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Nouvelles technologies aux laboratoires culture
prolongee et eclosion assistee des embryons
S Douard , A Glissant , C Nathan , A Stanovici , M. Dumont , Paul Cohen-Bacrie , A. Hazout et FX Aubriot
Introduction
En fécondation in vitro, l’objectif à atteindre est de permettre à des couples infertiles ou stériles d’avoir un
enfant en bonne santé, en essayant de limiter le nombre des tentatives donc en optimisant chacune d’entre
elles. Les laboratoires de fécondation in vitro ,ont été amenés, progressivement, à développer différentes
techniques pour tenter de répondre aux problèmes posés par des situations difficiles telles que des situations
:
- D’échecs de maturation ovocytaire in vivo - D’échecs de fécondation - D’échecs d’implantation. Pour les
échecs de maturation ovocytaire in vivo, la maturation in vitro se développe dans plusieurs laboratoires avec
des succès encore très faibles. Cette technique, lorsqu’elle sera, plus efficiente, permettra également, de
limiter les stimulations ovariennes chez certaines femmes et de développer des banques d’ovocytes
immatures.
Pour les échecs de fécondation essentiellement dû à des pathologies masculines ; les années 90 avec
l’essor de l’ICSI ont permis à un grand nombre de couples d’être parents.
Pour les échecs d’implantation embryonnaire, plusieurs techniques
on été proposées :
- La culture prolongée des embryons
pour adapter le stade embryonnaire à la fenêtre d’implantation c’est-à-dire réaliser un transfert intra-utérin
d’un ou deux blastocystes, - L’assistance à l’éclosion embryonnaire par perforation, amincissement ou
dissolution de la zone pellucide dans le but de favoriser l’éclosion de l’embryon donc son implantation. - Le
diagnostic préimplantatoire (DPI) initialement développé pour des couples fertiles ou stériles à risque
génétique élevé pourrait également avoir un intérêt chez les couples à échecs répétés d’implantation, ou
avortements à répétition et chez des couples à femme d’âge élevé pour essayer de ne transférer que des
embryons chromosomiquement normaux.
Nous parlerons ici des techniques utilisées pour essayer de favoriser l’implantation embryonnaire : La culture
prolongée et l’éclosion assistée des embryons.
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La culture prolongée des embryons ; in vitro
Chez l’humain, contrairement aux autres espèces de mammifères, le transfert dans l’utérus d’embryons
précoces ( obtenus après 2 jours de culture in vitro ) permet d’obtenir des grossesses. C’est l’obtention de
ces résultats , avec des protocoles simples qui a retardé la mise au point de techniques et de milieux
permettant le développement embryonnaire jusqu’au stade blastocyste.
Cependant, notre incapacité à produire des grossesses chez certaines femmes ayant eu plusieurs fois des
transferts d’embryons précoces nous a fait prendre conscience de la nécessité de reconsidérer toutes les
étapes du protocole de fécondation in vitro.
Le faible taux d’implantation des embryons âgés de 2 jours (10 à 15 %) peut s’expliquer en partie par la
fréquence relativement élevée des anomalies chromosomiques embryonnaires mais aussi par la période
inappropriée du transfert (à ce stade, les embryons devraient être dans la trompe) et l’impossibilité de prédire
le développement des embryons transférés. Les méthodes de culture prolongée des embryons humains,
revues par MENEZO et coll, 1998, permettent d’obtenir des blastocystes dans le but d’augmenter le taux
d’implantation embryonnaire. La culture prolongée permet d’identifier et d’éliminer les œufs dont la
segmentation s’arrête après quelques divisions et de réaliser un transfert approprié plus physiologique :
transfert de blastocystes dans l’utérus.
