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VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année 2013 - Thèse n° 41 ACTUALITES EN BIOTECHNOLOGIES DE L’EMBRYON CHEZ LES CARNIVORES DOMESTIQUES ET MISE EN PLACE D’UN PROTOCOLE DE TRANSFERT D’EMBRYONS CONGELES CHEZ LA CHIENNE THESE Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 11 octobre 2013 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par BONTE Tancrède Né le 06 mai 1988 A Saumur VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année 2013 - Thèse n° 41 ACTUALITES EN BIOTECHNOLOGIES DE L’EMBRYON CHEZ LES CARNIVORES DOMESTIQUES ET MISE EN PLACE D’UN PROTOCOLE DE TRANSFERT D’EMBRYONS CONGELES CHEZ LA CHIENNE THESE Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 11 octobre 2013 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par BONTE Tancrède Né le 06 mai 1988 A Saumur 2 Civilité M. M. Mme Nom ALOGNINOUWA ALVESDEOLIVEIRA ARCANGIOLI Prénom Théodore Laurent Marie-Anne M. ARTOIS Marc M. BARTHELEMY Anthony Mme BECKER Claire M. BELLI Patrick Mme BELLUCO Sara Mme M. M. Mme BENAMOUSMITH BENOIT BERNY BONNETGARIN Agnès Etienne Philippe Jeanne-Marie Mme BOULOCHER Caroline M. BOURDOISEAU Gilles M. BOURGOIN Gilles M. BRUYERE Pierre M. BUFF Samuel M. BURONFOSSE Thierry M. CACHON Thibaut M. CADORE Jean-Luc Mme CALLAITCARDINAL Marie-Pierre M. CAROZZO Claude M. CHABANNE Luc Mme M. Karine Loïc Alice Unité pédagogique Gestion des élevages Mme CHALVETMONFRAY COMMUN DE BOYER DES ROC HES DELIGNETTEMULLER Unités pédagogiques Unité pédagogique Pathologie du bétail Unité pédagogique Gestion des élevages Unité pédagogique Pathologie du bétail Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Pathologie du bétail Unité pédagogique Pathologie morphologiq ue et clinique des animaux de compagnie Unité pédagogique Pathologie morphologiq ue et clinique des animaux de compagnie Unité pédagogique Equine Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Biotechnologies et patho logie de la reproduction Unité pédagogique Biotechnologies et patho logie de la reproduction Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Pathologie médicale des animaux de compagnie Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Pathologie médicale des animaux de compagnie Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Gestion des élevages Marie-Laure M. DEMONT Pierre Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Mme DESJARDINS PESSO N Isabelle Mme DJELOUADJI Zorée Mme ESCRIOU Catherine M. FAU Didier Mme FOURNEL Corinne M. FRANCK Michel M. FREYBURGER Ludovic M. FRIKHA MohamedRidha M. GENEVOIS Jean-Pierre Mme GILOTFROMONT Emmanuelle M. GONTHIER Alain Mme M. GRAIN GRANCHER Françoise Denis Mme GREZEL Delphine M. GUERIN Pierre Mme GUERINFAUBLEE Véronique Mme Unité pédagogique Equine Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Pathologie médicale des animaux de compagnie Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Pathologie morphologiq ue et clinique des animaux de compagnie Unité pédagogique Gestion des élevages Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Pathologie du bétail Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Gestion des élevages Unité pédagogique Gestion des élevages Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Biotechnologies et patho logie de la reproduction Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri Grade Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Professeur Professeur Professeur Maître de conférences Professeur Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Maître de conférences Maître de conférences Maître de conférences Stagiaire Professeur Professeur Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Professeur Professeur Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Professeur Maître de conférences Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Maître de conférences 3 naire Unité pédagogique Pathologie médicale des animaux de compagnie Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Gestion des élevages Unité pédagogique Pathologie du bétail Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Equine Unité pédagogique Equine Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Pathologie morphologiq ue et clinique des animaux de compagnie Mme HUGONNARD Marine M. JUNOT Stéphane M. KECK Gérard M. KODJO Angeli Mme LAABERKI Maria-Halima M. LACHERETZ Antoine Mme Mme LAMBERT LE GRAND Véronique Dominique Mme LEBLOND Agnès Mme M. Mme LEFRANCPOHL LEPAGE LOUZIER Anne-Cécile Olivier Vanessa M. MARCHAL Thierry Mme MIALET Sylvie Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Mme MICHAUD Audrey Unité pédagogique Gestion des élevages M. MOUNIER Luc M. PEPIN Michel M. PIN Didier Mme PONCE Frédérique Mme PORTIER Karine Mme POUZOTNEVORET Céline Mme PROUILLAC Caroline Mme REMY Denise M. ROGER Thierry M. SABATIER Philippe M. SAWAYA Serge Mme SEGARD Emilie Mme SERGENTET Delphine Mme SONET Juliette M. THIEBAULT Jean-Jacques M. VIGUIER Eric Mme VIRIEUXWATRELOT Dorothée M. ZENNER Lionel Unité pédagogique Gestion des élevages Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Pathologie morphologiq ue et clinique des animaux de compagnie Unité pédagogique Pathologie médicale des animaux de compagnie Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (AC SAI) Unité pédagogique Pathologie morphologiq ue et clinique des animaux de compagnie Unité pédagogique Santé Publique et Vétéri naire Maître de conférences Maître de conférences Professeur Professeur Maître de conférences Stagiaire Professeur Maître de conférences Maître de conférences Professeur Maître de conférences Professeur Maître de conférences Professeur Inspecteur en santé pu blique vétérinaire (ISP V) Maître de conférences Stagiaire Maître de conférences Professeur Maître de conférences Maître de conférences Maître de conférences Maître de conférences Stagiaire Maître de conférences Professeur Professeur Professeur Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Maître de conférences Contractuel Maître de conférences Professeur Maître de conférences Contractuel Professeur 4 REMERCIEMENTS A Monsieur le Professeur Michel Berland, de la Faculté de médecine de Lyon, Qui nous a fait l’honneur d’accepter la présidence de ce jury de thèse, Hommages respectueux A Monsieur le Docteur Samuel Buff du Campus Vétérinaire de VetAgro Sup, Pour avoir accepter de me confier et d’encadrer ce travail, Pour sa confiance, sa disponibilité, sa gentillesse et ses conseils avisés, Pour le temps qu’il a pu m’accorder et son aide précieuse Qu’il trouve ici toute l’expression de mon profond respect et de ma gratitude. A Monsieur le Professeur Pierre Guérin du Campus Vétérinaire de VetAgro Sup, Qui nous a fait l’honneur d’accepter de juger ce manuscrit et de siéger à ce jury, Avec l’expression de toute ma gratitude et de mon profond respect. A l’ensemble du CERREC pour leur disponibilité, leur aide précieuse et leur bonne humeur. 5 6 SOMMAIRE REMERCIEMENTS ......................................................................................................................................... 5 SOMMAIRE ...................................................................................................................................................... 7 TABLE DES ILLUSTRATIONS .................................................................................................................. 10 TABLE DES TABLEAUX ............................................................................................................................ 10 INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 11 PREMIERE PARTIE : PHYSIOLOGIE DE LA REPRODUCTION CHEZ LES CARNIVORES DOMESTIQUES ................................................................................................................................ 12 A) La gamétogénèse.............................................................................................................................. 12 B) Le cycle œstral .................................................................................................................................. 15 1) La spermatogénèse ..................................................................................................................... 12 2) L’ovogénèse ................................................................................................................................... 14 1) Le cycle œstral de la chienne .................................................................................................. 15 a. Le proœstrus ............................................................................................................................................... 16 b. L’œstrus ........................................................................................................................................................ 17 c. Le metœstrus............................................................................................................................................... 18 d. L’anœstrus ................................................................................................................................................... 19 2) Le cycle œstral de la chatte...................................................................................................... 20 a. Le proœstrus ............................................................................................................................................... 21 b. L’œstrus ........................................................................................................................................................ 21 c. L’interœstrus ............................................................................................................................................... 21 d. L’anœstrus ................................................................................................................................................... 22 e. L’ovulation ................................................................................................................................................... 22 f. La pseudo gestation .................................................................................................................................. 22 g. La gestation.................................................................................................................................................. 23 C) Endocrinologie du cycle ovarien ................................................................................................ 24 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) D) 1) 2) 3) 4) 5) La Gonadotrophin Releasing Hormone .............................................................................. 25 La Follicule Stimulating Hormone ........................................................................................ 25 La Luteinizing Hormone ........................................................................................................... 25 Les Œstrogènes ............................................................................................................................ 26 La progestérone ........................................................................................................................... 26 La prolactine.................................................................................................................................. 26 La relaxine ...................................................................................................................................... 26 La mélatonine ............................................................................................................................... 26 Hormones et folliculogénèse....................................................................................................... 27 La phase de recrutement .......................................................................................................... 27 La phase de sélection ................................................................................................................. 27 La phase de dominance ............................................................................................................. 28 Formation du corps jaune ........................................................................................................ 28 Lyse du corps jaune .................................................................................................................... 28 E) Les mécanismes de la fécondation ............................................................................................ 29 F) Le développent embryonnaire .................................................................................................... 34 1) Le transport des spermatozoïdes et la capacitation ...................................................... 30 2) Le transport de l’ovocyte jusqu’à l’ampoule de l’oviducte .......................................... 31 3) La fécondation .............................................................................................................................. 31 1) La période libre ............................................................................................................................ 34 2) La période embryonnaire ........................................................................................................ 36 3) Période fœtale .............................................................................................................................. 39 7 SECONDE PARTIE : ETAT DES LIEUX DES BIOTECHNOLOGIES DE L’EMBRYON CHEZ LES CARNIVORES DOMESTIQUES.................................................................................. 43 A) Induction des chaleurs et Superovulation.............................................................................. 43 1) Chez la chienne ............................................................................................................................. 44 a. Les anti-prolactiniques ........................................................................................................................... 44 b. Les agonistes de la GnRH ....................................................................................................................... 44 c. Les gonadotrophines................................................................................................................................ 45 d. Techniques alternatives ......................................................................................................................... 45 e. La superovulation ..................................................................................................................................... 45 2) Chez la chatte ................................................................................................................................ 46 a. Utilisation de la luminosité ................................................................................................................... 46 b. Les gonadotrophines ............................................................................................................................... 46 c. Les antiprolactiniques ............................................................................................................................. 46 d. La superovulation ..................................................................................................................................... 47 B) Récolte des embryons .................................................................................................................... 47 1) Chez la chienne ............................................................................................................................. 47 2) Récolte chez la chatte................................................................................................................. 48 C) Production d’embryons In vitro.................................................................................................. 49 1) La collecte des oocytes .............................................................................................................. 49 2) La sélection des ovocytes compétents ................................................................................ 50 4) La maturation In vitro (IVM) ................................................................................................... 50 a. b. Maturation iv vitro d’ovocytes canins .............................................................................................. 52 Maturation in vitro d’ovocytes félins ................................................................................................ 55 5) Prélèvement et préparation du sperme en vue de la fécondation in vitro............ 55 a. b. Prélèvement de semence chez le chien ............................................................................................ 55 Prélèvement de semence chez le chat .............................................................................................. 57 6) Capacitation in vitro ................................................................................................................... 58 7) Fécondation in vitro.................................................................................................................... 58 a. Mise en présence des gamètes ............................................................................................................. 59 b. Injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) .......................................................... 59 c. Insémination Sub Zonale (SUZI) ......................................................................................................... 63 D) La cryopréservation des embryons des carnivores domestiques ................................. 64 1) 2) 3) 4) Principe de la cryopréservation ............................................................................................ 64 La congélation lente ................................................................................................................... 66 La vitrification .............................................................................................................................. 66 Résultats ......................................................................................................................................... 67 E) Evaluation de la viabilité des embryons et comparaison embryons produits in vivo et in vitro ...................................................................................................................................................... 71 F) Le transfert d’embryon .................................................................................................................. 73 1) Technique de transfert d’embryons..................................................................................... 73 2) Efficacité des transferts embryonnaires chez le chien ................................................. 75 3) Efficacité des transferts embryonnaires chez la chatte................................................ 76 TROISIÈME PARTIE : MISE EN PLACE D’UN PROTOCOLE DE TRANSFERT D’EMBRYONS CONGELÉS CHEZ LA CHIENNE ........................................................................ 78 A) Matériels et méthodes .................................................................................................................. 78 1) 2) B) Récolte des embryons .............................................................................................................. 78 Transferts embryonnaires ...................................................................................................... 79 Protocoles expérimentaux .......................................................................................................... 80 1) 2) 3) 4) a. Récolte des embryons .............................................................................................................. 80 Congélation des embryons ..................................................................................................... 80 Décongélation des embryons ................................................................................................ 82 Transferts embryonnaires ...................................................................................................... 85 Protocole anesthésique........................................................................................................................... 85 8 b. Protocole chirurgical ............................................................................................................................... 85 C) Résultats ............................................................................................................................................. 90 1) 2) Récolte des embryons .............................................................................................................. 90 Transferts embryonnaires ...................................................................................................... 91 1) 2) Récolte des embryons .............................................................................................................. 96 Transferts embryonnaires ...................................................................................................... 96 a. Evaluation de la morphologie et de la viabilité des embryons............................................... 91 b. Diagnostic de gestation par échographie abdominale .............................................................. 93 c. Aspect morphologique de l’appareil génital .................................................................................. 94 D) Discussion ......................................................................................................................................... 96 a. Evaluation de la viabilité des embryons .......................................................................................... 97 b. Evaluation de la technique de transfert........................................................................................... 97 CONCLUSION ............................................................................................................................................... 99 BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................................................................100 9 TABLE DES ILLUSTRATIONS Figure 1 : Modifications cellulaires au cours de ma spermatogénèse (REECE, 1997) ......................... 12 Figure 2 Déroulement de la folliculogénèse (LAFOREST, 2005) ........................................................ 14 Figure 3 : Cycle sexuel de la chienne .................................................................................................... 16 Figure 4 : Variation hormonale péri ovulatoire chez la chienne (ENGLAND, 2010) .......................... 18 Figure 5 : Evolution de la concentration en progestérone durant la phase lutéale (ENGLAND, 2010) 19 Figure 6 : Production hormonale pendant un cycle anovulatoire chez la chatte (HALTER, 2010) ...... 20 Figure 7 : Production hormonale pendant un cycle ovulatoire sans gestation chez la chatte (HALTER, 2010) .............................................................................................................................................. 23 Figure 8 : Production hormonale pendant un cycle ovulatoire avec gestation chez la chatte (HALTER, 2010) .............................................................................................................................................. 24 Figure 9 : Endocrinologie du cycle ovarien chez la chienne (CONCANNON P. , 2011)..................... 27 Figure 10 : Devenir des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle (SENGER, 2003) .................. 29 Figure 12 : Initiation de la réaction acrosomique (SENGER, 2003) ..................................................... 32 Figure 13 : Réaction acrosomique (SENGER, 2003) ............................................................................ 32 Figure 14 : Fusion des membranes du spermatozoïde et de l'ovocyte (SENGER, 2003) ..................... 33 Figure 15 : Développement embryonnaire précoce............................................................................... 35 Figure 16 : Placentation des carnivores domestiques (SENGER, 2003) ............................................... 39 Figure 17 : Développement embryonnaire et fœtal du chat .................................................................. 42 Figure 18 : Principe de l'ICSI (FAURE, 2008) ..................................................................................... 60 Figure 19 : Images d'ICSI (FAURE, 2008) ........................................................................................... 61 Figure 20 : Montage d'une ICSI (FAURE, 2008).................................................................................. 62 Figure 21 : Schéma d'injection sub-zonale de spermatozoïdes (CATT, 1996) ..................................... 63 Figure 22 : Suivi de la viabilité des embryons grâce au respiromètre (LOPES, 2005) ......................... 72 Figure 23 : Embryon sans coloration / avec coloration vitale ............................................................... 73 Figure 24 : Sortie des paillettes de l'azote ............................................................................................. 82 Figure 25 : Décongélation en bain marie .............................................................................................. 83 Figure 26 : Incubation des paillettes...................................................................................................... 83 Figure 27 : Vérification avant transfert ................................................................................................. 84 Figure 28 : Matériel de transfert ............................................................................................................ 84 Figure 29 : Ponction de la corne utérine ................................................................................................ 86 Figure 30 : Saignement lors de la ponction ........................................................................................... 86 Figure 31 : Coagulation du saignement ................................................................................................. 87 Figure 32 : Transfert des embryons dans la corne utérine ..................................................................... 87 Figure 33 : Vérification des cornes après le transfert ............................................................................ 88 Figure 34 : Suture du point du transfert................................................................................................. 88 Figure 35 : Embryons aux stades 4 et 8 cellules ................................................................................... 90 Figure 36 : Embryon au stade blastocyste ............................................................................................. 90 Figure 37 : Qualité variable des embryons post décongélation ............................................................. 