caractérisation des mutations du virus herpès simplex impliquées

JULIE BESTMAN-SMITH
CARACTÉRISATION DES MUTATIONS DU VIRUS
HERPÈS SIMPLEX IMPLIQUÉES DANS LA
RÉSISTANCE AUX ANTIVIRAUX
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de microbiologie-immunologie
pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
FÉVRIER 2004
© Julie Bestman-Smith, 2004

i
Julie Bestman-Smith
Guy Boivin
Résumé court
La résistance du virus de l’herpès simplex (VHS) aux antiviraux est un problème courant
chez les individus immunosupprimés. Des mutations au sein du gène de la thymidine
kinase (TK) virale sont principalement à l’origine de la résistance au traitement de première
ligne, i.e. les analogues des nucléosides. La cible ultime de tous les antiviraux anti-
herpétique demeure cependant l’ADN polymérase (pol) virale. Ces deux gènes viraux (TK
et ADN pol) démontrent un certain degré de polymorphisme génétique et il peut devenir
difficile d’identifier avec certitude les mutations responsables de la résistance aux
antiviraux. Les travaux présentés dans cette thèse de Doctorat démontrent le développement
de nouvelles méthodes afin d’établir un lien entre l’apparition de mutations au niveau de
gênes viraux et un phénotype de résistance particulier. Un système d’expression du gène de
la TK virale chez le parasite Leishmania et un ensemble de cosmides et de plasmides
recombinants permettant de générer des virus ADN pol mutants ont été mis au point. Ces
nouvelles stratégies nous ont permis de caractériser les mutations virales impliquées dans la
résistance aux antiviraux.

ii
Résumé long
La résistance du virus de l’herpès simplex (VHS) aux antiviraux entraîne considérablement
de morbidité chez les individus immunosupprimés. Des mutations dans le gène de la
thymidine kinase (TK) virale sont principalement à l’origine de la résistance aux analogues
des nucléosides, alors que des mutations dans le gène de l’ADN polymérase (pol) virale, la
cible de tous les agents anti-herpétiques actuellement disponibles, peuvent entraîner un
phénotype de multirésistance. La présence d’un certain degré de polymorphisme génétique
au sein de ces gènes rend cependant difficile l’identification des mutations impliquées dans
la résistance aux antiviraux. OBJECTIF : L’objectif principal des travaux présentés dans
cette thèse de Doctorat consiste en la caractérisation des gènes de la TK et de l’ADN pol du
VHS par le développement de nouveaux systèmes qui permettront d’évaluer de façon plus
adéquate le rôle des mutations virales dans la résistance aux antiviraux. MÉTHODES : Le
premier système comprend un vecteur (pSPαNEOαTK) permettant l’expression du gène de
la TK dans le parasite Leishmania, normalement dépourvu d’activité TK. La sensibilité des
parasites TK-recombinants à l’antiviral peut alors être évaluée par la mesure de la densité
optique des cultures en présence de l’antiviral. Un système de cosmides et de plasmides
couvrant l’ADN complet du VHS a été mis au point afin d’introduire, par mutagenèse
dirigée, des mutations dans le gène de l’ADN pol. Les virus recombinants mutants peuvent
être générés par transfection des cellules Véro. RÉSULTATS : L’expression de gènes TK
provenant de souches cliniques sensibles à l’ACV a entraîné la sensibilité des parasites
Leishmania à l’antiviral. Inversement, la transfection des TK comprenant des délétions de
nucléotides menant à un changement du cadre de lecture ou certaines substitutions de
nucléotides a résulté à des niveaux élevés de résistance des parasites. L’ensemble des
résultats obtenus avec le système de cosmides et de plasmides recombinants nous a permis
d’établir un rôle fonctionnel pour la partie centrale (régions II et VI) des régions conservées
du gène de l’ADN pol dans la résistance croisée à l’ACV, au FOS et à l’ADV. D’un autre
côté, un rôle plutôt associé à l’activité réplicative de l’ADN pol a été relié aux extrémités
(régions δ-C, I, V et VII). CONCLUSION : Ces nouveaux systèmes permettent d’évaluer
de façon rapide et efficace le rôle des mutations virales dans la résistance du VHS aux
antiviraux, ce qui devrait faciliter le traitement des infections résistantes.