Les cocultures
Chez la plupart des espèces de mammifères, l’embryon est soumis, in vitro, à un arrêt de développement au
moment de l’activation du génome embryonnaire. Il y a plus d’une dizaine d’années ; cet arrêt progressif du
développement embryonnaire ne permettait d’obtenir qu’un pourcentage modeste de blastocystes lorsque les
embryons étaient cultivés dans des milieux simples. Pour lever le blocage des divisions cellulaires, in vitro, et
apprécier l’aptitude des zygotes au développement, les embryons de plusieurs espèces de mammifères
(bovins, ovins, caprins, porcins, murins, primates) ont été cultivés sur des tapis cellulaires de différentes
origines, jusqu’au stade blastocyste.
Depuis le début des années 90 , différents supports cellulaires ont été utilisés en embryologie humaine : des
tapis cellulaires d’origine génitale (cellules du cumulus, de la granulosa, de l’oviducte, de l’utérus) mais aussi
sur un support d’origine extragénitale : la lignée VERO qui est une lignée cellulaire établie de cellules
épithéliales de reins de singe. Un certain nombre d’études comparant la culture des embryons en milieux
simples avec la coculture ont montré la supériorité de la coculture pour l’obtention de blastocystes (tableau
1). En général, les embryons cocultivés avaient toujours un nombre de cellules plus élevés qu’en milieux
simples (MENEZO et coll, 1995). De plus, TURNER et LENTON 1996, ont montré dans une étude
randomisée que les blastocystes obtenus sur cellules VERO produisaient plus d’HCG que ceux obtenus en
milieu simple.
L’utilisation de la coculture est particulièrement intéressante dans quatre situations (OLIVENNES et coll,
1994).
- Les échecs répétés de transferts embryonnaires à J2 :les taux de grossesses cliniques par transfert sont de
37,2 % à 42 % (JANNY et coll, 1993).
- L’obtention d’une grossesse unique : Le taux d’implantation plus élevé des blastocystes (21% par
blastocyste transféré ) autorise un transfert numériquement plus faible sans altération des résultats. (36,4 %
grossesse/ transfert). Cela est intéressant pour les patientes ayant un utérus malformé ou de petite taille. –
L’analyse de l’aptitude au développement des embryons Lorsqu’un problème de qualité ovocytaire est
suspecté (patientes âgées et/ou ayant un taux de FSH élevé, patientes souffrant d’infertilité primaire
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inexpliquée) la coculture permet d’apprécier l’aptitude des zygotes au développement.
La congélation des embryons
La coculture permet de sélectionner les meilleurs embryons à congeler (MENEZO et coll, 1992 ; KAUFMANN
et coll, 1995 ; SHOUKIR et coll, 1998) Notre propre expérience (tableau 2) sur 6 années montre que les
blastocystes obtenus à J5 et J6 congelés et décongelés donnent 20 % de grossesse évolutive par transfert et
19 % d’accouchement par transfert. Les blastocystes expansés obtenus à J7 donnent très peu de grossesse
lorsqu’ils sont transférés frais alors que s’ils sont congelés et décongelés. Le taux d’accouchement par
transfert est de 16 % (DUMONT-HASSAN et coll, 1998).
Globalement sur 6 années d’expérience (tableau 2 ), le nombre d’enfants nés par blastocyste congelé est de
10,7 % ce qui est le double de ce que l’on obtient avec les embryons congelés aux stades précoces. – La
coculture permet donc :
- Le maintien de la qualité embryonnaire in vitro : après culture prolongée ; les taux d’implantation sont
satisfaisants après transferts.
– Une sélection cytogénétique des embryons : la moitié des embryons bloqués en coculture sont porteurs
d’anomalies cytogénétiques (BENKHALIFA et coll, 1996 ; MENEZO et coll, 1997).
– D’obtenir des blastocystes résistant au processus de congélation-décongélation.
