Apports des marqueurs moléculaires dans l`analyse des

Dossier
mt pédiatrie 2012 ; 15 (supplément 1) : 46-61
Apports des marqueurs moléculaires dans
l’analyse des mécanismes d’acquisition et
dans le suivi des infections nosocomiales
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The use of molecular markers for the analysis of initial infection and subsequent
monitoring of nosocomial infections
Philippe Bidet
Édouard Bingen
Université Paris Diderot - Paris-7,
Sorbonne Paris Cité,
Assistance publique des Hôpitaux de
Paris (AP-HP),
hôpital Robert-Debré,
service de microbiologie,
UFR de médecine,
48, boulevard Sérurier,
75019 Paris,
France
<[email protected]>
Résumé. L’investigation des cas d’infections nosocomiales s’apparente à une enquête policière, visant à retracer la diffusion d’une souche bactérienne épidémique au sein de
l’environnement hospitalier. Le laboratoire joue un rôle important dans ces enquêtes épidémiologiques grâce à l’analyse comparative des souches bactériennes par différentes méthodes
de typage. Du fait des nombreux inconvénients des marqueurs phénotypiques (biotypie, antibiotypie, sérotypage), des méthodes de typage moléculaire, analysant l’ADN lui-même, sont
préférentiellement utilisées. Ces méthodes de typage permettent de démontrer la transmission d’une même souche de patients à patients, de distinguer les récidives des réinfections,
d’identifier les voies de contaminations et de suivre la diffusion de clones au sein d’une
population.
Mots clés : génotypage, infection nosocomiale, PCR, AP-PCR, RAPD, REP-PCR, MLST, RFLP,
ribotypage, électrophorèse en champ pulsé
Abstract. The investigation of cases of nosocomial infections is similar to a police investigation,
in that the spread of a bacterial epidemic strain is traced within the hospital environment. The
laboratory plays an important role in these epidemiological studies involving comparative analysis of bacterial strains using different screening methods. Because of the many drawbacks of
phenotypic markers (biotyping, antibiotyping and serotyping), molecular screening methods,
analysing DNA itself, are promoted. These screening methods are used to demonstrate the
transmission of the same strain from patient to patient, to distinguish between recurrence and
re-infection, to identify the routes of contamination, and to track the spread of clones within
a population.
Key words: genotyping, nosocomial infection, PCR, AP-PCR, RAPD, REP-PCR, MLST, RFLP,
ribotyping, pulsed field gel electrophoresis
L
Tirés à part : P. Bidet
46
3 % chez l’enfant de plus de cinq
ans [1]. La survenue d’une infection
nosocomiale dans un service hospitalier exige une série d’investigations
afin de prévenir la survenue de nouveaux cas [2]. Sur le plan individuel,
il s’agira de déterminer la voie de
contamination du patient et, lors de
cas groupés, de déterminer s’il s’agit
d’une épidémie et d’en trouver la
source (figure 1) [3, 4]. Dans le cas
des infections bactériennes, les plus
fréquentes, les espèces en cause sont
principalement des staphylocoques,
des entérocoques et des bacilles à
Gram négatif. Ces espèces étant ubiquitaires, les voies de contaminations
peuvent être multiples : translocation
Pour citer cet article : Bidet P, Bingen É. Apports des marqueurs moléculaires dans l’analyse des mécanismes d’acquisition et dans le suivi des infections
nosocomiales. mt pédiatrie 2012 ; 15(supplément 1) : 46-61 doi:10.1684/mtp.2012.0451
doi:10.1684/mtp.2012.0451
mtp
e rôle du laboratoire de microbiologie dans un hôpital pédiatrique ne se limite pas seulement à
l’identification des germes responsables d’infections et à l’étude de
leur sensibilité aux antibiotiques. Son
activité de routine comporte également la surveillance des infections
nosocomiales. En effet, les infections
nosocomiales représentent une cause
importante de morbidité et de mortalité en milieu hospitalier pédiatrique.
Chez l’enfant, la fréquence des infections nosocomiales est inversement
corrélée avec l’âge. Elle est ainsi de
22 % chez le nouveau-né, de 11 %
chez l’enfant de moins de deux ans,
4 % entre deux et quatre ans et
E. coli
E. coli
Patient A
Patient B
Le même ?
Oui
Non
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Cas épidémiques
Cas sporadiques
non reliés
?
Source commune
Transmission croisée
Figure 1. Démarche d’investigation des cas groupés d’infections nosocomiales.
à partir de la flore digestive, contamination de dispositifs
médicaux (sondes, cathéters, solutions injectables), transmission manu-portée ou via l’environnement hospitalier
(eau, surfaces, matériel). La première étape de l’enquête
va donc s’attacher à retrouver l’espèce bactérienne en
cause dans les flores du patient et son environnement.
