François Gallet 1: M icro - Institut des Molécules et Matériaux du Mans

1er Colloque PHYSMED EURO INSTITUT
Micro- et nano-mécanique
à l’échelle cellulaire
François GALLET
Université Paris-Diderot (Paris 7)
Principaux domaines de recherche en physique
- « Deux infinis » : cosmologie, astrophysique, physique des
particules
AstroParticule
et Cosmologie (APC)
- Physique quantique et nanophysique : nano-electronique,
nouveaux matériaux quantiques
Matériaux et
Phénomènes
Quantiques (MPQ)
- Physique macroscopique et biophysique : matière molle,
physique non-linéaire, physique des systèmes biologiques
Matière et Systèmes
Complexes (MSC)
Interface Physique-Biologie
En quoi les concepts, les outils et les
méthodes de la physique sont-ils pertinents
pour la compréhension des phénomènes
biologiques ?
Exemple : importance de l’environnement
mécanique pour le vivant
Tensio n
Traction Propulsion
http://www.microscopyu.com/
moviegallery/livecellimaging/index.html
Organisation d’une cellule animale
Cellule eucaryote : avec noyau
Cellule procaryote : sans noyau
(bactéries)
Une architecture dynamique
L’architecture et les propriétés
mécaniques d’une cellule vivante sont
contrôlées par le
Cytosquelette,
réseau de polymères biologiques
constitué de plusieurs types de
filaments interconnectés :
- actine (en rouge)
- microtubules (en vert)
- filaments intermédiaires
(NB : bleu = noyau cellulaire )
Réseau dynamique: remodelage des filaments d’actine et des microtubules
- polymérisation/dépolymérisation
- agents réticulants
- activité des moteurs moléculaires (myosines/actine ; kinésines/microtubule)
Principales fonctions du cytosquelette
•Morphologie cellulaire
Cellules sanguines, cellules de l’épithélium, cellules musculaires, neurones
•Rigidité
Résistance à la traction ou à la compression
•Polarisation cellulaire, adhésion, migration
Polymérisation/dépolymérisation du cytosquelette
Dynamique du réseau (agents réticulants + moteurs moléculaires)
•Mouvements rapides
- Muscles = contraction du réseau d'actine
- Cils, flagelles = déplacement de la cellule (microtubules)
•Trafic intracellulaire
– Rails pour le transport de macromolécules ou de vésicules
•Mitose
– Microtubules -> fuseau mitotique
Moteurs moléculaires
Mouvement directionnel le long des filaments (=rails)
Energie apportée par hydrolyse de l’ATP = carburant de la cellule
Génération de force et transport de charge
Nb de protéines
chez l’homme
Myosines
50
Actine
Kinésines
75
Principales fonctions
Contraction musculaire
Transport de vésicules
Récepteur de cellules
sensorielles
Transport axonal
Transport de vésicules
Division cellulaire
Microtubule
10
Dynéines
D’après cours de Tim Mitchison, Harvard Univ.
Mouvement de cils et
Flagelles
Transport de vésicules
Division cellulaire
La myosine, un moteur pas à pas
-
+
In Vitro Motility Assay
La plupart des myosines se déplacent vers
l'extrémité (+) des filaments d'actine
filament d'actine
myosine
Moteur pas à pas, pas ~ 5 nm
Force générée : quelques pN
substrat
Ron Vale (http://valelab.ucsf.edu)
Mécano-transduction
Sensibilité du vivant à l’environnement mécanique
et réponse induite
Effets connus sur les tissus :
 atrophie du squelette en l’absence de gravité
 calcification d’un muscle immobilisé
Et sur les cellules:
 accroissement de la tension interne
 réorganisation du cytosquelette
 polarisation, migration, division
 synthèse de protéines
 expression de gènes mécanosensibles
 différentiation
Durotaxis
soft / hard
soft / hard
Lo C-M. et al. Biophys J 2000
Différentiation de cellules souches
induite par la rigidité du substrat
Expression d’un gène mécanosensible par application d'une
contrainte sur l'embryon de
drosophile
E. Farge, Curr. Biol. 13, 1265 (2003)
Engler Discher Cell 126, 677–689, 2006
Quelques illustrations
I – Propriétés mécaniques des cellules vivantes
II – Etudes sur molécules uniques
III – Mécanique des membranes biologiques
IV - Adhésion cellulaire
V - Moteurs moléculaires et trafic intracellulaire
I – Propriétés mécaniques
des cellules vivantes
Echelle d’élasticité
1012
diamond
1011
glass
Young’s Modulus (Pa)
1010
109
ice
MECHANISMS
MECHANISMS
covalent
covalent
steel
lead
wood
fiberglass
polystyrene
epoxy
actin
van
van der
der Waals
Waals
108
polypropylene
107
rubbers
106
bone
elastin
entropic
entropic
foamed polymers
reptation
reptation
Soft glassy matter:
foams, slurries, pastes, emulsions,
colloids, weak gels, cells
unknown
unknown
105
104
103
102
101
Tissus vivants : grandes disparités
D. E. Discher et al., Science 310, 1139 -1143 (2005)
Principaux outils pour la
micromécanique cellulaire
Informations sur la structure et la dynamique du cytosquelette : rigidité,
stockage et dissipation de l'énergie mécanique, régulation de la tension interne
- Micropipette, indentation cellulaire,
- Déformation de l'ensemble de la cellule
extension de la cellule entre deux plaques
- Pinces optiques et magnétiques
piégeage d'une bille attachée à la membrane
- Substrat déformables
capteurs de force ou de déplacement
- Microrhéologie passive
mouvement diffusif de traceurs dans la cellule
or optical trap
adapted from Kasza et al.
Curr. Opinion in Cell Biol. 101 (2007)
microscopie à force atomique (AFM)
Micropipettes
Force contrôlée par la
dépression constante
appliquée DP
Echelle
1pN à 100nN
Ecoulement
viscoélastique de la
cellule dans la pipette
(a)
(b)
Déformation observée
Modèle : solide de
Kelvin-Voigt
(a) déformation locale
cellule traitée à la cytochalasine D
µ
k1
k2
contrôle
(b) déformation globale (écoulement dans la pipette)
Valérie Laurent thesis, Univ Paris 6 (2000)
Un peu de rhéologie
Definitions :
• Contrainte : force appliquée par unité de surface
L0

