hapten-conjugated mAb (including anti-CD8, anti-CDllb, antiCD 16, anti-CD 19 anti-CD39, anti-CD56), MACS
microbeads coupled to anti-hapten monoclonal anti­
bodies and a MACS column (Santa Cruz Biotechnol­
ogies, Boechout, Belgium). Purity of CD4'*^T cells was
higher than 90% as assessed by FACS analysis.
Stimulator cells were autologous DC generated fi'om
adhèrent PBMC, incubated or not with HBs (10 pg/ml)
for 2 h before stimulation or not with OM-197 (20 pg/
ml) for 16 h. DC were then extensively washed and
cocultured with CD4'^T lymphocytes at a ratio of 1:10
in polypropylene tubes, in complété medium with 10%
human sérum. After 96 h, CD4^T lymphocytes were
transferred in wells of a nitrocellulose Millititer HA
plate (MAHAN 4550; Millipore, Eschbom, Germany)
coated with anti-human IFN-y monoclonal antibody
(mAb) (clone 1/Dl K, Chromogenix, Molndal, Sweden). After 48 h incubation at 37 °C, plates were
washed 10 times with PBS-0.25% Tween 20 to
remove cells, and a biotinylated niouse anti-human
IFN-y (clone 7/B6/1, Chromogenix) was added as
developing antibody. Finally, exti'avidine horseradish
peroxidase (Sigma, St. Louis, MO) was added for 1 h,
followed by 3-amino-9-ethylcarbazole (Sigma). Spots
were counted using low-magnification light microscopy.
2.7. Statlstical analysis
Médian values were compared using the unpaired
(Mann-Whitney) or paired (Wilcoxon) nonparametric
tests according to the effcctivcness of the pairing. This
one was assessed by corrélation calculation using the
nonparametric Spearman corrélation coefficient using
420
B. Byl et al. / International Immunopharmacology 3 (2003) 4 J 7—425
GraphPad Prism version 3.02 for Windows (GraphPad
Software, San Diego, CA).
3. Results
3.1. OM-197 stimulâtes cytokine production in whole
blood
induce the release of high levels of IL-12 (p40),
although lower than those induced by LPS, and also
high levels of TNF-a, in the same range than induced
by LPS (Fig. 3). The médian (range) IL-12 (p40)
concentrations were 40 (0-167), 340 (0-4700) and
884 (0-9210) pg/ml for medium alone, OM-197 and
LPS, respectively (P=0.0005 for comparison of OM197 stimulation with medium alone, P= 0.0122 for
comparison of OM-197 with LPS). The médian
In a first set of experiments, we found that addition
of graded concentrations of OM-197 to whole blood
resulted in a dose-dependent production of IL-12 (p40)
(Fig. 2A). A maximum effect was reached between 20
and 40 pg/ml. We next compared the effects of OM-
(range) TNF-a concentrations were 40 (10-150),
3100 (375-16,930) and 4606 (730-14,380) pg/ml,
for medium alone, OM-197 and LPS, respectively
(P=0.0005 for comparison of OM-197 stimulation
with medium alone, P= 0.2334 for comparison of OM-
197 (20 pg/ml) and LPS (10 ng/ml) on cytokine
production in the same System. OM-197 was able to
in three out of four assayed samples (data not shown).
197 with LPS stimulation). IL-12 (p70) was detected
V
-^lL-12 p40
80
OM-197 (pg/ml)
-*-HLA-DR
— CD80
— CD83
■—CD86
CD40
-0-CD54
OM-197 (pg/ml)
Fig. 2. OM-197 stimulâtes IL-12 (p40) release in whole blood and induces upregulation of HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD40, CD54 at the
surface of myeloid blood DC. Peripheral whole blood was cultured either in medium alone (corresponding to 0 pg/ml OM-197) or with graded
doses of OM-197 (A) After 24 h, plasma samples wcie assayed by HLIS.A for IL-12 (p4ü) levels. One représentative experiment is shown. (B)
Aller 4 h. myeloid blond DC were analyzed for surface molécules expression by flow cytometry. Data represenl médian fluorescence intensity
of one représentative experiment.
B. Byt et al. / Inlenialional Immunopharmacohgy 3 (2003) 417-425
20000-
421
P=0.000S
P=0.2334
I------------------------- 1
I---------------------
I
B)
O.
a 10000-
v^'
O
Fig, 3. Production of IL-12 (p40) and TNF-a by whole blood samples upon addition of OM-197. Whole blood was cultured either in medium
alone or with OM-197 (20 pg/ml). After 24 h, plasma samples were assayed for cytokine levels by ELISA. Data represent 12 independent
experiments from different donors. Boxes are for interquartiles and bars for ranges.
3.2. OM-197 induces dendritic cell maturation
DC represent a major source of IL-12 and are
critically involved in the induction of primary immune
responses. We therefore determined the influence of
OM-197 on DC présent in whole blood and compared
blood DC responses to OM-197 and LPS. For this
purpose, we used a four-color flow cytometry method
allowing the distinction between myeloid DC (lineage-/HLA-DR'^/CDl Ic^) and plasmacytoid DC (lineage-/HLA-DR'^/CDl lc“). As shown in Fig. 2B,
incubation of whole blood for 4 h with graded con­
centrations of OM-197 induced a dose-dependent
upregulation of MHC class II molécules, CD40,
CD80, CD86 costimulatory molécules, CD54 adhe­
sion molécule and CD83 maturation marker on mye­
loid DC. A maximum effect was reached with 20 pg/
ml OM-197 and was comparable to the increase of the
same markers induced upon 1 pg/ml LPS stimulation
(Table 1 and Fig. 4). In contrast, plasmacytoid DC
were only slightly affected by OM-197 as the product
only slightly upregulated the expression of CD40,
CD80 and CD83 (Table 1 and Fig. 4). We conclude
from these experiments that OM-197 preferentially
activâtes myeloid DC présent in human blood.
As the effects of OM-197 in whole blood might
dépend on the presence of other cell types and
circulating factors, we investigated the effect of
OM-197 on DC derived from monocytes cultured
with IL-4 and GM-CSF. Data shown in Table 2
Table 1
Phenotype of blood DC exposed lo OM-197 or LPS
DC
Stimulus
HLA DR
CD40
CD54
CD80
CD83
CD86
Myeloid DC
Medium
OM-197
LPS
Medium
OM-197
LPS
614±471
10001689*
943 ± 604
473 1 351
5161341'^^
4521361
161 10
34123**
31 1 17
11 15.7
1418.6**
171 11
130 1 106
4101298**
450 1 365
66147
102 1 112'^®
105 1 118
6.4 1 2.4
60 1 39*
53 126
8.817.9
13111*
12 1 8.8
9.5 1 5.7
227 1 134*
252 1 133
6,0 1 2.5
17121**
25 125
231 1
448 1
393 1
64 1
75 1
641
Plasmacytoid DC
128
193**
163
125
126^®
120
Whole blood was cultured for 4 h with OM-197 (20 pg/ml) or LPS (10 ng/ml), or in medium alone. Myeloid and plasmacytoid blood DC were
analyzed by flow cytometry for the surface expression of the indicatcd molécules. Data represent mean ± S.D. of médian fluorescence intensity
of eight independent experiments on different donors. P values are for comparison between OM-197-stimulated and unstimulated blood
samples. NS is for P valuoO.lO.
♦P value<0.0.5
**P value<0.01.
* P value < 0.001.
422
B. Byt et at. / International Immunopharmacology 3 (2003) 417—425
Fig. 4, Flow cytometry analysis of circulating DC upon addition of OM-197 to whole blood. Blood DC were gated front whole blood cells by
assembling RI and R2 régions. Myeloid DC and plasmacytoid DC were identified as CDllc'/HLA-DR‘ and CD 11 C“/HLA-DR'* cells,
respectively. Whole blood was incubated eiüier in medium alone or with OM-197 (20 pg/ml) for 4 h and tlien analyzed by flow cytometry for
the surface expression of the indicated molécules. Solid histograms depict spécifie Ab staining in the absence of stimulus and open histograms
represent spécifie Ab staining in the presence of OM-197. One représentative experiment out of eight is shown.
established that OM-197 (20 |4g/ml) induced a clear
upregulation of HLA-DR, CD40, CD54, CD80, CD83
3.3. OM-197-induced DC maturation increases DC
capacity to elicit a primary immune response
and CD86 on these cells, this effect being comparable
to DC phenotypic maturation observed in response to
LPS (1 pg/ml). Moreover, we observed that OM-197
(20 pg/ml) induced the production of IL-12 (p40), IL12 (p70) and TNF-a by monocyte-derived DC, the
cytokine levels being lower than those obtained after
LPS stimulation (Table 3).
To analyze the conséquence of OM-197-induced
DC maturation at the T cell level, OM-197-activated
DC were tested for their ability to stimulate an in vitro
primary CD4'^T cell response. For that purpose, HBs
was used as a model of primary Ag and HBs-specific
CD4"^T cell responses were monitored in blood donors
Table 2
Phenotype of monocyte-derived DC exposed to OM-197 or LPS
Stimulus
HLA DR
CD40
CD54
CD80
CD83
CD86
Medium
OM-197
LPS
370 ±234
711 ±406**
768 ±461
142 ±99
480 ± 325*
519±319
185 ±89
351 ± 149**
362 ±138
48 ±47
112 ± 117*
116± 113
11 ± 6.6
45 ± 22*
53 ±28
99 ± 109
428 ± 402*
454 ± 426
DC were cultured ovemight with OM-197 (20 pg/ml) or LPS (1 pg/ml), or in medium atone. DC were analyzed by flow cytometry for the
surface expression of the indicated molécules. Data represent mean ± S.D. of médian fluorescence intensity of 12 independent experiments on
different donors. P value are for comparison between OM-197-stimulated and unstimulated blood samples.
* P vainc <n ns
**P value<0 01
value <0.001.