91 Figure 38 : Coloration Live Dead d'un embryon 8 cellules................................................................... 93 Figure 39 : Mise en évidence d’adhérences de l'omentum sur les cornes utérines................................ 94 Figure 40 : Observation d’une inflammation locale au niveau des sites de transfert ............................ 95 Figure 41 : Mise en évidence d’une sténose de la corne utérine ........................................................... 95 TABLE DES TABLEAUX Tableau 1 : Résultats des études de transferts d'embryons frais chez le chien ...................................... 75 Tableau 2 : Résultats des études de transferts d'embryons congelés/vitrifiés chez le chien.................. 75 Tableau 3 : Résultats des études de transferts d'embryons chez le chat ................................................ 76 Tableau 4 : Tableau récapitulatif des paillettes ..................................................................................... 81 Tableau 5 : Tableau récapitulatif des transferts embryonnaires ............................................................ 89 Tableau 6 : Correspondance entre les chiennes donneuses et receveuses ............................................. 97 10 INTRODUCTION Les biotechnologies consistent à l’ensemble des principes scientifiques et de l’ingénierie permettant l’exploitation des propriétés du vivant pour produire des biens et des services. Il s’agit donc de l’union de la science des êtres vivants, et des techniques issues des autres sciences. L’utilisation des biotechnologies dans le secteur de la reproduction a connu un essor incroyable durant les cinquante dernières années par son application chez les espèces de rente, soumises à une pression économique importante. Chez ses espèces, les biotechnologies ont su s’imposer comme des procédés incontournables, et sont maintenant utilisées en routine. Le développement des biotechnologies de l’embryon a ainsi permis la création de banque génétique, facilitant les échanges et la sélection à grande échelle. Chez les carnivores domestiques, on observe un retard important dans le développement de ces biotechnologies de la reproduction, où seule l’insémination artificielle et la congélation de semence sont bien maîtrisées, mais les biotechnologies de l’embryon presque inexistantes. Ces lacunes s’expliquent par l’importance économique bien moindre que chez les animaux de production, et par la bonne prolificité des ces espèces dans leurs milieux naturels, à l’origine d’une surproduction incontrôlée dans de nombreux pays. Au fil des années sont cependant apparus de nouveaux besoins, ayant motivé le développement des biotechnologies de l’embryon chez les carnivores domestiques. Leur première application est la préservation des espèces de canidés et de félidés en voie de disparition, en faisant des chiens et des chats des modèles d’études pour la reproduction assistée des espèces non domestiques. Une bonne maîtrise et un développement des biotechnologies embryonnaires permettrait également la préservation d’un pool génétique d’élite et la création de banque génétique. Cela aurait un intérêt tout particulier dans la sélection des chiens de travail, où une stérilisation précoce est souvent réalisée. L’augmentation importante des échanges de semences canines à travers le monde laisse penser que les éleveurs de chiens d’exposition seraient également intéressés. Enfin, leur utilisation dans le domaine de la recherche biomédicale aurait une importance capitale. En effet ce domaine nécessite l’élevage d’animaux dans des conditions particulières imposées par des cahiers des charges parfois très contraignants. L’objectif serait ici de faciliter l’obtention de lots d’animaux homogènes répondant aux critères de ces études. Le but de ce travail est de faire le point sur les techniques de biotechnologies de l’embryon chez les carnivores domestiques et leur application dans le domaine de la recherche et en clientèle. Nous reviendrons dans une première partie sur les différents aspects de la reproduction des carnivores, puis nous ferons un état des lieux des biotechnologies de production et conservation embryonnaire dans un second temps, et nous finirons par la mise au point d’un protocole de congélation et de transfert d’embryon congelé chez la chienne. 11 PREMIERE PARTIE : PHYSIOLOGIE DE LA REPRODUCTION CHEZ LES CARNIVORES DOMESTIQUES Cette première partie est un rappel des particularités de la physiologie de la reproduction chez les carnivores domestiques. En effet, il est impératif de bien connaître les particularités de chaque espèce, car celles-ci sont autant de contraintes auxquelles il est nécessaire de se soumettre en reproduction assistée. Ces particularités concernent notamment le cycle sexuel de ces espèces, mais également la nature biochimique de l’embryon. A) La gamétogénèse La gamétogénèse correspond à l’étape de production des gamètes fécondants. Elle commence dans les gonades et s’achève lors de l’acquisition du pouvoir fécondant par les gamètes. 1) La spermatogénèse L’appareil génital masculin est composé : - des testicules : ils ont une fonction exocrine (production des gamètes mâles) et une fonction endocrine (production de testostérone) ; - le tractus génital qui véhicule les spermatozoïdes ; - les glandes annexes, comme la prostate et les vésicules séminales produisant le liquide de transport des spermatozoïdes. La spermatogénèse est composée de trois étapes conduisant à la formation des spermatozoïdes : l’étape de divisions cellulaires, l’étape de grandissement cellulaire et l’étape de différenciation cellulaire. La spermatogénèse a lieu de manière centripète dans l’épithélium des tubes séminifères des testicules. Figure 1 : Modifications cellulaires au cours de ma spermatogénèse (REECE, 1997) 12 L’étape de division cellulaire par mitose permet de passer du stade spermatogonies (cellules souches) au stade spermatocyte I. Ces mitoses ont lieu de manière continue de la naissance à la mort. La spermatogonie mère en se divisant va donner une spermatogonie souche et une spermatogonie fille qui va connaitre une spermatogénèse centripète et donnera 32 spermatocytes I évoluant de manière synchrone et reliés entre eux par les relations cytoplasmiques. La phase de grandissement cellulaire et de méiose permet de passer du stade spermatocyte I au stade spermatide. Le spermatocyte I subit un grandissement cellulaire avant de subit une réduction chromatique ou méiose composé de deux divisions cellulaires, la première permettant la séparation des chromosomes homologues parentaux et la formation de spermatocytes II et la deuxième aboutissant à la répartition de chaque chromatide des chromosomes dans les cellules filles. On obtient ainsi des spermatides haploïdes, qui vont ensuite subir la spermiogénèse. La spermiogénèse correspond à l’étape de différenciation des spermatides en spermatozoïdes. Elle commence par une réorganisation du noyau qui va être fortement condensé suite une hyperméthylation de l’ADN et un remplacement des histones par des protamines. Le nucléole n’est plus visible et le noyau va migrer du centre vers la périphérie. Ensuite on va avoir développement et mise en place de l’acrosome à partir de la fusion des vésicules golgiennes. Il va venir coiffer le noyau et contiendra les enzymes permettant la pénétration dans l’ovule. Le flagelle va être mis en place par le déplacement des centrioles. Le centriole distal génère des microtubules formant le flagelle. Les mitochondries se disposent à l’arrière du noyau et forment un manchon hélicoïdal à la base du flagelle. La cellule va ensuite s’allonger, le cytoplasme va se positionner à l’arrière du noyau et former une fine couche au niveau du flagelle et le reste sera exocyté puis phagocyté par les cellules de Sertoli. Les spermatozoïdes sont alors immobiles et non fécondant, ils sont libérés dans le liquide tubaire produit par les cellules de Sertoli et poussés vers l’épididyme par les contractions des testicules et des fibres myoïdes péritubulaires. Le passage dans l’épididyme voit la poursuite de la maturation avec une condensation nucléaire supplémentaire, un positionnement définitif des mitochondries, l’acquisition de la mobilité linéaire et un remaniement membranaire avec un enrichissement en cholestérol et la mise en place de molécules de reconnaissance et d’adhérence. Cependant le processus de décapacitation rend la fécondation de l’ovule impossible. A la sortie de l’épididyme on aura une modification des sécrétions permettant de favoriser la mobilité, avec du sucre, du Zinc (bactéricide), du mucus (lubrifiant, sécréter par les glandes de Cowper), des enzymes protéolytiques liquéfiant le sperme. 13 2) L’ovogénèse Figure 2 Déroulement de la folliculogénèse (LAFOREST, 2005) Elle a lieu dans la zone corticale des ovaires et comprend également trois phases : la multiplication, l’accroissement et la maturation. La production de gamète commence à la puberté. La phase de multiplication intensive a lieu durant la vie embryonnaire. Les ovogonies obtenues s’entourent de cellules folliculaires aplaties ou dégénèrent. Durant la vie fœtale on a un début de division méiotique mais celle-ci reste bloquée en prophase I. A partir de la puberté, on observe une phase d’accroissement de l’ovocyte. L’environnement de l’ovocyte évolue également lors de cette phase, avec une multiplication et une modification de la morphologie des cellules folliculaires qui deviennent cubiques et la mise en place de la zone pellucide. L’ovocyte I et les cellules folliculaires forment alors le follicule primaire. Les cellules folliculaires vont ensuite se multiplier et former la granulosa et la thèque va se mettre en place : on est alors en présence d’un follicule secondaire. Une cavité va se former dans la granulosa et le follicule va augmenter de taille, c’est alors un follicule tertiaire. 14 Le dernier stade est le follicule de De Graaf qui présente une grande cavité, l’antrum, qui entoure presque tout l’ovocyte sauf au niveau du cumulus oophorus. Les cellules folliculaires forment la corona radiata. Le début de la maturation est déclenché par le pic de LH et est caractérisée par la reprise de la méiose. Le pic de LH initie au niveau du follicule de De Graaf une séparation de l’ovocyte et des cellules folliculaire grâce à la sécrétion d’acide hyaluronique par l’ovocyte, qui va déstabiliser les jonctions lacunaires. Les microvillosités de la membrane plasmique disparaissent au niveau du matériel génétique. On observe un arrêt de l’activité transcriptionnelle mais une persistance de l’activité traductionnelle. Lors de l’ovulation, la paroi de l’ovaire et du follicule se déchire et l’ovocyte est libéré entouré de la zone pellucide et des cellules folliculaires de la corona radiata. Le follicule rompu s’affaisse et se remplit de vaisseaux sanguins et de sang. Les cellules restantes de la granulosa augmentent de volume et les cellules de la thèque grandissent, se multiplient et changent de phénotype pour constituer une nouvelle glande endocrine : le corps jaune. La maturation présente deux aspects inhabituels chez la chienne : les ovocytes sont ovulés à un stade immature et leur survie est beaucoup plus longue que chez les autres mammifères (plusieurs jours contre quelques heures). La méiose sera complétée pendant le transport tubal afin de donner un ovocyte fécondable, c’est pourquoi il ne peut pas y avoir de fécondation avant 48h. B) Le cycle œstral 1) Le cycle œstral de la chienne La chienne est un animal à cycle mono-œstrienne avec une seule période de chaleur et une seule ovulation par cycle. Son ovulation est spontanée. Elle présente généralement 2 cycles par an, tous les 7 mois en moyenne (mais très variable selon les races et les chiennes), et est monosaisonnée à l’exception de certaines races saisonnières. La durée du cycle augmente légèrement avec l’âge. La puberté est atteinte entre 6-8 mois pour les petites races et 12-15 mois pour les grandes races. Le cycle de la chienne présente deux particularités par rapport aux autres mammifères : A) La présence d’une lutéinisation pré-ovulatoire (ceci est mis à profit pour les suivis de chaleurs par suivi de progestérone) B) L’ovocyte est immature et bloqué en prophase I de méiose lors de l’ovulation et nécessite donc une maturation. Le cycle œstral est découpé en 4 phases distinctes. 15 Figure 3 : Cycle sexuel de la chienne a. Le proœstrus Cette phase dure en moyenne 9 jours avec une variabilité de 2 à 22 jours (CONCANNON P. , 2011). Les signes d’appels sont un œdème vulvaire, à l’augmentation de la concentration plasmatique en œstradiol, et la présence de pertes vulvaires séro-hémorragiques contenant des hormones sexuelles (principalement du méthyl p-hydroxybenzoate) attractives pour le mâle. (JOHNSTON, Canine and Feline Theriogenology, 2001) L’apparition des pertes séro-hémorragiques est considérée comme le signe marquant le premier jour des chaleurs. Celles-ci sont dues à l’action de l’œstradiol qui va stimuler la croissance et l’activité de l’épithélium glandulaire ainsi que la vascularisation et l’œdème de la muqueuse du tractus génital. Cela va entrainer une fragilité de la muqueuse des capillaires et le passage de plasma et de cellules sanguines va pouvoir se faire entre les jonctions des cellules épithéliales. Un changement du comportement de la chienne peu également être observé, avec une augmentation du marquage urinaire, l’apparition de signes de nervosité, de désobéissance et une tendance à errer. On observe également une kératinisation progressive de la muqueuse vaginale au frotti vaginal secondaire à l’imprégnation œstrogénique et la muqueuse apparait plus rouge et présente des plis œdématiés et proéminents à l’endoscopie. Durant le pro-œstrus, on peut observer dans certains cas un basculement de la vulve vers le haut ou une déviation la queue à l’approche du mâle mais la chienne refuse l’accouplement. 16 Le développement folliculaire est permis par l’action de la LH et de la FSH sécrétées par l’antéhypophyse sous contrôle de la GnRH. Le pic d’œstradiol entrainera environ 24h après le pic de LH à l’origine de l’ovulation. L’ovulation sera spontanée chez la chienne au contraire de la chatte ou des mustélidés, où des saillies répétées sont nécessaire à la libération de la LH et donc à l’ovulation. La sécrétion de FSH est également indispensable au développement des follicules et à la sécrétion d’œstradiol mais la concentration en FSH dans le courant circulatoire n’est pas aussi marquante que celle de la LH car sa sécrétion est inhibée par la production d’Inhibine, qui est un inhibiteur sélectif de la FSH, par les follicules. Son rôle reste néanmoins important pour la maturation des follicules et leur équipement en vue de leur conversion en corps jaune après l’ovulation. La lutéinisation pré-ovulatoire est l’une des spécificités de la chienne. Contrairement aux autres espèces chez qui la concentration en progestérone doit être minimale pour permettre l’ovulation, la sécrétion de progestérone par les follicules pré ovulatoires semble jouer un rôle central dans le déclenchement de l’ovulation. Il est à noter que chez la chienne le stade de gestation sera compté par rapport au pic de LH et non par rapport au premier jour de l’œstrus. b. L’œstrus L’œstrus dure en moyenne 9 jours, et peut aller de 3 à 15 jours (CONCANNON P. , 2011). Son début est marqué par un changement de comportement, avec une acceptation du mâle par la chienne. Les phéromones sont des composés chimiques permettant de délimiter cette transition. Elles sont produites par les reins et le tractus génital sous l’influence de l’œstradiol et sont émises via les urines et les pertes vulvaires. Elles sont détectées par le mâle grâce aux organes olfactifs ou à l’organe voméro nasal. L’une des principales phéromones excrétées est la méthyl-p-hydroxybenzoate. Ces phéromones n’agissent pas que sur les mâles, en effet elles peuvent avancer les chaleurs d’une autre femelle ou synchroniser les chaleurs de plusieurs chiennes lorsque celles-ci vivent en meute. Cela semble montrer que ces phéromones ont une action sur l’hypothalamus et la sécrétion de GnRH. On note également une modification des écoulements qui deviennent plus claires, et une turgescence moins marquée de la vulve. Tous ces signes sont en lien avec l’augmentation plasmatique en progestérone. Au moment du pic de LH, elle est à 6-10 nmol/L (soit 2-3 ng/mL) et atteint 15-20 nmol/L (soit 6-8 ng/mL) au moment de l’ovulation, 48 à 72h après le pic de LH en moyenne. Lors de l’ovulation, les ovocytes diploïdes sont bloqués en prophase I. (ANDERSON, 1973). 6 à 12 ovocytes sont expulsés en moyenne par chienne (TSUTSUI, 1975) (LEE, 2005) (REYNAUD, 2006). L’ovulation se déroule sur 24 à 36h (SIMPSON, 2004) (MIMOUNI, 2005), ce qui explique que l’on peut observer des stades embryonnaires différents au sein d’une même cohorte d’embryons (BYSTED, 2001) (KIM, 2002) (REYNAUD, 2005). La maturation ovocytaire dure 48h en moyenne, l’ovocyte ne peut donc pas être fécondé avant le 4ème jour suivant le pic de LH, qui marque le début de la période fertile. La durée de survie de l’ovocyte est de 24 à 48h, mais la survie des spermatozoïdes dans les voies 17 génitales femelles pouvant aller jusqu’à 5 à 7 jours, on ne peut déduire la date de fécondation en connaissant la date de la saillie. En effet la durée de gestation pourrait alors aller de 58 à 72 jours post saillie ; c’est pourquoi on prend comme repère le pic de LH avec une durée de gestation de 63 ± 2 jours. Figure 4 : Variation hormonale péri ovulatoire chez la chienne (ENGLAND, 2010) c. Le metœstrus Le metœstrus débute le premier jour où la chienne refuse la saillie, généralement 5 à 7 jours après l’ovulation (JOHNSTON, 2001) ou 6 à 10 jours après le pic de LH (CONCANNON P. , 2011). Il dure 60 à 90 jours en moyenne. La vulve se décongestionne progressivement jusqu’à revenir à sa taille normale. Il est caractérisé par des changements sur le frotti vaginal, avec l’apparition de polynucléaires neutrophiles et la réapparition des cellules intermédiaires puis parabasales. A l’endoscopie, la muqueuse présente alors des zones hyperhémiées et on voit la présence de mucus. La progestérone continue d’augmenter jusqu’à 30-90 nmol/L (soit 10–30ng/mL). Celleci est sécrétée exclusivement par le corps jaune, que la chienne soit gestante ou non. Le corps jaune est entièrement autonome les 20 premiers jours du metœstrus, puis nécessite l’action lutéotrophique de la LH et de la prolactine. La concentration plasmique en progestérone continue d’augmenter jusqu’à 90-270 nmol/L (30-90 ng/mL) 30 jours après le pic de LH puis commence à diminuer 18 progressivement ensuite pour être à environ 30 nmol/L (soit 10ng/mL) 60 jour après le pic de LH. Jusque-là, on n’observe pas de différence dans l’évolution de la progestéronémie selon que la chienne soit gestante ou non. Chez les chiennes non gestantes, la progestérone redescend progressivement jusqu’à 3-9 nmol/L (1-3 ng/mL) en 30 à 60 jours à cause de l’absence de mécanismes lutéolytiques. La chute de progestérone est rapide avant la mise bas chez les chiennes gestantes. La concentration plasmatique en prolactine augmente également à partir de 30-65 jours après le pic de LH, que la chienne soit gestante ou non. Des lactations de pseudo-gestation peuvent être observées chez certaines chiennes cyclées ou ayant été stérilisée en metœstrus. En effet la concentration en progestérone diminuant, le rétrocontrôle négatif de celle-ci est moins efficace, ce qui est à l’origine d’une augmentation de la concentration de prolactine. De plus, la progestérone diminue en temps normal la sensibilité des glandes mammaires à la prolactine, on aura donc ici une stimulation des glandes mammaires en fin de metœstrus similaire à celle ayant lieu lors de la chute de progestérone. A la fin du metœstrus, le taux de progestérone est inférieur à 3 nmol/L (1 ng/mL) (MIMOUNI, 2005). Figure 5 : Evolution de la concentration en progestérone durant la phase lutéale (ENGLAND, 2010) d. L’anœstrus C’est la période de repos sexuel entre deux cycles consécutifs pendant laquelle il n’y a pas d’activité ovarienne. Le taux de progestérone est alors basal. 19 Sa durée varie de 2 à 9 mois selon les races et selon les individus. Il va y a voir des modifications morphologiques avec une involution utérine (70 jours chez la chienne non gestante, 90 jours en post partum). (MIMOUNI, 2005). La durée totale semble similaire qu’il y ait ou non gestation (CONCANNON P. , 2011). 2) Le cycle œstral de la chatte Le chat est un animal présentent un cycle sexuel polyœstrienne (plusieurs œstrus par cycle) saisonnier (de janvier à octobre). La puberté est atteinte entre 6 et 9 mois en moyenne, avec des races plus précoces comme les orientaux par exemple et des races plus tardives comme les persans chez qui la puberté peut n’être atteinte qu’à 18 mois. Il faut que le poids de la chatte soit au moins égal à 75% de son poids adulte pour qu’elle présente des chaleurs (2.3 à 2.5 kg le plus souvent) (SCOTT, 1970). Enfin, l’un des principaux facteurs de la maturité sexuelle et de la cyclicité est la photopériode, c'est-à-dire la quantité de lumière à laquelle la chatte est exposée et la durée d’exposition. En effet, chez des chattes pour lesquelles toutes les conditions sont réunies pour favoriser la puberté, celle étant à ce stade en été présenteront une puberté précoce grâce à leur longue exposition lumineuse, alors que celle atteignant ce stade durant l’automne ou l’hiver ne feront leur puberté qu’à l’arrivée du printemps suivant. En l’absence de gestation ou de pseudo gestation, la chatte présentera des cycles répétés toutes les 2 à 3 semaines au printemps, en été ou en automne. Dans le cas de colonies félines où l’exposition à la lumière est contrôlée, le cycle peut perdre son caractère saisonnier et on peut avoir des cycles en hiver. Cette influence de la photopériode est due à l’action de la mélatonine sécrétée par la glande pinéale. Figure 6 : Production hormonale pendant un cycle anovulatoire chez la chatte (HALTER, 2010) 20 a. Le proœstrus Il dure 1 à 4 jours. Il correspond à la période pendant laquelle les mâles sont attirés par les femelles mais que celles-ci ne sont pas réceptives. La chatte présente alors un comportement de chaleur : elle vocalise plus, se montre plus affectueuse, se frotte contre les objets et les gens, se met en position de lordose, dévie la queue. Elle accepte également le chevauchement mais pas l’intromission du pénis : c’est la seule différence avec l’œstrus. Les signes externes de chaleurs sont très frustres voire absents : on peut observer une vulve légèrement rougeâtre ou œdématiée, une légère ouverture de celle-ci. Aucun écoulement n’est présent. C’est durant cette phase qu’a lieu la croissance des follicules et la synthèse des œstrogènes par les cellules de la granulosa. Leur concentration est encore basse et trop faible pour permettre l’expression maximale du comportement de chaleurs et elle augmente progressivement. L’évolution de la sécrétion de FSH est mal connue chez le chat. Concernant la LH, celle-ci est basale au début du cycle avec une valeur inférieure à 10ng/mL. b. L’œstrus L’œstrus dure de 6 à 10 jours selon la race (plus court chez les persans, plus long chez les orientaux). Il correspond à la période pendant laquelle la chatte accepte le chevauchement et le coït. Les signes comportementaux sont alors à leur paroxysme. On observe une baisse d’intérêt temporaire pour le mâle juste après coït suivi par de nouveaux multiples coïts. L’œstrus est caractérisé par une sécrétion et des effets maximaux des œstrogènes folliculaires, avec une concentration en œstradiol dépassant 150-300 pmol/L. La concentration en LH augmente quelques minutes après la stimulation vaginale et redevient basale en 24-48h. L’amplitude et la durée du pic seront dépendantes du nombre et de l’intensité des saillies. Un pic optimal (>100 ng/mL) est obtenu si au moins 4 saillies sont réalisées dans un intervalle de 2 à 4h. c. L’interœstrus En l’absence de saillie ou d’ovulation spontanée, les périodes de chaleurs se répètent tous les 10 à 14 jours. La période séparant deux périodes d’activité sexuelle est alors appelée interœstrus. Sa durée est plus courte chez les races de type orientale et plus longues chez les races de type persan. La chatte ne présente alors aucun signe physique ou comportemental de chaleurs, on est en repos ovarien et utérin apparent. Les ovaires peuvent être d’ores et déjà en train de se préparer pour la prochaine vague folliculaire. Les œstrogènes diminuent alors pour revenir à des valeurs basales. 21 Dans certains cas, les vagues folliculaires successives peuvent se chevaucher, alors la concentration en œstrogène ne redescend pas et la chatte est en œstrus permanent : c’est le phénomène de nymphomanie ou d’œstrus prolongé. En interœstrus, la concentration en œstrogènes redevient basale en 5 à 10 jours. d. L’anœstrus L’anœstrus correspond à la vraie période de repos sexuel entre deux saisons de reproduction. Il apparait l’hiver ou lorsque la chatte n’est exposée qu’à de courtes périodes lumineuses. En anœstrus, la concentration en œstrogènes redevient basale en 5 à 10 jours. e. L’ovulation L’ovulation est provoquée par le coït. En effet les stimulations vaginales par les spicules kératinisées du pénis du mâle vont être à l’origine de la libération de GnRH par l’hypothalamus à l’origine du pic de LH. L’importance du pic de LH est fonction du nombre de saillies et de l’intervalle entre les saillies : il faut un minimum de quatre saillies en 2h pour déclencher l’ovulation qui aura lieu entre 24 et 52h après. Dans le cas d’une unique saillie, seule 50% des chattes ovulent (CONCANNON, 1980). La chatte ne présente plus de signes de chaleurs dès 24 à 48h après l’ovulation. Il est possible d’observer un pic de LH spontané sans qu’il n’y ait eu de saillie ou de stimulation vaginale, qui peut être suivi par une ovulation. On peut alors également mettre en évidence une augmentation de la concentration de progestérone plasmatique. Ces ovulations spontanées sont plus fréquentes chez les chattes âgées et celles vivant en colonie, et pourraient être dues aux phéromones. Leur fréquence est de 30% et peut monter jusqu’à 70% si un mâle est présent. Quand l’ovulation a lieu, la concentration en œstradiol chute en 2 à 3 jours. Qu’il y ait ou non fécondation, la concentration en œstradiol est généralement inférieure à 40 nmol/L même si certains individus peuvent présenter des concentrations plus élevées. S’il y a ovulation, la mise en place des corps jaunes entrainent une augmentation de la concentration en progestérone plasmatique entre 24 et 50h après le pic de LH, même s’il n’y a pas fécondation. La concentration peut atteindre 100 à 200 nmol/L (35 à 65 ng/mL) 25 jours après la première saillie. f. La pseudo gestation Si les ovocytes ne sont pas fécondés, des corps jaunes se mettent en placent et vont produire de la progestérone durant 25 à 45 jours. Cette courte phase lutéale est appelée pseudo gestation. La chatte ne revient pas en chaleur car la libération de la GnRH est bloquée par les concentrations élevées en progestérone. A la fin de cette période, un inter œstrus de 15 jours est observé si on est toujours en période de reproduction, sinon un anœstrus est mis en place. 