La culture prolongee en milieux sequentiels
La pratique de la coculture a permis une meilleure connaissance de la biochimie de l’embryon et la
fabrication de milieux de culture capables de maintenir le développement jusqu’au stade blastocyste sans
coculture. Pour suivre au plus près les besoins de l’embryon au cours de son développement, on expose
successivement les embryons à des milieux de culture différents c’est la culture en milieux séquentiels. Cette
culture nécessite un premier milieu de J0 à J2, avant l’activation du génome embryonnaire, puis un deuxième
milieu à J3 pour favoriser la compaction de l’embryon et l’obtention du blastocyste.
La mise au point par différentes sociétés internationales, de milieux séquentiels faciles à utiliser permet aux
biologistes de FIV d’envisager le transfert de blastocyste non seulement pour essayer de résoudre certains
échecs d’implantation mais aussi comme technique de routine en FIV.
Dans un protocole de don d’embryons, BUSTER et coll, 1985, ont montré que des blastocystes obtenus in
vivo et récupérés par lavage utérin ont un taux d’implantation de 60 % lorsqu’ils sont transférés dans l’utérus
d’une femme receveuse. Le transfert au stade blastocyste devrait donner la meilleure chance à une femme
d’être enceinte tout en lui évitant une grossesse multiple.
Pour des raisons pratiques, les équipes de FIV sont parfois amenées à proposer le transfert des embryons à
J3. Cette pratique n’est pas délétère puisqu’il n’y a pas de différence entre les taux de grossesses obtenus
respectivement à J2 ou à J3. De plus, elle permet de repérer les embryons qui se développent le mieux
pendant cette période d’observation.
Lors d’une étude prospective randomisée, SCHOLTES et coll, 1996, ont comparé les taux d’implantation
après transfert systématique des embryons à J3 ou à J5 (quel que soit leur stade de développement). Ils
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n’ont pas trouvé de différence significative que ce soit entre les taux de grossesses (26 % et 25 %
respectivement) ou entre les taux d’implantation embryonnaire (13 % et 12 % respectivement).
Lorsque les résultats sont analysés en fonction de l’aspect morphologique des embryons transférés : Les
taux de grossesse et d’implantation obtenus avec les embryons sans fragments ou avec moins de 20 % de
fragments à J3 sont respectivement égaux à 32 % et 27 % ; 18 % et 12 %. Le transfert de 1 ou 2 blastocyste
(s) expansé (s) à J5 permet d’obtenir 49 % de grossesse par transfert et 35 % d’implantation par embryon ;
ce qui est significativement plus élevé que ce qui est obtenu avec les plus beaux embryons à J3. D’après
GARDNER et coll, 1998, il faut transférer en moyenne 3,8 embryons à J3 contre 2,7 à J5 pour obtenir des
taux de grossesses équivalents (47 % versus 63 %) .
Avec les milieux séquentiels développés par GARDNER (G1, G2), il est possible d’obtenir 52 % de
blastocystes (JONES et coll, 1998). Le développement des embryons en culture prolongée dépend de leur
morphologie à J2 ; Placés dans les mêmes conditions de culture ; 47 % des embryons ayant entre 0 et 20 %
de fragments atteignent le stade blastocyste contre 21 % pour les embryons ayant plus de 20 % de
fragments (RIJNDERS et coll, 1998). Néanmoins seulement 51 % des embryons transférés à J5 avaient été
présélectionnés pour un transfert à J3. La morphologie embryonnaire à J3 a donc une valeur prédictive
limitée.
Le pourcentage de transferts d’au moins 1 blastocyste à J5 dépend essentiellement du nombre d’ovocytes
récupérés à la ponction. Il varie d’environ 48 % pour moins de 5 ovocytes à 80 % pour des cohortes
d’environ 15 ovocytes (SCHOLTES et coll, 1998). En première intention, il est donc recommandé de réserver
le transfert de blastocyste uniquement aux femmes ayant au moins 10 à 12 ovocytes matures.