B. Byl et ai / International Immunopharmacology 3 (2003) 417-425
423
Table 3
Production of cytokines by monocyte-derived DC exposed to OM-197 or LPS
Stimulus
IL-12 (p40) (pg/ml)
IL-12 (p70) (pg/ml)
TNF-a (pg/ml)
Medium
OM-197
LPS
248 (32-3028)
19,968 (3365-96,495)**
71,950 (6220-273,000)’
<2(<2 to <2)
65 (0-1045)*
237 (18-1733)’
402 (148-4028)
17,885 (5050-73,800)**
65,525 (14,805-181,600)’
DC were generated from PBMC and cultured at 5 x lO’ DC/ml ovemight with OM-197 (20 pg/ml) or LPS (1 gg/m!) or medium alone.
Cytokine levels in culture supematants were assayed by ELISA and expressed in pg/ral. Data represent médian (range) of 12 independent
experiments on different donors.
*P value <0,01 for comparison between medium alone and OM-197 stimulation.
**P value<0.0001 for comparison between medium alone and OM-197 stimulation.
* P value<0.01 for comparison between OM-197 and LPS stimulation.
* P value<0.001 for comparison between OM-197 and LPS stimulation.
naive for hepatitis B virus. Monocyte-derived DC
were loaded with HBs (10 pg/ml) for 2 h and then
activated by OM-197 (20 pg/ml). After 16 h, DC were
washed and seeded in culture with autologous CD4"^T
cells. After 4 days, we measured the number of IFN7-secreting CD4‘^T cells per lO'’ CD4’^T cells after
their stimulation with either DC alone or OM-197-
+
Q
O
activated DC or HBs-pulsed DC or HBs-pulsed/OM197-activated DC. As shown in Fig. 5, OM-197activated DC were able to induce higher numbers of
HBs-specific CD4"^T cells secreting IFN-y than unactivated DC (Fig. 5). The médian (range) of IFN-ysecreting cells for 10*’ CD4'^cells were 20 (0-50), 37
(6-103), 33 (10-40) and 125 (83-312) for medium
alone, OM-197 stimulation without HBs Ag, HBs Ag
without OM-197 and association of HBs Ag with
OM-197, respectively. The différences between OM197 alone and OM-197 assoeiated with HBs Ag, or
HBs Ag alone and OM-197 assoeiated with HBs Ag
were significant with P values of 0.0087 and 0.0022,
respectively.
O
CO
4. Discussion
The recent insights into proinflarmnatory signais
(N
O'
Fig. 5. OM-197 promotes the expansion of IFN-y-secreting HBs
Ag-specific CD4'T lymphocytes from naive individuals. Monocytederived DC were incubated for 2 h in medium alone or with HBs
(10 pg/ml) and then stimulated ovemight with OM-197 (20 pg/ml),
After washing, DC were seeded in cultures with autologous CD4'T
cells at 1;10 responder to stimulator ratios. Aller 4 days culture,
cells were transferred on ELISPOT plates for énumération of IFN-ysecreting CD4 T cells. Results are expressed as number of IFN--ysecreting cells for 10* CD4D' lymphocytes. Data represent six
independent expcnincMls fKiiii differeni donors négative for anti
HBs, anti-HBc and HBs antigcii. Boxes are for interquarliles and
bars for ranges.
hâve opened the way to a more rational design of
immunoadjuvants. This is of major interest in view of
the urgent need of adjuvants able to elicit strong and
lasting T cell immunity as required to prevent HFV
infection and to mount efficient anti-tumor responses.
To elicit a broad immune response and to complété the
humoral response with a strong eellular component,
the wish is now to formulate adjuvants able to induee
Thl cytokine production. Monophosphoryl lipid A,
bacterial DNA as well as virus-like particles are
currently developed for this purpose.
Immunostimulatory adjuvants eould stimulate the
initial step of the immune response by mimicking
Thl-inducing signais naturally pruvided by certain
bacteria and viruses. The sliinulation of innate
immunity by bacterial produets represents indeed an
424
B. Byl el al. / International Immunopkarmacology 3 (2003) 417-425
important step for the development of spécifie im­
mune responses [11]. LPS is a potent immunomodulator agent, but its médicinal use is limited because of
its toxicity including the induction of systemic inflammatory response syndrome. Other bacterial- or viralderived molécules providing signal are available such
as CpG oligonucleotides or lipid A mimetics, both
under investigation for their adjuvants properties [1215]. LPS adjuvant activity résides indeed in the lipid
A portion. Structural and conformational différences
between LPS and numerous semi-synthetic dériva­
tives modify the ability to induce endotoxin effect as
measured by Limulus amoebocyte lysate or to produce
cytokines [16]. Monophosphoryl lipid A (MPL), an
produce IL12-p70 seems related to the ability to
stimulate TLR-4 [19], OM-197 appears thus as a
potential ligand for TLR-4. However, considering
the triacylated structure of OM-197, TLR-2 could
also be involved in its récognition, as TLR-2 appears
to recognize lipoproteins derived ffom bacteria, mycobacteria or yeasts, characterized by a triacylated NHotenninal residue [4].
Although the relevance of these in vitro data to the
pharmaceutical development of OM-197 needs to be
validated in an in vivo model, we suggest that OM197 should be considered as a promising adjuvant to
elicit Th 1 immune response.
acylated diglucosamine dérivative of lipid A front
Salmonella minnesota was shown to display greatly
Acknowledgements
reduced toxicity while retaining immunomodulatory
properties [15]. Other lipid A mimetics such as OM174, a semi-synthetic triacylated lipid A, or GLA-60,
This study was supported by OM-Phanna, Meyrin,
Switzerland.
a synthetic triacylated monosaccharide lipid A, harbor
immunomodulatory effects without endotoxin activity
[8,17]. By comparison with natural products, syn­
Référencés
thetic compounds présent numerous advantages. Their
Chemical structure can be modified to resuit in
enhanced biological activity, stability and safety, and
they are also ffee of any biological contaminants.
OM-197 shows structural similarities with semi-syn­
thetic dérivatives of lipid A and is devoid of endo­
toxin activity as measured by Limulus assay. In the
présent study, we demonstrated that OM-197 induced
a potent phenotypic maturation of myeloid DC naturally présent in blood as well of DC generated ffom
monocytes. Moreover, we found that OM-197 activated myeloid DC to produce large amounts of TNFa and IL-12, both IL-12 (p40) and bioactive IL-12
(p70) wliich is critical for the induction of a Thloriented immune response [5]. This contrasts with
MPL which was shown to be a weaker inducer of DC
maturation and IL-12 synthesis [18]. Consistent with
the OM-197-induced IL-12 synthesis, OM-197-activated DC were more efficient than unactivated DC to
expand IFN-y-secreting HBs Ag-specific CD4’' T lym­
phocytes fi'om naive individuals.
Additional studies are needed to détermine the
membrane target of OM-197 on human DC. However,
the Chemical similarity of OM-197 with lipid A
dérivatives suggests that Toll-like receptors could be
involvcd in its slimulatory effects. As the ability to
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5.
Discussion
5.1. Introduction
Depuis la première publication de Jenner en 1798 rapportant le succès de la vaccination
contre la variole, la mise au point successive d’un grand nombre de vaccins a permis une
réduction impressionnante de l’incidence de nombreuses maladies infectieuses. L’éradication
totale de la variole en 1980 représente le premier succès en principe définitif de cette
approche, et l’on a observé une réduction de plus de 90% des cas de maladies telles que la
rougeole, le tétanos, la rubéole, les oreillons, la fièvre jaune, la coqueluche, la poliomyélite,
les infections k Haemophilus influenzae, la diphtérie,... parmi les populations vaccinées. Les
recommandations américaines proposent ainsi actuellement la vaccination des enfants contre
pas moins de treize micro-organismes infectieux [Atkinson et al. 2002]. En Belgique, le
schéma vaccinal de base recommandé par le Conseil Supérieur d’Hygiène en 2003 comporte
la vaccination contre dix micro-organismes ou toxines bactériennes auxquels s’ajoutent des
vaccins complémentaires pour certains groupes à risque. Deux grandes stratégies ont été
initialement développées : celle de l’atténuation de l’agent infectieux et celle de l’inactivation
de celui-ci. Au caractère empirique des premiers vaccins, dont le critère biologique
d’efficacité
consistait
essentiellement
en
l’apparition
d’anticorps
titrables,
succède
actuellement une approche basée sur une meilleure connaissance de l’immunophysiologie de
la réponse immune et de la cascade qui conduit de la présence de l’alloantigène à la réponse
cellulaire et humorale.
La complexité des différents mécanismes immunopathologiques et les tentatives de
développement vaccinal qui en dérivent sont illustrées par l’approche vaccinale menée contre
le RSV ou Bordetella pertussis. Les premiers vaccins mis au point contre le RSV, composés
d’un virus inactivé et d’un adjuvant à base d’aluminium, ont induit une exacerbation des
signes respiratoires lors de l’exposition ultérieure à l’infection naturelle. Cette exacerbation de
la présentation clinique a été attribuée à l’induction d’une réponse de type 2, en conséquence
de quoi l’approche actuelle consiste à forcer la réponse vers une réponse de type 1 par le
choix de l’adjuvant [Hancock et al. 2003], En ce qui concerne l’infection à Bordetella
pertussis, on a d’abord considéré que la protection était obtenue par le développement d’une
réponse humorale après administration du vaccin cellulaire. Il est cependant apparu par la
66
suite que la protection n’était pas corrélée au taux d’anticorps obtenu, et que par contre
l’infection naturelle induisait une puissante réaction immunitaire de type cellulaire.
L’intolérance relative au vaccin cellulaire et l’insuffisance de couverture vaccinale qui en
résultait ont conduit à son remplacement progressif par les vaccins acellulaires. Ils utilisent
comme cible antigénique la FHA (filamentous haemagglutiniri) qui est une des protéines
impliquées dans l’adhésion de la bactérie aux cellules épithéliales, et la toxine impliquée dans
les conséquences cliniques de l’infection. Ce vaccin induit une réponse plus orientée que le
vaccin cellulaire vers le type Th2 caractérisée par un taux élevé d’anticorps. Par comparaison
avec le vaccin cellulaire, le vaccin acellulaire induit une élimination du pathogène plus lente
lors d’une inoculation chez l’animal. Cependant, il est associé à un taux de protection
vaccinale en clinique identique à celui du vaccin cellulaire [Bamard et al 1996] sans pour
autant induire plus de problèmes atopiques [Maitra et al. 2004].
