1. Génome

Ils possèdent une organisation semblable à celle des Oncornaviridae. Voici un schéma d’un
Lentiviridae :
Chez le HIV (Cf. schéma), la SU c’est la gp120, la TM c’est la gp41 (gp165 est clivée en
gp41 et gp120) ; la matrice est la p18. La nucléocapside est formée de p7 et p9 ou p25. p25
est détectée de manière précoce associée à l’ARN. Elle a pu être utilisée dans la détection du
HIV (ELISA). À noter la présence d’une RT et d’une protéase.
1. Génome
On voit que gag et pol se chevauchent (riches en séquences de régulation (saut de ribosome,
changement de cadre de lecture…)).Certains gènes sont éclatés (composés de plusieurs
Gènes supplémentaires propres aux VIH (gènes de
régulation)
Gènes communs aux
rétrovirus
exons), ce sont tat et rev. Les entiers sont vif, vpr, nef…. Les entiers avec spécificités sont
vpu pour HIV1 et vpx pour HIV2. Plusieurs chevauchements sont présents dans les différents
gènes. De nombreuses protéines de fusion peuvent être faites (ex : si l’épissage de tat n’a pas
lieu).
En fonction des individus et des souches virales infectantes, on a des variations des protéines
synthétisées ce qui peut faire changer le pourcentage de virus infectants. Quel est le rôle des
protéines de fusion ?
Gènes
Protéines codées par les gènes
Fonctions
GAG
p18, p13, p25 (p7, p9)
Protéines de structure
POL
p10, p64-p51*, p34
Protéase, transcriptase
inverse, endonucléase
ENV
gp120, gp41
Fixation au récépteur CD4,
phénomène de fusion des
membranes
VIF
p23
Rôle dans l'infectiosité
VPR
p15
Rôle dans la vitesse de
réplication du virus
TAT
p14
Régulation positive
REV
p20
Régulation positive
NEF
p27
Régulation négative (virus
en "sommeil"?)
VPU (VIH1 seulement)
p16
Rôle dans la maturation
des particules virales
VPX (VIH2 seulement)
p16
Action à stade précoce de
la réplication du virus?
p64 et p51 représentent en fait 2 formes de la même protéine.
2. Réplication du HIV
Pour l’adsorption, la cible serait le récepteur CD4 des lymphocytes T. Les HIV sont CD4+
grâce à la gp120. Après l’adsorption, la fusion fait intervenir un corécepteur qui permettrait la
fusion. Le 1er trouvé a été appelé « fusine ». L’extrémité de la gp41 joue un rôle ainsi que la
boucle V3.
La gp120 est composée d’un domaine C (constant) et V (variable). La boucle V3 est présentée
à l’extérieur mais sa variabilité empêche sa mise en évidence par des Ac monoclonaux. Elle
joue un rôle dans la fusion avec la membrane cellulaire.
Il y a 2 types de récepteurs : CCR5 et CXCR4. Soit les virus utilisent ceux de type CCR5, soit
ceux les CXCR4. Des virus pouvaient infecter des cellules qui avaient un des deux récepteurs
mais pas de CD4. Actuellement, si on peut infecter des cellules n’ayant pas de CD4 mais des
corécepteurs alors, le CD4 serait un corécepteur et le corécepteur serait le vrai récepteur. Les
adipocytes contiennent du CCR5 ou CXCR4. Ils peuvent être infectés et représenter un
réservoir à virus.
Les parties A et B sont représentées sur le schéma suivant. (Les acides aminés acides sont
représentés en noir).
La fusion mène à l’entrée de matériel viral dans la cellule. On ne sait pas exactement ce qui
pénètre. On sait que le complexe est dérivé du nucléoïde et permet les étapes initiales du
développement viral. Un certain nombre de protéines à l’intérieur du nucléoïde dirigent les
étapes (rétrotranscription et intégration au niveau du génome cellulaire). La rétrotranscription
est cytoplasmique, la traduction est nucléaire, les épissages aussi. L’expression des protéines
et l’assemblage du virus sont cytoplasmiques.