22 En cas de pseudogestation, la concentration en progestérone diminue à partir du 25 jours suivant la première saillie pour redevenir basale vers le 30-40ème jour. Cette diminution progressive est caractéristique de la pseudo gestation et est due à l’atrophie des corps jaunes en l’absence de support lutéotrophique par l’embryon ou le placenta. Figure 7 : Production hormonale pendant un cycle ovulatoire sans gestation chez la chatte (HALTER, 2010) g. La gestation Si l’ovulation est suivie d’une fécondation, une gestation est mise en place. La fécondation a lieu dans l’oviducte et les embryons passent après 4-5 jours dans les cornes utérines où l’implantation a lieu 12 à 14 jours après le coït. Comme chez la chienne on peut observer une migration entre les cornes des blastocystes avant l’implantation. La longueur totale de la gestation est de 65 jours en moyenne. Comme dans le cas de la pseudogestation, la sécrétion de progestérone empêche la réapparition de l’œstrus. L’évolution de la progestérone diffère de celle observée pendant une pseudogestation : on aura une chute initiale aux alentours de J25-35, mais la valeur reste stable aux alentours de 15-30 nmol/L (5-10 ng/mL) jusqu’à J60. La progestérone est indispensable au maintien de la gestation, et une chute en dessous de 3 nmol/L (1 ng/mL) entrainera un avortement. Les placentas produisent de la progestérone en quantité faible, insuffisante pour maintenir la gestation, la principale source de progestérone restant les corps jaunes. Le maintien de ceux-ci quand il y a gestation pourrait être permis par la libération de facteurs lutéotrophiques par les fétus ou les placentas. En cas de gestation, on note également la sécrétion par les placentas de Relaxine, qui est la seule hormone spécifique à la gestation chez le chien et le chat. Elle augmente 20 à 30 jours après la saillie de la chatte seulement si celle-ci est gestante, et on lui soupçonne une action lutéotrophique : elle pourrait agir directement sur les corps jaunes ou 23 indirectement en favorisant la libération de prolactine ou d’un autre facteur lutéotrophique inconnu. On observe également une augmentation de la concentration en prolactine, jusque-là basale, à partir du 25 à 30ème jour après la saillie chez la chatte gestante, qui s’accentue fortement quelques jours avant la mise bas. La prolactine sera maximale pendant la lactation. L’administration d’une agoniste de la dopamine, comme la cabergoline par exemple, aura pour effet de supprimer la sécrétion de prolactine et d’entrainer une chute de progestérone fatale pour la gestation en dessous de 3 nmol/L (1ng/mL). Quand la chatte arrête d’allaiter les chatons, un bref interœstrus peut être observé avant le retour en chaleur si on est encore en saison de reproduction, sinon un anœstrus est mis en place. L’œstrus revient habituellement 10 à 15 jours après le sevrage des chatons mais dans certains cas la chatte retombe en œstrus dès 10 à 15 jours après la mise bas. Si la chatte n’est pas saillie, elle retombera en chaleurs normalement tous les 10-20 jours. La première saillie après une mise bas est généralement infructueuse à cause de l’involution utérine incomplète. Figure 8 : Production hormonale pendant un cycle ovulatoire avec gestation chez la chatte (HALTER, 2010) C) Endocrinologie du cycle ovarien Les follicules ovariens abritent deux types de cellules présentant un équipement enzymatique différent : les cellules de la thèque et les cellules de la granulosa. Les cellules de la granulosa ne possèdent pas de cytochrome P450, elles ne peuvent donc pas sécréter d’androgène à partir de cholestérol mais seulement de la progestérone. Elles possèdent néanmoins un complexe aromatase permettant de transformer la testostérone et l’androsténédione en œstradiol. Celui-ci sera stocké dans le liquide folliculaire ou passera dans la circulation. 24 Les cellules de la thèque possèdent le cytochrome P450 et peuvent donc transformer du cholestérol en progestérone puis en testostérone, qui sera transformée en œstradiol par les cellules de la granulosa. Elles peuvent également produire elles-mêmes de l’œstradiol, mais en quantité moindre que les cellules de la granulosa. Ces mécanismes sont dépendants des interactions avec les hormones gonadotrophiques. Les cellules de la thèque présentent des récepteurs à la LH, et les cellules de la granulosa présentent des récepteurs à la FSH puis aux derniers stades de développement embryonnaire lorsque la concentration en FSH augmente apparaissent également des récepteurs à la LH. Les sécrétions de LH et FSH par l’hypophyse sont elles-mêmes dépendantes de l’action de la GnRH sécrétée par l’hypothalamus. 1) La Gonadotrophin Releasing Hormone La GnRH est un neuropeptide sécrétée au niveau de l’hypothalamus de façon pulsatile par les neurones hypothalamiques et est transportée jusqu’à l’antéhypophyse par le système porte hypothalamo-hypophysaire. Elle y stimule la synthèse de FSH et de la LH. Elle subit un rétrocontrôle négatif par l’action des œstrogènes. 2) La Follicule Stimulating Hormone La FSH est une glycoprotéine synthétisée au niveau de l’antéhypophyse. Elle a pour rôle l’activation de la croissance et de la maturation folliculaire ainsi que le contrôle de l’activité de l’enzyme aromatase permettant la transformation de la testostérone en œtradiol par les cellules de la granulosa. Elle provoque également l’apparition des récepteurs à la LH au niveau des cellules de la thèque interne et de la granulosa et la multiplication des cellules de la granulosa. 3) La Luteinizing Hormone La LH est une glycoprotéine synthétisée par l’antéhypophyse. Elle permet la maturation folliculaire après l’apparition des récepteurs à la LH, et à haute concentration elle bloque les multiplications cellulaires des cellules de la granulosa et inhibe l’enzyme aromatase, ce qui est à l’origine de la diminution de l’œstradiol. Elle induit l’ovulation et stimule le développement du corps jaune. Elle permet la synthèse de testostérone à partir du cholestérol dans les cellules de la thèque interne et la synthèse de progestérone dans les cellules de la granulosa, ce qui pourrait expliquer les comportements masculins observés chez certaines femelles en pro œstrus, comme le chevauchement par exemple. Lors de la mise en place du corps jaune, son action inhibitrice de la formation d’androstènedione et donc d’œstradiol permet l’accumulation de la progestérone et la baisse progressive du taux d’œstrogènes dans les cellules de la thèque et de la granulosa qui se transforment alors en cellules lutéales. 25 4) Les Œstrogènes Les œstrogènes sont des hormones stéroïdiennes synthétisées au niveau de la granulosa à partir de la testostérone. Ils agissent principalement sur l’antéhypophyse, mais également sur les surrénales et la thyroïde. A faible dose, ils exercent un rétrocontrôle négatif sur l’axe hypothalamohypophysaire et inhibe la synthèse de GnRH. A forte dose, ils exercent au contraire un rétrocontrôle positif, comme en fin de proœstrus, ce qui va entrainer une forte sécrétion de GnRH à l’origine du pic de LH. Les œstrogènes vont également entrainer l’augmentation de l’expression des caractères sexuels primaires et secondaires (phase de proœstrus et d’œstrus, développement des canaux galactophores) et des caractères sexuels tertiaires (acceptation du mâle). 5) La progestérone La progestérone est une hormone stéroïdienne sécrétée par la granulosa puis par le corps jaune. Son rôle est de préparer puis de maintenir la gestation, avec un développement de la muqueuse utérine, des mamelles et en particulier des acini. Elle entraine également une modification du mucus cervical. Elle exerce un rétrocontrôle négatif sur l’hypothalamus, empêchant ainsi de nouvelles ovulations pendant la phase lutéale. 6) La prolactine Le rôle de la prolactine est moins connu. Contrairement aux autres hormones sécrétées par l’antéhypophyse, il apparait que la sécrétion de prolactine ne requière de stimulation hypothalamique mais soit spontanée. Elle intervient dans la formation et le maintien du corps jaune en maintenant les récepteurs à LH sur les cellules lutéales et en stimulant la synthèse de progestérone. 7) La relaxine La relaxine est un polypeptide sécrété par le placenta. Chez la chienne, sa concentration augmente à partir de la quatrième semaine de gestation et reste élevée jusqu’à la mise bas. Chez la chatte, on observe une hausse soudaine de la concentration en relaxine à partir du 23ème jour de gestation avec un pic à 36 jours suivi d’une diminution brutale juste avant la mise bas. Elle joue un rôle essentiel lors de la parturition, en permettant l’ouverture de la symphyse pubienne, la dilatation du col de l’utérus, le relâchement des ligaments pelviens, le développement des glandes mammaires. Elle est également utilisée pour le diagnostic de gestation chez la chienne. 8) La mélatonine La mélatonine intervient dans la régulation du cycle œstrale de la chatte. Elle est sécrétée par la glande pinéale à partir de sérotonine. Chez le chat, sa sécrétion est corrélée à la photopériode : elle est élevée pendant les périodes sombres, et basse 26 pendant les périodes de forte luminosité. On observe une synchronicité entre les concentrations de mélatonine et de prolactine. Figure 9 : Endocrinologie du cycle ovarien chez la chienne (CONCANNON P. , 2011) D) Hormones et folliculogénèse 1) La phase de recrutement La phase d’entrée en croissance concerne tous les follicules sains d’une certaine taille. Tous les follicules recrutés peuvent potentiellement devenir des follicules pré ovulatoires. Ce recrutement est essentiellement induit par la FSH mais la LH est également indispensable. Pendant la phase de recrutement, on observe une croissance folliculaire et la production par les follicules d’œstrogènes en faible quantité ainsi que d’inhibine, qui exercent tous les deux un rétrocontrôle négatif sur l’axe hypothalamo-hypophysaire. 2) La phase de sélection Deux hypothèses ont été avancées pour expliquer le phénomène de sélection. - Les œstrogènes et l’inhibine exerçant un rétrocontrôle négatif sur l’axe hypothalamo-hypophysaire, la concentration plasmatique en FSH va diminuer et passer en dessous de la concentration minimale induisant le recrutement. - On suspecte également l’intervention d’un facteur local synthétisé par les follicules plus important afin d’inhiber la croissance des autres follicules. Ces deux hypothèses ne s’excluent pas réciproquement. 27 3) La phase de dominance Ensuite seul le follicule dominant persiste car ses besoins en FSH sont réduits. L’apparition des récepteurs à LH et leur stimulation par celle-ci lui permette de subsister alors que les autres follicules deviennent atrésiques. 4) Formation du corps jaune Le corps jaune est rapidement formé après l’ovulation à partir du follicule de De Graaf, principalement à partir des cellules de la granulosa et des cellules de la thèque interne. Le corps jaune est formé de plusieurs types cellulaires : des grandes et des petites cellules lutéales sécrétant des stéroïdes, des fibroblastes, des cellules musculaires lisses, des péricytes et des cellules endothéliales. C’est proportionnellement l’organe le mieux vascularisé. Chez la chienne, on observe une lutéinisation pré ovulatoire. Les hormones impliquées dans la mise en place et le maintien du corps jaune semblent être la prolactine et la LH (également peut être la FSH pour la mise en place mais pas pour le maintien). 5) Lyse du corps jaune La présence d’un corps jaune fonctionnel sécrétant de la progestérone va inhiber, par rétrocontrôle négatif sur l’anté-hypophyse, le retour de l’œstrus. Le mécanisme de maintien du corps jaune n’est pas totalement connu. Les molécules intervenant dans le maintien du corps jaunes sont des prostaglandines deux types : Les PGF2α qui sont lutéolytiques, elles sont sécrétées au niveau de l’utérus et vont agir sur la contraction des muscles lisses avec la mise ne place d’une vasoconstriction : celle-ci va diminuer le flux sanguin arrivant au corps jaune, l’ischémie en résultant étant à l’origine d’une chute de la production de progestérone. On a également un arrêt de la production d’AMPc d’où une diminution de la stéroïdogénèse. Enfin l’ischémie va avoir pour conséquences une dégénérescence et la mort cellulaire des cellules du corps jaune. Les PGE qui sont lutéotrophiques. Les effets dépendent du rapport PGF2α/PGE. A la fin de la gestation, la concentration de progestérone et d’œstrogènes circulant diminue rapidement secondairement à la libération de grande quantité de PGF2α. Celleci serait déclenchée par l’activation de l’axe hypothalamo-hypophysaire fœtal. On soupçonne également que le cortisol joue un rôle dans la lutéolyse avant la mise bas. En effet, celui semble avoir un rôle activateur de la Prostaglandine synthétase à l’origine d’une augmentation de l’expression des enzymes synthétisant la PGF2α. Il semblerait également qu’il supprime la 15 hydroxyprostaglandine deshydrogénase, responsable du catabolisme de la PGF2α dans les tissus (CONCANNON, 2001). 28 La régression du corps jaune présente deux aspects : - La lutéolyse fonctionnelle, qui est rapide et à l’origine d’une chute rapide de progestérone - La lutéolyse anatomique : l’atrésie du corps jaune qui se transforme en corps blanc La lutéolyse touche d’abord les grandes cellules lutéales qui rétrécissent, puis les petites cellules lutéales. E) Les mécanismes de la fécondation La fécondation se déroule dans la partie supérieure de l’oviducte et est précédée par un ensemble d’interactions qui vont permettre à l’ovule et au spermatozoïde d’acquérir leur pouvoir fécondant. Figure 10 : Devenir des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle (SENGER, 2003) 29 1) Le transport des spermatozoïdes et la capacitation Suite à l’accouplement, les spermatozoïdes sont déposés dans le vagin et vont se déplacer vers le lieu de la fécondation. Le vagin est un milieu acide qui est hostile aux spermatozoïdes s’ils y restent plus de une à deux heures. Les spermatozoïdes progressent via le col de l’utérus où ils doivent franchir la glaire cervicale. Seule une petite partie des spermatozoïdes (1/100) arriveront jusqu’à l’ampoule de l’oviducte où aura lieu la fécondation. Globalement le taux maximum de survie est de trois jours et demi à 6 jours après la saillie, même si certains spermatozoïdes peuvent résister 11 jours. La survie est meilleure lorsque la chienne est en œstrus. (DOAK, 1967) La capacitation va avoir lieu tout au long de la migration des spermatozoïdes dans les voies génitales femelles et va leur permettre d’acquérir leur pouvoir fécondant. Elle comporte : - l’élimination des sécrétions épididymaires par l’action d’enzymes protéolytiques et par l’action du pH ; Figure 11 : Elimination des sécrétions épididymaires (SENGER, 2003) - la modification de la composition de la membrane plasmique avec l’élimination du cholestérol (qui stabilisait la membrane) par l’albumine permettant une augmentation de la fluidité de la membrane ; 30 - la modification des propriétés électriques de la membrane avec son hyperpolarisation (due à l’ouverture de canaux K+ sortants et HCO3- entrants ; - l’hyperactivité des spermatozoïdes : l’hyperpolarisation va entrainer l’ouverture des canaux calciques Voltage dépendant. L’entrée de Ca2+ va activer l’adénylate cyclase et la production d’AMPc, activant ainsi la PKA qui va phosphoryler une tyrosine kinase. Cela va permettre de phosphoryler les protéines du flagelle à l’origine de l’hyperactivité. Les spermatozoïdes sont alors capables de reconnaitre la zone pellucide et de s’y fixer. 2) Le transport de l’ovocyte jusqu’à l’ampoule de l’oviducte Les contractions de l’oviducte vont permettre de transporter passivement les ovocytes jusqu’au lieu de la fécondation. Ces contractions vont augmenter de manières importantes lorsqu’ils y seront arrivés afin de permettre la dispersion des cellules folliculaires et de favoriser la rencontre avec les spermatozoïdes. La durée de survie de l’ovule est de 108h après l’ovulation (TSUTSUI, 1975) . Tous ne seront pas fécondés, et la cause probable est une qualité moindre ou la présence d’anomalies. 3) La fécondation Avant la fécondation, l’ovule est bloqué au stade métaphase II. Il est entouré de plusieurs enveloppes : la zone pellucide, acellulaire et résistante, la corona radiata et le cumulus oophorus. La polyspermie est très rarement observée in vivo (REYNAUD, 2005). 31 La fécondation en elle-même va se dérouler en plusieurs étapes : - la phase de reconnaissance entre les glycoprotéines de la zone pellucide et les récepteurs membranaires du spermatozoïde ; Figure 12 : Initiation de la réaction acrosomique (SENGER, 2003) - le passage de la zone pellucide grâce à la réaction acrosomique faisant intervenir les enzymes présentes dans l’acrosome. Ces enzymes vont permettre au spermatozoïde de commencer à pénétrer la zone pellucide. Le spermatozoïde se situe ensuite dans l’espace périvitellin et va entrer en contact avec la membrane plasmique de l’ovocyte ; Figure 13 : Réaction acrosomique (SENGER, 2003) 32 - la fusion des membranes plasmiques grâce à l’interaction des fertilines et intégrines présentes à la surface du spermatozoïde et de l’ovule. L’ovocyte est alors activé et on observe l’exocytose de granules corticaux dans l’espace périvitellin, une libération de calcium et une élévation du pH. On observe également une modification de la zone pellucide la rendant imperméable, empêchant ainsi la polyspermie. L’ovocyte va ensuite achever sa méiose, donnant le pronucléus femelle possédant la moitié du matériel génétique, l’autre moitié étant expulsé dans le globule polaire ; Figure 14 : Fusion des membranes du spermatozoïde et de l'ovocyte (SENGER, 2003) 33 - la fusion des pronucléi : une enveloppe nucléaire se forme alors autour des matériels père et mère et les deux pronucléi migrent l’un vers l’autre au centre de l’œuf. Ceux-ci sont décondensés et une étape de réplication de leur ADN a lieu. Les chromosomes père et mère se rassemblent et se condensent, et subissent alors la première division de segmentation de l’œuf fécondé. Parallèlement on a une reprise du métabolisme énergétique et du métabolisme génétique avec une augmentation des synthèses et la traduction des ARNm maternels F) Le développent embryonnaire Le développement embryonnaire peut être divisé en trois phases : - la période libre, qui débute à la fécondation et est caractérisée par un blastocyste libre et migrant. Elle s’étend du 2ème au 17ème jour de gestation ; - la période embryonnaire, qui s’étende de l’implantation à l’achèvement de l’organogénèse ; - la période fœtale, durant laquelle les signes caractéristiques apparaissent et qui est marquée par une croissance rapide. 1) La période libre Elle commence juste après la fécondation de l’ovocyte par un spermatozoïde dans l’oviducte. Cette phase va être caractérisée par un grand nombre de divisions cellulaires rapides : c’est l’étape de la segmentation. Le mouvement des cellules ciliées et le péristaltisme engendré par la contraction des cellules musculaires lisses des oviductes vont entrainer un courant liquidien à l’origine de la migration des embryons vers les trompes utérines. Le péristaltisme est contrôlé par le système nerveux autonome et par le rapport œstro-progestatif. L’intervalle pour franchir la jonction de la trompe utérine est de 7 à 10 jours chez la chienne et la chatte, ce qui est plus important que chez les autres espèces (CONCANNON, 2001). Les premières divisions sont égales, puis à partir du stade 8 cellules on observe la formation de deux pôles cellulaires présentant des cellules de tailles différentes : le pôle végétatif, composé de quatre gros blastomères, et le pôle animal avec quatre petits blastomères. La segmentation est influencée par la quantité de vitellus et sa répartition, celui-ci inhibant la segmentation. On le trouve en quantité plus importante dans le pôle végétatif que dans le pôle animal. Le stade 16 cellules est atteint à J11 chez le chien. Les divisions continuent mais la taille de l’embryon reste identique, le stade 64 cellules est appelé morula. Au cours des divisions, une cavité centrale remplie de liquide séreux se forme, il s’agit du blastocœle. Lorsque celle-ci devient importante, l’embryon est appelé blastula. Durant toutes ces étapes, le génome zygotique n’est pas fonctionnel et les divisions sont permises par les protéines et l’ARN maternel. 34 Après le 12ème cycle de divisions, la vitesse de segmentation diminue et les divisions ne sont plus synchrones à cause de la pénurie de protéines et d’ARN maternels. On va alors avoir activation du génome zygotique : la synthèse d’ARNm débute et les gênes zygotiques sont transcrits : il s’agit de la transition blastuléenne. La pénétration dans l’utérus se fait au stade blastocyste le plus souvent, parfois au stade morula. Entre J12 et J17, on observe une migration inter cornes des blastocystes qui permet une répartition plus homogène, un ovaire produisant fréquemment plus que l’autre. Ce brassage des blastocystes est rendu possible par des contractions du myomètre malgré le rôle inhibiteur de la progestérone sur la contraction des cellules musculaires pendant la gestation. Ces contractions sont permises par la sécrétion de facteurs locaux pro contractant par les blastocystes lorsque leur taille dépasse 1mm de diamètre. Cette sécrétion s’arrête lorsqu’ils deviennent trop gros. Le stade blastula est caractérisé par la présence de différents feuillets embryonnaires : la masse cellulaire et le blastocœle sont entourés par le trophoblaste, qui donnera le chorion et le sac vitellin. Durant cette phase de vie libre, on observe également des modifications de l’utérus, avec une prolifération des cellules endothéliales, une hyperplasie du myomètre ainsi que des modifications de la physiologie utérine. L’implantation des embryons a lieu entre le 14ème et le 17ème jour de gestation chez la chienne et entre le 11ème et le 12ème chez la chatte (HOLST, 1971). Figure 15 : Développement embryonnaire précoce 35 2) La période embryonnaire La phase embryonnaire débute par l’implantation et s’achève à la fin de l’organogénèse. L’implantation n’est possible que dans une période très courte appelée « fenêtre d’implantation » correspondant à une imprégnation hormonale précise de l’endomètre. Elle dépend également du stade du blastocystes, et après cette fenêtre d’implantation l’endomètre sera en stade réfractaire ce qui rendra toute implantation impossible. Ce sont ces différents phénomènes qui rendent compliqué le transfert d’embryons car ils opposent une synchronisation très précise. L’implantation débute par la perte de la zone pellucide, qui est induite par la sécrétion d’hormones protéolytiques corrélée à l’expansion de l’embryon. Cette perte de la zone pellucide marque la première étape de la réaction déciduale, qui regroupe l’ensemble des modifications cellulaires de l’endomètre en vue d’accueillir l’embryon. On observe ensuite un accolement et une orientation de l’embryon, qui va s’immobiliser au niveau des microvillosités de l’épithélium utérin. Celles-ci vont se transformer en pilopodes et vont bloquer l’embryon. Il va ensuite y avoir apposition de l’œuf et création de contacts cellulaires étroits menant à son adhésion. La dernière étape est l’invasion de l’endomètre. La muqueuse utérine subit de profondes modifications, avec la mise en place d’une hypervascularisation et d’une congestion importante. Son métabolisme se trouve également augmenté et il y a sécrétion de lait utérin (comprenant protéines, globules gras éléments organiques et minéraux divers) qui a un rôle nutritif pour l’embryon. Vient ensuite l’étape de la gastrulation, qui va permettre d’obtenir à partir d’un embryon organisé en une couche une structure en trois couches différenciées : l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme. Ces trois couches donneront naissance à des territoires et des appareils différents en subissant la différenciation. L’ectoderme va donner l’épiderme, l’ensemble des tissus neurologiques, les glandes mammaires, l’hypothalamus, les lobes pituitaires, le vagin caudal ainsi que le pénis ou le clitoris. Le mésoderme sera lui à l’origine de l’appareil urogénital (gonades, utérus, col, vagin crânial, épididyme), de l’appareil circulatoire et du système musculaire squelettique. Enfin l’endoderme se différenciera en appareil respiratoire et appareil digestif. Le développement de l’embryon va suivre une séquence céphalo caudal, c'est-à-dire qu’il va commencer par la tête et finir par la queue : on va donc avoir formation de la tête, puis fermeture du tube neural, suivie par la formation des somites, l’apparition des fentes brachiales, des placodes oculaires et auditives, du cœur primitif, et enfin le début de la croissance des bourgeons des membres. C’est à partir du 30ème jour de gestation que l’on commence à observer une petite différenciation anatomique, avant ce jour seule la polarité est visible grâce à l’observation des battements cardiaques et à la présence d’une zone anéchogène au niveau de la tête. Voici les différentes dates et les observations associées visibles à l’échographie que l’on peut retenir sur le développement embryonnaire chez la chienne : 36 - - - J19 : Vésicules rondes anéchogènes de 1-2 mm ; J21 : Diagnostic de gestation ; J23 : battements cardiaques visibles, on observe les bougeons des membres proéminents, les placodes oculaires et auditives, les processus mandibulaires et maxillaires sont distincts. L’embryon mesure alors environ 10mm ; J25 : début de l’ossification vertébrale, formation des lames dentaires et de la crête mammaire. L’embryon mesure alors 14 mm ; J28 : Ossification des os mandibulaires, maxillaires, de l’os frontal et de la clavicule. La longueur de l’embryon est de 17 mm ; J30 : Observation de l’estomac, formation des paupières et de l’oreille externe, développement des vibrisses sur le museau, le menton et des sourcils. On observe une hernie ombilicale physiologique. Sont également présentes et visibles les 5 paires de mamelles, les bourgeons digitaux ainsi que le tubercule génitale proéminent. L’embryon mesure alors 19 mm ; J33 : Observation de la vessie, ossification des os nasaux, pariétaux, incisifs, zygomatiques et palatins. Ossification des cotes 4 à 10, et de l’humérus, du radius, de l’ulna, du fémur, du tibia et de la fibula. On observe également la fusion palatine, l’ébauche des canines, et on peut distinguer les doigts au niveau des membres postérieurs. La taille de l’embryon est de 27 mm à ce stade. Parallèlement au développement de l’embryon lui-même, la période embryonnaire abrite également la mise en place et le développement des annexes de l’embryon. Il y aura quatre annexes différentes : - la vésicule vitelline ; - l’amnios ; - l’allantoïde ; - le chorion. Les rôles de ces enveloppes sont : - la protection mécanique du fœtus ; - sa nutrition ; - l’élimination de ses déchets ; - la synthèse d’enzymes ou d’hormones nécessaires au maintien de la gestation. Le sac vitellin est la première enveloppe à se mettre en place à partir d’une protubérance de l’endoderme fœtal. C’est dans le sac vitellin que se forment les premiers éléments sanguins. <il persiste tout au long de la gestation chez les carnivores. L’amnios est fermé d’un repliement du chorion et de l’ectoderme au-dessus de l’embryon. Il est constitué d’un sac à double paroi cellulaire qui entoure totalement l’embryon sauf au niveau de l’anneau ombilical et est clôt dès la troisième semaine de gestation. Il a un rôle nutritif au début puis un rôle de protection mécanique du fœtus. C’est une membrane transparente et résistance qui contient un liquide claire, incolore et mucoïde. La quantité varie de 10 à 15mL chez la chatte et de 50 à 60mL chez la chienne. 