La difficulté de l’évaluation de la réponse vaccinale est également illustrée par la controverse
actuelle concernant la nécessité d’administrer un rappel d’antigène HBs chez les sujets chez
qui, après qu’un taux élevé initial d’anticorps ait été obtenu, le taux résiduel devient
indétectable [Banatvala and Van Damme 2003]. Des éléments épidémiologiques indiquent
qu’au-delà de cette disparition, une réponse cellulaire efficace persiste.
Les vaccins efficaces disponibles actuellement partagent deux caractéristiques principales: ils
induisent une réponse
en anticorps capables
de reconnaître
des micro-organismes
responsables d’infections aiguës, et les micro-organismes concernés sont caractérisés par une
grande stabilité antigénique telle que celle observée pour les virus de la poliomyélite ou de la
variole. Dans de nombreuses autres situations, telles que les infections virales chroniques dont
le prototype est l’infection par le VIH, mais aussi les infections causées par des micro­
organismes intracellulaires ou les affections cancéreuses, la génération d’une réponse immune
spécifique permettant l’éradication du micro-organisme infectieux ou de la tumeur se révèle
infiniment plus difficile. En ce qui concerne par exemple la prévention de l’infection par le
VIH, ni l’utilisation de virus atténués ou inactivés, ni l’utilisation de protéines recombinantes,
n’ont été, jusqu’à présent, couronnées de succès.
Malgré des efforts multiples et soutenus, les recherches en vue d’obtenir un vaccin
prophylactique vis-à-vis de maladies telles que la tubereulose, l’infection par le VIH ou la
malaria n’ont toujours pas abouti, alors que naît de surcroît le besoin de vaccins
thérapeutiques qui pourraient contribuer à contenir voire à guérir des maladies chroniques
telles que certaines infections ou néoplasies. Outre les exemples ci-dessus, des vaccins
67
efficaces sont également toujours attendus pour la leishmaniose, les schistosomiases, la
dengue, le RSV, l’EBV, le CMV, le rotavirus, l’HSV, les papillomavirus,...
L’infection par le VIH, la malaria, l’hépatite C et la tuberculose partagent d’intéressantes
similitudes en terme d’approche vaccinale. En effet, tant les données épidémiologiques que
les résultats des premiers essais vaccinaux soulignent l’importance non seulement d’une
fonction helper mais également d’une puissante activité CTL pour maîtriser l’infection (revu
dans [Esser et al 2003]).
La mémoire immunitaire des lymphocytes CD4+ peut se maintenir par la présence
d’antigènes sous forme inerte, stockés sous forme de complexes immuns, au niveau des
cellules dendritiques folliculaires ou dans des granulomes. Pour obtenir le développement
d’une puissante CTL, les vaccins devraient pouvoir induire, outre des anticorps neutralisants,
la présentation par la voie du MHC de classe I de peptides générant une réponse persistante en
lymphocytes CD8+. Le maintien de lymphocytes CD8+ mémoires pourrait dépendre de la
persistance de l’infection et l’activation continue des lymphocytes T qui en résulte
[Zinkemagel 2003]. En effet, la présentation par le MHC de classe I dépend essentiellement
de la synthèse intracellulaire de l’antigène. De façon finaliste et évolutionniste, la persistance
de la CTL envers certains pathogènes contribue à contenir l’infection à bas bruit en instaurant
un subtil équilibre entre infection et immunité. Cet équilibre entre infection et immunité induit
une activation permanente du système immunitaire non spécifique par la production de
cytokines, l’activation des macrophages, etc. L’échec de certaines approches vaccinales visant
à induire une CTL provient peut-être alors du fait que l’agent infectieux vaccinal ne persiste
pas suffisamment longtemps.
L’élaboration de vaccins possédant cette puissante CTL nécessite tout à la fois de maîtriser le
suivi de la réponse immune, d’utiliser ce suivi pour étudier l’effet des différentes approches
d’immunomodulation, et enfin de sélectionner les techniques d’immunomodulation orientant
la réponse dans le sens pressenti comme le plus efficace. Ceci nécessite la capacité à évaluer
plus finement la réponse immune en ne se contentant pas de la simple mesure du taux
d’anticorps
68
5.2. Suivi de la réponse immune
En complément du suivi traditionnel de la réponse immune par la mesure de la production
d’anticorps, l’évolution technologique a permis le suivi de la réponse cellulaire. L’analyse du
profil de cette réponse suite à une stimulation antigénique a souffert cependant du manque de
sensibilité des techniques telles que la mesure de la production de cytokines dans les
surnageants de culture ou la détection de cytokines intracellulaires par cytométrie de flux.
Ceci explique que beaucoup de travaux, notamment parmi ceux orientés sur l’étude de
l’équilibre Thl / Th2, ont été réalisés soit en utilisant des stimulations polyclonales puissantes
telles que celles induites par la phytohémagglutinine, soit en étudiant la production de types
cellulaires particuliers tels que des clones. La technique ELISPOT permet la détection de
petits nombres de cellules sécrétrices et permet l’étude de systèmes plus physiologiques tels
que la stimulation antigénique. Elle a été d’abord mise au point dans l’étude des cellules
productrices d’anticorps et a ensuite été adaptée à l’étude des cellules sécrétrices de cytokines
[Czerkinsky et al. 1988]. Cette technique est souvent plus sensible que la technique ELIS A, et
est plus spécifique que la détection de cytokines intra-cytoplasmiques [Kabilan et al. 1990].
Ceci est probablement dû au fait que cette dernière technique détecte également des cellules
qui ont internalisé la cytokine comme démontré pour l’mSf-y [Akdis et al. 1995], ou des
cellules qui l’ont produite mais ne l’excrètent pas. L’influence de la capture de la cytokine sur
les résultats de dosages en surnageant de culture est également apparue dans nos mains lors de
la mesure de la production d’IL-4 par ELIS A. Nous avons en effet pu modifier la mesure
apparente de la production d’IL-4 en ajoutant dans le surnageant un anti-récepteur soluble de
cette cytokine.
L’ELISPOT tire avantage de la production de cytokines spécifiques d’un antigène pour
permettre la visualisation directe et l’énumération des cellules répondant à cet antigène. De
plus, l’ELISPOT n’énumère que les cellules spécifiques d’un antigène qui effectivement
produisent la cytokine, et non pas les lymphocytes spécifiques mais éventuellement non
fonctionnels qui sont détectés au même titre que les cellules fonctionnelles par la technique de
la liaison par les complexes MHC de classe I tétramériques. Plus récemment, nous avons
également pu mettre en évidence la sensibilité de la Real Time PCR réalisée en sang total
après stimulation ex vivo, dans le suivi de la réponse immune secondaire [Stordeur et al.
2003], technique que nous investiguons actuellement dans un modèle de réponse primaire.
69
5.3. Altérations de la réponse immune au cours de l’infection par le VIH
Au cours de l’infection par le VIH, de nombreuses fonctions immunitaires présentent des
anomalies. Certaines des protéines virales contribuent directement aux altérations observées.
C’est le cas notamment des gpl60, gpl20, gp41 et p24, des protéines nef, et tat. En
particulier, tat inhibe la réponse des lymphocytes CD4+ à l’anatoxine tétanique [Chirmule et
al. 1995], induit l’expression du Pas ligand sur les macrophages, et se lie également avec
haute affinité au CD26, molécule d’activation des lymphocytes T impliquée dans la réponse
immune spécifique [Gutheil et al. 1994]. Nef
tat induisent une diminution d’expression des
molécules HLA de classe I, qui induit la diminution de la réponse cytotoxique des
lymphocytes CD8+, tandis que en outre tat inhibe la fonction cytolytique des cellules NK par
interaction avec la voie de transmission intracellulaire (revu dans [Brander and Walker
1999]). Une des caractéristiques principales de l’infection par le VIH est d’induire une
diminution du nombre de lymphocytes CD4+. Le VIH infecte préférentiellement les
lymphocytes CD4+ spécifiques des antigènes du VIH [Douek et al. 2002] et en particulier la
sous-population exprimant le CCR5, qui prédomine au niveau des muqueuses respiratoires,
génitales et digestives [Douek et al. 2003]. Il en résulte une déplétion très rapide de la
population des lymphocytes CD4+ au niveau des muqueuses dans les premières semaines de
l’infection. Au décours de la phase aiguë, la déplétion en lymphocytes CD4+ se poursuit
lentement au niveau de l’ensemble du tissu lymphoïde.
En plus de la diminution du nombre de lymphocytes CD4-I-, l’infection par le VIH est
caractérisée par l’apparition de défauts fonctionnels tant des lymphocytes CD4+ que CD8+,
mais également des lymphocytes B, des cellules présentatrices d’antigènes et des lymphocytes
yô [Lane et al. 1985; Shearer et al. 1986; Hofinann et al. 1987; Miedema et al. 1988; Martini
et al. 2002]. Plusieurs travaux ont mis en évidence un défaut de prolifération des lymphocytes
CD4+ et CD8+ lié à un défaut d’activation du TCR et un défaut de la fonction helper vis-à-vis
des lymphocytes B. La perte de la réponse à une stimulation du TCR est liée à un défaut dans
la production d’IL-2 et peut d’ailleurs être compensée par l’adjonction d’IL-2 ou par une
costimulation par la voie du CD28 [Gruters et al. 1990]. Certaines anomalies lymphocytaires
ne sont cependant pas liées à la diminution de la production d’IL-2, comme en témoigne la
persistance d’anomalies phénotypiques malgré l’exposition à l’IL-2 [Sieg et al. 2003].