L’ARN qui va être transcrit dans le noyau à partir de l’ADNc aura 2 devenirs :
- Sert de génome viral.
- Expression du virus (traduction ou épissage puis traduction).
2.1 La reverse transcription
Il y a une liaison entre la reverse transcription et l’activité cellulaire. La reverse transcription
est ralentie sur des lymphocytes latents ou au repos. On peut même aller jusqu’à
l’accumulation d’ADNc incomplet, partiellement rétrotranscrit (la 1ère moitié du brin, vers le
saut à la PPT). Si on réactive les lymphocytes, on a des rétrotranscriptions normales. Des
facteurs cellulaires auraient donc un rôle dans la rétrotranscription (activation). On ne pas
jouer avec ces facteurs car sont peut-être essentiels pour la vie de la cellule.
La rétrotranscription est liée à l’état d’activation de la cellule et à la division de la cellule.
L’état d’activation de la cellule correspond au moment où l’ADNc n’est pas intégré. Si la
cellule transcrit beaucoup, il y aura beaucoup de rétrotranscription. Si la cellule est latente, la
rétrotranscription sera lente elle aussi. A la division cellulaire, le génome et intégré, il dépend
donc de la division cellulaire.
La rétrotranscription fait des erreurs (10-6-10-10) mais elle n’engendre pas de variation de
virus. La variabilité dépend du système immunitaire du patient (plus il est performant et plus
il peut tuer de variants). Pendant un infection, ce sont des centaines de virus différents qui
attaquent, le virus minoritaire sera différent en fonction du temps de l’infection.
La 2ème partie de la rétrotranscription démarre au niveau de la PPT. Le HIV a 2 PPT (une
centrale cPPT et une distale dPPT). On a synthèse de 2 brins à peu près égaux qui vont se
chevaucher sur 100-150 nt. Le contrôle du chevauchement se fait par la CTS (Central
Terminaison Sequence) accolée à la cPPT.
2.2 Import nucléaire
C’est le passage de l’ADN du cytoplasme au noyau. Au moment de la mitose, on a
désorganisation partielle de la membrane nucléaire, un passage est donc possible. L’import
dépend de l’état de division (pas comme la rétrotranscription qui marche quand elle peut).
Chez les oncornavirus, par manipulation in vitro, on bloque la division cellulaire et l’infection
alors que chez les lentivirus, on ne peut rien bloquer. L’import nucléaire est indépendant de la
mitose. Cela est vrai et faux car même sans mitose, il y a un faible import. Remarque : Les
macrophages ne se divisent pas, ils ne permettent pas la multiplication du virus.
2.3 Intégration
C’est le même phénomène que chez les oncornavirus.
Le précurseur est la chaîne avec 2 LTR. L’ARN LTR
est plus court car n’a pas de U3. Le précurseur
d’intégration est linéaire. Ce sont les extrémités U3 et
U5 avec leurs petits nucléotides qui sont substrat de
l’intégrase.
Dans le cas des HIV, ce sont 4 nt qui sont aux
extrémités (séquences att) et qui sont indispensables à
l’intégration (avec quelques nt voisins). L’intégrase est
nécessaire avant l’expression du génome, elle est donc
encapsidée. Elle dégrade 2 nt des séquences att avant
l’intégration. Elle clive 4 nt dans l’ADN génomique.
2.4 Expression du virus
Organisation du génome du HIV :
- Cadres de lecture multiples (donc expression de protéines multiples).
- Un messager de 9.5 kb.
- Des ARN (de 4.5 à 5 kb).
- Un groupe d’ARN de 1.8 à 2 kb.
L’ARN viral va être encapsidé mais code aussi pour gag et pol. Tous les ARN possèdent un
site préférentiel d’épissage en 5’ (= jonction 5’ d’épissage majeure) mais aussi une extrémité
3’ commune.
2.4.1 Les messagers génomiques gag et pol
Le transcrit génomique est appelé transcrit majeur, c’est à partir de lui que l’on a 3 classes
d’ARN :
- celui qui est encapsidé.
- celui qui code pour gag et pol.
- celui qui code pour les autres messagers.