37 Il contient de la pepsine, des diastases, des lipases, des protéines, du fructose, des graisses et des sels minéraux. Il a un pouvoir bactéricide et sa viscosité prévient les adhérences. L’allantoïde se forme par protrusion de l’intestin postérieur fœtal. Il est donc constitué d’endoderme recouvert d’une couche vascularisé de mésoderme. La couche externe de l’allantoïde fusionne avec le chorion pour former le placenta fœtal. En début de gestation, le liquide allantoïdien provient de la sécrétion de l’épithélium allantoïdien. Il sera ensuite composé des déchets des reins fœtaux qui passent de la vessie à l’allantoïde par le canal de l’Ouraque. Ce liquide est clair, ambré et aqueux et contient de l’albumine, du fructose et de l’urée. Chez la chatte la quantité est de 3 à 5mL et chez la chienne d’une cinquantaine de millilitres. Les carnivores domestiques présentent une placentation endothéliochorial zonale, avec un anneau placentaire complet chez le chien et un anneau placentaire incomplet chez le chat. Avant J20, la placentation est choriovitelline. A partir de J20, une placentation chorioallantoïde se met en place. Le placenta fœtal est lui formé de la fusion entre la couche externe de l’allantoïde et le chorion et est en relation avec le placenta maternel. Les projections fœtales forment un entrelacement complexe avec les septa maternels. Son rôle est essentiellement d’apporter au fœtus les substances nutritives et le gaz nécessaire à son développement ainsi que d’évacuer ses déchets. Il a également un rôle de filtre et un rôle immunitaire. Durant le dernier tiers de gestation, la complexité de l’organisation lamellaire et la concentration en capillaires augmenteront de manière importante afin de répondre aux besoins nutritionnels accrus nécessaires à la croissance. En bordure de la zone placentaire se trouve une bande de coloration différente, verte chez la chienne et marron chez la chatte correspondant à une structure haemochoriale : les villosités chorioniques baignent directement dans le sang maternel extravasé dont l’hémoglobine modifié en hématochlorine prend une couleur caractéristique (MIGLINO, 2006). Lors de la mise bas, une partie de la muqueuse utérine sera expulsée avec les placentas. 38 Figure 16 : Placentation des carnivores domestiques (SENGER, 2003) On observe également lors de cette période l’apparition d’autres modifications chez la chienne : - la mise en place du bouchon muqueux au niveau du col utérin et la distension de l’utérus sous imprégnation hormonale ; - une hyperplasie des trompes avec une disparition de la ciliature et une augmentation des sécrétions ; - une augmentation de la musculeuse vaginale, ainsi qu’un développement de la vascularisation et une mucification du vagin ; - la vulve va présenter les mêmes modifications que le vagin ; - un développement des canaux galactophores et des acini des mamelles sous l’influence du rapport progestérone/œstrogènes. Enfin afin de permettre une oxygénation et une perfusion suffisante des embryons, la mère va présenter une augmentation de la fréquence respiratoire, une augmentation de la volémie, une hémodilution, une augmentation du débit sanguin rénal et une glycosurie. Ces signes seront plus marqués en fin de gestation (KNOSPE, 2002). 3) Période fœtale La période fœtale s’étend de J35 à la mise bas. L’organogénèse est achevée et cette étape voit apparaître les signes caractéristiques de l’espèce et abrite la différenciation sexuelle et une phase de croissance rapide. Les différents signes qui vont apparaître sont le développement de la pigmentation, la pousse des poils et des griffes, la fermeture des ébauches des yeux, la croissance des oreilles et l’élongation du tronc (EVANS, 1993). 39 Les étapes du développement fœtal sont : - J35 : Achèvement des paupières, les yeux sont fermés, les pavillons couvrent l’ouverture des oreilles ; - J40 : Les paupières sont fusionnées, la hernie ombilicale physiologique disparait et les griffes sont présentes sur tous les doigts ; - J45 : Apparition du pelage et du marquage ; - J55 : Calcification des dents ; - J57 : Ossification des derniers os : talus, basihyoïde, aile de S1. La différenciation sexuelle est l’une des étapes la plus importante de la période fœtale. En effet un développement sexuel normal est dépendant du développement du sexe chromosomique, du sexe gonadique et du sexe phénotypique. Le gêne de déterminisme sexuel est le gène SRY et est porté sur le chromosome Y, il est donc responsable de la mise en place du sexe gonadique mâle et son absence celle du sexe gonadique femelle. Le sexe n’est pas distinguable morphologiquement avant J30 (EVANS, 1993). Les cellules germinales primordiales se développent quand le sac vitellin est encore présent, et migrent médialement aux reins pour former les gonades indifférenciées. On a également formation des canaux de Müller et des canaux de Wolf, l’embryon a alors un bipotentiel sexuel mais pas de sexe morphologique. La détermination du sexe se fait par l’action du Testis Determining Factor (TDF) qui est contrôlé seulement par le chromosome Y. Il va permettre la transformation des gonades indifférenciées en testicules : les cellules des cordons sexuels vont se différenciées en cellule de Sertoli, ou vont fusionnées pour former un réseau de codons sexuels médullaires et le rete testis. Cette différenciation sexuelle est visible dès J36. Les cellules de Sertoli vont ensuite sécréter une glycoprotéine appelée Hormone AntiMülerienne ou MIS (pour Müllerian inhibiting substance) qui va entrainer la régression des canaux paramésonéphrique entre J36 et J46. Puis après la différentiation des cellules mésenchymateuses en cellule de Leydig on va avoir production et sécrétion de testostérone, qui va permettre la formation de l’épididyme et des canaux déférents à partir des canaux mésonéphriques. Le 5αDiHydroTestostérone, ou DHT, qui est le métabolite de la testostérone va entrainer la formation de l’urètre, de la prostate, du pénis, du prépuce et du scrotum à partir des tubercules génitaux (MEYERS, 1991) (GILBERT, 1996). La différenciation ovarienne sera induite par l’absence du TDF. En effet, comme le MIS n’est pas sécrété, les canaux paramésonéphriques ne régressent pas et se différencient en trompe utérine, utérus et vagin crânial (MORROW, 1986). 40 De même, l’absence de testostérone et donc de DHT entraine la différentiation du sinus urogénital en vagin caudal et son vestibule, et du tubercule génital en clitoris et vulve. La descente testiculaire a également lieu pendant la phase fœtale. Ils vont descendre en deux temps, avec d’abord une translocation trans abdominal, puis dans un second temps une descente inguino sacrale afin de passer de leur position intra abdominale d’origine à une position extra abdominale sous cutanée (EVANS, 1993). Le testicule est attaché caudalement par le ligament du gubernaculum, qui est une corde mésenchymateuse le reliant distalement au scrotum en traversant l’anneau inguinal. Durant la première phase, sous l’effet du peptide 3 insuline like, le gubernaculum va augmenter de taille et de volume de manière très importante à travers l’anneau inguinal, ce qui va le dilater. La deuxième phase va voir le gubernaculum être transformé en une petite structure fibreuse dans le sac scrotal, laissant ainsi la place au testicule. Le jour de la naissance, les testicules sont à mi-chemin entre les reins et l’anneau inguinal, et le gubernaculum commence alors à régresser. Trois ou quatre jours après la naissance, les testicules passent à travers l’anneau inguinal et le gubernaculum régresse complètement, mais ce n’est que 35 jours après la naissance environ que les testicules auront atteint leur place définitive (PRETZER, 2008). 41 Figure 17 : Développement embryonnaire et fœtal du chat 11) 18jours 12) 19 jours 13) 21 jours 14) 22 jours 15) 25 jours 16) 26 jours17) 32 jours 18) 36 jours 19) 38 jours 20) 46 jours 21) 60 jours 22) 63 jours 42 SECONDE PARTIE : ETAT DES LIEUX DES BIOTECHNOLOGIES DE L’EMBRYON CHEZ LES CARNIVORES DOMESTIQUES Dans cette seconde partie, nous nous intéresserons aux différents protocoles mis en place ou en voie de développement dans les biotechnologies de l’embryon. Tout d’abord nous aborderons la question des protocoles d’induction de chaleurs et de superovulation. En effet, travailler sur la production d’embryons nécessite un grand nombre d’ovocytes, la faible fréquence des chaleurs et le faible nombre d’ovocytes ovulés limitent donc les possibilités de travail. Nous aborderons tout d’abord les techniques de récolte d’embryons produit in vivo, par insémination ou saillie. Nous verrons ensuite les techniques de production d’embryons in vitro. Celles-ci comportent différentes étapes : la récolte des ovocytes, la maturation in vitro des ovocytes, la récolte des spermatozoïdes, la fécondation in vitro et enfin une étape de culture in vitro. Nous développerons ensuite les avancées en cryopréservation des embryons félins et canins, étape indispensable à l’application des biotechnologies de l’embryon à grande échelle et aux échanges de ressources génétiques. Cette étape, rendue complexe par la nature biochimique des embryons, a nécessité la mise au point de technique d’évaluation de la viabilité des embryons avant leur transfert. Nous finirons par parler des techniques de transferts des embryons, frais ou après décongélation. A) Induction des chaleurs et Superovulation La mise en place de protocole d’induction de chaleurs et de superovulation est nécessaire pour l’avancée en biotechnologie de l’embryon. En effet, certains actes comme le transfert d’embryon frais nécessitent une synchronicité des cycles entre la chienne donneuse d’embryons et la (ou les) chienne(s) receveuse(s) car sinon l’implantation sera impossible, l’embryon n’étant pas au bon stade de développement au moment de la fenêtre d’implantation. La superovulation a elle pour objectif de permettre l’obtention d’un nombre de gamètes femelles plus important que la normale en un cycle, sans compromettre leur qualité. Cela prend son importance dans le fait qu’aujourd’hui les méthodes de récolte des ovocytes ou des blastocystes sont très invasives (laparotomie) et ne permettent pas de récupérer la totalité des embryons. 43 1) Chez la chienne a. Les anti-prolactiniques Ce sont des molécules très utilisées chez les carnivores domestiques et dont l’indication primaire est le traitement des lactations de pseudo gestation en inhibant la libération de la prolactine par l’antéhypophyse. Les chiennes traitées pour des lactations de pseudo gestation présentant un retour des chaleurs plus précoces, ces molécules ont ensuite été utilisées dans le but d’induire l’œstrus. On distingue deux types de molécules antiprolactiniques : les anti-sérotoninergiques (comme la métergoline) et les dopaminergiques (comme la cabergoline et la bromocriptine). C’est l’effet dopaminergique central qui semble être à l’origine d’induction des chaleurs. La métergoline (Contralac®) à forte dose présente cependant également un effet dopaminergique. Elle devra donc être utilisée à plus forte dose que lors du traitement des lactations de pseudogestation pour induire les chaleurs, mais elle reste peu utilisée. La cabergoline (Galastop®) est utilisé à la dose de 5 μg/kg/jour pendant 3 semaines. 70% des chiennes reviennent en chaleur dans le mois avec un taux de fertilité de 80%. On arrête le traitement dès l’apparition des chaleurs. Le coût du traitement au Galastop® étant important, il est possible de donner une spécialité humaine, le Dostinex® (VERSTEGEN, 1999) (CIRIT, 2007). La bromocryptine (Parlodel®) est utilisé à la dose de 20 μg/kg deux fois par jour pendant 30 à 40 jours. Elle peut être à l’origine de vomissement (HATOYA, 2006) (ZOLDAG, 2001). b. Les agonistes de la GnRH Les premiers protocoles d’induction de chaleurs utilisant des agonistes de la GnRH nécessitaient des injections pulsatiles ce qui étaient très compliqué dans la pratique courante. D’autres protocoles préconisaient une injection quotidienne pendant 7 à 14 jours (CONCANNON, 66). Dans les différents dosages et durée de traitement étudiés, le meilleur résultat est obtenu par l’administration de Lutréine à 0.6 μg/kg/jour pendant 12 jours, qui a permis l’obtention d’un taux de gestation de 100%. L’arrivée récente d’implant d’agonistes de la GnRH comme la Desloréline (Suprelorin®) a permis de faciliter grandement les protocoles d’induction des chaleurs (FONTAINE, 2011) (VOLKMANN, 2006). Un implant de 4.7 mg est posé en sous cutanée en arrière de l’ombilic et va relarguer 25μg de desloréline par jour. Il sera retiré le jour de l’ovulation. Les chaleurs sont observées en 4.3 jours ±14 jours. Les résultats sont médiocres pour les chiennes en début d’anœstrus (62.5% d’ovulation et 25% de gestation) mais meilleur pour les chiennes en anœstrus plus avancé (>200 jours) avec 87.5% de cycles ovulatoires permettant d’obtenir une gestation dans 78.3% des cas. Les portées sont de tailles normales. (6.7±3.5 chiots). On observe cependant des effets indésirables dans 10 à 15% des cas lors de l’utilisation des antagonistes de la GnRH, comme des insuffisances lutéales, des chaleurs persistances ou l’apparition de kystes ovariens. 44 En 2006 un protocole utilisant un spray intra nasal d’acétate de leuprolide avec ou sans administration d’œstradiol semble avoir donné de bons résultats mais nécessite plus d’approfondissement (HATOYA, 2006). c. Les gonadotrophines On utilise deux équivalents à la FSH et la LH qui sont trop couteuses à produire : - l’eCG (equine Chorionic Gonadotrophin ou Chronogest-PMSG®) anciennement appelé PMSG qui aura une activité mixte FSH et LH, extraite des urines de juments gravide, et qui sera utilisé pour son effet FSH-like permettant d’induire la folliculogénèse ; - l’hCG (human Chorionic Gonadotrophin ou Chorulon ®) extraite de l’urine de femme enceinte à activité LH ayant ainsi un rôle sur l’ovulation et le maintien du corps jaune. Le protocole le plus souvent utilisé par les vétérinaires consiste en l’administration de : - 20 à 30 UI/kg d’eCG pendant 5 à 9 jours ; - 50UI/kg d’hCG au début de l’œstrus pour induire l’ovulation. L’efficacité de ce traitement est limitée avec à peine 50% de gestation. Les corps jaunes obtenus sont fréquemment de mauvaise qualité et à l’origine d’une insuffisance lutéale (FONTBONNE, 2007) (STORNELLI, 2012). d. Techniques alternatives Une autre méthode d’avancer l’apparition de l’œstrus est d’agir pendant le metœstrus afin de réduire sa durée et ainsi diminuer l’intervalle œstrus-œstrus. Pour cela on va lyser le corps jaune prématurément à l’aide d’aglépristone (Alizine® 2 injections à 10mg/kg à 24h d’intervalle) ou de prostaglandines F2α comme le cloprostenol (Estrumate® 5mg/kg 3 fois à 48h d’intervalle). L’avancement du cycle suivant n’est pas systématique mais fréquemment d’un mois ou deux avec un taux de fertilité semble-t-il inchangé (FONTBONNE, 2007). e. La superovulation De nombreux protocole de superovulation ont été mis en place chez la chienne, comme par exemple le protocole décrit par Yamada : - Injection d’œstrone à 100-400μg/jours jusqu’à l’apparition des pertes vulvaires (J0) - Injection de 400 UI d’eCG et 1000 UI d’hCG par voie sous cutanée à J+3 - Injection de 10 μg d’œstradiol par voie intramusculaire à J+6 et J+7 - Injection de 1000 UI d’hCG par voie intraveineuse le premier jour de l’œstrus (YAMADA, 1992). Cependant aucun protocole de superovulation n’a encore donné de résultat satisfaisant chez la chienne. 45 2) Chez la chatte a. Utilisation de la luminosité Comme il a été dit en première partie, le chat est une espèce saisonnière donc l’activité sexuelle est dépendante de la durée d’éclairement. Ainsi ajuster la durée d’éclairage peut permettre de contrôler l’apparition de l’œstrus : diminuer la durée d’éclairage en dessous de 8 h inhibera le cycle de la chatte alors qu’une exposition à un éclairage suffisamment important (323 lux au niveau du sol) maintenue pendant 14 heures par jour engendrera la réapparition des cycles en 15 jours qui se répèteront en continu toute l’année tant que l’éclairage sera maintenu (KUTZLER, 2007). Cependant il a été montré qu’un éclairement continu peut inhiber les chaleurs à long terme et n’est donc pas souhaitable. L’œstrus peut également être induit en 3 semaines par un éclairage de durée plus courte (12h) si la chatte est stimulée par la présence d’un mâle ou d’une autre chatte en chaleur, ou si la chatte a été exposée à une période d’obscurité. b. Les gonadotrophines Comme chez la chienne, les deux molécules utilisées seront l’eCG pour son effet FSH-like, et l’hCG pour son effet LH-like. La sensibilité des ovaires à l’eCG est importante chez la chatte car celle-ci va persister pendant 120h dans l’organisme, une seule injection suffit donc à déclencher les chaleurs. Le protocole le plus courant préconise l’injection de 100 UI d’eCG par voie intramusculaire puis 80h plus tard une injection de 75 UI d’hCG permettant de déclencher l’ovulation (FONTBONNE, 2007). Ce protocole entraine un taux d’ovulation et un taux de gestation similaires à ceux obtenus naturellement. Il est à noter que les gonadotrophines peuvent entrainer une hyperstimulation ovarienne : l’augmentation importante des œstrogènes peut être à l’origine d’une mauvaise qualité des ovocytes ovulés ainsi que de troubles du développement embryonnaire, de l’implantation ou du maintien de la gestation. Cela peut également troubler la sécrétion de progestérone pendant la gestation, avec une sécrétion prématurée ou trop importante ou encore une insuffisance lutéale et des avortements. Enfin les gonadotrophines ont un effet immuno-sensibilisants et leur efficacité diminue si les administrations sont trop rapprochées : on déconseille leur utilisation à moins de 6 mois d’intervalle. c. Les antiprolactiniques Ces molécules ne sont pas utilisées chez la chatte car elles donnent de mauvais résultats. 46 d. La superovulation Contrairement à la chienne plusieurs protocoles de superovulation ont donné de bons résultats chez la chatte, les meilleurs résultats ont été obtenus avec le protocole suivant : - trois injections de 100 UI puis 50 UI et 50 UI d’eCG respectivement à J0, J1 et J2 par voie intramusculaire ; - deux injections de 250 UI d’hCG par voie intraveineuse à J7 et J8 qui ont permis de récolter en moyenne 39 ovocytes par chatte (KANDA, 1995). Ce protocole est également utilisable en dehors de la saison de reproduction (TSUTSUI, 2000). Un protocole similaire nécessite l’injection de 200 UI d’eCG en une fois à J0 en intramusculaire puis une injection de 100UI d’hCG 100 heures après mais donne des résultats bien moindres (YU, 2010). Enfin, un troisième protocole plus ancien utilise de la FSH porcine au lieu de l’eCG, administré par voie intramusculaire à la dose de 2mg le premier jour puis 1mg les jours suivants jusqu’à l’œstrus (jusqu’à une dose maximale de 9mg). L’ovulation est ensuite déclenchée par une injection de 500 UI d’hCG par voie intraveineuse, et on obtient 9 ovocytes par chatte en moyenne. B) Récolte des embryons 1) Chez la chienne Plusieurs méthodes ont été mises au point pour la récolte des embryons chez la chienne, avec des rendements différents. Le rendement est calculé en divisant le nombre d’embryons récoltés par le nombre de corps jaunes observés, le tout multiplié par cent. Une approximation est donc faite, puisque cela part du principe que chaque ovocyte donne un embryon, ce qui n’est bien sûr pas vrai. La méthode ayant donné le meilleur rendement est également la plus invasive. Elle a été décrite par Tsutsui et passe par l’excision des oviductes et de l’utérus sous laparotomie 8 à 11 jours après l’ovulation. Les oviductes et les cornes utérines sont alors flushés de haut en bas afin de récolter les embryons. Cette méthode lui a permis de récolter 97.1% des embryons (et même 100% chez 13 chiennes sur 16). Elle peut cependant compromettre la carrière reproductrice de la chienne ce qui rend cette méthode difficilement utilisable en pratique courante (TSUTSUI, 2001). Dans la même étude, il compare ces résultats avec ceux obtenus lors d’un flush chirurgical de l’utérus. Les chiennes subissent également une laparotomie, une aiguille de 21G est ensuite introduite dans la lumière des cornes utérines et l’utérus est flushé à l’aide de 5mL d’une solution composée de Ringer Lactate complémenté à hauteur de 20% avec du sérum canin. Cette méthode est beaucoup moins invasives mais présentes 47 également des résultats plus médiocres, avec un rendement de seulement 42.5%. Celuici s’explique par la prolifération importante de l’endomètre, rendant plus difficile la récupération du liquide de flush (la plupart du temps le volume total n’était pas récupéré). Cette méthode prend également plus de temps (TSUTSUI, 2001). Cependant cette étude visait à la récolte de jeunes embryons canins, et elle peut présenter de meilleurs résultats en cas de récolte plus tardive, lorsque les embryons seront tous dans l’utérus. Ces deux méthodes permettent d’obtenir des embryons de bonnes qualités, avec seulement 5.9% d’embryons dégénérés. Une troisième méthode, plus ancienne, passe par la récupération des embryons à l’aide d’une sonde de Foley. On cathétérise le col de l’utérus avec celle-ci et le ballon est ensuite gonflé. Un clamp est placé entre l’utérus et les oviductes afin d’empêcher le reflux dans ceux-ci. L’utérus est ensuite flushé à trois reprises avec 10mL de solution saline qui est récupérée par la sonde de Foley. Le rendement est meilleur avec 75% d’embryons récoltés. Dans la plupart des études, les méthodes utilisées sont inspirées de la première car l’objectif ici n’était pas de préserver les capacités reproductrices des chiennes donneuses d’embryons mais d’obtenir un maximum d’embryons. Ainsi dans de nombreuses études on procède à l’ovariohystérectomie de la chienne donneuse puis au flush de son utérus afin de récolter les embryons (TSUTSUI, 1988) (JALKANEN, 1998). 2) Récolte chez la chatte Chez la chatte, les techniques utilisées pour la récolte des embryons sont les mêmes que chez les chiens. Cette technique est également utilisée avec succès chez les grands félins. (POPE, 2000) Les meilleurs résultats sont également obtenus avec les techniques les plus invasives, avec un rendement maximal de 93.1% obtenu en flushant les oviductes après ovariohystérectomie (KANDA, 1995). La solution utilisée pour le flush lors de cette étude n’était pas du Ringer lactate complémenté avec du sérum félin à hauteur de 20% comme dans les autres études mais 2mL de D-PBS complémenté avec du glucose, du pyruvate de sodium, de la pénicilline G, de la streptomycine et de l’albumine de sérum bovin. Il convient cependant de préciser que la nature de la solution utilisée n’a aucune influence sur le rendement de la récolte, mais n’intervient que sur la conservation des embryons après la récolte. La récolte est ici effectuée 48 à 54h après l’injection d’hCG du protocole de superovulation. Le nombre d’embryon récolté varie de 25 à 65 par chatte dans cette étude. Chez la chatte comme chez la chienne la technique visant à exciser les oviductes et l’utérus afin de les flusher avec une solution de Ringer Lactate complémenté en sérum félin donne de bons résultats, avec un rendement de 73.8 ±9.6% (TSUTSUI, 2000). La technique visant à flusher les cornes utérines sur leurs 2/3 craniaux avec du Ringer Lactate complémenté en sérum félin ne permet un rendement que de 66.1% (TSUTSUI, 1989). 48 C) Production d’embryons In vitro La production d’embryons in vitro consiste à permettre la fécondation d’un ovocyte prélevé chez une femelle par un spermatozoïde en dehors des voies génitales femelles. Elle comprend 3 phases : - la maturation in vitro des ovocytes ; - la fécondation in vitro des ovocytes par des spermatozoïdes capacités ; - la culture in vitro des embryons obtenus (LUVONI, 2000) Cette production nécessite la collecte préalable d’ovocytes, prélevés chez des jeunes chiennes (ROCHA, 2006). 1) La collecte des oocytes Il existe 3 procédures habituellement utilisées pour la récolte des Complexes Ovocytes Cumulus : -l’aspiration des follicules : c’est une technique rapide et simple mais qui n’est cependant pas utilisée communément chez les chiennes pour plusieurs raisons. Tout d’abord la durée de l’anœtrus et du diœstrus, pendant laquelle les follicules ne sont pas visibles, est plus importante que chez les autres espèces. De plus l’aspiration individuelle des follicules est rendue difficile par la petite taille des ovaires, ainsi il s’agit le plus souvent d’une aspiration « à l’aveugle » sans vraie sélection des follicules. Chez la chienne, la présence de la bourse ovarienne rend nécessaire son ouverture, ce qui favorise la formation d’adhérence pouvant gêner la répétition de cet acte. Enfin le rendement est plus faible que celui obtenu par la découpe des ovaires (une douzaines d’ovocytes par femelles) (LUVONI, 2005). Chez la chatte la ponction des follicules est plus facilement réalisable, par laparoscopie ou par ovariectomie ; - la dilacération des ovaires: c’est la procédure la plus couramment utilisée chez les carnivores domestiques. Elle consiste en des découpes longitudinales et transversales de la surface de l’ovaire avec une lame de scalpel, suivies par un rinçage au PBS afin de récupérer les Complexes Ovocytes Cumulus. La population ainsi obtenue est très hétérogène et nécessite une sélection sévère. Cette méthode permet de récolter en moyenne 128.4 ±25.2 ovocytes par chienne (FUJII, 2000) ; - l’utilisation de la réserve ovarienne du cortex : il s’agit ici d’ovocytes très immatures. Cette technique n’est que très rarement utilisée, car elle nécessite le prélèvement de fragments de cortex ovariens et leur transplantation chez des souris afin de reconstituer une folliculogénèse in vivo. Une fois des follicules préovulatoires obtenus, ceux-ci seront ponctionnés (LESEGNO, 2007). Cette réserve ovarienne pourrait également être utilisée dans l’avenir afin de réaliser une folliculogénèse in vitro. Un dernier protocole de récolte des ovocytes consiste à récupérer les ovocytes post ovulatoires 70 à 76 heures après l’ovulation. On réalise alors une laparotomie et un cathéter est introduit dans la lumière de l’oviducte à l’une de ses extrémités afin de 49 flusher l’oviducte. Les ovocytes récupérés ont l’avantage d’avoir déjà atteint le stade métaphase II. Cependant là encore la répétabilité de l’acte sur une même chienne et son incidence sur son potentiel reproducteur ne sont pas connues (REYNAUD, 2005). 2) La sélection des ovocytes compétents Comme nous l’avons dit précédemment, les ovocytes récoltés par ces différentes méthodes se présentent comme une population très hétérogène, avec des ovocytes compétents et d’autres incompétents qui ne pourront pas supporter une maturation in vitro de manière satisfaisante. Il convient donc de faire une sélection afin de ne garder que les ovocytes présentant un maximum de chance de réussir. Les critères de sélection les plus souvent retenus sont : (LUVONI, 2005) - le cytoplasme de l’ovocyte doit être sombre et homogène, à cause de sa forte teneur en lipide, et doit être de forme sphérique ; - le diamètre cytoplasmique (en excluant la zone pellucide) doit être supérieur à 100 μm ; - le cumulus doit être formé d’au moins deux couches complètes de cellules jointives car les ovocytes n’en possédant qu’une dégénèrent dans les 48h suivant la mise en culture. En tenant compte de ces critères de sélection, 44.7±3.2% d’ovocytes sont conservés pour les ovocytes obtenus par dilacération ovarienne (FUJII, 2000) et 63 à 75% pour les ovocytes post ovulatoires (LESEGNO, 2007). 