70
La perte de la réponse à un antigène de rappel est une des premières altérations de la réponse
immune au cours de l’infection par le VIH. Elle précède l’altération de la réponse aux
alloantigènes HLA et ensuite celle de la réponse aux mitogènes [Meyaard et al 1993], Les
lymphocytes T se comportent au cours de l’infection par le VIH comme dans un état
d’anergie vis-à-vis des antigènes de rappel, et la stimulation par des APC autologues ne
conduit pas à la production d’IL-2. Les antigènes de rappel tels que l’anatoxine tétanique
activent exclusivement les lymphocytes CD4+ [Via et al 1990], ce que nous avons confirmé
en montrant que la déplétion en lymphocytes CD4+ annihile la production de cytokines en
réponse à l’anatoxine tétanique. La différence entre les voies d’activation de ces antigènes et
des allo-antigènes HLA, dont les réponses prolifératives peuvent utiliser soit les lymphocytes
CD4 soit les lymphocytes CD8, explique peut-être la persistance de la réponse aux allo­
antigènes HLA plus longtemps au cours de la maladie. Différents mécanismes pourraient
intervenir : effet délétère d’une modification de production de cytokines sur une des voies
conduisant à la présentation (le TGF-P par exemple désactive les monocytes), insuffisance du
signal de costimulation ou déficience en cystéine conduisant à une diminution de la
concentration intracellulaire de glutathion. En étudiant la réponse aux allo-antigènes HLA
dans un modèle de présentation par des allo-APC incluant notamment des allo-APC de
jumeaux homozygotes non infectés par le VIH, Clerici et al ont pu montrer que le défaut de
réponse réside au niveau du lymphocyte T helper, mais qu’une réponse aux allo-antigènes
peut cependant être initiée par les allo-APC. Ceci suggère que le défaut de réponse des
lymphocytes CD4+ peut peut-être être compensé par une densité plus importante d’allodéterminants sur l’allo-APC [Clerici et al. 1991].
Chez les patients chroniquement infectés par le VIH, la production d’fFN-y en réponse à la
stimulation polyclonale par la PHA est également le reflet de la stimulation de la population
des lymphocytes CD8+ et de la population des lymphocytes NK dont l’activation est
cependant moindre qu’à la phase de séroconversion [Graziosi et al. 1994; Caruso et al. 1995;
Caruso et al. 1996; Klein et al. 1997]. Des données très contradictoires existent concernant la
production d’IL-4 des lymphocytes de patients infectés par le VIH, après stimulation
spécifique ou non. La plupart de ces données ont été obtenues à l’aide de stimulations
polyclonales ou sur des populations clonales. Maggi et al ont ainsi pu mettre en évidence la
production d’IL-4 par des clones dérivés de lymphocytes CD8+ chez des patients au stade
avancé de l’infection par le VIH [Maggi et al. 1995]. Les résultats obtenus dans ces modèles
ne doivent ainsi être comparés qu’avec la plus grande prudence à ceux obtenus en stimulation
antigénique. En effet, il n’y a pas de similitude automatique entre la production de cytokines
71
par une stimulation polyclonale et une stimulation antigénique [Imada et al. 1995], D’autre
part, la production de cytokines en réponse à une stimulation polyclonale reflète la capacité
intrinsèque des lymphocytes, alors que la stimulation antigénique permet d’explorer la
résultante de cette capacité, du micro-environnement et des signaux régulateurs émis par les
cellules présentatrices d’antigènes. La production d’EL-4 en réponse à une stimulation
antigénique n’a cependant pas été fréquemment étudiée, notamment à cause du faible nombre
de cellules sécrétant cette cytokine et des faibles quantités produites en surnageant. L’analyse
du nombre de cellules sécrétrices par la méthode ELISPOT nous a permis une analyse fine de
cette production.
Nous avons montré que la réponse à la stimulation par la PHA chez les patients
infectés par le VIH était accompagnée d’une production d’IFN-y comparable à celle de sujets
contrôles, tandis que nous avons noté un effondrement de la production d’IL-4. Par contre, en
réponse à une stimulation antigénique, tant la proportion de cellules sécrétrices d’IFN-y que
celle de cellules sécrétrices d’IL-4 étaient profondément diminuées chez les patients infectés,
et ceci même en corrigeant pour le nombre de lymphocytes CD4+. Nos expériences de
stimulation de suspensions cellulaires déplétées en lymphocytes CD4+ ont mis en évidence
que seuls les CD4+ représentent une source significative d’IL-4 tant en stimulation
antigénique que mitogénique. Les différences de production de cytokines que nous avons
observées sont donc essentiellement le reflet d’une altération de la production de cytokines
par la sous-population des lymphocytes CD4+. Nous avons montré qu’après administration
d’un rappel d’anatoxine tétanique, la réponse immune en production d’EFN-y restait inférieure
à ce qui était observé chez les témoins. Nous avons également montré qu’en réponse à ce
rappel, alors que la plupart des sujets contrôles voient le nombre de leurs lymphocytes CD4-Isécrétant de l’IL-4 après restimulation in vitro augmenter, ce n’est le cas que d’une minorité
de patients infectés par le VM. De façon intéressante, chez les deux patients chez qui nous
avons détecté une réponse importante en nombre de cellules sécrétrices d’IL-4, la production
d’IFTSl-y était également importante. Enfin, nous avons observé une réponse en anticorps de
moindre amplitude chez les patients infectés par le VEH par rapport aux sujets contrôles, et
l’absence de corrélation entre la réponse en anticorps d’une part et la réponse en nombre de
cellules productrices de cytokines d’autre part. Ce dernier point pourrait s’expliquer pai‘ la
participation à la stimulation des lymphocytes B de cytokines que nous n’avons pas
investiguées telle que l’EL-13 [Zou et al. 1997] ou par une différence entre les cytokines
72
produites par les lymphocytes circulants et la stimulation au niveau des ganglions
lymphoïdes.
Ces différentes observations indiquent que, chez le patient infecté par le VIH, la
production à l’échelon cellulaire tant d’IL-4 que d’EFN-y spécifique d’un antigène dépendant
des lymphocytes CD4+ décroît, et ce d’autant plus que la maladie progresse. Ceci démontre
que la détérioration de la réponse immune chez le sujet infecté par le VIH n’induit pas un
shift vers un profil Th2, comme suggéré par certains auteurs [Clerici et al. 1993a; Meyaard et
al. 1996], mais plutôt une atteinte diffuse de la réponse y compris dans les populations de type
Th2. Le déficit mis en évidence dans la production d’IL-4 est à rapprocher de l’hypothèse de
linéarité dans la polarisation des types lymphocytaires évoquée plus haut. Faut-il voir dans ce
déficit de production d’EL-4 le facteur responsable du déficit en production d’EFN-y ?
La production d’EL-12, cytokine centrale dans l’activation du système immunitaire, est
profondément altérée durant l’infection par le VIH. La diminution de production en réponse à
un stimulus bactérien est dépendante de l’infection par le VIH elle-même, et ne semble pas
secondaire à un phénomène d’immunorégulation [Chehimi et al. 1994]. Cette diminution ne
s’accompagne pas d’une régulation négative par hyperproduction d’IL-10, ni d’une
diminution linéaire de la production de toutes les cytokines, puisque notamment l’IL-ô est
produite en quantité plus importante dans ce modèle chez les patients infectés par le VEH.
L’adjonction d’IL-12 exogène mais aussi d’anti-EL-10 restaure la production d’EFN-y et d’IL2 en réponse à la stimulation par des antigènes viraux ou des antigènes de rappel de PBMC de
patients infectés par le VIH [Clerici et al. 1993b; Clerici et al. 1994; Daftarian et al. 1995;
Landay et al. 1996; Uherova et al. 1996]. L’adjonction d’EL-15 exerce le même effet [Seder et
al. 1995]. L’adjonction d’IL-15 aux PBMC de patients infectés par le VEH augmente en outre
la cytotoxicité des cellules NK, la prolifération en réponse à une stimulation mitogénique ou
antigénique et restaure la production d’IL-12 [Chehimi et al. 1997].
La diminution de production d’EL-12 est observée en réponse à de nombreux stimuli tels que
le LPS, l’acide lipoteichoique des bactéries à Gram positif, et d’autres antigènes bactériens ou
fungiques. Elle touche l’expression des deux sous-unités de l’IL-12, semble induire une
diminution de l’expression du récepteur membranaire à ril..-12, elle-même responsable d’une
diminution de production d’EFN-y [Marshall et al. 1999]. Ceci oriente vers un défaut au
niveau des cellules présentatrices d’antigènes. Parmi celles-ci, les cellules dendritiques jouent
un rôle important quoique controversé dans la pathogénie de l’infection [Lore and Larsson
73
2003]. Par l’étude de jumeaux homozygotes, il apparaît que dans la relation entre CD et
lymphocytes helper, la CD du patient infecté garde toute sa compétence dans la présentation
de l’antigène au cours d’une réponse secondaire in vitro, contrastant avec les capacités
altérées du lymphocyte T à produire de l’IL-2 [Blauvelt et al. 1996]. Si certains travaux
suggèrent que les CD puissent également être infectées, [Macatonia et al. 1990; Langhoff et
al. 1991; Macatonia et al. 1992], d’autres données ne vont pas dans ce sens [Cameron et al.
1992; Karhumaki et al. 1993]. Les cellules dendritiques exposées au virus expriment des
particules virales infectantes à leur surface et sont capables dans un second temps d’infecter
des lymphocytes CD4+ autologues [Ludewig et al. 1995]. Par contre, les autres cellules
présentatrices d’antigènes que sont les lymphocytes B et les monocytes semblent incapables
d’induire l’infection des lymphocytes CD4+ par ce mécanisme. La possibilité pour des
cellules dendritiques matures d’adsorber des particules virales à leur surface et de les
présenter aux lymphocytes CD4+ est une propriété importante de ces cellules étant donné leur
rôle fonctionnel. Deux mécanismes distincts ont été récemment démontrés : d’une part,
l’infection des cellules dendritiques par le VIH qui peut être bloquée par le RANTES ou un
anti-CD4, et d’autre part la capture virale suivie de présentation [Blauvelt et al. 1997]. Les
molécules d’adhésion telles que le CD54 et le CDlla semblent jouer un rôle important dans
cette dernière voie [Fujiwara et al. 1999].