Les transcrits primaires vont donner les protéines du core mais aussi les molécules à action
catalytique (protéase, RT, intégrase…). Ces protéines vont être les produits de clivage de
polypeptides précurseurs. Le précurseur de gag fait 55K, celui de pol fait 200K.
Un incident au niveau de la traduction va avoir lieu sur 200 qui est un décalage du cadre de
lecture dû à des séquences en amont de la séquence gag/pol.
Il va y avoir une accumulation du précurseur gag/pol à la surface cellulaire, pendant le
bourgeonnement a lieu le clivage de ces précurseurs. La dimérisation de la protéase enclenche
son activation (facilitée par la structure 3D) avec mise en évidence de sites actifs ce qui cause
l’emballement et l’infection s’accélère.
Les protéines de structure, produites en surnombre, on peut avoir beaucoup de pseudo
particules virales qui sont libérées. Si on a le précurseur gag/pol seul, on peut avoir des VLP
(Viral Like Particules). S’il n’y a que le précurseur gag, on a un aspect de particule immature.
Les VLP servent à l’implosion des systèmes immunitaires. Quand les transcrits primaires sont
dimérisés, encapsidés sous forme de double brin (ce ne sont pas des doubles chaînes car sont
dans le même sens) on dit que la particule est diploïde.
La séquence d’encapsidation est au niveau du leader
(séquence ? « psi » en 3’ du leader).
L’épissage se fait au niveau de ? , dans les séquences
subgénomiques, la séquence ? va sauter ce qui
empêche gag d’être encapsidé, on fera des VLP vides. (Le site d’épissage J est situé juste
avant ? ). Juste avant ? se trouve la séquence dim (dimérisation). On ne sait pas si la
dimérisation est nécessaire pour l’encapsidation ou l’inverse.
2.4.2 Les gènes env
Il est produit à partir d’un messager de 4.2 kb. La protéine d’enveloppe est variable, le site
d’épissage est variable aussi. Le précurseur de env fait 160 K et donne 2 protéines : la TM de
41K et la SU de 120K. La 160K est une protéine fortement glycosylée. La 41 a 2 régions
hydrophobes. Ce domaine NT permet la fusion entre 2 cellules infectées et/ou cellules non
infectées, on a formation d’un syncytium.
Le 2nd domaine hydrophobe permet l’ancrage de la protéine dans la membrane virale. La
nature de l’attachement gp41-gp120 est mal connu (gp= gene product ou glycoprotein).
La gp41 comporte à l’extrémité CT un long domaine intracytoplasmique qui est nécessaire
pour assurer l’ancrage dans la membrane. Ce domaine peut disparaître dans certains isolats de
virus simien voire être réduit ce qui donne une protéine incomplète. Ce système fonctionne
surtout chez les virus qui sont propagés à fort titre.
Au niveau gp120, beaucoup de partie V et C sont présentes, les domaines V sont les plus
accessibles, il est donc difficile de faire des vaccins. La boucle V3 est l’épitope de
neutralisation principal. V3 est nécessaire à la fusion.
2.4.3 Les gènes de régulation (vpr, vpu, vif, vpx…)
2.4.3.1 Les gènes vif
Vif est produite à partir d’un messager mono épissé d’environ 0.7 kb nécessaire à l’infectivité
des particules virales. Cette protéine n’est pas encapsidée. La sévérité des mutations sur vif
dépend de l’hôte infecté. Il joue un rôle dans le spectre d’infectibilité. Vif serait une protéase
qui pourrait cliver une partie du domaine intracytoplasmique de l’enveloppe. Il pourrait être
un facteur nécessaire à l’incorporation des protéines d’enveloppe à la surface de la particule
virale.
2.4.3.2 Les gènes vpr
Il est trouvé chez le HIV1 et 2 (parfois absent de certains SIV). Il est présent dans la particule
virale et est incorporé par une interaction entre la partie intracytoplasmique de gag et vpr.
Chez les lymphocytes, la délétion de vpr chez des clones infectieux provoque une baisse
d’infectivité mais ne bloque pas la propagation de la particule virale.
Chez les macrophages, si on délète vpr, la réplication virale est bloquée.
