TP3 chap 13

TP 3 chap 13 Ts obl
LA DETECTION DE L’ACTION DU SYSTEME IMMUNITAIRE A L’AIDE DU TEST ELISA
MISE EN SITUATION ET RECHERCHE A MENER
Les microorganismes pathogènes franchissent la peau ou les muqueuses et peuvent être responsables d’infections.
Un des aspects de la réponse immunitaire est la sécrétion d’anticorps. Ces anticorps sont des protéines circulantes produites par les
plasmocytes.
La production d’anticorps constitue un des modes de défense de l’organisme. La méthode ELISA ( Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay) permet de détecter des anticorps sécrétés en réponse à l’infection par un virus.
On cherche à déterminer la séropositivité d’un patient, c'est-à-dire la présence d’anticorps contre un agent infectieux dans son
sérum.
Objectifs : savoir réaliser une observation microscopique, savoir appliquer un protocole expérimental, savoir appliquer une démarche
explicative
RESSOURCES :
Matériel envisageable : tout matériel de laboratoire
Contexte d’utilisation du test ELISA :
Le test ELISA est utilisé lors du test de dépistage du virus du SIDA : Ce test de dépistage s’effectue en deux étapes dont la première
est un test E.L.I.S.A. permettant de détecter les anticorps produits par l’organisme et dirigés contre le virus. Les tests ELISA HIV
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permettent de déterminer la présence ou l'absence de l'Ag P24 et/ou des anticorps anti HIV1/HIV2, par comparaison à une valeur
seuil (résultats qualitatifs).
La deuxième étape est un test de confirmation par immuno-transfert (Western blot).
Intérêt pédagogique :
L’intérêt général de la manipulation est de montrer (en une séance de TP) que l’on peut non seulement détecter mais aussi doser
une protéine (ici un anticorps) dans une solution ou un sérum (un anticorps anti-HIV dans le cas du test du SIDA) grâce à la
technique ELISA.
But du test ELISA ici :
Le test consiste à doser un anticorps de lapin anti-BSA à l’aide d’un support tapissé de BSA (Bovine Serum Albumin) et d’un
anticorps antiimmunoglobuline de lapin couplé à la peroxydase.
Les anticorps sont généralement coûteux, les barettes ou plaques de microtitration permettent de travailler avec de petits volumes.
Description des étapes du kit :
La première étape (réalisée par nos soins) est nommée “Coating”, durant cette étape la BSA va se fixer au fond des cupules (par
effet électrostatique). Nous utilisons une solution très concentrée de BSA qui va tapisser le fond des cupules et occuper tous les
sites de fixation protéique. Les cupules sont ensuite lavées à l’aide d’un tampon et sont alors prêtes à l’emploi.
Pour mieux comprendre le Coating :
200µL d’une solution de BSA à 20g/L ont été distribués dans chacune des cupules. Les barrettes ont ensuite été incubées à 4°C
durant 24 heures puis lavées pour enlever l’excès de BSA. Cette étape permet la fixation des protéines au fond des cupules.
L’anticorps à doser (anti-BSA) pourra ensuite se fixer à la BSA.
La fixation de la BSA au fond des cupules est un phénomène électrostatique propre à n’importe quel type de protéine (donc
également aux anticorps). Il est primordial pour réaliser un bon dosage que la cupule soit tapissée de BSA afin d’éviter que des
anticorps se fixent au fond de la cupule et non à la protéine.
C’est la raison pour laquelle nous utilisons une solution très concentrée de BSA.
La deuxième étape correspond à la fixation de l’anticorps à doser. On incube dans les cupules 80µL de la solution à doser durant 15
minutes. Puis les cupules sont lavées avec un tampon pour enlever les quelques anticorps non fixés.
Lors de la troisième étape, l’anticorps de détection (ou conjugué) se fixe à l’anticorps anti-BSA. Il est couplé à une enzyme : la
peroxydase. Une solution d’anticorps de détection est incubée dans les cupules durant 15 minutes. Puis les cupules sont lavées
pour enlever les quelques anticorps non fixés.
La dernière étape est la détection des anticorps fixés. On incube dans les cupules une solution révélatrice contenant un substrat de
la peroxydase : le TMB (tétra-méthyl-benzidine) qui se colore en bleu en présence de l’enzyme.
L’intensité de la coloration est directement proportionnelle à la quantité de peroxydase présente dans la cupule, donc directement
proportionnelle à la concentration d’anticorps à doser.