Au cours de l’infection par le VIH, on constate une diminution du nombre et de la
fonctionnalité des CD [Knight et al. 1997; Lore and Larsson 2003]. En comparaison avec des
CD de sujets sains, les CD de patients infectés par le VIH présentent une expression diminuée
du CD86 et CD40, et l’absence d’expression des CD83 et CD80. Les CD matures, par leur
capacité de présentation, contribuent plus que les immatures à la dissémination du VIH. Le
déficit de maturation observé durant l’infection participe peut-être à la limitation de cette
propagation du virus, mais aux dépens de la capacité à induire une réponse cellulaire.
L’expression des récepteurs des CD peut être restaurée in vitro, à l’exception de celle du
CD83 [Mcllroy et al. 1998]. En plus de la diminution du nombre de CD, la proportion de
celles-ci exprimant le CD 11c, la fi-action myéloïde, est également diminuée [Grassi et al.
1999]. La susceptibilité des CD à l’infection par le VIH semble être hétérogène, comme en
témoigne la plus grande susceptibilité des CD exprimant le CDllc, associée à une expression
plus élevée du co-récepteur CXCR4 [Patterson et al. 1999].
74
5.3.1. Restauration de la fonction immune
Plusieurs études ont mis en évidence une restauration de certains paramètres immunitaires au
cours du traitement de l’infection par le VIH (revues par [Brander and Walker 1999]). Autran
et al ont montré qu’au cours du traitement par Highly Active AntiRetroviral Therapy
(HAART), on pouvait assister à une récupération fonctionnelle en plusieurs étapes : (1)
augmentation du nombre de lymphocytes T mémoires circulants, (2) diminution de
l’activation des lymphocytes, (3) augmentation du taux de lymphocytes T naïfs, et (4)
diminution du nombre de lymphocytes CD8+ [Autran et al 1997]. Si l’augmentation initiale
rapide du nombre de lymphocytes T mémoires suggère plus une redistribution d’un
compartiment non accessible vers le compartiment sanguin, la réapparition de cellules naïves
dans un délai plus long suggère une nouvelle différenciation à partir de précurseurs
thymiques. Une telle différenciation de nouvelles cellules naïves au départ du thymus a
d’ailleurs été démontrée au cours de la HAART [Douek et al. 1998], La récupération du
nombre de lymphocytes CD4+ semble concerner cependant essentiellement les lymphocytes
mémoires [Evans et ai 1998a], et une participation extra-thymique dans la restauration des
lymphocytes CD4+ a été récemment mise en évidence [Pido-Lopez et al. 2003]. La
combinaison de l’administration d’un puissant traitement anti-rétroviral et d’IL-2 permet
d’atteindre la restauration d’un nombre important de lymphocytes CD4+ chez des patients ne
répondant pas à la HAART. La réponse à l’administration d’IL-2 en association avec un
traitement anti-rétroviral est cependant dépendante du nadir des lymphocytes CD4-I-,
suggérant une irréversibilité dans la perte de ceux-ci [Markowitz et al. 2003]. Parmi les
paramètres améliorés par la HAART, on peut encore citer la récupération, mais seulement
partielle, de la CTL aux antigènes de rappel, alloantigènes et mitogènes [Blazevic et al. 2000;
Amiel et al. 2000], ainsi que la normalisation de Tactivation immune du tissu lymphoïde
démontrée par la diminution de la production d’IFN-y, d’ILl-a et ILl-p [Behbahani et al.
2000] et par une diminution de l’expression du CD40L, 0X40 et Pas au niveau des
lymphocytes [Sousa et ai 1999]. L’administration d’AZT en monothérapie induit une
augmentation du nombre de cellules dendritiques et augmente leur capacité à stimuler des
lymphocytes [Gompels et al. 1998]. Administrée au cours de l’infection aiguë, la HAART
permet la persistance d’une puissante CTL spécifique au VIH, tandis que cette CTL diminue
75
chez les patients chez qui la HAART est débutée plus tard dans l’évolution de la maladie
[Oxenius et al. 2000].
Certaines anomalies de la fonction immune ne semblent cependant pas être réversibles par la
HAART. Ainsi, si le nombre de cellules dendritiques revient à la normale, l’expression du
CDllc reste altérée chez les patients traités [Grassi et al
1999]. On observe également la
persistance d’une diminution de la production d’IL-2, IL-12 et IFN-y en réponse à des
stimulations antigéniques [Clerici et al. 2000] et une dissociation entre une récupération de
l’immunité cellulaire et la persistance d’une production réduite d’IL-2 [Alfonzo et al. 2003].
Cette dissociation pourrait être liée à une présentation d’antigène suboptimale par les APC.
Au niveau de la population des lymphocytes yô, la reconstitution immune n’est pas complète,
et, malgré la HAART, les proportions relatives des lymphocytes Vôl et Vô2 restent altérées
[Pôles et al. 2003].
On peut conclure que les schémas actuels de HAART conduisent à une restauration partielle
de la réponse immune. Celle-ci semble suffisante pour réduire de façon significative le risque
d’infection opportuniste. Par contre, tant la réponse à des antigènes de rappel que la réponse à
de nouveaux antigènes restent altérées [Lederman et al. 2003].
5.3.2. Approche vaccinale
Malgré de nombreux progrès réalisés dans la compréhension de la réponse immunitaire à
l’infection par le VIH, la mise au point d’un vaccin bute sur de nombreuses difficultés. Parmi
celles-ci, on peut notamment citer la diversité antigénique du virus, l’absence de modèle
animal pertinent et l’absence de marqueurs immunologiques de protection. A ces facteurs
s’ajoute en outre toute la dimension éthique de l’expérimentation des vaccins potentiels.
Malgré ces difficultés, de nombreuses études ont contribué à tracer les voies qui semblent les
plus prometteuses.
•
Plusieurs travaux ont mis en évidence une CTL anti-VIH chez des patients chez qui le
virus n’a pas pu être détecté, et qui n’ont pas évolué en plusieurs mois ou années vers une
infection détectable, ce qui suggère qu’ils ont peut-être réussi à éliminer le virus.•
•
L’apparition précoce de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d’antigènes du VIH est
détectée chez la grande majorité des patients [Koup et al. 1994; Borrow et al. 1994;
76
Musey et al. 1997], Le peptide env paraît particulièrement immunogène puisque des
lymphocytes cytotoxiques sont détectés chez 80 à 100 % des patients étudiés. De
nombreux épitopes d’autres protéines virales induisent également une réponse cytotoxique
des lymphocytes CD8 {env, gag, pol, nef, vif). L’absence de réponse cytotoxique
lymphocytaire est associée à une virémie et à une symptomatologie clinique persistante
ainsi qu’à une chute précoce des lymphocytes CD4+, tandis que de nombreuses études
suggèrent un rôle important de la CTL dans le contrôle initial de la virémie [Yasutomi et
al. 1993; Rosenberg et al. 1997]. Cette CTL est dépendante d’une fonction helper
compétente [Rosenberg et al 1997]. Au cours de l’évolution de l’infection par le VIH, on
observe une diminution progressive de la réponse des lymphocytes T cytotoxiques.
Plusieurs mécanismes (revus dans [Geretti et al. 1996]) ont été proposés pour expliquer ce
déclin, parmi lesquels une altération de la fonction des APC, l’infection des lymphocytes
CD8+, la variation antigénique du virus, l’atteinte de la population des lymphocytes T
helper. Curieusement, les patients co-infectés par le VIH et le virus d’Epstein-Barr
perdent plus volontiers leur CTL spécifique du VIH que celle du virus d'Epstein-Barr
[Geretti et al
1996]. Une explication pourrait être que cette dernière dépend moins de
l’effet helper des lymphocytes CD4+ que la CTL vis-à-vis du VEH. L’intensité et la
polyclonalité de la réponse T cytotoxique seraient des facteurs associés à un meilleur
pronostic.
O
Suite à l’observation de la puissante CTL induite lors de la primo-infection par le VIH, de
son rôle dans la diminution de la charge virale, et de la mise en évidence d’une
cytotoxicité vis-à-vis du VIH chez des sujets exposés à l’infection et qui semblent donc
l’avoir contrôlée, il est généralement admis qu’une réponse vaccinale adéquate doit viser à
l’obtention d’une CTL puissante et de taux d’anticorps neutralisants. Une des difficultés,
et non des moindres, réside dans l’induction de cette réponse cellulaire puissante.
Plusieurs approches peuvent être envisagées. Elles comprennent, par exemple, l’utilisation
de doses faibles d’antigènes, l’utilisation d’adjuvants favorisant une réponse de type Thl,
l’utilisation de cytokines ou de vecteurs vivants inducteurs d’une réponse de type Thl
(tels que le BCG) ou transfectés par une gène de cytokine Thl [Salk et al. 1993]. Plusieurs
candidats vaccins qui pourraient induire une réponse cellulaire puissante accompagnée
d’une réponse humorale sont en cours d’investigation. Citons notamment l’administration
successive d’un virus recombinant contenant la gpl60 et de gpl20 [Corey et al. 1998]. Par
contre, l’utilisation d’un vecteur viral incapable de se reproduire chez l’homme est
77
associée de manière variable à une immunogénicité suffisante [Carruth et al 1999; Shiver
et al. 2002],
•
La diversité antigénique parmi les différentes souches de VIH ne semble pas un obstacle
rédhibitoire au développement d’une CTL vaccinale. De nombreux travaux ont mis en
évidence un certain degré de reconnaissance croisée entre les épitopes testés, suggérant
qu’une combinaison d’épitopes permettrait de réduire la probabilité qu’une souche puisse
totalement échapper à la réponse immune. Par contre, une mutation dans l’épitope ayant
préalablement induit une CTL est capable d’induire un échappement viral [Barouch et al.
2002].
•
L’observation d’une évolution vers un état d’immunodéficience chez des patients infectés
par des souches de VIH atténuées par une délétion naturelle au niveau du gène nef
hypothèque sérieusement la possibilité de vaccination par des souches atténuées
[Learmont et al. 1999; Collins and Nabel 1999].