3) Facteurs influençant la quantité et la qualité des ovocytes obtenus Si l’âge influence la quantité d’ovocytes obtenus (baisse de 4.7 ovocytes/an) celui-ci ne semble pas avoir d’impact sur leur capacité à maturer un vitro (LUVONI, 2005). De même aucune influence de la race n’a pu être mise en évidence. Certaines études tendent à montrer cependant qu’une influence du stade du cycle pourrait exister, avec des proportions plus élevées d’ovocytes atteignant le stade métaphase II lors de collecte en œstrus/ diestrus plutôt qu’en proœstrus/anœstrus. Cela serait dû à des différences de communication entre les cellules du cumulus et les ovocytes. 4) La maturation In vitro (IVM) L’étape de maturation in vitro est nécessaire afin d’obtenir un ovule fécondable. C’est une étape de culture dans un milieu spécifique permettant la reprise et l’achèvement de la méiose. C’est une procédure bien maitrisé chez la chatte mais qui pose encore problème chez la chienne. L’environnement biophysique est représenté par le système et les conditions de culture dans lesquels les ovocytes sont incubés. Plusieurs types de culture ont été mis au point : 50 - La culture folliculaire : On maintient la structure tridimensionnelle du follicule afin de préserver l’intégrité fonctionnelle et morphologique. Cela n’a pas permis d’obtenir des résultats satisfaisants, avec un pourcentage maximum de 11.5% et 8.7% d’ovocytes atteignant les stades MI ou MII. Cela est obtenu après une culture de 48H. Il semblerait que l’isolation empêche les échanges de facteurs intra ovarien ce qui diminuerait la capacité de l’ovocyte de reprendre sa méiose (BOLAMBA, 1997) ; La culture en goutte : c’est la méthode la plus utilisée chez la majorité des espèces. La culture se fait alors dans une goutte de milieu de culture recouverte par une goutte d’huile. Le facteur biophysique essentiel ici est le ratio nombre d’ovocytes par goutte / volume de milieu. En effet un nombre élevé de Complexes Ovocyte Cumulus dans une petite goutte pourrait entrainer une inhibition de la reprise des méioses par la sécrétion de facteurs inhibant le découplage des jonctions GAP par les cellules du cumulus. En effet l’arrêt des communications entre l’ovocyte et les cellules de la granulosa est considéré comme l’un des points essentiels à la reprise de la méiose. La ratio permettant d’obtenir la meilleure maturation semble cependant changer en fonction du stade du cycle de la chienne donneuse, car le nombre et l’activité des cellules du cumulus doivent changer selon le stade ; La culture sur monocouche cellulaire : l’effet bénéfique de la co-culture sur le développement embryonnaire est bien connu en production embryonnaire in vitro bovine. Chez le chien, une couche de cellules du cumulus bovines dans son milieu de culture a été utilisée pour la maturation in vitro, ce qui a permis une augmentation du nombre d’ovocytes atteignant le stade métaphase II même si aucun effet sur leur développement post – fécondation in vitro n’a été observé (GHANI, 2012). Il a également été essayé d’utiliser une couche de cellules d’oviducte canines. Si les premiers essais n’ont donné aucun ou peu de résultats (HEWITT, 1999), une étude récente utilisant des cellules de l’oviducte prélevées dans l’infundibulum et la région de l’ampoule de chiennes en œstrus a donné des résultats positifs : le pourcentage de franchissement du stade métaphase II est de 16.7 et 23.2% après 48h e t72h de culture contre seulement 4% en l’absence de cellules de l’oviducte. Le stade du cycle de la chienne donneuse et la région d’origine des cellules utilisées pourraient jouer un rôle important (BOGLIOLO, 2002) ; La culture dans un oviducte isolé : contrairement au protocole précédent, tous les types cellulaires sont présents ici et dans le même stade de différenciation que in vivo. De plus il permet une organisation spatiale et des contacts entre la muqueuse et l’ovocyte qui ne sont pas possibles dans les autres milieux de culture. Après 30h de culture, le stade MI-MII est atteint chez 31.9% des ovocytes contre seulement 12.5% dans le cas d’une culture sur cellules d’oviducte. Ce protocole est cependant plus complexe à mettre en œuvre mais nous montre qu’il pourrait exister d’autres facteurs impliqués dans la maturation et la survie des ovocytes. 51 Concernant la composition chimique du milieu, différentes compositions ont été essayées : - Milieu simple : SOF (Synthetic Oviductal Fluid) : Solution saline complémentée en sources d’énergies - Milieu Complexe : TCM 199 : Solution complémentée en acide aminé, vitamines, etc a. Maturation iv vitro d’ovocytes canins Trois milieux de culture ont été testés pour évaluer leur capacité à permettre la maturation des ovocytes canins in vitro : le TCM 199, le SOF et le CMRL1066. Si les premières études ne semblaient pas montrer de différences entre le SOF et le TCM 199, une étude plus récente a démontré que la supériorité du TCM 199. Le TCM 199 a également été comparé au CMRL 1066 issu de la recherche sur la maturation in vitro chez le singe et a là aussi donné de meilleurs résultats (SONGSASEN, 2002). Cette différence est probablement du à la composition de milieu TCP199 qui contient plus de vitamines et des concentrations plus importantes en cystéine et acide ascorbique qui sont des anti oxydants. Le rôle positif des antioxydants dans la maturation des ovocytes canins a déjà été mis en avant par Kim en 2004. Durée de maturation In vivo, la durée de la maturation des ovocytes chez la chienne est de 48 à 72h. Si certaines études ont permis l’obtention d’ovocytes au stade MII après seulement 24h de culture (DIZIER, 2004). Les meilleurs résultats sont néanmoins obtenus pour une durée de maturation de 72h. En effet, si la maturation dépasse 72h, le nombre d’ovocytes atteignant le stade métaphase II n’augmente plus et on observe même une dégénérescence plus importante des ovocytes (LUVONI, 2005). Cependant la durée de maturation idéale que nous retiendrons sera de 48h car si une durée de maturation de 72h permet d’obtenir un maximum d’ovocytes maturés, une durée de 48h permet un meilleur développement après Fécondation In vitro (KIM, 2004) (OTOI, Influence of maturation culture period on the development of canine oocytes after in vitro maturation and fertilization , 2004). Une autre alternative pour diminuer la durée de maturation serait l’utilisation séquentielle de plusieurs milieux de culture. Cela permettrait de tirer avantage des effets positifs de chacun des milieux tout en diminuant le taux de dégénérescence. Conditions de cultures La concentration en oxygène ne semble pas influencée la maturation des ovocytes chez la chienne (SONGSASEN, 2002), contrairement à ce qui avait été montré chez la souris et la vache (LUVONI, 2005). Pour ce qui est des conditions de température, aucune étude n’a été réalisée et les températures habituellement utilisées vont de 37 à 39°C. 52 Supplémentation du milieu en hormones Les effets de la supplémentation du milieu de culture en hormone sont encore peu connus et font l’objet de nombreuses discussions. De nombreuses études ont données des résultats très variables, parfois contradictoires, ce qui rend leur interprétation difficile. Nous tiendrons ici compte des résultats en accord avec les tendances actuelles : - Œstradiol 17-β : chez les bovins il est bien connu qu’il permet d’augmenter le taux de maturation ovocytaire. Une étude récente chez la chienne (KIM, 2005) montre son effet positif chez la chienne sur les ovocytes, avec un effet dépendant du stade de la chienne donneuse au moment de la récolte des ovocytes. Dans le cas d’ovocytes prélevés au stade folliculaire, l’œstradiol permet d’améliorer la maturation nucléaire. Si les ovocytes on été prélevés lors de l’anœstrus, la supplémentation en œstradiol va permettre de diminuer le taux de vésicule germinale et d’augmenter celui d’ovocytes au stade métaphase I. - Progestérone : elle n’est généralement pas jugée utile lors de la maturation ovocytaire in vitro dans la plupart des espèces mais l’existence de la lutéinisation préovulatoire chez la chienne a justifié son utilisation pour la maturation ovocytaire. Ses effets sont l’objet de débats, mais là encore Kim et all montre un taux de maturation en métaphase II significativement plus important pour les ovocytes prélevés au stade folliculaire mis en présence de progestérone. Ici aussi les effets semblent dépendre du stade de prélèvement et de la concentration utilisée. La co-supplémentation en œstradiol et progestérone montre un effet biphasique : en cas de faible concentration en progestérone, la co-supplémentation va avoir un effet négatif sur la maturation nucléaire alors qu’elle aura un effet positif en cas de concentration plus importante. Ces éléments suggèrent que ces deux hormones dans l’oviducte pourraient jouer un rôle important dans la reprise de la méiose des ovocytes canins bien que leurs concentrations dans le fluide de l’oviducte ne soient pas connues. L’utilisation de concentrations plus importantes pourrait permettre d’améliorer les protocoles de maturation in vitro chez la chienne. - Les gonadotrophines : contrairement à chez la chatte, la supplémentation du milieu de culture en gonadotrophine ne permet pas d’améliorer la maturation in vitro pour les ovocytes canins (HEWITT, 1999). La LH a même des effets négatifs sur la maturation in vitro puisqu’elle va entrainer une baisse du nombre d’ovocytes présentant une maturation nucléaire (SONGSASEN, 2002). Cependant on ne peut exclure leur intérêt éventuel pour la maturation in vitro en cas d’exposition temporaire ou de courte durée. En effet une nouvelle tendance veut essayer d’obtenir des meilleurs taux de maturation en mettant au point des milieux de culture mimant le mieux possible l’environnement hormonal in vivo. En effet l’utilisation ponctuelle d’hCG et d’eCG lors d’un protocole de superovulation a montré son effet positif sur la maturation in vitro (YAMADA, 1993), ce qui tendrait à montrer que l’utilisation ponctuelle des 53 gonadotrophines à un moment donné améliorerait la maturation in vitro alors que leur présence en permanence dans le milieu de culture y nuit. (EVECEN, 2011) - Hormone et facteurs de croissance : différents essais ont été réalisés avec des hormones de croissance humaines ou bovines. L’hormone de croissance bovine accélère la reprise de la méiose et augmente le nombre d’ovocytes atteignant le stade métaphase II chez le renard (LUVONI, 2005). Cet effet n’a pas été retrouvé chez la chienne, où seule l’utilisation de l’hormone de croissance humaine permet une faible amélioration de la maturation in vitro (BOLOMBA, 2006). Supplémentation en protéines L’effet de la supplémentation en protéines pour la culture des ovocytes canins a été bien démontré. Les sources de protéines les plus utilisées sont l’albumine sérique bovine (BSA) et le sérum de veau foetal (FBS). Le taux de supplémentation dépend de la richesse initiale du milieu utilisé. Ainsi pour un milieu simple comme le milieu SOF, la supplémentation se fera à hauteur de 4% d’ albumine sérique bovine, alors que pour un milieu complexe de type TCM199, on supplémentera à hauteur de 0.3% d’albumine sérique bovine (ou 10-20% de sérum de veau fœtal) (HEWITT, 1999). L’utilisation de sérum de chienne en œstrus a donné des résultats très variables, ce qui est probablement dû à des différences de qualification du stade œstral : histologie des ovaires, signes cliniques, cytologie vaginale. Cependant il a été mis en évidence que lors de culture en follicules isolés en milieu SOF, la supplémentation en protéine n’était pas essentielle, et que de meilleures proportions d’ovocytes atteignant le stade métaphase II pouvait être obtenu en l’absence de protéines (SONGSASEN, 2002). Cependant la culture de follicules isolés, en diminuant les échanges intra- et extrafolliculaires, pourrait ne pas être le milieu idéal pour évaluer les effets des différentes supplémentations. Supplémentation en énergie et anti-oxydants La présence de substrats énergétiques adéquats est nécessaire à la survie des cellules en culture, mais on ne dispose que de peu d’éléments ceux permettant la maturation ovocytaire. L’utilisation de pyruvate ne semble pas influencer les résultats. L’utilisation de glucose ne permet pas l’amélioration de la maturation in vitro et a même un effet délétère en grande concentration (LUVONI, 2005). Cependant le glucose reste la source principale d’énergie de l’ovocyte, mais ses effets sont liés au métabolisme de la glutamine in vitro (SONGSASEN, 2007). L’utilisation d’anti-oxydants a pour objectif de prévenir les dommages causés par la haute teneur en oxygène à laquelle les cellules sont exposées en culture. Le βMercaptœthanol est un composé anti-oxydant synthétisé par les cellules vivantes et ajouté dans le milieu de maturation pour augmenter la synthèse de glutathione et ainsi améliorer les compétences de développement des ovocytes. Si l’effet est démontré chez les bovins et les porcins, aucun effet n’est montré chez la chienne (SONGSASEN, 2007). 54 b. Maturation in vitro d’ovocytes félins Contrairement à la chienne et à la plupart des espèces domestiques, la chatte présente une ovulation provoquée par le coït. Celle-ci a lieu 24 à 48h après le pic de LH postcoïtal. Les ovules sont ovules au stade métaphase II, ils sont donc fécondables dès l’ovulation. Cependant une étape de maturation in vitro reste indispensable pour les ovocytes folliculaires n’ayant pas été ovulés. Le taux de maturation in vitro chez la chatte est plus élevé que chez la chienne, allant de 40 à 60%, selon la qualité des ovocytes et le type de supplémentation hormonale. Ce taux reste néanmoins inférieur à ceux rencontrés chez les animaux de rente qui dépassent les 80%. La durée de culture permettant le meilleur taux de métaphase est de 40 à 48h, ce qui correspond à la période séparant la saillie de l’ovulation chez la chatte. Cependant certaines études ont montrés que cette maturation peut être achevé avec seulement 24h de culture (BOGLIOLO, 2001). Ces variations sont très certainement dues aux différences de conditions de culture. Cette étude a également comparé les effets des milieux de culture SOF et TCM199. Le milieu SOF semble plus intéressant pour a maturation des ovocytes félins avec un taux de métaphase II obtenu de 80% contre 60% avec le milieu TCM199. Supplémentation en hormones Les gonadotrophines : l’effet des gonadotrophines pour améliorer la maturation in vitro des ovocytes félins est bien démontré (49.1% de métaphase II contre 21.1% sans gonadotrophines) (LUVONI, 2006). Supplémentation en source de protéine La source de protéine communément utilisée au cours de l’étape de maturation in vitro d’ovocytes canins est l’albumine sérique bovine. En effet le sérum bovin et le sérum de chatte en œstrus donnent des taux de maturation significativement inférieur (GOODROWE, 1991). Supplémentation en énergie et anti-oxydants L’usage des anti-oxydants lors de la maturation in vitro des ovocytes félins présente un grand intérêt puisqu’ils augmentent de manière significative son efficacité. Le composé anti-oxydant le plus souvent retenu est la cystéine. 5) Prélèvement et préparation du sperme en vue de la fécondation in vitro a. Prélèvement de semence chez le chien L’éjaculat du chien est constitué de 3 phases : la phase urétrale, dont le volume varie de 0.5 à 10 mL selon l’excitation de l’animal. Elle peut ne pas être observée si le chien est très excité. Elle est de couleur claire ou jaunâtre et a pour rôle de lubrifier les voies génitales de la femelle. Certains chiens urinent dans la phase 1, ce qui a des effets spermicides ; 55 la phase spermatique, dont le volume va de quelques gouttes à 3.5 mL selon la taille de l’animal. Il s’agit de la phase la plus riche en spermatozoïdes, ce qui lui donne une couleur blanc laiteux ; la phase prostatique, qui est émise en dernière après quelques secondes de pause, a un volume très important pouvant aller jusqu’à 40 mL. Son rôle est de diluer la semence. Chez un chien en bonne santé cette phase est transparente, mais elle peut se teinter de sang en cas de problèmes prostatiques chroniques. Plusieurs techniques existent pour prélever les semences chez le chien, comme l’électro éjaculation, l’utilisation de vagins artificiels, et la récolte manuelle, mais la facilité de la récolte manuelle et le cout plus élevé et l’incapacité à séparer les phases lors de l’utilisation de vagins artificiels font que seule la récolte manuelle est utilisée en routine. La récolte manuelle On utilise des cônes en plastique souple relié à des tubes de récolte. La taille des cônes est adaptée en fonction de la taille du chien à prélever, l’essentiel étant qu’il soit suffisamment grand pour que le tube ne risque pas de blesser le bout du gland, ce qui pourrait altérer la libido du mâle et être à l’origine de petites hémorragies pouvant nuire à la qualité de la semence. Les cônes sont mis à chauffer à l’étuve à 37°C au moins 15 minutes avant le prélèvement. Il faut se tenir prêt dès l’entrée de l’animal dans la salle de consultation car la récolte peut être très rapide chez certains chiens étant « conditionnés » surtout en présence d’une femelle en chaleur. Il est préférable de prélever les chiens au sol plutôt que sur une table de consultation car certains chiens refusent alors de se faire prélever, sauf chez les petits chiens pour qui on ne peut faire autrement. Il privilégie également un environnement calme, sans personnes désœuvrées, afin de stresser le chien le moins possible. Afin de faciliter la récolte, il est utile d’avoir une femelle en chaleur. Le mâle doit être tenu en laisse afin qu’il ne monte pas sur la femelle, celle-ci risquant de se retourner, mais il faut faire attention à ne pas brider sa libido en le maintenant trop fermement. Si aucune femelle n’est présente lors de la récolte, il est possible d’utiliser un écouvillon de frottis vaginal réalisé chez une femelle en chaleur et conservé au congélateur. La première étape du prélèvement à proprement parler est la masturbation. On place la chienne en chaleur de façon à présenter sa vulve au mâle ou on place l’écouvillon devant son nez. Pour cela, il faut masser fermement et rapidement la base du pénis d’une main et remonter le fourreau en arrière des bulbes érectiles avec l’autre main. Le cône est mis en place soit après avoir remonté le fourreau, soit pendant que l’on remonte le fourreau avec la même main lorsqu’on a l’habitude. Durant cette étape, le chien présente des mouvements du bassin d’arrière en avant. C’est le moment où il chevaucherait la femelle en saillie naturelle (FONTBONNE, 2007) (ENGLAND, 2013). 56 Une striction est alors maintenue entre le pouce et l’index en arrière des bulbes érectiles afin de maintenir l’érection, et on comprime doucement et rythmiquement afin de mimer les contractions vaginales de la chienne. Lorsque l’érection est complète, le chien se met à piétiner ou lève un postérieur afin d’essayer de se retourner. Il arrête alors les mouvements de bassin. C’est à partir du moment où l’érection est maximale que la phase spermatique est éjaculée et qu’il faut changer de cônes (À noter que si on n’a pas l’habitude, il vaut mieux garder le même cône que de le changer et de perdre quelques gouttes de phase spermatique). On replace alors le pénis en arrière afin de mimer le moment ou le chien se retourne lors d’une saillie naturelle. La dilatation du pénis est parfois telle que des micro capillaires de la muqueuse éclatent, ce qui peut entrainer des saignements bénins. Lorsque l’on observe une pause et que l’éjaculat passe du blanc laiteux au transparent, on change à nouveau le cône pour prélever la phase prostatique. Cette phase peut altérer la qualité de la semence, on contrôlera donc son pH et l’absence de sang avant de l’utiliser. b. Prélèvement de semence chez le chat Chez le chat, le sperme est d’aspect blanc laiteux, avec un volume d’éjaculat moyen, d’environ 0,04mL. Ce volume est plus important lors de prélèvement par électro éjaculation à cause d’une stimulation des glandes accessoires plus importantes. La numération moyenne est de 60 millions de spermatozoïdes. La technique de récolte manuelle utilisée chez le chien n’est pas utilisable chez le chat. Il existe quatre techniques (FONTBONNE, 2007) (NOAKES, 2009): le vagin artificiel : Cette technique nécessite un entrainement de 2 à 3 semaines. Un vagin artificiel est fabriqué à l’aide d’un tube relié à une poire à pipette pasteur coupée à son extrémité. La présence d’une femelle en chaleur est préférable afin d’exciter le mâle. Le nez du mâle est placé au niveau de l’arrière train de la femelle afin que le choix puisse s’exciter et la chevaucher. Lorsque l’érection apparaît, on enfile l’extrémité lubrifiée du vagin artificiel sur le pénis et on la maintient pendant la récolte, qui dure 1 à 4 minutes. L’électro-éjaculation : c’est la méthode de récolte la plus utilisée chez le chat car elle ne nécessite pas d’entrainement et est réalisée sous anesthésie générale, permettant le prélèvement des chats peu coopératifs. Une sonde rectale avec une électrode est introduite dans le rectum. On réalise 3 à 4 séries de 3à stimulations de 2 à 6 volts d’intensité espacées de 3 secondes, en réalisant une pause de 5 minutes entre chaque série. La méthode chirurgicale : elle consiste en une ablation de 2 cm du canal déférent et à son hachage dans un milieu afin de recueillir la semence. Le sondage urétral : on introduit une sonde urétrale fine sur une dizaine de centimètres après un anesthésie à la médétomidine à forte dose. Son effet α 2 agoniste entraine l’élimination des spermatozoïdes dans l’urètre, et permet ainsi leur récupération par sondage. 57 6) Capacitation in vitro Dans le cas de la fécondation in vitro, les spermatozoïdes se retrouvent directement en contact avec les ovocytes et la phase de remontée dans les voies génitales femelles est donc shuntée. Or cette étape est nécessaire à la capacitation des spermatozoïdes, puisqu’elle leur permet d’acquérir leur pouvoir fécondant. Il a donc été mis au point des milieux de culture afin de permettre cette capacitation in vitro. Chez la chienne : Un milieu de culture a été mis au point pour réaliser cette étape, le milieu CCP (Canine Capacitation Medium) (MAHI, 1978). Les spermatozoïdes sont incubés dans ce milieu pendant 7h à 37°C dans une atmosphère à 5% CO2 à la concentration de 5x106 spermatozoïdes/mL. Le pourcentage de motilité obtenu à 7h est de 83%. Cependant ce milieu contient du bicarbonate de sodium, dont des effets délétères sur le spermatozoïdes canins ont été mis en évidence (WALES, 1958). Il a donc été mis au point un milieu mCCM (modified Canine Capacitation Medium), où le bicarbonate de sodium est remplacé par du trishydroxyméthylaminométhane, la quantité d’albumine sérique bovine augmentée et le glucose remplacé par du fructose directement utilisable par le spermatozoïde. On observe ainsi une meilleure conservation de la motilité des spermatozoïdes au cours du temps (JACQUET, 2003). Chez la chatte : Dans le cas de l’espèce féline, deux milieux ont permis de bons résultats pour la capacitation des spermatozoïdes félins : le milieu F10 de Ham, dans lequel les spermatozoïdes sont incubés pendant 2h à température ambiante (JACQUET, 2003) et le milieu B2 complémenté avec 100 μmol/L d’hypotaurine pendant 3 à 6h, permettant la capacitation de près de 80% des spermatozoïdes (DONZÉ, 2002). 7) Fécondation in vitro L’objectif final de la maturation in vitro est de donner à l’ovocyte la capacité de supporter un développement embryonnaire normal après la fécondation. Celle-ci se décompose en une suite d’événements permettant la mise en commun des matériels génétiques, qui comprend la capacitation du spermatozoïde, l’adhésion du spermatozoïde et sa pénétration dans la zone pellucide, la traversée de l’espace péri vitellin, la fusion avec l’oolemme, l’activation de l’ovocyte et enfin la décondensation de la chromatine présente dans la tête du spermatozoïde. Chez nos carnivores domestiques, la fécondation in vitro reste également une technique expérimentale qui n’est pas encore pratiquée en routine. Différentes techniques ont été mises au point, la plus utilisée étant la mise en présence des gamètes. 58 a. Mise en présence des gamètes Le mise en présence des gamètes est le premier procédé mis au point pour réaliser la fécondation in vitro. Il consiste en une co-incubation des gamètes mâles et femelles en haute concentration afin de favoriser au maximum leur rencontre (OTOI, 2000) (RODRIGUES, 2004). Cette co-incubation se fait sous une atmosphère humide à 5% de CO2 dans l’obscurité à 37°C. On met en présence 15 à 20 ovocytes avec 10 à 50000 spermatozoïdes. L’incubation dure une vingtaine d’heures, les ovocytes sont ensuite rincés 3 ou 4 fois à l’aide d’un milieu neuf identique à celui de la fécondation in vitro afin d’éliminer les spermatozoïdes non fécondants et les cellules du cumulus oophorus. Dans l’heure suivant le début de la co-incubation, on observe des spermatozoïdes dans la zone pellucide ou dans l’espace périvitellin mais aucun n’a encore pénétré l’ovocyte. Le premier spermatozoïde à pénétrer l’ovocyte est observé après 2h, et le premier pronucléus mâle est visible à partir de 8h (YAMADA, 1992). Après 12h d’incubation, seulement 37% des ovocytes présentent un pronucléus. La première division est observée après 24h (YAMADA, 1992). Cette technique est la plus documentée, avec des études réalisées pour investiguer l’influence des différents paramètres sur le rendement de fécondation in vitro. Le premier facteur étudié a été l’importance de la maturation pré ovulatoire en comparant les résultats obtenus avec des follicules pré ovulatoires ou des follicules recueillis sur des chiennes en anœstrus. Le développement des pro-nucléi est de 37% pour les follicules pré ovulatoires contre seulement 2% sinon, ce qui montre que la maturation pré ovulatoire est indispensable à l’acquisition des compétences de développement de l’ovocyte et ne peut pas être compensée par la maturation in vitro. L’influence de la température est négligeable lorsque celle-ci est comprise entre 37 et 39°C (JOHNSTON, 1991). La composition de l’atmosphère ne semble également pas avoir d’impact significatif sur l’accomplissement de la fécondation in vitro pour les compositions étudiées (5% CO2 + 95% d’air, 10% CO2 + 90% d’air et 5% CO2 + 5% d’O2 + 90% d’N2) Pour ce qui est de la composition du milieu de Fécondation In vitro, les milieux utilisés sont similaires à ceux de la maturation in vitro et il est également difficile de déterminer une composition idéale, le choix étant généralement empirique et manipulateur dépendant. b. Injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) Après leur sélection, les complexes ovocytes-cumulus sont placés en milieu de maturation in vitro pendant 72h. Ils sont ensuite colorés à l’aide d’un colorant vital permettant de déterminer leur stade nucléaire sans nuire à leur survie. Ils sont ensuite placés individuellement dans des gouttes numérotées et observés au microscope à l’aide d’un objectif x60. Une caméra avec une lampe UV et 2 filtres permettant d’atténuer 99% de la lumière permet la visualisation de l’ADN des ovocytes, qui sont alors classés selon leur stade de développement. 