Les lymphocytes sont très actifs et se ne se divisent pas comme les macrophages, vpr pourrait
être un transactivateur (active la transcription) en accélérant le cycle viral et démarrant
précocement le cycle.
2.4.3.3 Les gènes vpu
Il est nécessaire au bourgeonnement des particules à la surface de la cellule. Elle stabilise un
complexe au sein du réticulum formé par la gp160 et CD4 (1990-1992). Vpu a pour rôle de
réduire la ½ vie de CD4 au niveau du réticulum (même en absence de protéine d’enveloppe).
2.4.3.4 Les gènes vpx
(Présent chez le HIV2 et SIV).
Des HIV2 défectifs en vpx vont perdre la capacité de se répliquer dans les lymphocytes
normaux mais peuvent infecter des lignées établies (tumorales). Des mutants sur vpx ne
peuvent plus se répliquer quelque soit le mutant cellulaire. Vpx est dans la particule virale à la
même manière que vpr.
2.4.3.5 Les gènes nef (negative expression factor)
Elle est issue d’un ARN multiépissé (5 exons). Il jouerait un rôle dans la maintenance de la
phase de latence (sans nef, la production passe de 2 à 2.5 fois plus). Nef pourrait réduire de 2
à 5 fois l’activité du promoteur viral. Ces manipulations sont difficilement reproductibles, il y
a peut être d’autres choses qui interfèrent (hypothèse pas sûre).
Action de nef en 5’ de U3 du LTR :
Le signal de régulation est sur U3 vu qu’il est rajouté par la RT dans l’ADNc. C’est une partie
qui est sujette à variation. Nef est localisé sous la membrane cellulaire grâce à un site
myristillé dans la partie NT.
Quand il y a nef, on s’aperçoit que la cellule infectée réduit l’expression de CD4 ce qui évite
la surinfection (action à peu près égale à celle deVP3, on libère le complexe gag/pol).
In vitro, il manque des facteurs de contrôle d’où une différence entre in vitro et in vivo. On a
une infection larvée chez le singe avec des mutants nef et une forte production d’anticorps et
faible production virale (~ vaccination).
Si on enlève la mutation, tout redevient normal. La mutation de nef disparaît avec les
générations, nef est réparé. Nef a un double rôle :
- Nécessaire pour un infection in vivo.
- Sert à l’échappement immunitaire.
Nef, facteur négatif, maintient la latence, échappe au système immunitaire. D’un coup, la
machinerie cellulaire s’emballe. Quel est le facteur déclenchant.
2.5 Régulation de l’expression des HIV
-
Activation cellulaire et expression du génome viral
Elle se fait par les lectines mais surtout IL2. L’IL2 maintient les lymphocytes dans un état de
forte activation. Il doit y avoir un fort taux d’activation pour une bonne production virale.
Certaines lignées cellulaires vont avoir intégré le génome viral et produisent les HIV en
permanence sans être détruites. Certaines produisent des virus normaux, des défectifs…
Les stimulants peuvent être l’ester de phorbol, TNF…
Dans la région U3, on a beaucoup de signaux d’activation. À part la TATA box, on a des
sites NF?B qui sont des sites de régulation cellulaire. NF?B joue un rôle dans la réactivation
de la transcription virale au moment de l’activation immune de la cellule. Plusieurs gènes sont
répétés pour assurer l’infectivité. NF?B détermine la migration vers le noyau. En dehors des
sites NF?B, il y a une zone de régulation négative due à un ensemble de sites différents en
amont du site enhancer. Si on les délete, on a activation de la transcription. Ces sites
pourraient être des cibles de nef.
- Transactivation de la transcription par le système tat.
Ce système est étudié par le système de gènes rapporteurs. Tat fait 2 kd, il est di-épissé. La
protéine tat est codée à partir de 2 exons. Le 2ème exon est situé en plein dans env. La région
correspond à la partie gp41. Tat fait 82aa et est situé dans le noyau (car elle transactivatrice),
elle possède un domaine riche en cystéine d’où une affinité pour les métaux lourds.