F
s = F/S
S
• Déformation : déplacement normalisé
e = DL/L0
DL
• s(e) fonction de réponse
- Matériau purement élastique
s= Ee (extension uniaxiale)
E module de Young
E
- Matériau purement visqueux
m
de
s=m
= me
dt
m coef. de viscosité
s
s
Un système viscoélastique simple : solide de Voigt
E
m
1
s
s = s1  s2 ; e1 = e2 = e
 s = Ee  me
2
Fonction de fluage J(t)
= Réponse à une échelon de contrainte s0 à t=0
J(t) = e(t)/s0
e
J(t) = 1/E [1- exp(-t/t)]
s0/E
avec t = m/E
s0
0
t = µ/E
t
Rhéomètre à cellule unique
Fibroblaste étiré entre deux
lamelles de verre
Thoumine et Ott, J. Cell Sci. 110 p 2109 (1997)
N. Desprat, A. Guiroy, and A. Asnacios, Rev Sci Inst.77, 055111 (2006)
J(t) = A ta
Invariance d’échelle
Pas de temps caractéristique
Fonction de fluage
F
Contrainte constante s = S
Déformation e(t) =
L(t)  L0
L0
distribution continue de temps de
relaxation
h k
h’
Fonction J(t) = e(t)
s
de fluage
k'
0.1
0.06
y = 0.01651 * x^(0.25677) R= 0.99972
y = 0.01651 * x^(0.25677) R= 0.99972
0.05
0.04
J(t) ~ ta
0.03
0.02
0.01
0.01
0
20
40
60
80
100
0.1
time (sec)
N. Desprat, A. Asnacios et al., Biophys J. 88, 2224 (2005)
1
10
time (sec)
100
Mesures locales : pinces optiques ou magnétiques
Cellules en culture sur substrat plan
Bille manipulée optiquement
ou magnétiquement
Ø ~ qqs µm
Filaments d'actine
Ligands spécifiques
des récepteurs de l'adhésion
fibronectine
noyau
Billes attachées à des récepteurs de l'adhésion cellulaire liés à l'actine, et utilisées
comme poignées pour exercer une traction sur le réseau d'actine cortical.
Application d’une force F (constante ou oscillante)
Mesure du déplacement x  réponse viscoélastique
Pinces optiques
Force exercée proportionnelle au
gradient de l'intensité I  E²de
l'onde électromagnétique
( )