Notre expérience préliminaire avec des patientes ayant eu plusieurs échecs d’implantation embryonnaire à
J2 montre que la culture prolongée en milieux séquentiels (IVF50 puis S2) offre à certaines femmes ; la
possibilité d’obtenir une grossesse évolutive (24 cycles (14 ICSI + 10 FIV ), 23 transferts, 8 grossesses ). Par
contre, on ne sait pas encore si les blastocystes congelés obtenus par cette méthode permettront d’obtenir
les mêmes taux d’implantation que ceux obtenus après coculture sur cellules VERO.
TABLEAU 1 : OBTENTION DE BLASTOCYSTES HUMAINS SUR DIFFERENTS SUPPORTS
CELLULAIRES
COCULTURE AUTEURS POURCENTAGE DE BLASTOCYSTES
COCULTURE TEMOINS
Supports d’origine
Génitale : Cellules
oviducte
YEUNG et al, 1992
BONGSO et al, 1989 51 %30 % 46 %28 %
Cellules endomètre PLACHOT et al, 1994
JAYOT et al, 1995 47 %45 % 3 %-
Séquence : Cellules
oviducte Puis cellules
endomètre BONGSO et al, 1994 63 % 41 %
Cellules cumulus QUINN et al, 1996 45 % 31 %
Cellules granulosa PLACHOT et al, 1996
FREEMAN et al, 1995 30 %67,7 % 3 %-
Lignée cellules
endomètre DESAI et al, 1994 69 % 29 %
Cellules oviductes bovin WIEMER et al, 1993 58,5 % 29,3 %
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COCULTURE AUTEURS POURCENTAGE DE BLASTOCYSTES
Support d’origine extra
génitale : Cellules
épithéliales de Rein, de
singe : Lignée VERO
MENEZO et al, 1990
,1992SCHILLACI et al,
1994SAKKAS et al,
1994VAN BLERKOM
et al, 1993TURNER et
LENTON, 1996
61 %57 %68 %62 %45,6 %77
% 3 %17 %1 % 53,6 % 38,5 %46 %
TABLEAU 2
RESULTATS DES TRANSFERTS DE BLASTOCYSTES DE FIV CONGELES ; OBTENUS PAR CULTURE
SUR CELLULES VERO (Activité 1992-1997 – AMP EYLAU)
CYCLES 506
TRANSFERTS 471
Nb BLASTO CONGELES 931
Nb BLASTO AYANT RECUPERES 787
Nb GROSSESSES EVOLUTIVES 95 (90 accouchements, 5 FCS 2nd trimestre)
Nb ENFANTS NES 100
BEBE / EMB. CONG. 10,7 %
BEBE / EMB. TRANSFERES 12,7 %
L’éclosion embryonnaire assistée
In vivo, la perte de la zone pellucide (ZP) est un phénomène, étroitement lié à l’implantation . Si cette étape
du développement embryonnaire intervient en retard ou ne se fait pas, alors l’implantation de l’embryon sera
compromise. Deux mécanismes interviendraient dans la perte de la Zone Pellucide :
un facteur lytique utérin hormono dépendant.
Un procédé actif d’éclosion engagé par le blastocyste indépendamment d’un stimulus hormonal. Ce procédé
ferait intervenir des lysines embryonnaires mais aussi des cycles de contraction et de réexpansion du
blastocyste.
Les changements biochimiques que subit la Zone Pellucide, au moment de la fécondation, la rendent plus
résistante aux protéases. Cette modification est appelée durcissement de la zone pellucide. En plus de ce
durcissement induit par la fécondation, la Zone Pellucide peut subir un durcissement spontané après culture
in vitro ou après vieillissement in vivo.
L’hypothèse selon laquelle des défauts d’éclosion pourraient être responsables d’échecs d’implantation a été
émise par l ‘équipe américaine de COHEN et coll 1990, suite à deux observations :
les embryons à Zone Pellucide épaisse (supérieure à 15 µm) s’implantent moins que ceux à Zone Pellucide
fine et régulière (10% contre 29%).
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