Cependant, ces espèces bactériennes étant fréquemment
isolées, tant comme pathogènes que comme commensaux
ou colonisateurs, la simple identité d’espèce ne permet
pas, à elle seule, de conclure sur la source de l’infection ou
l’existence d’une véritable épidémie. Il faudra démontrer
que les bactéries isolées appartiennent à un même clone,
c’est-à-dire qu’elles sont issues d’une bactérie-mère suffisamment proche dans le temps pour partager les mêmes
caractéristiques, liées à un même génome. Le laboratoire
doit donc aller plus loin que la simple identification de
l’espèce. Il doit être capable, au sein d’une même espèce
bactérienne, de distinguer plusieurs « types » présentant
des caractéristiques différentes grâce à des méthodes dites
de « typage ».
Cette capacité à différencier deux souches n’ayant aucun
lien épidémiologique, qui porte le nom de « pouvoir discriminant », est la caractéristique la plus importante de tout
système de typage. Il peut être calculé grâce à l’indice de
Hunter qui évalue la probabilité pour que deux souches
non reliées apparaissent différentes en utilisant la méthode
de typage. On comprend bien qu’une méthode de typage
qui ne classerait les isolats qu’en seulement deux ou trois
types différents serait trop peu discriminante et conduirait
à de fausses interprétations d’identités des souches analysées. Les autres qualités recherchées pour un système
de typage sont la typabilité ou la capacité de typage (la
méthode est applicable à toutes les souches d’une espèce),
la reproductibilité (obtention de résultats identiques pour
une même souche analysée plusieurs fois), l’universalité
ou la versatilité (la méthode peut être utilisée pour typer
plusieurs espèces bactériennes différentes avec le minimum de modification). Enfin, on privilégiera les méthodes
largement et facilement applicables (simples, rapides,
accessibles et peu coûteuses) et celles déjà validées en
situation pratique dans l’investigation épidémiologique.
Caractéristiques
d’un système de typage idéal
Les marqueurs phénotypiques
Un système de typage bactérien a donc pour but de
mettre en évidence des caractères variables au sein d’une
même espèce bactérienne (marqueurs épidémiologiques).
Les premiers outils dont dispose le laboratoire pour
répondre à cette question sont les caractères phénoty-
mt pédiatrie, vol. 15, supplément 1, novembre 2012
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Apports des marqueurs moléculaires
piques les plus simples : aspect des colonies sur milieu
de culture (pigmentation, opacité, mucosité), caractères
biochimiques et sensibilité aux antibiotiques. Mais ces
caractères de base sont pauvres et trompeurs. Pauvres, car
bien souvent peu variables au sein de l’espèce. Trompeurs,
car influencés par les traitements antibiotiques reçus par
le patient ou les conditions de culture de la bactérie.
Pour ne prendre que la sensibilité aux antibiotiques, qui
est couramment utilisée, car immédiatement disponible,
elle n’a de sens que pour un germe ayant acquis plusieurs mécanismes de résistance dont la combinaison est
peu fréquente. Mais, face à une bactérie présentant le
phénotype sauvage de sensibilité aux antibiotiques, cette
méthode n’est d’aucun secours. Et la prise d’antibiotique
par le patient peut parfois modifier le phénotype de résistance chez la bactérie qu’il héberge, alors qu’il s’agit
toujours du même clone. D’autres méthodes de typage
phénotypiques peuvent être utilisées : sérotypage (antigènes de surface déterminés par agglutination avec des
antisérums spécifiques), lysotypage (sensibilité aux bactériophages, virus spécifiques de clones bactériens formant
des plages de lyse sur les cultures). Le lysotypage est
actuellement réservé à des laboratoires de référence qui
seuls possèdent la collection de bactériophages adéquats.
Le sérotypage et le sérogroupage sont couramment utilisés pour typer les méningocoques, les salmonelles et
les shigelles. Des antisérums sont aussi à la disposition
des laboratoires pour certains sérogroupes de Escherichia
coli (antigène capsulaire K1 et antigènes somatiques des
E. coli entéropathogènes) et sérotypes de streptocoques
du groupe B. Pour les autres espèces bactériennes, la
possession d’une banque d’antisérums est l’affaire de laboratoires spécialisés. Cependant, le sérotypage classique
est parfois confronté à des biais liés soit à la lecture des
agglutinations, soit à la variabilité d’expression des antigènes par la bactérie selon les conditions de culture. On
voit donc que les méthodes phénotypiques, si elles ont
l’avantage de donner des résultats rapides, sont entachées
d’un grand nombre de biais et de limitations.