Dans la composition de barrette proposée, nous utiliserons une gamme de concentration de l’anticorps à doser pour montrer que
plus sa concentration en solution est importante, plus la coloration est visible. Nous lirons les intensités contre deux témoins.
Nous vous proposons de réaliser d’autres témoins (facultatifs) pour vérifier toutes les étapes du test et avoir une réelle démarche
de laboratoire.
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MANIPULATION PAR LES BINOMES :
Les barrettes fournies ont déjà subi l’étape de « coating », c'est-à-dire qu’elles sont prêtes à l’emploi : la BSA est fixée au fond des
puits.
‡NB‡ : Les barrettes de huit puits ne sont pas totalement symétriques, un coté possède une encoche ce qui permet de repérer le
puit N°1 et le N°8.
Le puit 1 sera le témoin positif, les puits 2 à 7 seront les différentes concentrations de la gamme étalon et le puit 8 sera le témoin
négatif.
1) Incubation de l’anticorps ou du sérum non-immunisé dans les cupules et lavage
A. Remplissage des cupules
→ Dans le puit 1, mettre 80 µL (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution de PBSx1
→ Dans le puit 2, mettre 80 µL (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d’anticorps anti-BSA C1
→ Dans le puit 3, mettre 80 µL (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d’anticorps anti-BSA C2
→ Dans le puit 4, mettre 80 µL (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d’anticorps anti-BSA C3
→ Dans le puit 5, mettre 80 µL (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d’anticorps anti-BSA C4
→ Dans le puit 6, mettre 80 µL (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d’anticorps anti-BSA C6
→ Dans le puit 7, mettre 80 µL (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d’anticorps anti-BSA C8
→ Dans le puit 8, mettre 80 µL (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution de sérum non immunisé
B. Incubation
→ Incuber 15 minutes à température ambiante
C. Lavage
→ Vider les cupules par retournement (voir schéma suivant en page 11) en prenant garde à ce que les contenus des cupules des
puits 1 à 7 ne contaminent pas le contenu de la cupule du témoin négatif du puit 8.
→ Laver deux fois au PBS tween en remplissant à la pipette les cupules sans les faire déborder.
→ Vider les cupules par retournement en prenant à nouveau garde à ne pas contaminer le puit 8 du témoin négatif (respecter le
sens de retournement)
2) Incubation de l’anticorps conjugué et lavage
→ Déposer 80µL (ou 2 gouttes de 40µL) de la solution d’anticorps de détection dans toutes les cupules
→ Incuber 15 minutes à température ambiante
→ Vider les cupules en prenant garde à ne pas contaminer le puit 8
→ Laver deux fois au PBS tween en remplissant à la pipette les cupules sans les faire déborder.
→ Vider les cupules par retournement en prenant à nouveau garde à ne pas contaminer le puit 8 du témoin négatif (respecter le
sens de retournement)
3) Révélation
A. Enlever l’aluminium protégeant le tube de TMB de la lumière pour vérifier que le TMB n’est pas bleu
B. Dépôt de la solution de révélation :
• Pour les puits 2 à 8 : Déposer 80 µL (ou 2 gouttes de 40µL au compte-gouttes calibré) de la solution de TMB substrat de la
peroxydase.
• Pour le puit 1 : Déposer 40 µL (ou 1 goutte de 40µL au compte-gouttes calibré) de la solution d’anticorps de détection et 40 µL (ou
1 goutte de 40µL au compte-gouttes calibré) de la solution de TMB substrat de la peroxydase
C. Incubation
→ Incuber 5 minutes à température ambiante
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4) Interpréter les résultats (assez rapidement)
→ Dès le dépôt du TMB, la réaction de révélation commence : la coloration bleue apparaît.
→ Vous disposez d’environ 5 minutes pour observer les colorations de tous les puits.
ATTENTION : Au-delà de 5 minutes, les puits 1 à 7 présenteront tous la même intensité de bleu. En effet, la réaction enzymatique
de révélation continue car le TMB est en excès. Une fois une molécule de TMB oxydée, le site actif de l’enzyme est libéré. Une
nouvelle molécule de TMB se fixe à l’enzyme et est oxydée à son tour.
COMPTE RENDU A REALISER
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Décrire le principe de l’expérience réalisée
Présenter dans un tableau les résultats de la manipulation et les schémas d’interprétation correspondants
Proposer un bilan à l’ensemble du TP