La dimérisation est indispensable à son activité. Un autre domaine riche en acides aminés
basiques joue un rôle dans le transport nucléaire. Dans un vecteur LTR-CAT-Tat, l’expression
est variable. Dans les cellules murines, on a une faible transactivation (5 à 10 fois). Dans les
cellules simiennes ou humaines, on a une transactivation de 30 fois. Le niveau de base (sans
tat) varie d’une cellule à une autre sans activation. Ex : dans les lignées tumorales, le niveau
de base sera élevé et bas dans les cellules normales. Tat va mettre d’autres activateurs en
marche (action à 2 niveaux). Tat va agir sur une cible du LTR située juste avant le site
d’initiation de la transcription. Cette cible est appelée TAR (Réponse à Tat), elle contient
environ 25 nt et 2 répétitions inversées (hair pin). Tat reconnaît la séquence et la forme. On a
fait des mutations pour ôter la boucle, l’activité disparaît. La reconnaissance du TAR se ferait
par l’ARN. On pense que TAR jouerait un rôle sous forme d’ARN dans l’activation au cours
de sa synthèse. In vitro, si on met des grosses quantités au niveau de tat, on a une action mais
ce n’est pas montrer l’activité de tat puisque plus il y en a et plus ça marche. (Ce qui est
normal !). Au contraire, ça prouve qu’on a besoin d’autres facteurs (entre autre une protéine
de 68 K qui se fixe sur la tige de l’hair pin). Le cofacteur se fixe, tat se fixe sur celui-ci
ensuite. Une sorte de CPI (Complexe de Pré Initiation) se forme au niveau de l’hair pin. Tat
pouvait avoir 2 rôles supplémentaires :
- Antiterminateur.
- Stabilisation des transcrits.
Tat s’associe à des facteurs cellulaires, se fixe sur une chaîne naissante au niveau de TAR.
L’ensemble ARN/Tat va interagir au niveau de TAR et de l’ADN pour former un CPI et
stimuler la transcription. Tat agit sur l’élongation.
- Système rev : régulation des épissages et transport de messagers.
Il est multi épissé à peu près comme tat. En présence de tat, sans rev (rev muté), les mutants
ne pouvaient pas faire de virus infectieux. Il a été appelé « art » puis « trs » et enfin « rev »
(Régulateur de l’expression virale). Il existe une partie commune à tat et rev. Deux domaines
fonctionnels :
- L’un est capable de se fixer à l’ARN
- L’autre est le site actif.
Il intervient dans l’épissage avec des cofacteurs. Il agit aussi au niveau du transport nucléaire
(du noyau vers le cytoplasme). On peut avoir un certain nombre d’action de rev qui sont
semblables à celles de rex chez l’HTLV. L’absence de rev diminue fortement voire totalement
le taux d’épissage. La cible de rev est le RRE (Rev Responsible Element) qui est une structure
complexe en tige boucle multiple dont une seule est vraiment nécessaire (les autres
stabilisent) située juste en amont du site tat/rev. En déplaçant le RRE, on déplace l’épissage.
Le transport des messagers vers le cytoplasme se ferait comme pour tat, grâce à des facteurs.
La dimérisation se fait quand rev est attaché à la cible. Il y a un besoin d’accumuler des
protéines pour former le dimère. On a un effet de seuil au début puis emballement au bout
d’un moment par apparition de tat et rev. Il y a beaucoup d’expression et d’épissage.
3. Variation des virus
Elles peuvent se faire par recombinaison entre même group (intraéspèces) ou différents
groupes (chimpanzé et HIV1 – intergroupe). Parmi ces contrôles, certaines séquences peuvent
concerner quelques rétrovirus. Des séquences pourraient permettre des recombinaisons. On a
apparition du « moi viral » de spécificité ainsi que de cassettes de virus à virus d’où des hot
spot (points chauds de recombinaison).
4. Thérapie
Il n’en existe aucune. On doit avoir recours à des soins palliatifs (multi thérapie d’AZTs). Le
problème est la variabilité du virus.
Dans le futur, on pourrait utiliser la thérapie génique en remplaçant un gène par un gène KG
(Killing Gene) pour tuer la cellule.
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