Ces limites ont amené les microbiologistes à développer des méthodes d’analyse directe de l’ADN génomique
bactérien (caractéristique de la bactérie) qui, lui, reste
stable, quelles que soient les conditions de culture et les
antibiothérapies utilisées. Comme le séquençage complet
du génome bactérien reste encore long et onéreux, les
méthodes de typage utilisées ne vont étudier que certaines régions du génome bactérien. On parlera alors
de marqueurs moléculaires caractérisant un génotype
bactérien.
Les méthodes de typage moléculaire
On peut classer les méthodes de génotypage en trois
catégories :
48
– les techniques de séquençage de l’ADN ;
– les techniques de restriction enzymatique ;
– les techniques d’amplification génique basées sur
la polymerase chain reaction (PCR).
Alors que les techniques de séquençage donnent,
comme résultat final, une séquence d’ADN sous la forme
d’une chaîne de caractères composés des quatre bases (A,
C, T et G), les autres techniques génèrent des fragments
d’ADN de tailles différentes que l’on fait migrer dans un
champ électrique (électrophorèse en gel d’agarose ou de
polyacrylamide) afin de les séparer en fonction de leurs
tailles. Le résultat final se présente alors sous la forme
d’un profil de bandes, semblable à un « code-barres »
que l’on va comparer à celui obtenu pour une autre
souche bactérienne (figure 2). Certaines techniques vont
analyser le génome dans sa globalité, ou pour être plus
précis, inspecter différents sites dispersés sur l’ensemble
du chromosome : c’est notamment le cas des techniques
de restriction enzymatique. D’autres, au contraire, cibleront seulement quelques gènes, ne donnant ainsi qu’une
vision partielle ou focale du génome bactérien. Cependant, dans tous les cas, si la méthode utilisée ne montre
aucune différence entre les souches analysées, il faudra toujours garder à l’esprit que des différences situées
ailleurs sur le génome, donc non étudiées, peuvent quand
même exister. C’est pour cette raison qu’il est généralement conseillé d’associer plusieurs méthodes de typage
afin d’augmenter la sensibilité et d’obtenir un résultat plus
fiable.
Techniques de séquençage de l’ADN
À défaut de pouvoir séquencer le génome complet
des bactéries, les techniques de génotypage basées sur le
séquençage de l’ADN génomique se limitent à l’analyse
d’un ou de plusieurs gènes présentant un polymorphisme
suffisant pour être exploitable. Ces gènes peuvent être des
gènes de virulence, des gènes codant des antigènes de
surface (on parle alors de sérotypage moléculaire) ou des
gènes dits « de ménage » codant des fonctions de base
de la cellule. Les séquences d’ADN obtenues pour un
même gène chez les différentes souches sont alignées et
comparées afin de repérer des mutations, des délétions
ou des insertions qui les différencieraient. La technique de multi-locus sequence typing (MLST) combine
le séquençage de plusieurs gènes de ménage (généralement sept) afin d’analyser l’évolution d’une espèce sur
une longue période de temps [5]. Cette méthode permet
de classer les souches en « sequence types » (ST), regroupés en groupes ou complexes clonaux, et est devenue la
méthode de référence pour les études phylogénétiques de
collections de souches [6]. Malgré leur grande fiabilité,
et les comparaisons interlaboratoires qu’elles permettent,
les méthodes de génotypage basées sur le séquençage
présentent plusieurs inconvénients qui limitent leur utilisa-
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ADN bactérien
PCR
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Restriction enzymatique
Fragments d’ADN
Séquençage des
produits de PCR
Séparation des fragments selon
leur taille par électrophorèse
-
+
s1
s2
s3
Comparaison des profils de bandes
s1
ACTGGTCATTGA
s2
ACTGGTCATTGA
s3
ACTG-TCATCGA
Comparaison des séquences
Figure 2. Principe général des méthodes de génotypage bactérien.
tion dans le typage des bactéries responsables d’infections
nosocomiales. Elles sont d’abord limitées à une seule
espèce bactérienne, ce qui oblige le laboratoire à changer de méthode pour chaque nouvelle espèce. Ce premier
inconvénient les confine à quelques laboratoires spécialisés effectuant des travaux de recherche sur l’espèce en
question. Elles n’étudient qu’une toute petite partie de
l’ensemble du génome bactérien. Aussi, si elles ne révèlent
aucune différence de séquence sur les gènes étudiés,
cela n’exclut pas que des différences importantes existent
ailleurs sur le génome des bactéries comparées, d’où un
pouvoir discriminant inférieur à celui d’autres méthodes
d’analyse globale du génome comme l’électrophorèse en
champ pulsé. Il existe cependant des cas où un gène peut
présenter un polymorphisme exploitable pour le typage
alors que les techniques d’analyse globale du génome ne
parviennent pas à différencier des souches non reliées,
notamment lorsqu’elles appartiennent à un clone de diffusion mondiale comme c’est le cas des streptocoques du
groupe A de sérotype M1 [7]. Dernier inconvénient de
ces techniques, elles restent encore onéreuses et d’accès
difficile pour beaucoup de laboratoires qui, obligés de
sous-traiter le séquençage proprement dit, n’obtiennent
de résultats que tardivement. Ces inconvénients limitent
donc, jusqu’à présent, l’utilisation de ces méthodes à des
laboratoires de recherche.