59 La préparation de la semence du mâle a pour objectif de sélectionner les spermatozoïdes les plus mobiles et ne présentant pas d’anomalies morphologiques. Pour cela, la semence est diluée au 5/1000ème dans une solution d’albumine sérique bovine à 2%. Une goutte de 20 μl de semence diluée est déposée dans une boîte de culture cellulaire, et dix gouttes de 5 μl d’albumine sérique bovine à 2% sont réparties de part et d’autres de la semence. Un pont d’albumine sérique bovine à 2% plongeant dans la goutte de semence est tracé avec une pipette pour permettre l’ascension des spermatozoïdes des plus mobiles. Ce procédé nécessite un matériel de micro injection. Celui et constitué de pipettes de maintien et de pipettes d’injection montées sur les porte pipettes d’un micro manipulateur. Celui est relié à un microscope inversé. Les pipettes sont courbées à leur extrémité et les manettes réglées de façon à ce que la partie courbée soit parallèle au fond de la boîte de culture. On aspire un peu de solution d’albumine sérique bovine à 2% à l’intérieur des pipettes. Les manipulations se font ensuite sous l’objectif x20. Les spermatozoïdes sont alors quasi immobiles à cause de la faible teneur en nutriments du milieu. On sélectionne un spermatozoïde ne présentant aucune anomalie morphologique et sa queue est cassée à l’aide de la pipette de micro injection. Il est ensuite aspiré par celle-ci au niveau de la queue et immobilisé dans la pipette tout en restant visible. L’ovocyte est maintenu à l’aide d’une pipette de maintien, pendant que la pipette d’injection permet de percer la zone pellucide et la membrane cytoplasmique de l’ovocyte. On libère ensuite le spermatozoïde en essayant d’injecter le moins de milieu possible dans l’ovocyte, puis la pipette est ressortie de l’ovocyte. Le relargage n’est pas visible compte tenu de la richesse en lipide du cytoplasme (CATT, 1996) (POPE, 1998) (COMIZZOLI, 2006). Figure 18 : Principe de l'ICSI (FAURE, 2008) 60 Figure 19 : Images d'ICSI (FAURE, 2008) 61 Figure 20 : Montage d'une ICSI (FAURE, 2008) 62 c. Insémination Sub Zonale (SUZI) L’insémination subzonale consiste à injecter plusieurs spermatozoïdes sous la zone pellucide, au niveau de l’espace périvitellin (POPE, 1995). C’est une technique moins développée que les deux autres, car elle nécessite un niveau de technicité élevé comme pour l’ICSI mais présente un taux de polyspermie plus importante que celui retrouvé lors d’ICSI. La préparation des gamètes suit un protocole similaire à celui mis en place pour l’ICSI. La principale différence est que les queues des spermatozoïdes ne sont pas cassées et que plusieurs spermatozoïdes sont injectés dans chaque ovocyte. L’ovocyte est maintenu à l’aide d’une pipette de maintien, pendant que l’injection est réalisée avec une pipette d’injection insérée selon le même axe que la pipette de maintien qui sert ainsi de butée. La pipette d’injection pénètre dans l’ovocyte à travers la zone pellucide tangentiellement à celle-ci afin de rester dans l’espace périvitellin, au niveau du premier globule polaire. L’injection est alors effectuée en contrôlant de manière précautionneuse la pression. Au retrait de la pipette, la zone pellucide se scelle d’elle même, empêchant ainsi la sortie des spermatozoïdes. Figure 21 : Schéma d'injection sub-zonale de spermatozoïdes (CATT, 1996) Le nombre de spermatozoïdes injectés est le point critique de cette technique. Si chez la souris l’injection d’un seul spermatozoïde a donné de bon résultat (PALERMO, 1991), cela ne semble pas suffisant chez les autres espèces où l’injection de plusieurs spermatozoïdes semble nécessaire pour induire une réaction acrosomique physiologique. Les résultats semblent très variables d’un animal à l’autre et le taux de polyspermie élevée. En effet dans une étude réalisée chez l’humain au Royal North Shore 63 Hospital qui comprend 421 SUZI, le taux de polyspermie atteint 40% des ovocytes fécondés. D) La cryopréservation des embryons des carnivores domestiques L’objectif de la cryopréservation des embryons est de permettre la conservation sur de longue durée d’embryons sans qu’ils se dégradent. Cela a de nombreuses applications pratiques, comme la création de banque de conservation en vue d’une utilisation ultérieure des embryons, la facilitation des échanges internationaux et la diffusion rapide d’un patrimoine génétique. Si ces techniques sont bien maitrisées et d’utilisation courante dans le monde des animaux de rente et le monde équin, elles en sont encore au stade expérimental pour les carnivores domestiques (NOAKES, 2009). 1) Principe de la cryopréservation La conservation sur une longue durée nécessite l’arrêt du vieillissement des embryons. L’objectif de la cryopréservation est donc de stopper les réactions chimiques enzymatiques de l’embryon. Or toute réaction chimique a une cinétique qui dépend de la température : en diminuant celle-ci, on ralentit donc la vitesse de réaction jusqu’à tendre vers une vitesse de réaction nulle. Les cellules mettent alors un temps infini à vieillir, ce qui permet leur conservation aussi longtemps que ces conditions de température sont maintenues. Les trois risques de la congélation sont la cristallisation intracellulaire, le pic de surfusion et l’effet solution. La cristallisation intracellulaire a lieu lors de refroidissement trop rapide, au cours duquel l’embryon n’a pas le temps de se déshydrater avant que la température de cristallisation soit atteinte. Le volume de la glace étant 1,1 fois supérieur à celui de l’eau, cette cristallisation intracellulaire va entrainer une distension des organites contenant de l’eau. Les effets de ces distensions sont de plus aggravés par la baisse de fluidité de la bicouche lipidique à faible température, à l’origine d’une plus grande fragilité. Le pic de surfusion correspond lui à une phase de réchauffement apparaissant au cours du processus de congélation. Lors du refroidissement d’une solution aqueuse, le point de congélation est d’abord atteint, à une température variable selon la pression et la concentration de la solution. Il n’y a alors pas de changement d’état de l’eau. A mesure que le refroidissement se poursuit, on atteint ensuite le point de cristallisation, qui correspond à la température à laquelle a lieu le changement d’état de l’eau de sa forme liquide à sa forme solide. Cette réaction est exothermique, et entraine une hausse de température jusqu’au point de congélation. Enfin le troisième risque lors de la congélation est constitué par l’effet solution. En effet, lors du refroidissement, on observe tout d’abord la formation de cristaux de glace dans le milieu extracellulaire à partir de l’eau pure. Cela va donc entrainer une augmentation de la concentration en sels dissous dans le milieu extracellulaire, jusqu’à l’obtention d’un 64 milieu extracellulaire hypertonique. La différence de pression osmotique est alors à l’origine d’un mouvement d’eau du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire à l’origine d’une déshydratation intracellulaire. Ce phénomène, s’il est trop important, va être à l’origine d’un endommagement des cellules, d’une part à cause d’une concentration en solutés intracellulaires trop importante devenant toxique pour le cellule, mais également à cause d’une réduction trop importante du volume de l’embryon qui endommage les membranes. Ce phénomène est une conséquence d’une vitesse de refroidissement trop lente. Le choix des cryoprotecteurs La survie des embryons nécessite l’ajout de solvants organiques dans le milieu de suspension. Ceux-ci permettent de modifier les propriétés physiques des solutions afin de minimiser les altérations cellulaires apparaissant au cours des phases de congélation et de décongélation. On distingue 3 grands groupes de cryoprotecteurs : - les cryoprotecteurs perméables, de faible poids moléculaire comme l’éthylène glycol, le glycérol, le méthanol, le Dimethylsulfoxide et d’autres alcools ; - les cryoprotecteurs non perméables de faible poids moléculaire comme le saccharose, le glucose, le galactose et d’autres sucres ; - les cryoprotecteurs non perméables de poids moléculaires élevé (>50kDa) comme me polyvinylpyrrolidone, et d’autres polymères. Le mode d’action varie selon la nature perméable ou non perméable du cryoprotecteur. Les cryoprotecteurs perméables vont franchir les membranes cytoplasmiques et remplacer l’eau intracellulaire des cellules. Ils permettent également de réduire les changements de volume des cellules. Les cryoprotecteurs non perméables ne peuvent pas franchir les membranes cytoplasmiques. Ils vont être à l’origine d’une déshydratation des cellules embryonnaires avant le refroidissement. Les cryoprotecteurs présentent une toxicité osmotique et une toxicité biochimique qu’il est important de maitriser pour les utiliser sans endommager les embryons. La toxicité osmotique est due à la pression osmotique élevée du cryoprotecteurs et au fait que les membranes cellulaires sont beaucoup moins perméables au cryoprotecteur qu’à l’eau. Ainsi lorsqu’un embryon est mis en présence d’un cryoprotecteur, celui-ci va être à l’origine d’une sortie massive d’eau des cellules. À mesure que le cryoprotecteur pénètre dans la cellule, l’eau re-rentre progressivement dans la cellule jusqu’à ce que celle-ci retrouve son volume isotonique : c’est le phénomène d’équilibration. Lors du retrait du cryoprotecteur, le phénomène inverse se produit. La cellule contenant du cryoprotecteur hyper osmotique se trouve alors dans un milieu isotonique ce qui va être à l’origine de l’entrée massive d’eau dans les cellules, pouvant entrainer l’éclatement de celles-ci. Afin de réduire les risques lié à cette toxicité osmotique, l’ajout et le retrait du cryoprotecteur se fait de manière progressive, afin d’éviter les mouvements d’eaux brutaux. On utilise donc des bains de cryoprotecteurs de concentration croissante lors de son incorporation et de concentration décroissante lors de son retrait. 65 La toxicité biochimique résulte elle des interactions entre les cryoprotecteurs et les constituants cellulaires et de leurs effets sur l’environnement cellulaire. Elle est principalement caractérisée par des modifications de perméabilité membranaire, des perturbations des pompes ioniques, ou des modifications des protéines de structures. Cette toxicité est d’autant plus importante que le temps de contact entre les cellules et le cryoprotecteur est important, et le seul moyen de la diminuer est de réduire les temps d’incorporation et de retrait des cryoprotecteurs (LELONG, 2007). 2) La congélation lente La congélation lente est une technique de cryoconservation dont le principe est l’équilibration progressive entre les cryoprotecteurs et le compartiment aqueux de l’embryon. La température est abaissée lentement à l’aide ou non d’un programmateur. Les cryoprotecteurs utilisés pour ce type de congélation sont principalement le glycérol lors de la congélation et le glycérol additionné de saccharose lors de la décongélation. Les embryons sont conditionnés par paillettes de 0,25mL qui sont initialement à une température de 20°C. La réfrigération se fait ensuite jusqu’à -6°C à une vitesse de 2°C/min. Une fois atteint la température de -6°C, celle-ci est maintenue pendant 10 minutes. On peut alors procéder à l’étape de « seeding » qui consiste à l’induction de la cristallisation par refroidissement localisée de la paillette. Le refroidissement reprend ensuite à une vitesse moins importante de 0,3°C/min jusqu’à -30°C, température à laquelle un nouveau palier est réalisé. Les paillettes peuvent ensuite être plongées directement dans l’azote liquide à -196°C. Afin d’éviter les phénomènes de recristallisation à la décongélation, le réchauffement des paillettes doit être rapide. Il peut se faire à l’air ambiant, mais certains auteurs préconisent une immersion d’environ 10 secondes dans un bain marie à 37-38°C. On ne note aucune incidence sur les lésions de la zone pellucide et le développement embryonnaire entre ses deux méthodes. On rince ensuite les embryons afin d’éliminer toutes traces des cryoprotecteurs toxiques (LELONG, 2007) (GUAITOLINI, 2012). Cette une méthode facile à réaliser, avec des étapes relativement longues ce qui la rend plus accessible à des personnes non expérimentées. Les cryoprotecteurs sont utilisés à des doses faibles peu toxiques. Son principal inconvénient est lié au temps requis. 3) La vitrification C’est une technique de non équilibre. Elle permet d’éviter au maximum la formation de cristaux de glace en transformant la phase liquide du cytoplasme cellulaire en phase solide amorphe. Pour cela, on utilise de très grandes concentrations de cryoprotecteurs, à l’origine d’une grande viscosité du milieu, et on applique une vitesse de 66 refroidissement très rapide. Ces vitesses de refroidissement, de l’ordre de 20000°C/min nécessitent de travailler sur des volumes de quelques microlitres. Les embryons sont déposés dans différents bains contenant des concentrations croissantes en cryoprotecteurs, afin d’éviter les chocs osmotiques. Le cryoprotecteur ayant donné les meilleurs résultats est l’éthylène glycol, utilisé à des concentrations successives de 5, 10, 20 puis 30%. 2 à 3 embryons sont ensuite placés dans des Cryotop et immédiatement plongés dans l’azote liquide, ou ils sont conservés jusqu’au réchauffement. Lors du réchauffement, les embryons sont plongés dans une solution PB1 contenant 0,5 mmol/L de saccharose pendant 1 minute à 37°C puis rincés successivement dans des bains à concentration décroissante en saccharose (0,5, 0,25, 0,125 mmol/L) avant d’être transférés dans une solution PB1 pur à 37°C pendant 5 minutes. C’est une technique très rapide, ne nécessitant pas d’équipement et permettant la vitrification des embryons au fur et à mesure de leur récolte. Elle nécessite néanmoins une plus grande expertise, avec une gestion très précise du temps des différents bains et des températures. De même les très fortes concentrations de cryoprotecteurs, toxiques pour les embryons, nécessitent une très bonne connaissance du protocole (ABE, 2010). 4) Résultats Dans le cas de l’espèce féline, la cryoconservation des embryons, produits in vitro ou in vivo a donné des bons résultats avec l’obtention de plusieurs gestations. Les taux de gestations obtenus après transfert d’embryons congelés produits in vitro varient entre 40% et 60% selon les études (GOMEZ, 2003) (POPE, 1994) (SWANSON, 1999). Quel que soit le stade de congélation, le taux de survie des embryons après transfert varie entre 4% et 20%. Il semblerait que les embryons produits in vivo tolèrent mieux la congélation-décongélation et permettent l’obtention d’un meilleur taux de survie. Lors de ces études, un maximum d’embryons était transféré, sans qu’une sélection soit faite, afin de s’assurer que le nombre d’embryons transférés ne soit pas un facteur limitant, l’objectif étant l’obtention d’une gestation. Les cryoprotecteurs utilisées pour la cryoconservation d’embryons félins sont le glycérol, l’éthylène glycol et le propylène glycol. Ces deux derniers semblent présenter une meilleure perméabilité, et les meilleurs résultats en termes de taux de survie et de développement in vivo post décongélation sont obtenus en utilisant le propylène glycol (GOMEZ, 2003). Cette étude est celle qui a donné les meilleures résultats pour l’espèce féline, puisqu’il n’y a pas de différence en terme de survie embryonnaire, développement embryonnaire ou numération cellulaire embryonnaire entre les embryons congelés et les embryons frais témoins. Cela montre bien que les effets néfastes de la congélation ont été très limités dans cette étude. 67 La solution cryoprotectrice utilisée est la solution CPS qui est un mélange de 1,4mol/L de propylène glycol, 0,125 mol/L de saccharose, 10% de dextran 70 (ces deux derniers permettent de minimiser les effets osmotiques) et 10% de sérum de veau fœtal dans une solution de Tyrode-HEPES. Les embryons sont mis en présence de la solution CPS en deux étapes d’équilibration de 3 minutes chacune, d’abord avec deux volumes de solution Tyrode-HEPES pour un volume de solution CPS, puis un volume de solution Tyrode-HEPES pour deux volumes de solution CPS à 22°C. Les embryons sont ensuite placés dans la solution CPS pure pendant une phase d’équilibration de 10-15 minutes. Les embryons sont alors dans des paillettes de 0,25 mL qui sont scellées et placés dans un automate de congélation initialement à 20°C. La température est abaissée à la vitesse de -2°C/minute jusqu’à -6°C où un palier de 10 minutes est réalisé, puis la température est abaissée à la vitesse de 0,3°C/minute jusqu’à -30°C où un second pallier de 10 minutes est réalisé avant de plonger les paillettes dans l’azote liquide. La méthode de décongélation utilisée consiste à réchauffer les paillettes à température ambiante pendant deux minutes à 22°C, puis à retirer le milieu CPS en réalisant cinq rinçages successifs de 3 minutes avec une solution de Tyrode-HEPES contenant des concentrations décroissantes de propylène glycol et de saccharose. Cette technique a permis d’atteindre un taux de survie embryonnaire in vitro après décongélation de 89%, comparable à celui atteint par Pope qui était de 80% (POPE, 1997). Les progrès réalisés nous montrent bien que lors de l’application d’un protocole de congélation embryonnaire lente, il est recommandé de multiplier les étapes d’équilibration et d’utiliser un soluté non perméable comme le saccharose comme tampon osmotique, afin de minimiser le choc osmotique. Des détériorations touchant la zone pellucide sont observés dans 11 à 18% des cas avec ce protocole (POPE, 1994), mais ils n’ont pas été retrouvé dans la seconde étude après l’ajout de Dextran qui a permis d’inhiber la formation de cristaux de glace et de limiter leur taille, protégeant ainsi l’intégrité de la zone pellucide. Une méthode permettant de réduire ces effets néfastes serait de continuer la congélation progressive après avoir atteint -30°C jusqu’à -150°C à la vitesse de –10°C/minute, avant de plonger les paillettes dans l’azote. Cela permettrait de diminuer le risque d’atteinte de la zone pellucide à 2% (GOMEZ, 2003). Concernant la vitrification d’embryons félins, aucune étude n’a encore été réalisée. Cependant le succès de la congélation lente d’embryons félins et la réussite de cryoconservation d’ovocytes félins laisse présager qu’un protocole de vitrification est applicable aux embryons félins. Dans le cas de l’espèce canine, les tentatives de congélation d’embryons ont donné de très mauvais résultats jusqu’à très récemment. La principale raison semble être la grande quantité de lipide contenu dans leur cytoplasme, bien supérieure à celle rencontrée dans les autres espaces. 68 La première étude réalisée par Kim utilisait un protocole de congélation lente conventionnelle avec comme cryoprotecteur du glycérol. Cependant aucune étude de la viabilité après décongélation n’a été réalisée, les embryons ont été directement transférés et comme aucune gestation n’a été obtenue, il est impossible de savoir si le protocole de congélation était bon. Une autre étude a été mise en place en reprenant un protocole de congélation lente afin de comparer les résultats obtenus avec deux cryoprotecteurs différents, le glycérol et l’éthylène glycol (GUAITOLINI, 2012). Dans cette étude, les embryons ont subit des protocoles de congélation et décongélation similaires adaptés en fonction du cryoprotecteur (le glycérol ayant un poids moléculaire élevé, il nécessite la mise en place de rinçage par étape afin de prévenir tout choc osmotique). Leur viabilité a ensuite été évaluée avec une coloration au iodure de propidium et au Hœchst 33 342 sous microscopie de fluorescence, immédiatement après décongélation, après 3 jours de culture et après 6 jours de culture. On a mis en évidence le pourcentage de rupture de la zone pellucide, le taux de ré expansion et le nombre de cellules des blastocystes. Tout d’abord cette étude a mis en évidence l’absence de différence significative entre le pourcentage de rupture de la zone pellucide après décongélation entre les deux groupes d’embryons, avec 11,5% du groupe Glycérol et 8% du groupe Ethylène glycol. Ces résultats sont également comparables à ceux retrouvés dans l’espèce féline ou dans l’espèce humaine. Le taux de ré expansion après 24h de culture ne diffère pas non plus de manière significative entre les deux groupes, avec 76,5% pour le groupe Glycérol et 68,8% pour le groupe Ethylène Glycol. Aucune autre étude similaire n’a été réalisée chez l’espèce canine, et il est donc difficile d’interpréter ces résultats. Cependant sachant que des taux de ré expansion de 50% et 55 à 87% sont considérés comme un signe de ré expansion rapide au sein de l’espèce humaine (SHU, 2009) et bovine (LEONI, 2002) respectivement, on peut considérer ces résultats comme satisfaisants. L ‘étude de la viabilité des embryons des deux groupes n’a pas permis non plus de trouver de différence significatives, avec 66,5% d’embryons viables pour le groupe Glycerol et 57,3% pour le groupe Ethylène glycol. Le nombre total de cellules est également similaire dans les deux groupes. La seconde partie de l’étude avait pour but de comparer la viabilité observée immédiatement après décongélation aux valeurs trouvées après respectivement 3 et 6 jours de culture. Le pourcentage de viabilité immédiatement après décongélation est de 62,3 ± 5,7 % des cellules blastocystes, ce qui est supérieur aux 50% de cellules vivantes nécessaires pour considérer le blastocyste viable. Après trois jours de culture, le pourcentage de cellules est légèrement inférieur avec 56,9 ± 6%, mais celui remonte après 6 jours de culture à 66,5± 6%. Même si ces différences ne sont pas statistiquement significatives, on peut se demander quelle en est l’origine. Les auteurs pose l’hypothèse qu’elles seraient dues à des altérations réversibles des membranes plasmiques suite à la décongélation. Ces altérations seraient donc responsables d’une perméabilité de la membrane disparaissant après quelques temps, donc les cellules seraient colorées par le iodure de 69 propidium et seraient considérées comme morte, alors que les altérations membranaires ne seraient pas suffisantes pour entrainer la mort de la cellule. Contrairement à ce que l’on aurait pu attendre, aucune éclosion de blastocyste n’a été observée dans cette étude. En effet, les embryons observés 6 jours après la mise en culture avaient approximativement 18 jours, ce qui correspond à l’âge à partir duquel l’implantation embryonnaire commence à être observée chez la chienne. Les hypothèses formulées seraient une « faiblesse » des embryons, ne permettant pas l’implantation. Cette faiblesse pourrait être consécutive à des conditions de culture insuffisantes, qui reste l’un des facteurs limitant en biotechnologie de l’embryon canin. Cependant, vu les bons résultats obtenus lors de cette étude, on ne peut exclure que le transfert de ces embryons immédiatement après décongélation aurait pu donner de bons résultats. Pour finir, nous pouvons citer une récente étude qui ouvre de nouvelles perspectives puisqu’elle a permis l’obtention de 7 chiots de 5 chiennes différentes après le transfert non chirurgical d’embryons vitrifiés (ABE, 2010). Le cryoprotecteur utilisée est l’éthylène glycol dilué dans le milieu de culture PB1. Les embryons sont exposés pendant 5 minutes à 200 μL de PB1 contenant 5% d’éthylène glycol, puis 2 minutes avec 10%, 2 minutes avec 20% et enfin 1 minutes avec du PB1 contenant 30% d’éthylène glycol et 0,5 mol/L de saccharose. Les embryons sont placés dans des cryotop avec un minimum de milieu et immédiatement immergés dans l’azote liquide. Pour la décongélation, les cryotops contenant les embryons sont directement plongés dans la solution PB1 complémentée à 0,5 mol/L de saccharose à 37°C, puis rincés avec des solutions de concentrations décroissantes en saccharose. Les embryons sont ensuite colorés à l’aide de iodure de propidium afin d’évaluer leur viabilité. Le pourcentage de cellules vivantes afin de considérer l’embryon viable dans cette étude est de 75%, contre 50% dans les études précédentes. Cette étude innove également quant à la technique de transfert, puisque les auteurs ont choisi une technique de transfert non chirurgicale, avec un transfert intra utérin par endoscopie sur chienne vigile. Concernant la morphologie des embryons après décongélation, les auteurs rapportent que plus de 80% des embryons plus jeunes que le stade blastocystes présentent une morphologie normale. L’utilisation des colorants vitaux corrobore cette observation, puisque que la viabilité des embryons aux stades 4 à 16 cellules est de 90 à 100%, de 50% pour les stades morula et de 40% pour les stades blastocyste. Il semblerait donc que la vitrification soit mieux supportée pour les stades embryonnaires précoces. 77 embryons ont été transférés par voie endoscopique chez neuf chiennes, cinq ont été gestantes et quatre d’entre elles ont mené leur gestation jusqu’à son terme en donnant un total de sept chiots, ce qui donne un pourcentage d’embryons atteignant le terme de 9,1%. Des tests ADN ont été réalisés afin de s’assurer que la mère porteuse et les chiots qu’elle met bas n’ont pas de lien de parenté. 