•
L’utilisation de CpG ODN a permis d’orienter une réponse vers un type Thl dans un
modèle de vaccination murine par la gpl60 [Demi et al 1999].
•
De nombreux éléments plaident en faveur du développement de vaccins administrés par
voie muqueuse. Plusieurs essais d’administration par voie orale, nasale ou rectale
semblent prometteurs [Amara et al. 2001].
Force est de constater qu’à ce jour, l’administration de vaccins à des sujets exposés au VIH ou
à des sujets déjà infectés, si elle s’est souvent accompagnée d’une réponse immune détectable,
n’a pas réduit le taux d’infection ou la charge virale de sujets déjà infectés [Brander and
Walker 1999], ou n’a pas induit l’effet escompté sur la CTL [Robbins et al. 2003]. La
première étude en phase Kl d’un vaccin contre le VIH, composé d’une protéine gpl20
recombinante de sous-type B, le vaccin AIDSVAX B/B™ (VAXGEN), s’est soldé par un
échec [McCarthy 2003].
De très nombreux travaux ont été réalisés tels que le vaccin par AnefSTW (mutant du Virus de
l’Immunodéficience Simien dépiété en son gène codant pour nef), des virus à réplication
limitée transfectés par des produits du VIH ou des souches atténuées de VIH, des peptides
78
vaccinaux (vaccins subunitaires) [Steinman and Germain 1998; Esser et al
2003],
L’utilisation de vaccins à ADN a fait également l’objet de nombreuses études. Si leur
innocuité et leur capacité à induire une réponse tant humorale que cellulaire ont été
démontrées de façon prometteuse, cette réponse reste insuffisante dans l’état actuel des
connaissances (revu dans [Liu 2003]). C’est probablement par la combinaison de ces
différentes approches que l’on pourra mettre au point un vaccin efficace. Ainsi, dans un
modèle murin, on peut moduler la réponse à un vaccin à ADN en modifiant la séquence
d’administration d’un plasmide codant pour le GM-CSF par rapport à la dose d’ADN vaccinal
[Kusakabe et al. 2000]. L’injection intradermique d’ADN viral chez des macaques rhésus,
renforcée par l’administration de virus de la vaccine, induit une CTL efficace sans induire
pourtant
d’anticorps
neutralisants
détectables
[Robinson
et
al.
1999].
De
même,
l’administration successive de gpl20 et d’IL-2 chez la souris est accompagnée de l’apparition
d’une réponse mixte, meilleure que si les deux composants sont injectés en même temps
[Barouch et al. 1998]. Plus récemment, un vaccin ADN codant pour une protéine de fusion
entre CTLA-4 et gpl20 s’est révélé plus efficace que le vaccin ADN ne codant que pour la
gpl20 chez la souris [Nayak et al. 2003]. Enfin, l’administration successive d’ADN et d’un
vaccin par virus recombinant induit une réponse immune supérieure à chaque composé
administré isolément [McMichael and Hanke 2003].
Les stratégies poursuivies actuellement [Letvin 2002; McMichael and Hanke 2003] visent à
utiliser un vecteur viral ou un vaccin ADN. Le virus de la vaccine, quoique bon candidat, est
contre-indiqué dans la mesure où des vaccinations de masse dans des régions à haute
prévalence de patients déjà atteints par le VIH induiraient un risque de vaccine généralisée
probablement inacceptable. D’autres vecteurs viraux tels que le MVA (modified vaccinia
Ankara) sont également étudiés.
L’approche consiste à concevoir des vaccins capables tant d’initier la production d’anticorps
que d’induire une réponse cellulaire conduisant à la production de cytokines du type de l’IFNy et de lymphocytes cytotoxiques. L’ensemble de ces éléments suggère que la stimulation des
cellules dendritiques in vivo par le biais de l’utilisation de puissants adjuvants ou in vitro par
le biais de la stimulation de CD pulsées avec des antigènes du virus VIH pourrait apparaître
comme une des voies prometteuses [Lore et al. 2003; Lapenta et al. 2003; Lu et al. 2003].
Dans ce contexte, le développement d’adjuvants capables d’induire une réponse primaire in
vitro, comme l’OM-197, prend tout son sens.
79
5.4. Cellules dendritiques et adjuvants vaccinaux
Afin de répondre aux défis exposés ci-dessus, il faut donc concevoir des approches vaccinales
permettant d’augmenter la qualité de la réponse des lymphocytes CD4+ Thl et CD8+
cytotoxiques, d’induire une immunité muqueuse (voie naturelle d’entrée de nombreux agents
infectieux tels que le VIH par exemple), d’obtenir des vaccins thérapeutiques aussi bien que
préventifs, mais également des vaccins capables de réduire une réponse immune inopportune
telle que rencontrée dans les maladies auto-immunes.
Les cellules dendritiques semblent jouer un rôle important dans la physiopathologie de
nombreux états où il apparaît que le système immunitaire n’est plus ou pas suffisamment
capable de réagir à l’invasion infectieuse ou tumorale. De nombreuses recherches se sont
donc orientées vers l’utilisation de vaccins basés sur les propriétés des cellules dendritiques et
en particulier dans le domaine de l’oncologie (revus dans [Schuler et al. 2003]). Les
lymphocytes CD4+ et CD8+jouent un rôle important dans la réponse antitumorale (revu dans
[Kalos 2003]). L’approche principale a été de promouvoir l’activation de lymphocytes T
spécifiques de l’antigène tumoral. De nombreux obstacles ont été identifiés tels que
l’impossibilité dans de nombreux cas à identifier un antigène tumoral ou la difficulté à
délivrer cet antigène adéquatement aux lymphocytes.
Une réponse immune et un effet anti-tumoral ont été observés en puisant des CD avec des
lysats de tumeur, des peptides dérivés, des peptides synthétiques MHC restreints, des
protéines (revu dans [Fong and Engleman 2000]). Plusieurs essais ont été réalisés dans le
traitement du mélanome notamment en utilisant des peptides tumoraux spécifiques comme
l’antigène MAGE ou d’autres antigènes de différenciation des mélanocytes, utilisés seuls ou
incorporés dans des virus recombinants, ou encore utilisés pour puiser des CD avec
différentes molécules adjuvantes [Boon and van Baren 2003]. Dans le cadre d’un essai de
vaccination thérapeutique par administration de CD pulsées chez des patients porteurs d’un
mélanome, il a été possible de convertir une réponse Th2 en réponse Thl chez un patient,
shift accompagné d’une réponse clinique [Schmitz et al. 2002]. Plusieurs travaux ont mis en
évidence qu’une meilleure réponse était obtenue en générant des CD4+ de profil Thl plutôt
que Th2 dans des modèles de tumeurs ou d’infections chroniques. Les éléments théoriques en
faveur d’une meilleure efficacité d’une réponse Thl sont les suivants : les lymphocytes Thl
par l’expression des récepteurs aux chémokines de type CXCR6, induiraient une meilleure
80
migration vers les sites inflammatoires ; par leur profil de sécrétion de cytokines, les cellules
Thl induiraient une activation plus efficace des CD pour expandre la population des
lymphocytes CD8+ et la cytotoxicité par la voie de Fas ligand. L’EL-12 a déjà été démontrée
comme permettant d’induire une réponse de type Thl in vitro ou in vivo. De même, une
synergie entre vaccination par CD et administration d’IL-2 a également été observée [Shimizu
étal. 1999]
Parmi les questions non résolues figure notamment le choix d’utiliser des CD matures ou
immatures. En effet, quoique des succès aient été observés dans des modèles de vaccination
contre des antigènes tumoraux lors de l’utilisation de CD tant matures qu’immatures,
l’inhibition de la réponse des lymphocytes T après injection de CD immatures dérivées de
macrophages a été rapportée tant dans des applications anti-tumorales [Nestle et al 2001] que
dans un essai de vaccination de volontaires sains par des CD pulsées par l’antigène du virus
de l’influenza [Dhodapkar et al 2001].
Les résultats encourageants observés soulèvent l’importance de pouvoir disposer de puissants
agents de stimulation des CD pour les puiser avec l’antigène choisi ou les administrer avec les
cellules dendritiques. L’utilisation de CD pulsées ex vivo et l’apport d’adjuvants pourraient
contribuer à annihiler les différents mécanismes par lesquels les tumeurs sont capables
d’inhiber la différenciation, la maturation ou la migration des CD (revu dans [Fong and
Engleman 2000]). De plus, s’il devait apparaître qu’un déficit de maturation des CD contribue
à la pathogenèse du cancer, l’utilisation d’agents capables d’induire une telle maturation ex
vivo pourrait devenir un des éléments clés dans l’évolution de la thérapeutique anti­
cancéreuse.
L’expérience accumulée en oncologie ouvre certainement la voie à des développements dans
le domaine connexe des maladies infectieuses.
5.5, Immunisation par voie muqueuse
Nos travaux sur l’OM-85 BV ont permis de mettre en évidence que cet extrait bactérien induit
une production dose dépendante d’fFN-y par les lymphocytes CD4+ et uniquement ceux-ci.
Cette stimulation des lymphocytes CD4+ nécessite la présence de cellules présentatrices
d’antigènes. La stimulation des lymphocytes CD4+ est dépendante de la production d’IL-12,
et donc de l’activation des monocytes. L’activation des APC par l’OM-85 BV est
indépendante de la voie du CD 14 [Marchant and Goldman 1996], et nous avons montré que la
81
polymyxine n’a pas d’effet réducteur sur cette activation. On peut en concliu'e que le principe
actif responsable de l’activation des APC et de l’activation secondaire des lymphocytes CD4+
n’est pas l’endotoxine de la paroi microbienne présente en quantité résiduelle dans cette
préparation. Nous avons aussi montré que les lymphocytes de patients infectés par le VIH
sont également stimulables par l’OM-85 BV.