   a 
F = p. E = E²
2
Piégeage de l’objet au point
d’intensité maximale
Ordres de grandeur
Taille de l'objet a  1 µm
Puissance laser P  100 mW
Force F  50 pN
Laser beam focused by a microscope objective
Torsion magnétique
(Optical Magnetic Twisting Cytometry - OMTC)
Bille spécifiquement attachée au réseau d'actine
à travers la membrane d'une cellule HASM
Un champ magnétique orthogonal au
moment magnétique de la bille exerce un
couple et provoque sa rotation
B
Moment magnétique M
Module viscoélastique
extra-cellular
matrix
piège optique
(ou torsion
magnétique)
actin
microtubule
intégrin
RGD
Adherence
protein
Silica
bead
Force F sinusoïdale de fréquence f
F(t)
 module viscoélastique G(f)
F(t) = F0 e 2ipft
x(t) = x0 e i(2pft-d)
x(t)
G(f) = x/F
= |G(f)| e
id(f)
Single C2 cell
1000
0,9
Comportement en
loi de puissance
100
|G(f)| = G0
10
fa
0,6
0,3
d = cste
1
0,1
1
f(Hz)
10
0
100
|G(f)| = G0 fa
Exposant a mesure le caractère +/élastique ou dissipatif
a = 1 solide élastique
a = 0 liquide visqueux
Frequency f (Hz)
Pas de temps de réponse caractéristique dans ce réseau de polymères multiéchelles
Analogie avec les matériaux « vitreux mous » (mousses, émulsions, pâtes, coulis, milieux
granulaires…) caractérisés par :
- désordre structurel
- état hors équilibre
- métastabilité
M. Balland et al.
European Biophys. J. 34, 255 (2005)
Fabry et al. Phys Rev Lett. 87 p 148102 (2001)
Fabry et al. Phys Rev E 68, 041914 (2003)
Rôle des moteurs moléculaires
Inhibition des moteurs par une drogue : la blebbistatine
 déplace l'équilibre myosine attachée-détachée vers l'état détaché
Single C2-7 cell with blebbistatin
single C2-7 cell
1000
1000
aa= =0.19
0.19
1
a=2 =0.24
0.24
aa ==0.05
0.05
1
a20
 0f<10Hz
f<10Hz
100
100
Avec blebbistatine
10
10
Sans blebbistatine
1
0,1
1
10
Frequency (Hz)
100
1
0,1
1
10
100
Frequency (Hz)
M. Balland et al. Eur Biophys. J. 34, 255 (2005)
M. Balland thesis (2005)
Les moteurs génèrent une tension interne
Contrôle
Cellule traitée à la blebbistatine
Actin filament
Myosin II head
En présence de blebbistatine, le réseau est :
- moins rigide (diminution de la tension interne)
- moins dissipatif (diminution de l'activité de glissement entre les filaments)
Accord avec les observations
II – Etudes sur molécules uniques
Ex 1 : Mécanique d’un brin d’ADN
ADN = acide désoxy-ribo nucléique
Structure de l'ADN
Adénine
Guanine
(Désoxy)ribose
Thymine
Cytosine
4 nucléotides (bases)
Les deux brins complémentaires d'ADN sont liés entre eux par des liaisons hydrogène entre
les bases A-T et G-C.
La séquence des bases azotées A, C, T, G, constitue l'information génétique.
Extension d’un polymère
Modèle d’élasticité pour un polymère