iii
Abstract
Drug resistant HSV isolates are responsible form substantial morbidity among
immunocompromised subjects. The genetic basis for resistance to nucleoside analogs such
as acyclovir (ACV) have been mapped to point mutations in the viral thymidine kinase
(TK) gene while mutations within the viral DNA pol gene, the main target for all anti-
herpetic drug actually available, could lead to a multidrug resistance phenotype. However,
the distinction between viral mutations (TK and DNA pol) involved in antiviral resistance
or part of viral polymorphism can be difficult to evaluate with current methodologies.
OBJECTIVE: The aim of this research project is thus to evaluate the role of particular
mutations within the HSV TK and DNA pol gene with regard to drug-resistance patterns
and viral fitness, by designing new gene expression systems. METHODS: The protozoan
parasite Leishmania stably transfected with a TK expression vector (pSP72αNEOα) was
used as an heterologous system to evaluate the role of several different point mutations
within the coding region of the TK gene in conferring resistance to nucleoside analogs.
Susceptibility of TK-expressing parasites to nucleoside analogs can thus be tested very
easily by a simple measurement of the optic density of cultures grown in the presence or in
the absence of the drug. Finally, a set of overlapping viral cosmids and plasmids for the
rapid generation of recombinant HSV-1 DNA pol mutants have been developed.
RESULTS: Expression of the TK gene from ACV-susceptible clinical isolates resulted in
Leishmania susceptibility to the antiviral, whereas expression of a TK gene with frameshift
mutations or nucleotide substitutions from ACV-resistant isolates gave rise to parasites
with high levels of antiviral resistance. Twenty HSV-1 recombinants with single or dual
mutations within the DNA pol gene were successfully generated with the cosmid/plasmid
based approach. Mutations within the central part of the enzyme’s catalytic domain
(regions II and VI) were associated with resistance to ACV, FOS, and ADV, whereas
mutations inserted within extremities (δ-region C, I, V, and VII) were mostly related to the
replicative activity of the enzyme. CONCLUSION: Such new strategies provide an easy,
reliable, and sensitive means of evaluating the functional role of viral mutations which
should translate in improved management of drug-resistant HSV infections.

iv
Avant propos
Que dire pour être à la hauteur de l’appui des gens qui m’ont entourée au cours de mes
études au doctorat. La première personne que j’aimerais souligner est bien sûr mon
directeur de recherche, le Dr Guy Boivin. Son ardeur, sa passion et son ambition pour son
travail n’ont pu que m’encourager à entreprendre mon projet de recherche avec sérieux et
de toujours aller au delà de mes capacités. Son sens de la perfection et sa grande exigence
du travail bien fait m’ont incitée à réclamer le meilleur de moi-même, ce qui me permet
aujourd’hui de signer, avec plus de fierté que je ne l’aurais jamais cru, ma thèse de
doctorat. Les membres de notre équipe de recherche m’ont également été d’un grand
soutien tant au niveau scientifique que sur le plan moral. Leur confiance en mes capacités et
leurs encouragements répétés m’ont été d’un support précieux.
Je dois également souligner l’aide financière obtenue tout au long de mes études au
doctorat du fond de recherche en santé du Québec (FRSQ) et des instituts de recherche en
santé du Canada (IRSC) .
J’ai certainement un mot particulier pour les membres de ma famille. Leur authenticité, leur
grand intellect et leur désir de toujours vouloir performer peuvent qu’inciter quiconque à
prendre goût aux études et de vouloir constamment s’enrichir de nouvelles connaissances.
J’aimerais particulièrement remercier ma grand-mère Aline et ma mère Gisèle qui ont lu et
corrigé ma thèse de doctorat et qui éveillent, chacune de leur façon, ce qu’il y a de plus
précieux en moi. Je veux également relever la générosité de ma belle famille qui savent
spécialement bien souligner mes accomplissements.
Mon amour Nicolas qui me suit pas à pas depuis le commencement de mes longues études,
navigue patiemment dans les tempêtes de ma vie, me fait savourer les temps plus éclaircis
et sera toujours la raison des rayons les plus resplendissants.