70 E) Evaluation de la viabilité des embryons et comparaison embryons produits in vivo et in vitro Il est admis que les embryons produits in vivo et les embryons produits in vitro présentent des différences, aussi bien au niveau de leur morphologie qu’au niveau de leur viabilité. Les embryons produits in vivo présentent une plus grande résistance vis à vis des conditions environnementales, comme la température et la lumière, que les embryons produits in vitro qui se révèlent plus fragiles. Il semblerait cependant que l’amélioration de la maîtrise des conditions de culture tende à réduire ces différences. On ne sait pas encore quelles sont les étapes de la production in vitro responsables de cette fragilité, mais il semblerait que l’étape de culture in vitro soit l’étape la plus sensible. Les différences morphologiques entre les deux types d’embryons, quelle que soit l’espèce concernée, sont une plus grande richesse en lipides qui va être à l’origine d’embryons plus sombres, un taille plus grande, un nombre de cellules plus important et une zone pellucide plus fragile que chez l’embryon produit in vivo. Un des caractéristiques importantes des embryons produits in vitro sont leur plus grande sensibilité au refroidissement et à la congélation. Des différences entre les embryons produits in vitro et in vivo ont également été mise en évidence au niveau de leur organisation et de leur composition, avec une distribution des organites pouvant être différence et des paramètres biochimiques différents. Des études de fluorescence par hybridation in situ a également permis la mise en évidence d’une plus grande polyploïdie chez les embryons produits in vitro. En effet la polyploïdie concerne jusqu’à 75% des embryons bovins produits in vitro contre seulement 25% de ceux produits in vivo. Ces anomalies chromosomiques pourraient être à l’origine d’une viabilité moins bonne. Enfin on a montré que les embryons produits in vitro présentaient un taux d’apoptose supérieur, ce taux étant inversement proportionnel à la viabilité. Ce taux d’apoptose semble cependant lié en partie au milieu de culture, à la durée de culture et à la proportion en O2 du milieu de culture, on pourrait donc s’attendre à retrouver un taux d’apoptose normal en maîtrisant de manière optimale les conditions de culture, qui reste l’étape la plus difficile dans la production d’embryon chez les carnivores domestiques. Une autre méthode d’évaluation de la qualité et de la viabilité des embryons serait l’observation répétée au microscope de ceux-ci, afin d’évaluer leur vitesse de développement. On sait que le temps de clivage initial est corrélé à la qualité des embryons. (HOLM, 2002), et des études ont montré qu’il existe des différences importantes de cinétiques de développement entre les deux types d’embryons, avec des cycles cellulaires plus courts chez les embryons produits in vivo lors des quatre premiers cycles post fécondation. Des études de cinétiques permettraient donc d’évaluer la viabilité d’embryon produit in vitro en prenant pour témoin des embryons produits in vivo, même si de telles études imposent des contraintes techniques très importantes. L’utilisation des techniques de réaction de polymérisation en chaine (PCR) a montré une différence d’expression des gènes intervenant dans le développement embryonnaire. On 71 a également remarqué que les embryons présentant un profil d’expression génétique anormal étaient plus sensibles à la congélation et étaient donc de moins bonne qualité. Une autre approche moins invasive afin d’évaluer le développement des embryons est d’observer leurs échanges avec le milieu de culture, puisque ceux-ci sont directement liés à leur activité. Une technique utilisant des micro capteurs à O2 mesurant la pression partielle en O2 dans le milieu de culture entourant des embryons bovins produits in vitro a été développé. (LOPES, 2005) Cela a montré des différences importantes entre les embryons produits in vitro et ceux produits in vivo, et il a été mis en avant une corrélation significative entre la tension en oxygène et l’expression de certains gênes de développements. (LOPES, 2006). Enfin cette méthode n’a aucun impact sur la survie des embryons ce qui en fait un outil très intéressant. Figure 22 : Suivi de la viabilité des embryons grâce au respiromètre (LOPES, 2005) Plus récemment, la mise au point de microscopie plus performante combinée au développement de coloration fluorescente intravitale spécifique a permis une nouvelle approche de l’étude du développement embryonnaire in vitro et présente une voie d’avenir. Ces colorations vitales sont le iodure de propidium et le Hœchst 33 342. Ces deux molécules sont des agents d’intercalation utilisé comme marqueurs des acides nucléiques. Ils se lient aux bases de l’ADN et de l’ARN, et présentent une fluorescence, de couleur rouge pour le iodure de propidium et de couleur bleu pour l’Hœschst 33 342. La principale différence entre ces deux molécules est la caractère lipophobe du iodure de propidium, qui l’empêche de pénétrer et donc de colorer les cellules ayant une membrane cytoplasmique intacte, contrairement au Hœchst 33 342. Ainsi, lorsque l’on utilise les deux colorants en même temps, le colorant Hœchst pénètre totalité des cellules, intactes ou endommagées, qui apparaissent bleu, alors que le iodure de propidium ne pénètre que les cellules ayant perdu leur intégrité membranaire. Celles-ci 72 sont donc colorées en rouge, et on peut donc clairement distinguer les cellules intègres, bleues, des cellules lésées, rouges. Figure 23 : Embryon sans coloration / avec coloration vitale Les cellules sont comptées à l’aide d’un logiciel, et les embryons présentant plus de 50% de blastomères vivants sont considérés comme viables (ABBEEL, 2000) (SHU, 2009). F) Le transfert d’embryon Le transfert d’embryon chez les carnivores domestiques est une technique expérimentale consistant à placer des embryons, produits in vivo chez une femelle donneuse ou in vitro, directement dans les voies génitales d’une femelle receveuse. Le point essentiel à maitriser, en dehors de la technique en elle-même, est la connaissance du stade physiologique de la femelle. En effet, lors de transfert d’embryons frais, la femelle donneuse et la femelle receveuse doivent être strictement au même stade physiologique pour qu’il puisse y avoir survie des embryons après le transfert. L’écart maximum toléré est de 24h entre l’ovulation de la femelle donneuse et celle de la femelle receveuse. Les protocoles de synchronisation des cycles sexuels ne donnant pas de résultats satisfaisants dans l’espèce canine, la seule alternative pour s’affranchir de cette contrainte est le développement de technique de conservation des embryons, que nous développerons plus tard. 1) Technique de transfert d’embryons Les techniques utilisées pour le transfert d’embryons sont les mêmes pour tous les carnivores domestiques. La plupart du temps on emploie des techniques chirurgicales mais des techniques non chirurgicales se développent également. 73 Dans la plupart des études la totalité des embryons sont injectées dans une seule corne, on choisit alors le coté où l’ovaire présente le plus de corps jaunes. Les différentes techniques chirurgicales sont : Le transfert par laparotomie : une laparotomie sur la ligne blanche est effectué e et la corne utérine est extériorisée. On utilise une aiguille afin de creuser un puit dans la muqueuse utérine au niveau de la portion crâniale de la corne utérine, puis un cathéter est mis en place dans la lumière de celle-ci. On utilise alors une pipette en verre afin de déposer les embryons (TSUTSUI, 2001) (POPE, 2006). Le transfert par cœlioscopie : une aiguille de Veress est inséré au travers de la paroi abdominale entre la première et la deuxième mamelle à droite. La cavité abdominale est ensuite gonflée à l’aide d’un mélange de 5% O2 5% CO2 et 90%N2 jusqu’à une pression de 10 mmHg. La cavité abdominale est ensuite visualisée à l’aide d’un endoscope introduit 1 à 2 cm en avant de l’ombilic sur la ligne blanche. Un troisième port situé juste en arrière des mamelles M5 va permettre de saisir les ovaires à l’aide de pinces de Babcock. Une canule de 16G est introduite dans la cavité abdominale environ 5 cm en dessous de l’ombilic. Elle est utilisée afin d’insérer un cathéter Tomcat de 14,5 cm dans l’infundibulum de la trompe utérine puis dans au niveau de l’ampoule de l’oviducte. Un tube de polyéthylène stérile de 40 cm est alors utilisé pour injecter les embryons contenus dans 5 μL de milieu de culture (POPE, 2012). Concernant les techniques de transferts non chirurgicales, la documentation est beaucoup moins importante. Nous retiendrons l’étude faite par Abe (ABE, 2010). Celuici a mis en place un protocole de transfert d’embryons similaire à celui utilisé pour les inséminations artificielles intra utérines sous endoscopie. La chienne n’a ainsi pas besoin d’être sédatée. Elle est maintenue debout et l’endoscope est inséré dans le vagin et on progresse jusqu’à visualisation du col de l’utérus. Celui-ci est alors cathétérisé à l’aide d’une sonde urinaire. Les embryons sont alors injectés avec une faible quantité de milieu de conservation (0,5mL de milieu PB1). La sonde est alors retirée et le train arrière de la chienne est maintenu surélevé afin de minimiser tout risque de reflux. Cette méthode présente l’avantage d’éviter la procédure chirurgicale, plus lourde pour l’animale et pouvant être à l’origine de saignements délétères pour la survie des embryons. Cependant elle nécessite un matériel moins accessible, et peu de publications ont été réalisées sur le transfert non chirurgical d’embryons. Il est donc difficile de comparer son efficacité à celle des transferts chirurgicaux, bien mieux documentés. Les deux facteurs limitant de cette méthode sont les particularités anatomiques de la chienne rendant le cathétérisme utérin plus difficile et nécessitant donc une bonne maîtrise du matériel, et la nécessité d’utiliser un faible volume de milieu de transfert : un quantité trop importante semble être un facteur majeur de reflux vers le vagin. (HOSKEN, 2007 ) (FARSTAD, 2000) 74 2) Efficacité des transferts embryonnaires chez le chien Les modalités des transferts embryonnaires chez la chienne sont très variées, notamment en ce qui concerne le stade des embryons utilisés et le lieu de leur transfert. (CHASTANT-MAILLARD, 2007) Tableau 1 : Résultats des études de transferts d'embryons frais chez le chien Kinney et al. 1979 Tsutsui et al. 1989 Tsutsui et al. 2001b Tsutsui et al. 2001a Tsutsui et al. 2006 Chiennes donneuses 28 embryons J14-15 (blastocystes) 3 donneuses 18 embryons J9-J12 (blastocystes) 19 donneuses 120 embryons J8-11 (8 cellulesblastocystes) 19 donneuses 29 embryons J3-7 (zygote – 8 cellules) 10 donneuses 52 embryons J5-6 (zygote-8 cellules) Chiennes receveuses 5 receveuses (transfert intra utérin) 3 receveuses (intra utérin) Nombre de Nombre gestations chiots nés 2 gestations 2+1 chiots 1 gestation 2 chiots 21 receveuses (intra utérin) 12 gestations 25 chiots 15 receveuses 4 gestations (intra tubaire) 11 chiots 13 receveuses (intra utérin) 4 chiots 3 gestations de Tableau 2 : Résultats des études de transferts d'embryons congelés/vitrifiés chez le chien Chiennes Chiennes Nombre de Nombre de donneuses receveuses gestations chiots nés Kim et al. 2002 19 donneuses 3 receveuses 0 gestation 0 chiot J8-13 post (transfert intra saillies utérin) 52 morulasblastocystes congelés Abe et al. 2000 80 donneuses 9 receveuses 5 gestations (4 7 chiots J2-10 post IA (transfert trans mises bas) 474 embryons cervical) De 1cellule à blastocystes (KINNEY, 1979) (TSUTSUI, 1989) (TSUTSUI, 2001a) (TSUTSUI, 2001b) (TSUTSUI, 2006) (KIM, 2002) 75 Ces résultats semblent montrer qu’il n’y a pas de différence importante selon le stade des embryons transférés et le lieu de transfert. 3) Efficacité des transferts embryonnaires chez la chatte Chez la chatte, les études sur le transfert embryonnaire sont plus nombreuses, voici certains résultats : Tableau 3 : Résultats des études de transferts d'embryons chez le chat Origines des embryons Pope et al. 30 zygotes et 4 2012 stade 2 cellules produit in vitro 9 zygotes produit in vivo et maturé in vitro Pope et al. 45 embryons 2009 produit par FIV à J2 Gomez et al. Embryons issus 2003 de FIV 66 J2 49 J4 72 J5 Chattes Nombre de Nombre de receveuses gestations chatons nés 2 receveuses 2 gestations 2+1 chatons Transfert par cœlioscopie 4 receveuses 3 gestations 4+1+7 chatons J2 : 5 2 gestations J2 : 0 chaton receveuses J4 : 2 chatons J4 : 4 J5 : 2 chatons receveuses J5 : 6 receveuses Tsutsui et al. 4 donneuses : 18 receveuses 17 gestations 47 chatons 2000 90 morulas (5 embryons 1 chatte 3 avortements compactes chacunes) infertile Pope et al. 43 morulas 4 receveuses 2 gestations 2+1 chatons 1998 obtenues par ICSI Kanda et al. 10 donneurs 12 receveuses 7 gestations 19 chatons 1994 88 embryons J3 : 4 J3 : 4/4 2 avortements Morula J3 J4-6 : 5 J4-6 : 3/5 Blastocystes J4- J7 : 3 J7 : 0/3 6 Blastocystes J7 Tsutsui et al. 3 donneuses 6 receveuses 6 gestations 2 chatons 1989 38 blastocystes 2 morts fœtales étendues 3 avortements (POPE, 2012) (POPE, 2009) (GOMEZ, 2003) (TSUTSUI, 2000) (POPE, 1998) (KANDA, 1995) (TSUTSUI, 1989) (POPE, 2006) 76 Les résultats obtenus sont meilleurs que chez la chienne. Les vieux blastocystes semblent donner de moins bons résultats et cela nous amène à utiliser des embryons au stade morula (KANDA, 1995). Chez la chatte, la fécondation in vitro donne de meilleurs résultats que chez la chienne, et plusieurs études ont permis l’obtention de chatons après le transfert embryonnaire d’embryons obtenus par fécondation in vitro. Chez la chatte, le problème de la synchronisation des cycles entre la femelle donneuse et la femelle receveuse est facilement résolu : l’ovulation des femelles receveuses est induite par une injection de 500 UI d’hCG le jour où les femelles donneuses sont saillies (AMSTISLAVSKY, 2012). Dans le cas de transfert embryonnaire en dehors de la saison sexuelle, il semblerait qu’il y a un risque important d’insuffisance lutéale, pouvant apparaître à environ 39 jours de gestation. Une supplémentation en progestérone donne des résultats satisfaisants. 77 TROISIÈME PARTIE : MISE EN PLACE D’UN PROTOCOLE DE TRANSFERT D’EMBRYONS CONGELÉS CHEZ LA CHIENNE L’objectif de cette étude était d’adapter un protocole de cryoconservation d’embryons utilisé avec succès dans d’autres espèces à l’embryon canin, dont la nature biochimique n’a pour l’instant jamais permis d’obtention de gestations après cryoconservation par des méthodes de congélation lente. La première partie de cette étude correspond à la récolte des embryons, la seconde partie décrit le protocole de congélation appliqué, et la dernière partie la décongélation et leur transfert. Nous discuterons ensuite des résultats obtenus et des voies d’amélioration du protocole à envisager. A) Matériels et méthodes 1) Récolte des embryons 14 chiennes Labrador Retriever de âgées 6,2 ± 1,8 ans et pesant 26,3 ± 1,6kg ont été inclues dans l’étude. Un suivi de chaleurs à l’aide de dosage de progestérone et d’échographie ovarienne a été mis en place. Le jour du pic préovulatoire de LH est matérialisé comme étant le jour où la progestéronémie augmente rapidement d’une valeur de 1 à 2,9 ng/mL la veille à 3,2 à 6,4 ng/mL. L’échographie ovarienne permet de confirmer l’ovulation, généralement observée entre 48 et 72 h après le pic de LH. Pour faire ce suivi de chaleur, des prises de sang sont donc réalisées dès le début du proœstrus à un intervalle de 1 à 3 jours selon la valeur de la progestéronémie, et sont continuées jusqu’au met-œstrus. Lorsque l’ovulation est mise en évidence, les inséminations sont réalisées et seront répétées tous les 48h jusqu’au 5ème jour. La semence utilisée provient de deux mâles dont la fertilité et la prolificité sont contrôlées (respectivement 89% de fertilité avec 8,1 chiots en moyenne sur 35 chiennes inséminées et 83% avec 8,0 chiots sur 36 chiennes inséminées). Les embryons récoltés sont ensuite congelés. On a un total de 80 embryons allant du stade 1¢ au stade blastocystes expansés. Les embryons provenant des chiennes 2, 6 et 11 n’ont pas été congelés. 78 2) Transferts embryonnaires Toutes les expérimentations ont été approuvées par le Comité d’Ethique du Campus Vétérinaire de Lyon (n°= 1070) et sont conformes à la directive européenne 86/609/EC relative à la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques. Recrutement et examens préalables Cinq chiennes de race Beagle de 16,5 ± 6,64 mois et pesant 12,55 ± 2,00 kg sont incluses dans l’étude. Le suivi de chaleurs des chiennes est commencé dans l’élevage d’origine et réalisé à l’aide de dosage de progestérone sur tubes secs et héparinés amenés par transporteur. Les prélèvements sont réalisés tous les 2-3 jours à partir de la fin du proœstrus. Les chiennes sont amenées sur place à partir du 18 septembre (à l’exception de Z8BE53 « EMI » qui arrive le 28 septembre) et on continue le suivi de chaleurs pour celles n’ayant pas encore ovulé en réalisant un frotti vaginal en plus du dosage de progestérone. Le jour de l’ovulation est estimé comme étant le jour où le taux de progestérone sanguin dépasse la valeur seuil de 25 nmol/L. Le frotti vaginal apporte également un indice sur le cycle avec un frotti caractéristique présentant des amas de cellules kératinisées et un fond de frotti propre. Le transfert d’embryon est réalisé 9,67 ± 0,82 jours après la date estimée d’ovulation. Les chiennes sont mises à jeun la veille de la chirurgie. La matin de la chirurgie, un cathéter veineux périphériques est posé sur un membre thoracique. 79 B) Protocoles expérimentaux 1) Récolte des embryons Toutes les chiennes subissent une ovario-hystérectomie entre le 8 ème et le 12 ème jour suivant l’ovulation. Durant la chirurgie, un clamp est mis en place afin de fermer le col utérin et laissé après résection du tractus génital afin de prévenir les pertes durant le transport. L’appareil génital est ainsi transféré au laboratoire en une dizaine de minute. Les cornes sont séparées par une incision réalisée à 5 mm du col environ, et elles sont flushées à l’aide de 20mL de milieu de collecte d’embryon bovin. Les oviductes et les cornes sont rincés à l’aide d’une seringue de 20 mL sur laquelle a été ajusté un cône de micropipette d’une contenance de 200 μL. Le cône est introduit dans l’oviducte au niveau de la frange ovarienne, et tout le milieu de rinçage est recueilli dans des boites de Petri stériles. Les embryons sont tout d’abord isolés et comptés à l’aide d’un microscope binoculaire puis ils sont manipulés sous un microscope inversé au grossissement x400. Ils sont alors classés selon leur stade de développement et on vérifie l’absence d’anomalies de divisions ou d’effraction de la zone pellucide. Les corps jaunes de chaque ovaire sont comptés afin d’estimer le rendement de la récolte. 2) Congélation des embryons Le protocole de congélation utilisé dans cette étude est un protocole issue de la recherche embryonnaire chez les animaux de rente et ayant donné de bons résultats. Le milieu de congélation utilisée est un milieu Vigro®, qui est un milieu dérivé du DMPBS (Tampon phosphate salin modifié selon Dulbecco) complémenté en albumine sérique bovine à hauteur de 0,4% et en éthylène glycol à hauteur de 1,5 mol/L. Les embryons sont incubés dans le milieu Vigro® pendant cinq minutes à l’obscurité et à température ambiante. Après équilibration, les embryons sont montés dans des paillettes souples de 0,25 mL à l’aide d’une micropipette entre deux bulles d’air. Chaque paillette est ensuite identifiée. La congélation commence avec une étape de seeding de 12minutes à la température de 7°C. Les paillettes sont ensuite congelées à une vitesse de -0,5°C jusqu’à la température de – 35°C. Une fois cette température atteinte, les paillettes sont plongées dans l’azote liquide. 80 Tableau 4 : Tableau récapitulatif des paillettes Chienne Age Jours post ovulation 1 7 ans J10 3 ? J 10-11 4 8 ans J9 5 7 ans J10-11 7 8 ans J 9-10 9 ? J9 10 ? J10 12 13 14 6 ans 8 ans 7 ans J10 J12 J11 15 7 ans J9 16 7 ans J10 Numéro de paillette 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Nombres d’embryons 5 embryons 4 embryons 6 embryons 4 embryons 4 embryons 4 embryons 2 embryons 5 embryons 5 embryons 5 embryons 4 embryons 3 embryons 4 embryons 3 embryons 2 embryons 7 embryons 3 embryons 3 embryons 4 embryons 3 embryons Stade des embryons 4-6 cellules 2 cellules 5 morulas 1 blastocyste expansé 4 morula 1 morula 1x 2 cellules et 2x 1cellule 4 blastocystes 2 morula 2x 2 cellules 3x 4 cellules 2x 4 cellules 2x 2cellules 1x 1cellule 1x 4 cellules 2x 8cellules 2x 1cellule 1x 6cellules 1x 4cellules 2x 1cellule 3 blastocystes 4 blastocystes expansés 2 morulas 1 blastocyste 2x 8cellules 1x 8cellules 4 blastocystes 2 blastocystes expansés 3 morula 3 morula 4x 8cellules 3x 8cellules 81 3) Décongélation des embryons Pour décongeler les paillettes contenant les embryons, celles-ci sont sorties de l’azote et laissées à l’air ambiant environ dix secondes avant d’être plongées dans un bain maire à 37,2°C pendant une quinzaine de secondes. Elles sont ensuite incubées dans un milieu de décongélation. Lors de la première série de transfert (chiennes A7BJ32 « SAM » et A7BJ53 « BREE »), les paillettes étaient incubées dans un seul bain d’holding medium à température ambiante pendant une durée variant entre 7 et 13 minutes dépendante de la chirurgie. Lors des transferts suivants, il a été préféré de réaliser l’incubation dans deux bains successifs avec d’abord 5 minutes dans un bain d’Holding Medium contenant 5% d’éthylène glycol (1 mL pour 20 mL de milieu) puis 5 minutes dans un bain d’Holding médium pur. La morphologie des embryons est ensuite observée afin d’évaluer leur qualité. Lors du dernier transfert (chienne Z8BE53 « EMI »), un embryon de qualité moyenne et un embryon de mauvaise qualité sont gardés afin d’évaluer leur viabilité à l’aide d’une coloration vitale. Figure 24 : Sortie des paillettes de l'azote 82 Figure 25 : Décongélation en bain marie Figure 26 : Incubation des paillettes 83 Figure 27 : Vérification avant transfert Figure 28 : Matériel de transfert 84 4) Transferts embryonnaires a. Protocole anesthésique Une prémédication est réalisée avec de l’acépromazine par voie intraveineuse à 0,03mg/kg et de la morphine à 0,3 mg/kg par voie sous cutanée. L’induction est réalisée 10 minutes après avec l’injection par voie intraveineuse de propofol à effet (dose prévue de 4 mg /kg). Les chiennes sont ensuite intubées et l’entretien est fait à l’isoflurane. Elles sont mises sous perfusion le temps de la chirurgie à 10 mL /kg/h de ringer lactate et reçoivent 0,2mg/kg de meloxicam et 30 mg/kg de céfalexine lors de l’induction. L’analgésie est prise en charge avec une perfusion continue de morphine (0,2 mg/kg/h) lidocaine (50 μg/kg/h) kétamine (10 μg/kg/h) après un bolus de charge réalisé avant la première incision. Le monitorage est réalisé à l’aide d’un électrocardiogramme, d’un apAlert, de l’oxymétrie de pouls et de la capnographie. Les chiennes sont ensuite tondues au niveau de l’abdomen et transférées aux blocs de chirurgie. Un scrub chirurgical est réalisé en trois temps. b. Protocole chirurgical On réalise une incision cutanée sur la ligne médiane au niveau de l’ombilic. Le plan cutané est dilacéré avec des ciseaux de Metzenbaum. La paroi musculaire est ensuite incisée sur la ligne blanche, les ovaires et l’utérus sont ensuite identifiés et les cornes utérines extériorisées. Technique de transfert : la première corne utérine est ponctionnée à l’aide d’une aiguille jaune sans transpercer la muqueuse. En cas de saignement, celui-ci est coagulé à l’aide d’un bistouri électrique monophasé appliqué sur l’aiguille. Une paillette de transfert est ensuite introduite dans le trou et enfoncée jusqu’à passer la muqueuse utérine. Le site de ponction est ensuite fermé à l’aide d’un point au PDS 4-0. Lors des premiers transferts, les embryons étaient injectés à environ 3 cm de la bifurcation des cornes. Le site d’injection a été modifié par la suite et il a été préféré une injection plus haute, avec une incision à 2-3 cm de l’ovaire afin de réaliser un transfert en butée de l’oviducte. Au fur et à mesure des transferts, on a constaté une amélioration de la technique de transfert, avec des saignements de moins en moins présents, et même une absence de saignements sur les derniers transferts. 85 Les chiennes sont réveillées en chenil, et sont mises sous méloxicam à 0,1 mg/kg une fois par jour pendant 5 jours et céfalexine 15 mg /kg deux fois par jour pendant 10 jours. Le lendemain de la chirurgie elles sont replacées en box avec les autres chiennes de l’étude. Figure 29 : Ponction de la corne utérine Figure 30 : Saignement lors de la ponction 86 Figure 31 : Coagulation du saignement Figure 32 : Transfert des embryons dans la corne utérine 87 Figure 33 : Vérification des cornes après le transfert Figure 34 : Suture du point du transfert 88 Tableau 5 : Tableau récapitulatif des transferts embryonnaires Chienne Stade Aspect l’utérus de Corne gauche Nombres et aspect embryons 1x 6 ¢ + 1x 4¢ + 2x 1¢ Corne droite des Saignements A7BJ32 « SAM » A7BJ53 « BREE » A7BD57 « NAD » J9 J10 J11 Normal Normal Normal + A5BJ58 « LOL » J9 Normal Z4BE64 « KTOU » Z8BE53 « EMI » J10 J9 5 embryons (4 ou 6¢) Normal +/Bosselé mais 3 embryons 8¢ (1 mauvaise bon état qualité, 2 moyens) 1 blastocyste et 2 morulas + de très bonne qualité 3 embryons (2 ou 4¢) + Nombres et aspect des embryons 1x 4 ¢ + 2x 8¢ + 2x 1¢ 3 blastocystes 3 morulas de très bonne qualité Saignements Total embryons transférés + + - 9 3 6 4 morulas +/- 7 (2 embryons manquants) 9 5 2 pour viabilité 4x 2¢ 2 embryons 8 ¢ qualité + de bonne - 39 89 C) Résultats 1) Récolte des embryons Au total 100 embryons ont été collectés pendant l’étude. 43% étaient au stade 1 à 16 cellules, 23% étaient au stade Morula et 34% au stade Blastocyste. Le rendement de la récolte est de 61,3% avec 7,1 ± 0,7 embryons en moyenne par chienne. Aucune rupture de la zone pellucide n’a été mise en évidence et les embryons récoltés ne présentaient aucune anomalie morphologique, même si certains blastocystes montraient un léger tassement. Les premières Morula sont retrouvées à partir de J9 tandis que les premiers blastocystes apparaissent à partir de J10. Figure 35 : Embryons aux stades 4 et 8 cellules Figure 36 : Embryon au stade blastocyste 90 2) Transferts embryonnaires a. Evaluation de la morphologie et de la viabilité des embryons Au moment de la décongélation et avant leur transfert, les embryons sont observés au microscope afin d’évaluer leur morphologie et de noter d’éventuelles anomalies. Sur certaine paillette, comme celles utilisées pour le transfert de A7BD57 « NAD », on observe des embryons tardifs de très bonne qualité après décongélation, ce qui tend à montrer que le protocole appliqué est bon. D’autres paillettes donnent des résultats plus contrastés, comme lors du transfert de Z8BE53 « EMI » où on observe pour la paillette 20 deux embryons-8¢ de bonne qualité et un embryon-8¢ de mauvaise qualité avec des restes de cellules de la corona radiata touchant la zone pellucide. La paillette 19 contenant les embryons devant être transférés dans la corne gauche contient deux embryons-8 cellules de mauvaise qualité présentant une zone pellucide hétérogène et deux blastomères un peu contractés de qualité moyenne à bonne. Cette variabilité de qualité entre des embryons congelés à des dates différentes laisse penser que ce n’est pas la qualité du protocole qui est à revoir, puisque certains lots présentent des embryons de qualité de manière homogène, mais que cette disparité de résultat est liée à un souci de manipulation. Figure 37 : Qualité variable des embryons post décongélation L’évaluation morphologique seule ne permet pas cependant d’avoir toujours une bonne estimation de la viabilité des embryons comme nous l’avons vu précédemment, c’est pourquoi nous avons réalisé des colorations vitales sur les embryons non transférés chez la chienne Z8BE53 « EMI ». 91 Le protocole de coloration utilisé dans notre étude pour évaluer la viabilité des embryons n’est pas le protocole Iodure de propidium-Hœchst 33342 décrit précédemment mais un protocole Live Dead®. Les colorants utilisés lors de ce protocole sont l’homodimère 1 d’éthidium et la calcéine AM. Le principe n’est pas tout à fait le même que celui du protocole Iodure de propidium-Hœchst 33342. L’homodimère 1 d’éthidium remplit la même fonction que le iodure de propidium, à savoir colorer les cellules mortes. Il est en effet également lipophobe, et ne peut par conséquent pénétrer que dans les cellules présentant des perturbations de membrane plasmique. La calcéine AM, contrairement au Hœchst 33 342 qui colorait toutes les cellules, vivantes ou mortes, n’est pas fluorescente initialement. Elle acquière une fluorescence bleue-verte intense après action d’une estérase intracellulaire convertissant la calcéine AM en calcéine fluorescente. Protocole de coloration : il est nécessaire de rincer avec du DPBS les embryons afin d’éliminer le milieu de culture pouvant interagir avec la calcéine AP. Les concentrations en réactifs nécessaires à la coloration sont dépendantes du type de cellule et il est nécessaire de tester les concentrations sur des cellules de même nature vivante et morte afin de connaître les concentrations optimales. Dans notre étude les concentrations retenues sont 4 mmol/L de calcéine AM diluée dans du DMSO anhydre, et 2 mmol/L d’homodimère 1 d’Ethidium dilué dans du DMSO-4H20. Les embryons sont disposés sur une lamelle dans des boîtes de Petri et on ajoute 150 μL de colorant Live/Dead® afin de recouvrir l’ensemble des cellules. L’incubation doit durer 30 à 45 minutes à température ambiante. Après l’incubation, on applique 10μL de solution Live/Dead® fraiche sur une lame de microscope. La lamelle présentant les embryons est précautionneusement saisie à l’aide d’une pince fine, retournée et montée sur la lame du microscope. Elle est scellée afin d’éviter l’évaporation. Les lames sont ensuite observées à l’aide d’un microscope à fluorescence. Ce protocole est utilisé sur deux embryons 8 cellules provenant respectivement des paillettes 19 et 20 utilisées lors des transferts de la chienne Z8BE53 « EMI ». La coloration montre une viabilité jugée mauvaise des embryons observés. Ces résultats ne sont cependant pas représentatifs de l’ensemble des embryons, puisque les embryons colorés ont été sélectionnés car leur morphologie laisser présager leur mauvaise qualité. 