F

F
L’extension du polymère diminue le nombre de configurations accessibles
Diminution d’entropie  coût en énergie libre
Il faut fournir un travail extérieur pour étendre la molécule
Modèle du ver (Worm Like Chain – WLC)
Le polymère a une flexibilité finie
caractérisée par une longueur de persistance x (rayon de courbure spontané)
q(s)
Energie libre de la molécule :
 ( )
x u 2

E = kBT  s  F cos(q(s))  ds
2

x
L
Solution approchée
L0
F

kBT 
L
1
1
F=
 
x  4(1  L / L )2 4 L0 


0
Bustamante et al. Science 265 p 1599 (1994)
Marko and Siggia, Macromolecules 28 p 8759 (1995)
Comment étirer un brin d’ADN ?
Bille magnétique soumise
- à un champ magnétique horizontal
- à un gradient de champ magnétique vertical
force verticale F = M B
z
Rotation des aimants  rotation de la bille
Strick et al. Biophys. J. 74 p 2016 (1998)
Courbes d’extension
Bustamante et al. Science 265 p 1599 (1994)
(pinces optiques)
Comparaison avec la theorie WLC :
Longueur de persistance de l’ADN
x = 53 nm
Strick et al. Biophys. J. 74 p 2016 (1998)
(pinces magnétiques)
Surenroulement de l’ADN
Torsion imposée par le champ
tournant  formation de plectonèmes
(raccourcissement du brin)
Sous tension, le brin retrouve sa
longueur initiale
Asymétrie selon le sens de la torsion
imposée (torsion propre de l’ADN)
Strick, Croquette, Bensimon, Nature 404 p 901 (2000)
Relaxation du surenroulement en présence de topoisomérase
la topoisomérase II permet le croisement de
deux brins d’ADN (en présence d’ATP)
 ouverture des plectonèmes
 Mesure des paramètres cinétiques
de la réaction
temps caractéristique du cycle : 28s
T. Strick et al., Nature, 404, p901 (2000)
1er Colloque PHYSMED EURO INSTITUT
Micro- et nano-mécanique
à l’échelle cellulaire (2)
Quelques illustrations
I – Propriétés mécaniques des cellules vivantes
II – Etudes sur molécules uniques
1 – Etirement d’un brin d’ADN
2 – Rupture d’une liaison moléculaire
(3 – Mouvement d’un moteur moléculaire)
III – Mécanique des membranes biologiques
IV - Adhésion cellulaire
V - Moteurs moléculaires et trafic intracellulaire
Ex 2 : Rupture d’une liaison moléculaire
Système étudié : couple biotine (vitamine B) + avidine
(système modèle récepteur-ligand)
(Kumar Sinniah web site)
(d'apres Moy et al. Science. 264(5157):415-417, April 15, 1994.
http://edoc.hu-berlin.de/conferences/conf1/moy-v-t/PDF/Moy.pdf)
Force de rupture d'une liaison
Interaction Biotin-Avidin : plusieurs événements
successifs de rupture de liens
(V. Moy, web site)
Histogramme des forces de rupture
mesurées pour le couple
biotine/avidine
Adhesion Forces Between Individual LigandReceptor Pairs.
Science. 264(5157):415-417, April 15, 1994.
Rupture d'un seul lien :
F = 160  20 pN
Modèle de Bell - Evans pour la rupture du lien
Paysage énergétique en présence d'une
force F :
Barrière énergétique Eb = E0-FxA
A
Probabilité par unité de temps de
franchir la barrière (rupture du lien)
p(F, t) = f0 exp (-Eb /kBT)
-E0
B
xA
La force de rupture
la plus probable est :
 x r 
F.x A
= ln  A 
k BT
 k BTf0 
Eb = E0-FxA
r = taux de charge
(vitesse d’extension)
Ex 3 : Mouvement d’un moteur moléculaire
Moteur kinésine-microtubule
Block et al. (1990) Nature 348 348-352
Mesure de la force et du pas élémentaire
- Force maximale exercée ~ 6 pN
- Déplacement élémentaire ~ 8 nm =
périodicité de structure du microtubule
-Kurashi et al., in "Laser tweezers in cell biology"
Academic Press, p. 126 (1998)
-www.stanford.edu/group/blocklab/opticaltweezers