La caractérisation précise des substances impliquées dans la réponse lymphocytaire est
difficile puisque de nombreuses molécules sont présentes dans cette préparation, dont on peut
supposer que tous les composants n’ont pas les mêmes capacités immunogènes. Nous ne
pouvons pas exclure que la stimulation des lymphocytes soit liée à un effet de type
superantigène lié à l’un ou l’autre composant. Cependant, l’intensité de la stimulation est du
même ordre de grandeur en réponse à l’OM-85 BV qu’en réponse à l’anatoxine tétanique
chez des témoins avant rappel d’anatoxine tétanique, ce qui paraît faible pour un effet de type
superantigène. Une stimulation non spécifique via par exemple les TLR est plus probable.
Nous avons cependant pu observer que l’effet de l’OM-85 BV sur les cellules dendritiques est
très réduit par rapport, par exemple, à celui de l’OM-197 (dormées non publiées).
L’efficacité de l’administration orale des préparations d’extraits bactériens peut paraître
surprenante dans la mesure où la muqueuse digestive est exposée à un grand nombre de
produits bactériens de
façon physiologique et que
l’on
conçoit
difficilement
que
l’administration d’un extrait inerte puisse induire un effet surajouté. Certaines substances
bactériennes, telles que la toxine cholérique déjà mentionnée, se sont cependant révélées de
puissants adjuvants lorsque administrées par voie orale en association avec d’autres protéines.
Dans le cadre d’un essai en double aveugle, nous avons administré de l’OM-85 BV ou un
placebo à 42 volontaires sains pendant 2 semaines afin de mesurer la réponse des
lymphocytes du sang circulant à une stimulation ultérieure ex vivo. Nous avons ensuite
mesuré le nombre de cellules produisant de l’IFN-y en réponse à une stimulation par des
mitogènes ou des antigènes in vitro dans les semaines suivant l’administration, ainsi que
l’évolution des différentes sous-populations lymphocytaires et de l’expression de marqueurs
d’activation. Aucune différence n’est appame entre les témoins et les sujets traités par l’OM85 BV. De même, nous n’avons pas pu mettre en évidence une réponse au niveau sérique en
anticorps anti-pneumocoque, un des composants de l’OM-85 BV dans un autre groupe de
volontaires, ni d’augmentation de la population lymphocytaire portant le marqueur de
l’intégrine a4p? identifiant les lymphocytes d’origine muqueuse (données non publiées).
82
Il apparaît donc que l’administration orale de l’OM-85 BV n’induit pas d’activation immune
détectable au niveau du compartiment sanguin alors que plusieurs travaux déjà cités montrent
l’apparition d’une réponse au niveau de la muqueuse respiratoire. On peut donc considérer
que rOM-85 BV induit une stimulation spécifiquement localisée au niveau du tissu
lymphoïde des muqueuses.
La mise en évidence de la capacité à stimuler le système lymphoïde muqueux par
l’administration de préparations d’extraits bactériens présente une approche intéressante dans
le développement de vaccins oraux. De nombreuses applications pourraient en dériver dans le
traitement des maladies infectieuses siégeant au niveau des muqueuses, ou dont la porte
d’entrée se situe à ce niveau (infections respiratoires, digestives ou urinaires, d’origine
bactérienne, virale ou parasitaire). En effet, l’administration d’un antigène par voie
systémique n’est pas toujours capable d’induire une réponse muqueuse, la réponse induite par
voie systémique n’est pas toujours dans le sens de la réponse induite par voie muqueuse et
l’utilisation d’adjuvants permet également de moduler cette réponse [Holmgren et al 2003].
Par exemple, dans un modèle animal de vaccination par un antigène de surface
mycobactérien, le PstS-1, l’administration muqueuse génère une réponse dont le profil Th
varie selon les adjuvants utilisés [Rodriguez et al. 2003].
Un ensemble de données expérimentales (revu dans [Esser et al 2003]) suggère en outre que
le développement et le maintien d’une CTL au niveau des sites muqueux nécessite
effectivement une vaccination par voie muqueuse.
Outre les dérivés bactériens déjà cités, on peut rappeler le rôle immunomodulateur du bacille
de Calmette Guérin utilisé en instillation locale dans le traitement de certaines affections
malignes telles que le cancer de la vessie, ou celui de 1’ OK-432, extrait streptococcique,
inducteur
de
la
production
d’IL-12
et
également
utilisé
pour
ses
propriétés
immunostimulantes en oncologie [Fujimoto et al. 1997; Itoh et al. 2003].
5.6. Agents mimétiques du Lipide A et adjuvants
Si le LPS apparaît comme la molécule adjuvante par excellence, sa toxicité rend son
utilisation extrêmement difficile, comme en témoigne par exemple la tolérance moyenne au
vaccin cellulaire de la coqueluche, dont les effets secondaires sont attribués notamment à la
présence de LPS. Plusieurs approches ont été proposées pour contourner cette toxicité. Des
dérivés ont été synthétisés en construisant un mutant de N. meningitidis produisant des formes
83
altérées de Lipide A [van der Ley et al 2001]. Ces Lipides A altérés contiennent un nombre
réduit de chaînes acylées. Cette modification a pour effet de modifier la sensibilité à certains
antibiotiques mais surtout de découpler la capacité à produire du TNF-a (réduite) de la
capacité à exercer un effet adjuvant. Une autre voie a consisté à modifier le Lipide A de
Salmonella minnesota RC595 pour aboutir au Monophosphoryl Lipid A (MLA), dérivé
diglucosamine-acylé. Ce dérivé possède des capacités immunomodulatrices tout en étant
dépourvu des effets toxiques du LPS initial. Un autre dérivé du MLA, obtenu par hydrolyse
d’un résidu beta-hydroxymyristoyl, est caractérisé par une diminution supplémentaire des
effets LPS tout en conservant des capacités immunomodulatrices (déposé sous le nom de
MPL™). Ce dernier produit entre dans la composition d’un vaccin contre le mélanome
commercialisé au Canada sous le nom de Melacine ™ (Corixa Inc., Schering Plough). Des
dérivés de cette famille ont été testés comme adjuvants dans des préparations vaccinales
contre Leishmania major [Persing et al. 2002]. Il est à noter que l’effet immunomodulateur de
ces dérivés disparaît dans les formes contenant moins de 5 chaînes acylées.
Le MLA induit une augmentation du calcium intracellulaire, ce qui n’est pas le cas du LPS.
Les deux molécules induisent une augmentation de l’ARN du TLR2 et une phosphorylation
de la kinase ERK 1/2 {extracellular-related kinase), impliquée dans la régulation de
l’expression de riL-12, mais selon des cinétiques différentes. Ceci illustre que, alors que
certaines voies d’activation sont communes, d’autres sont manifestement spécifiques au MLA
[Ismaili et al. 2002b]. Il en résulte un effet différent sur la production de TEL-12.
Les différences physico-chimiques existant entre le LPS et les analogues dérivés sont
illustrées par l’analyse détaillée des caractéristiques physico-chimiques de l’OM-174,
comparées à celles du LPS de Escherichia coli [Brandenburg et al 2000]. L’OM-174 est un
analogue obtenu par déacylation chimique du Lipide A de Escherichia coli. Cet analogue a la
capacité d’induire un effet anti-tumoral dans un modèle de péritonite carcinomateuse chez le
rat [Onier et al. 1999a; Onier et al. 1999b], est capable d’induire la maturation et la migration
des cellules dendritiques après injection chez la souris [Pajak et al. 2003], et est un adjuvant
potentiel dans l’induction d’une réponse cytotoxique vis-à-vis d’un peptide dérivé d’une
protéine de Plasmodium berghei [Meraldi et al. 2003]. Cependant, l’OM-174 n’induit qu’une
production réduite de TNF-a et d’IL-12 par les cellules dendritiques in vitro (données non
publiées), ce qui, vu l’importance de ces cytokines dans l’induction de la réponse immune,
pourrait limiter son efficacité adjuvante.
La perte de trois chaînes acylées dans la composition de l’OM-174 par rapport au LPS induit
des modifications au niveau de la fluidité et de la conformation supramoléculaire des
84
agrégats, passant d’une structure cubique pour la forme hexa-acylée à une forme lamellaire
pour la forme tetra-acylée et à ime forme micellaire pour la forme tri-acylée. Quoique
certaines controverses existent sur la part de l’effet biologique liée à la forme monomérique et
celle liée à la forme supramoléculaire, il apparaît que la capacité à s’intercaler dans les
membranes cellulaires et à activer les différents récepteurs est fonction de la stabilité du
monomère. Par contre, les monomères de LPS activent nettement moins bien la cascade
enzymatique du LAL que les agrégats. Un découplage entre l’activité endotoxine et d’autres
activités biologiques peut donc être lié à la structure tridimensionnelle du dérivé
[Brandenburg et al 2000; Seydel et al 2003].
L’OM-197-MP-AC (S,R) (OM-197) (OM Pharma, Meyrin, Suisse) est le nom de code d’un
pseudodipeptide synthétique acylé répondant à la formule suivante ; (3S,9R)-3-[(R)-3dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]décan-l,10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6-aminohexanoate) ]. Sa structure chimique
porteuse de 3 chaînes acylées est voisine de l’OM-174. L’OM-197 est dépourvu d’effet
endotoxine: 1 milligramme d’OM-197 contient moins de 0.125 Endotoxin Unit mesuré par le
Limulus amoebocyte lysate assay (LAL).
Nous avons montré que l’OM-197 induit une production importante d’IL-12 p40 et de TNF-a
lors d’une stimulation in vitro en sang total, quoique inférieure à la production induite par une
stimulation par le LPS. De façon intéressante, nous avons aussi pu montrer que 1’OM-197
induit la production de la forme bioactive de l’IL-12 (EL-12 p70), qui est une des cytokines
principales indispensables à la génération d’une réponse de type Thl [Trinchieri 2003]. Cette
caractéristique importante distingue ce produit d’autres analogues tels que l’OM-174 ou le
MLA [Ismaili et al
2002b]. L’OM-197 induit également la maturation des cellules
dendritiques du sang circulant de phénotype myéloïde, cormne en témoigne l’augmentation de
l’expression d’HLA-DR, et des CD40, CD54, CD80, CD83 et CD86, restreinte pour plusieurs
de ces marqueurs aux seules CD CDllc+. En outre, l’OM-197 diminue la capacité des CD à
phagocyter du dextran marqué au FITC, témoin de l’évolution d’un phénotype immature à un
phénotype mature.