92 Figure 38 : Coloration Live Dead d'un embryon 8 cellules b. Diagnostic de gestation par échographie abdominale Des échographies sont réalisées le 05 octobre 2012 afin de déterminer la gestation ou non des quatre premières femelles, à des stades de gestations supposés de J23 pour A5BJ58 « Lol », J24 pour A7BJ32 « Sam », et J25 pour A7BJ53 « Bree » et A7BD57 « Nad ». Les quatre diagnostics de gestation se révèlent négatif. On réalise alors des dosages de progestérone afin de mettre en évidence une éventuelle insuffisance lutéale précoce, mais les résultats sont normaux. Le diagnostic de gestation de Z4BE64 « Katou » se révèle par la suite également négatif. Suite à un incident au chenil, la chienne Z8BE53 « Emi » est décédée et il n’a pas été possible de déterminer une éventuelle gestation. Compte tenu de l’absence de gestation et en accord avec le comité d’éthique les chiennes sont euthanasiées. 93 c. Aspect morphologique de l’appareil génital Après l’euthanasie, les chiennes sont autopsiées afin de réaliser une analyse morphologique puis histologique (non réalisée à ce jour) de leur appareil génital. L’observation morphologique révèle plusieurs types d’anomalies. La première est la présence d’adhérence entre l’omentum et les cornes utérines, retrouvées chez les chiennes 7BJ53 (« «BREE ») A5BJ58 (« LOL ») et Z4BE64 (« KTOU »). Si ces adhérences ne peuvent pas être à l’origine de l’échec des transferts, elles sont les témoins d’une inflammation locale post opératoire. Figure 39 : Mise en évidence d’adhérences de l'omentum sur les cornes utérines Cette inflammation locale est clairement visible chez certaines chiennes au niveau des sites de transfert où un œdème important est observé. Cependant on ne peut conclure que cette inflammation puisse être à l’origine de l’échec du transfert sans comparaison avec des pièces anatomiques provenant de transfert ayant permis une gestation, ou sans analyse histologique. 94 Figure 40 : Observation d’une inflammation locale au niveau des sites de transfert La dernière anomalie mise en évidence lors de l’observation macroscopique des pièces anatomiques est une sténose de la corne utérine, observée chez la chienne Z4BE64 (« KTOU »). Cette anomalie peut être à l’origine notamment d’un défaut de circulation des embryons et d’un défaut d’implantation. Son origine est une anomalie lors de la chirurgie de transfert embryonnaire. Figure 41 : Mise en évidence d’une sténose de la corne utérine 95 D) Discussion 1) Récolte des embryons La technique utilisée permet d’éviter tout dégât sur les oviductes tout en permettant de collecter les embryons présents dans ceux-ci et dans les cornes. L’utilisation du cône rend inutile la cathétérisation de l’oviducte, et la coaptation et l’étanchéité du montage sont assurées par la pression des doigts de l’opérateur, rendant inutile l’usage de pince occlusive, ce qui permet d’éviter les compressions sur l’oviducte. La technique a permis un rendement de récolte total de 61,3% et le timing d’apparition des stades morula et blastocyste retrouvé dans cet étude est en accord avec la littérature. Une étude récente menée sur 18 chiens croisés a permis l’obtention d’un meilleur rendement en utilisant des techniques in vivo (72,8% par chirurgie) et ex vivo (81%). Cependant dans cette étude tous les embryons sont récoltés au même stade, à J12 post ovulation, ce qui permet la récolte d’embryons présentant un stade de développement homogène et se trouvant déjà dans les cornes utérines et non plus dans l’oviducte. On limite ainsi le risque de perte d’embryons entrainé par l’altération des oviductes durant la chirurgie pour la méthode ex vivo. Malgré le faible rendement, une moyenne de 7,1 embryons a été récoltée par chienne pour un taux d’ovulation moyen de 11,6 ovocytes. C’est le meilleur taux d’ovulation et la plus importante récolte d’embryons obtenus pour cette race. Le plus faible rendement pourrait s’expliquer par une sous-estimation du nombre de corps jaunes dans les études précédentes. En effet les taux d’ovulation rapportés sont moindres pour des chiennes de même race et de même gabarit, ce qui semble étonnant sachant que le nombre d’ovocytes ovulés est corrélé à l’augmentation de la concentration en IGF-1 circulante, elle-même corrélée à la taille du chien. 2) Transferts embryonnaires Le protocole mis en place n’a pas permis l’obtention de gestation, et il convient donc de déterminer la raison de cet échec. Les deux origines à envisager sont soit un protocole de congélation-décongélation inadapté ne permettant pas d’obtenir d’embryon viable, soit une technique de transfert non au point. Nous allons donc envisager la conduite à tenir pour rectifier le protocole. 96 a. Evaluation de la viabilité des embryons Afin de s’assurer que le protocole de congélation est au point, il est nécessaire de réaliser une étude de viabilité de manière plus importante que lors de l’étude. Il s’agirait donc de décongeler la totalité des embryons restants afin d’évaluer leur morphologie puis leur viabilité à l’aide des colorations vitales. En effet, le protocole Live/Dead® dans notre étude n’a été utilisé que sur deux embryons dont la morphologie laissait présager qu’ils avaient mal supporté la congélation. Ils n’étaient donc pas représentatifs de l’ensemble des embryons de la paillette, car d’autres embryons présentaient une morphologie normale. De même, décongeler une ou deux paillettes pour en observer les embryons ne seraient pas forcément représentatif, car on ne peut exclure des erreurs de manipulation lors de la congélation d’une paillette. Il faut donc réaliser ces tests sur un nombre important d’embryons afin de s’assurer d’obtenir des résultats représentatifs et statistiquement significatifs. b. Evaluation de la technique de transfert Si le protocole de congélation-décongélation permet l’obtention d’embryons viables de bonne qualité, cela signifie qu’il faut revoir la technique de transfert. Plusieurs causes peuvent être à l’origine d’un échec de transfert. Tout d’abord, il peut s’agir d’un problème de timing entre le stade de la chienne receveuse et le stade de l’embryon. Tableau 6 : Correspondance entre les chiennes donneuses et receveuses Chienne receveuse A7BJ32 « SAM » A7BJ53 « BREE » A7BD57 « NAD » A5BJ58 « LOL » Z4BE64 « KTOU » Z8BE53 « EMI » Stade J9 J10 J11 J9 J10 J9 Chienne donneuse Chienne 9 Chienne 10 Chienne 3 Chiennes 4 et 7 Chienne 1 Chienne 16 Âge des embryons J9 J10 J10-11 J9 et J9-J10 J10 J10 On constate ici d’une bonne correspondance entre les chiennes donneuses et les chiennes receveuses a été respecté, puisque la différence ne dépasse jamais une journée. Le timing du transfert ne peut donc pas être à l’origine de l’échec. La seconde origine possible est la technique en elle-même. En effet, on a constaté une amélioration de l’efficacité au fur et à mesure des transferts, qui se caractérisait par des saignements moins importants et une cathétérisation plus facile. Il a été démontré chez la femme que le sang était à l’origine d’une diminution du taux de réussite des transferts d’embryons (TIRAS, 2012). 97 Il est donc préférable de limiter au maximum les saignements pendant le transfert embryonnaire. Cela peut se faire en continuant à s’entrainer, puisque l’on a observé une amélioration spontanée au cours des transferts pendant l’étude. Outre les saignements, on peut s’interroger sur les éventuelles conséquences péjoratives pour l’utérus, pouvant nuire à la bonne implantation. En effet, on a observé sur les utérus une inflammation parfois importante au niveau des points de transferts, et également la présence d’une sténose dans un cas. Ces effets secondaires du transfert embryonnaire ont également été rapportés dans une étude sur la biopsie utérine, dont la technique chirurgicale est proche (MIR, 2013). Ces anomalies macroscopiques constituent des pistes à approfondir pour déterminer l’origine de l’échec du transfert, en effectuant des analyses histologiques des pièces anatomiques. Il pourrait également être intéressant d’évaluer les éventuelles conséquences délétères pour la muqueuse utérine de l’utilisation de l’électrocoagulation pour l’arrêt des saignements. Même si l’électrocoagulation n’a été utilisée que sur les couches les plus externes de l’utérus et jamais sur la muqueuse, elle pourrait être à l’origine de l’inflammation observée sur les pièces anatomiques au niveau des sites de transfert. Cependant il est difficile d’évaluer l’impact de l’électrocoagulation par manque de données bibliographiques, et même si les chirurgiens consultés semblent écarter cette piste, seule l’analyse histologique pourra l’éliminer définitivement. On peut aussi s’interroger sur l’intérêt de ne transférer les embryons que dans une seule corne. En effet on divise ainsi par deux la probabilité d’être à l’origine d’un saignement ou de modifications anatomiques, et comme on l’a vu en première partie il existe une migration inter cornes physiologique des embryons entre J12 et J17. Cela permettrait de limiter le temps opératoire, le risque de saignement et le risque de léser l’utérus pour un résultat à priori similaire. Enfin, une dernière possibilité est de changer la technique de transfert embryonnaire pour une technique de transfert par cathétérisme utérin sous endoscopie vaginale (ABE, 2010). Cela permet d’éviter tout saignement et le geste chirurgicale. De plus il s’agit d’un geste rapide et bien maîtrisé. Cependant il ne permet qu’un transfert bas des embryons et on ne peut juger de son efficacité par rapport à un transfert par laparotomie en l’absence d’étude supplémentaire. 98 CONCLUSION 99 BIBLIOGRAPHIE ABBEEL. (2000). Zona pellucida damage tu human embryos after cryopreservation and the consequences fot their blastomere survival and in vitro viability. Human Reproduction , 15-2, 373-378. ABE. (2010). Cryopreservation of canine embryos. Biology of reproduction , 363-368. AMSTISLAVSKY. (2012). Reproductive Technologies Relevant to the Genome Resource Bank in Carnivora . Reprod Dom Anim , 47, 164-175. ANDERSON. (1973). The ovary and reproduction cycle of the dog (Beagle). Los Altos. BOGLIOLO. (2002). Influence of co-culture with oviductal eptithelial cells on in vitro maturation of canine oocytes. Reprod Nutr Dev 42 , 265-273. BOGLIOLO. (2001). Intracytoplasmic sperm injection of in vitro matured oocytes of domestic cats with frozen thawed epididymal spermatozoa. Theriogenology 56 , 955-967. BOLAMBA. (1997). In vitro maturation of domestic dog oocytes cultured in advanced preantral and early antral follicles. Theriogenology 49 , 933-942. BOLOMBA. (2006). Effects of epidermal growth factor and hormones on granulosa expansion and nuclear maturation of dog oocytes in vitro . Theriogenology , 65, 1037–1047 . BUFF. (2010). Maitrise du cycle sexuel chez les carnivores : le suivi de chaleurs chez la chienne. Cours du module reproduction 4ème année VetAgro Sup . BYSTED. (2001). Embrionic development stages in relation to the LH peak in dogs. J Reprod. Fert. 57 Suppl , 181-186. CATT. (1996). Intracytoplasmic sperm injection ( ICSI) and related technology. Animal reproduction science , 42, 239-250. CHASTANT-MAILLARD. (2007). BIOTECHNOLOGIES DE L’EMBRYON DANS L’ESPÈCE CANINE . Bulletin de l'Académie Vétérinaire , 160, 145-161. CIRIT. (2007). The effects of a low dose of cabergoline on induction of estrus and pregnancy rates in anestrous bitches . Animal Reproduction Science , 101, 134–144 . COMIZZOLI. (2006). n vitro development of domestic cat embryos following intra-cytoplasmic sperm injection with testicular spermatozoa . Theriogenology , 66, 1659–1663 . CONCANNON. (1980). Biol Reprod 23 , 111. CONCANNON. (66). Effects of dose and duration of continuous GnRH-agonist treatment on induction of estrus in beagle dogs Competing and concurrent up-regulation and down-regulation of LH release. Threiogenology , 1488-1496. CONCANNON. (2001). Embryo development, hormonal requirements and maternal responses during canine pregnancy. J Reprod Fertil Suppl 57 , 169-179. 100 CONCANNON, P. (2011). Reproductive cycles of the domestic bitch. Animal Reproduction Science , 200-210. DIZIER, S. (2004). Chromatiin, microtubules, and kinases activities during meiotic resumption in bitch oocytes. Mol Repr Dev 68 , 205-212. DOAK. (1967). Longevity of spermatozoa in the reproductive tract of the bitch. Journal of Reprod and Fert , 13, 51-58. DONZÉ. (2002). La sperme de chat : collecte, cryoconservation, capacitation, présence d'acides aminés soufrés. Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon. ENGLAND. (2010). BSAVA Manual of Canine and Feline Reproduction and Neonatalogy Second edition. Gloucester: British Small Animal Veterinary association. ENGLAND. (2013). Dog breeding, whelping and puppy care. Chichister: Wiley Blackwell. EVANS. (1993). Miller's anatomy of the dog. Saunders. EVECEN. (2011). Adding hormones sequentially could be an effective approach for IVM of dog oocytes . Theriogenology , 75, 1647–1651 . FARSTAD. (2000). Current state in biotechnology in canine and feline reproduction . Animal Reproduction Science 60–61 (2000) , 60-61, 375–387 . FAURE. (2008). L'injection intracytoplasmique de spermatozoïde chez les mammifères. Etude expérimentale chez la chienne. maison alfort. FONTAINE. (2011). Induction of fertile oestrus in the bitch using Deslorelin, a GnRH agonist. Theriogenology , 1561-1566. FONTBONNE. (2007). Guide pratique de reproduction canine et feline. Paris: Med com. FUJII. (2000). The Quality and Maturation of Bitch Oocytes Recovered from Ovaries by the Slicing Method . J Vet Med Sci 62(3) , 305-307. GHANI, A. (2012). In vitro maturation of canine oocytes co-cultured with bovine and canine granulosa cell monolayers . Theriogenology , 77, 347–355 . GILBERT. (1996). Biologie du developpement 4ème edition. Bruxelles: De Boeck Université. GOMEZ. (2003). Development of in vitro matured, in vitro fertilized domestic cat embryos following cryopreservation, culture and transfer. Theriogenelogy , 60, 239-251. GOODROWE. (1991). Nuclear maturation of domestic cat ovarian oocytes in vitro. Biology of reproduction , 466-470. GUAITOLINI. (2012). Post thaw viability of in vivo produced canine blastocysts cryopreserved by slow freezing. theriogenology , 78, 576-582. HALTER. (2010). Croissance et maturation folliculaire dans l'ovaire félin (Felis catus) : Etude des enzymes de la stéroidogenese. Maison Alfort. HATOYA. (2006). Induction of fertile oestrus in bitches by an intranasal spray of gonadotrophinreleasing hormone agonist. Veterinary record 158 , 378-379. 101 HEWITT. (1999). Influence of gonadotrophin supplementation on the in vitro maturation of bitch oocytes. Veterinary records 144 , 237-239. HEWITT. (1999). Synthetica oviductal fluid and oviductal cell coculture for canine oocyte maturation in vitro. Anim Reprod Sci 55 , 63-75. HOLM. (2002). Kinetics of early in vitro development of bovine in vivo- and in vitro-derived zygotes produced and/or cultured in chemically defined or serum-containing media. Reproduction , 123, 553. HOLST. (1971). The prenatal development of the dogs : Preimplantation Events. Biology of reproduction , 5, 194-206. HOSKEN, F. . (2007 ). Embryo transfer in the dog and cat. Theriogenology , 68, 382–385 . JACQUET. (2003). Contribution à l'étude des protocolmes de capacitation in vitro et de congélation des spermatozoïdes chez le chien. Ecole nationale vétérinaire de Lyon. JALKANEN. (1998). Successful embryo transfer in the silver fox (Vulpes vulpes). Animal Reproduction Science 54 , 139-147. JOHNSTON. (2001). Canine and Feline Theriogenology. Saunders. JOHNSTON. (1991). influence of temperature and gas atmosphere on in-vitro fertilization and embryo development in domestic cats. Journal of reproduction and fertility , 92, 377_382. KANDA. (1995). Early embryonnic development in vitro and embryo transfer in the cat. The Journal of Veterinary Medical Science , 57 (4), 641-646. KIM. (2005). Effects of estradiol 17 β and progesterone supplementation on in vitro nuclear maturation of canine oocytes. Theriogenelogy 63 , 1342-1353. KIM. (2002). Embryo transfer with frozen embryos in the dog. Journal of veterinary clinics , 19, 73-79. KIM. (2004). Influence of maturation culture period on the development of canine oocytes after in vitro maturation and fertilization. Reprod Nut Dev 44 , 631-637. KINNEY. (1979). Surgical collection and tranfer of canine embryons. Biology Reproduction , 96. KNOSPE. (2002). Periods and Stages of the Prenatal Development of the Domestic Cat . Anat. Histol. Embryol. , 31, 37-51. KUTZLER. (2007). Estrus induction and synchronization in canids and felids. Theriogenology 68 , 354-374. LAFOREST. (2005). Le contrôle de la maturation nucléaire des ovocytes porcins. Implication de la phosphodiestérase de type 3 et de l'AMPK (5'adenosine monophosphate-activated protein kinase). Laval: Université Laval. LEE. (2005). Dogs cloned from adult somatic cells. Nature , 641. LELONG. (2007). La congélation de l'embryon équin : comparaison in vivo de la vitrification par la méthode ops à la méthode de congélation lente . Toulouse: Thèse vétérinaire. 102 LEONI. (2002). Defined media for vitrification, warming, and rehydratation : effects on post thaw protein synthesis and viability of in vitro derived ovine embryos. Cryobiology , 45, 204-212. LESEGNO, V. D. (2007). La maturation de l'ovocyte canin in vivo et in vitro. Thèse . LOPES. (2006). Respiration rates correlate with mRNA expression of G6PD and GLUT1 genes in individual bovine in vitro-produced blastocysts. Theriogenology , 68, 223. LOPES. (2005). Respiration rates of individual bovine in vitro-produced embryos measured with a novel, non-invasive and highly sensitive microsensor system . Reproducton , 130, 669-679. LUVONI. (2000). Current progress on assisted reproduction in dogs and cats: in vitro embryo production . Reprod. Nut. Dev. , 40, 505-512. LUVONI. (2006). Effect of gonadotrophins during in vitro maturation of feline oocytes on oocytecumulus cells functional coupling and intracellular concentration of glutathione. Animal Reproduction science 96 , 66-78. LUVONI. (2005). Factors involved in vivo and in vitro maturation of canine oocytes. Theriogenology 63 , 41-59. MAHI. (1978). Capacitation, acrosome reaction and egg penetration by canine spermatozoa in a simple defined medium. Gamete research , 1, 101-109. MARSELOO. (2004). Comparaison of ovarian ultrasonography with hormonal parameters for the determination of the time of ovulation in bitches. Proceedings of the 5th iternational symposium on canine and feline reproduction, (pp. 75-77). Sao Paulo. MEYERS. (1991). The critical period for Mullerian duct regression in the dog embryo. Biol Reprod 45 , 626-633. MIGLINO. (2006). The carnivore pregnancy: The development of the embryo and fetal membranes . Theriogenology 66 (2006) , 66, 1699–1702 . MIMOUNI. (2005). Vade-mecum de pathologie de la reproduction chez le chien. Med Com. MIR. (2013). Findings in uterine biopsies obtained by laparotomy from bitches with unexplained infertility or pregnancy loss: An observational study. Theriogenology , 79, 312-322. MORROW. (1986). Current therapy in theriogenology. london: Saunders. NOAKES. (2009). Veterinary reproduction and obstetrics ninth edition. London: Elsevier. OTOI. (2000). Development of canine oocytes matured and fertilised in vitro. The veterinary record , 146, 52-53. OTOI. (2004). Influence of maturation culture period on the development of canine oocytes after in vitro maturation and fertilization . Reprod. Nutr. Dev. , 44, 631-637. PALERMO. (1991). Enhancement of acrosome reaction and subzonal insemination of a single spermatozoon in mouse eggs5. Molecular Reproduction and Development , 30, 339-345. POPE. (2009). Birth of domestic cat kittens of predetermined sex after transfer of embryos produced by in vitro fertilization of oocytes with flow-sorted sperm. Theriogenelogy , 71, 864871. 103 POPE. (1998). Development of embryos produced by intracytoplasmic sperm injection of cat oocytes . Animal reproduction science , 53, 221-236. POPE. (2000). Embryo technology in conservation efforts for endangered felids. Theriogenology , 53, 163-174. POPE. (1995). In vitro and in vivo development of domestic cat oocytes following intracytoplasmic sperm injection or subzonal insemination. Theriogenology , 43, 302. POPE. (1997). In vitro and in vivo development of embryos produced by in vitro maturation and in vitro fertilization of cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility , 51, 69-82. POPE. (2006). In vitro embryo production and embryo transfer in domestic and non-domestic cats. Theriogenology , 66, 518–1524. POPE. (2006). In vitro production and transfer of cat embryos in the 21st century . Theriogenology , 66, 59-71. POPE. (2012). In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology , 77, 531-538. POPE. (1994). Successful in vitro and in vivo development of in vitro fertilized two to four-cell cat embryos following cryopreservation, culture and transfer. Theriogenology , 51, 441-451. PRETZER. (2008). Canine embryonnic and fetal development: A review. Teriogenology 70 , 300303. REECE. (1997). Physiology of domestic animals 2nd edition. Baltimore: Williams and Wilkins Compagny. REYNAUD. (2006). In vivo canine oocyte maturation, fertilization and early embryogenesis : a review. Theriogenology , 1683-1693. REYNAUD. (2005). In vivo meiotic resumption fertilization and early embryonic development in the bitch. Reproduction 130 , 193-201. ROCHA. (2006). Quantity and quality of oocytes recovered from donor bitches of different ages . Theriogenology , 66 , 1465–1467 . RODRIGUES. (2004). Embryonic Development of In Vitro Matured and In Vitro Fertilized Dog Oocytes . Molecular reproduction and development , 67, 215-223. SCOTT. (1970). Reproduction and breeding techniques for laboratory animals. Philadelphia: Lea & Febiger. SENGER. (2003). Pathways to pregnancy and parturition 2nd edition. Washington: Current conception. SHU. (2009). The value of fast blastocoele re expansion in the selection of viable thawed blastocyst for transfer. Fertility and Sterility , 91, 401-406. SHU. (2009). The value of fast blastocoele re-expansion in the selection of a viable thawes blastocyst for transfer. Fertility and Sterility , 91, 401-406. 104 SIMPSON. (2004). Manual of small animal Reproduction and Neonatalogy. British Small Animal Veterinary Association. SONGSASEN. (2002). Nuclear maturation of canine oocytes cultured in Protein-Free media. Mol Repr Dev 62 , 407-415. SONGSASEN. (2007). Oocyte biology and challenges in developing in vitro maturation system in the domestic dog. Anim Repro Sci 98 , 2-22. STORNELLI. (2012). Pharmacokinetics of eCG and induction of fertile estrus in bitches using eCG followed by hCG . Theriogenology , 78, 1056–1064 . SWANSON. (1999). Cryoprotectant toxicity and cryopreservation success in IVF derived domestic car embryos after embryo transfer. Theriogenology , 51, 174. TIRAS. (2012). Effect of blood and mucus on the success rates of embryo transfer. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology , 165, 239-242. TSUTSUI. (1988). An experimental trial on embryo transfer in the dog. Jpn J Vet Sci , 797-800. TSUTSUI. (1989). An experimental trial on embryo transfer in the dog. Japan Journal of Veterinary Science , 797-800. TSUTSUI. (1989). Embryo transfer in the cat during the non breeding season. Japanese journal of veterinary science , 51, 871-877. TSUTSUI. (2000). Feline Embryo Transfer during the Non-Breeding Season. The Journal of Veterinary Medical Science 62(11), 1179-1175. TSUTSUI. (2001a). Intratubal transplantation of early canine embryos. Journal of reproduction and fertility , Suppl 57, 309-314. TSUTSUI. (2006). Intrauterine transfer of early canine embryos. Theriogenelogy , 66, 1703-1705. TSUTSUI. (1975). On the fertile period of ovum after ovulation. Jpn J anim Reprod , 21-65. TSUTSUI. (1975). Ovulation rate and transuterine migration of fertilized ova. Japn J Anim Repro , 98-101. TSUTSUI. (2001). Transfer of canine embryos at various developmental stages recovered by hysterectomy or surgical uterine flushing. Journal of Veterinay Medical Science 63 (4) , 401-405. VERSTEGEN. (1999). Effect of stage of anoestrus on the induction of estrus by the dopamine agonist cabergoline in dogs. Theriogenology , 51, 597-611. VOLKMANN. (2006). The use of deslorelin implants for the synchronization of estrous in diestrous bitches . Theriogenology , 66, 1497-1501. WALES. (1958). The interaction of pH, tonicity and electrolyte concentration on the motility of dog spermatozoa. Journal of physiology , 141, 273-280. YAMADA. (1993). In Vitro maturation and fertilization of preovulatory dog oocytes. J Repro Fert Suppl 47 , 227-229. 105 YAMADA. (1992). Maturation, Fertilization and Development of Dog Oocytes In Vitro. Biology of reproduction , 46, 853-858. YU. (2010). Effect of equine chorionic gonadotropin on the efficiency of superovulation induction for in vivo and in vitro embryo production in the cat. Theriogenology , 413-420. ZOLDAG. (2001). Fertile estrus induced in bitches by bromocryptine, a dopamine agonist: a clinical trial. Theriogenology , 55, 1657-1666. 106 NOM PRENOM : BONTE TANCREDE TITRE : Actualités en biotechnologies de l’embryon chez les carnivores domestiques et mise en place d’un protocole de transfert d’embryons congelés chez la chienne Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, 11 octobre 2013 RESUME : Cette thèse d’exercice débute par une revue bibliographique contenant une synthèse des connaissances actuelles en biotechnologies de l’embryon chez les carnivores domestiques ainsi que les perspectives d’avenir dans ce domaine. Nous présentons d’abord un rappel des particularités physiologiques de la reproduction des carnivores domestiques ainsi que des enjeux de l’utilisation des biotechnologies de l’embryon. Nous faisons ensuite un état des lieux des savoir-faire actuels en biotechnologies de l’embryon chez les différents carnivores domestiques. En effet, si ces techniques sont bien maîtrisées chez certaines espèces, l’importante variabilité entre les espèces ne permet pas leur application chez d’autres espèces. Nous présentons ensuite la mise en place d’un protocole de récolte, de congélation/décongélation et de transfert d’embryons chez la chienne. Bien qu’aucune gestation n’ait été obtenue, l’analyse des données expérimentales nous permet de mettre en avant les points à améliorer dans l’avenir. MOTS CLES : - Carnivores domestiques - Techniques artificielles de la reproduction - Biotechnologie - Embryons - Cryoconservation JURY : Président : 1er Assesseur : 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur M. Berland Monsieur le Docteur S. Buff Monsieur le Professeur P. Guérin DATE DE SOUTENANCE : 11 octobre 2013 ADRESSE DE L’AUTEUR : 11 chemin du Mas 69210 Saint Pierre la Palud 107