Au-delà de la simple caractérisation des effets de l’OM-197 sur les cellules dendritiques, il
était important de s’assurer que les CD ainsi amenées à maturation étaient fonctionnelles et
capables de stimuler les lymphocytes T. Notre modèle de génération d’une réponse immune
primaire in vitro nous a effectivement permis de démontrer l’effet adjuvant de l’OM-197. En
effet, il est capable d’induire une expansion de la population de lymphocytes CD4+
produisant de l’IFN-y spécifique de l’antigène HBs au départ de cellules mononucléées du
85
sang périphérique de patients indemnes d’infection antérieure à ce virus, c’est-à-dire de
générer in vitro une réponse immune primaire.
Des études complémentaires sont nécessaires pour déterminer la ou les cibles membranaires
de rOM-197 au niveau des CD. La similarité chimique existant entre le LPS et l’OM-197
suggère que les TLR pourraient être impliqués dans ce mécanisme. La capacité de l’OM-197
à induire la production d’IL-12 p70, la forme bioactive de l’IL-12, en fait un ligand potentiel
du TLR4 [O'Neill 2002], tandis que sa structure triacylée pourrait lui permettre d’agir
également via le TLR2 [Akira et al. 2001].
Contrairement à la plupart des analogues du Lipide A, directement dérivés de celui-ci, l’OM197 partage avec une autre classe de dérivés synthétiques [Hawkins et al. 2002; Przetak et al.
2003], la propriété de ne pas contenir de glucosamines pour articuler les différentes branches
acylées, ce qui semble apporter l’avantage d’une simplification dans la synthèse chimique. De
plus, cette origine synthétique lui confère une stabilité et une résistance chimique ajustables et
surtout l’avantage supplémentaire de l’absence de contamination biologique résiduelle. Cette
contamination est en effet un problème difficile à maîtriser. Ainsi, les premiers vaccins
acellulaires contre Bordetella pertussis étaient suffisamment contaminés par une quantité de
fimbriae et pertactine, qui ne faisait en principe pas partie de leur composition, que pour
induire une réponse immune contre ces antigènes, soulignant la difficulté à purifier des
préparations d’origine bactérienne [Pichichero et al. 1997; Pichichero et al. 2000].
86
6.
Conclusions et perspectives
Malgré les immenses progrès réalisés dans leur prévention et leur traitement, les maladies
infectieuses restent responsables d’une importante morbidité et mortalité, en particulier dans
les pays les plus défavorisés. La recrudescence de certaines d’entre-elles telles que la
tuberculose, l’apparition d’autres telles que l’infection par le VIH, et l’émergence de la multirésistance aux agents anti-infectieux représentent autant de défis planétaires.
Les connaissances en immunologie et en vaccinologie ont explosé au cours de ces dernières
années et nous font mieux percevoir encore l’indispensable nécessité de comprendre pour
maîtriser et de maîtriser pour piloter la réponse immune dans le meilleur sens favorable à
l’individu et aux sociétés humaines.
Au cours des différents travaux exposés ici, nous avons développé plusieurs approches basées
sur la mise en évidence de la production de cytokines à l’échelon cellulaire. Cette technique
nous
a
permis
d’analyser
finement
divers
modèles
de
réponses
immunes
et
d’immunomodulation. Les approches suivies ici ont visé à se rapprocher autant que faire se
peut de la réalité physiologique, en évitant au maximum les écueils liés par exemple à
l’utilisation de clones cellulaires et en conservant le fonctionnement paracrine des cellules
actrices de la réponse immune. Ceci nous a permis d’obtenir une sensibilité supérieure à celle
des méthodes conventionnelles.
Nos travaux sur la réponse immune du patient infecté par le VIH nous ont natmellement
conduit à explorer la capacité d’extraits bactériens à moduler la réponse immune et ce
d’autant qu’il apparaît que le subtil équilibre entre micro-organismes infectieux et sujet
infecté d’une part, et homéostasie du système immunitaire d’autre part sont intimement liés.
Les progrès réalisés dans la compréhension du rôle des pathogen-associated molecular
patterns tant dans l’initiation de la réponse immune que dans le maintien de l’homéostasie du
système immunitaire suggèrent que les extraits bactériens et les molécules dérivées de ceux-ci
seront amenés à jouer un rôle important dans l’élaboration de nouvelles approches
prophylactiques et thérapeutiques tant dans le domaine des infections que dans ceux connexes
de l’oncologie ou de l’allergie.
87
7.
Liste des figures
Figure 1 : Représentation schématique de la structure du LPS..................................................15
Figure 2 : Conformation spatiale du Lipide A............................................................................ 15
Figure 3 : Voies de signalisation des TLR........................................................................... ......18
Figure 4 : Illustration de la technique d’ELISPOT.................................................................... 57
Figure 5 : Détermination de la durée de préincubation optimale pour l’énumération de cellules
productrices d’IL-4 et d’IFN-y en réponse à une stimulation polyclonale....................... 59
Figure 6 : Cinétique de la réponse cellulaire à l’administration d’anatoxine tétanique...........60
Figure 7 : Production d’LFN-y et d’IL-4 en réponse à une stimulation polyclonale au cours de
l’infection aiguë et chronique par le VIH........................................................................... 63
88
8.
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102
Deuxième partie : Thèse annexe
Comment maîtriser la transmission à l’hôpital du staphylocoque doré
résistant à la méthicilline (MRSA).
103
1.
Résumé
Le staphylocoque doré résistant à la méthicilline (methicillin résistant Staphylococcus aureus
- MRSA) est endémique dans de nombreux hôpitaux et institutions de soins chroniques. Il y
est responsable d’un nombre élevé d’infections, elles-mêmes associées à une morbidité et une
mortalité importantes [Cosgrove et al. 2003], Les facteurs favorisant la colonisation d’un
patient par le MRSA comprennent notamment une antibiothérapie préalable et la présence de
maladies ou de plaies chroniques [Rubinovitch and Pittet 2001]. Le contrôle de la
transmission du MRSA vise à contenir la dissémination au départ du porteur, mais les
mesures préventives sont d’efficacité et de niveau d’évidence variables [Marshall et al. 2004].
Notre hypothèse est que l’on pourrait réduire cette transmission en complétant les mesures de
prévention par une prophylaxie spécifique proposée aux patients à risque d’acquérir le MRSA
et hospitalisés dans des unités à prévalence élevée. Cette hypothèse repose sur l’expérience
acquise à l’Hôpital Erasme. L’administration systématique aux patients hospitalisés en soins
intensifs d’une prophylaxie associant mupirocine intra-nasale et toilette à l’aide d’un savon
désinfectant a été accompagnée d’une réduction de l’incidence d’acquisition nosocomiale
d’environ 50%. L’utilisation large de mupirocine est associée à l’émergence de MRSA
résistant à ce produit, ce qui justifie de cibler au mieux les indications tant thérapeutiques que
prophylactiques de son usage.
La démonstration de l’efficacité et de la sécurité de ce schéma de prophylaxie dans un cadre
plus large nécessite dans un premier temps que nous déterminions le niveau de risque au-delà
duquel la probabilité d’acquisition du MRSA est suffisante pour justifier les mesures
prophylactiques. Ce niveau de risque doit intégrer les risques d’acquisition liés au patient et
ceux liés à l’environnement hospitalier. Dans un second temps, nous évaluerons l’effet de la
prophylaxie limitée aux patients à haut risque séjournant dans des unités dans lesquelles le
risque de transmission est élevé, dans le cadre d’une étude contrôlée en cross-over. Nous
mesurerons l’impact de cette prophylaxie sur l’incidence d’acquisition nosocomiale et
d’infections à MRSA ainsi que sur l’évolution du taux de résistance des MRSA à la
mupirocine. Les facteurs suivants devront être également mesurés afin d’en contrôler l’effet
sur l’incidence d’acquisition de MRSA pendant l’investigation : la prévalence du MRSA dans
l’unité de soins, la quantité et la nature des antibiotiques prescrits dans l’unité, l’observance
des précautions standards (hygiène des mains) et additiormelles (isolements), ainsi que des
indicateurs d’activité des unités concernées.
104
2.
Références
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associated with methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus bacteremia: a metaanalysis. Clin.Infect.Dis. 2003; 36: 53-59.
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hâve we leamed? J.Hosp.Infect. 2001; 47: 9-18.
105
Annexe - Curriculum vitae abrégé
ADRESSE PROFESSIONNELLE :
Unité d’Epidémiologie et d’Hygiène Hospitalière, Hôpital Erasme
808, Route de Lennik ,1070 Bruxelles
tél : 02/555 6643
fax : 02/555 3912
E mail : [email protected]
Etudes universitaires
Docteur en Médecine, Chirurgie et Accouchements, ULB, 1986. grande distinction
Licence Spéciale en Médecine Interne, ULB, 1991 : grande distinction.
Certificat Complémentaire en Hygiène Hospitalière: ULB, 1991.
Certificat de Compétence particulière en maladies infectieuses ULB, 1994, la plus grande
distinction
Diplôme d’Etudes Approfondies en Sciences de la Santé, ULB, 2003
Prix et bourses
-
Prix de la Société Belge d'infectiologie et de Microbiologie Clinique, 1994.
Bourses de la Fondation Erasme en 1994 et 1995.
Educational Grant of MSD international, 1995.
Situation actuelle
Chef de Clinique adjoint, adjoint à la direction médicale en tant que médecin hygiéniste
responsable de l’Unité d’Epidémiologie et d’Hygiène Hospitalière depuis octobre 1998.
Consultant à la Clinique des Maladies Infectieuses depuis 1998.
Publications
Auteur ou coauteur de 34 publications, 4 chapitres de livres, et plus de 60 communications
internationales.
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