Techniques de restriction enzymatique
On appelle « enzyme de restriction » une enzyme
capable de couper l’ADN double brin en des sites spécifiques caractérisés par une séquence d’ADN de quatre à
huit bases. Ces séquences sont généralement des palindromes, c’est-à-dire que la séquence est identique sur
le brin sens et sur le brin antisens. Sur un ADN génomique, une enzyme de restriction va réaliser des coupures
à chaque fois que la séquence du site spécifique est reconnue. Le nombre de coupures varie donc selon les enzymes
et dépend de la fréquence avec laquelle le site reconnu est
présent. La taille et le nombre de fragments d’ADN obtenus après digestion sont donc un reflet de la séquence
globale du génome digéré. Ces fragments sont séparés
en fonction de leurs tailles par électrophorèse en gel
d’agarose. Après marquage de l’ADN par un agent intercalant fluorescent aux ultraviolets (bromure d’éthidium), on
obtient un profil de bandes, spécifique du génome digéré,
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Apports des marqueurs moléculaires
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- RFLP : coupures en nombreux fragments
- Ribotypage : hybridation des fragments codant pour l’ARNr 16S et 23S (sonde)
- Électrophorèse en champ pulsé : coupures en peu de fragments
Figure 3. Techniques basées sur la restriction enzymatique de l’ADN.
semblable à un « code-barres ». Les différents profils sont
comparés deux à deux et l’identité de profil entre deux
souches bactériennes permet de conclure à l’identité (ou
la très forte similitude) de leurs génomes donc à un lien
génétique entre les deux souches.
Cette technique simple et peu coûteuse, qui analyse le
polymorphisme de longueur des fragments de restriction
(restriction fragment length polymorphism [RFLP]), a, dans
un premier temps, utilisé des enzymes à haute fréquence
de site de coupure qui généraient un grand nombre de
fragments d’ADN sur un génome bactérien composé de
plusieurs millions de paires de bases [8]. Cela rendait donc
difficile la comparaison des profils du fait d’un nombre de
bandes trop important (> 1 000). Pour améliorer la lisibilité des profils, on a donc cherché à réduire le nombre
de bandes des profils, soit en ne rendant visibles que
certaines bandes par des techniques d’hybridation avec
sondes ADN (technique de Southern et ribotypage), soit en
diminuant le nombre de sites de coupure (électrophorèse
en champ pulsé) (figure 3).
Technique de Southern et ribotypage
La technique de Southern consiste à transférer, sur
une membrane de nylon, les fragments d’ADN obtenus
après restriction enzymatique et à les hybrider avec une
sonde ADN (ou ARN) marquée soit par un atome radioactif (sonde chaude), soit par une enzyme capable de
transformer un substrat en molécule colorée ou émettrice de lumière (sonde froide). On utilise généralement
un film radiographique pour révéler les fragments sur lesquels la sonde s’est fixée. La sonde ne se fixant que sur
les fragments d’ADN comportant la séquence complémentaire, il y aura autant de fragments rendus visibles
que de copies du gène reconnu par la sonde. Comme
de nombreuses espèces bactériennes possèdent plusieurs
copies des gènes des ARN ribosomaux (ARNr) sur leur
chromosome (par exemple, sept pour E. coli), l’ARNr marqué peut avantageusement servir de sonde. La technique
prend alors le nom de ribotypage [9]. Cette technique
a l’avantage d’être universelle car, les gènes des ARNr
ayant peu évolué au cours du temps, la sonde d’une
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espèce est capable de se fixer sur les fragments d’une
autre espèce proche. Les profils sont très faciles à lire et à
interpréter et peuvent être comparés d’un laboratoire à un
autre, sous réserve d’utiliser la même enzyme et la même
sonde. Elle a cependant l’inconvénient de comporter de
nombreuses étapes (digestion enzymatique, électrophorèse, transfert sur membrane de nylon, marquage de la
sonde, hybridation, lavages, révélation) qui retardent le
rendu des résultats (cinq jours) et nécessitent une bonne
connaissance pratique de toutes ces étapes, donc un personnel rompu à des techniques de biologie moléculaires
très spécialisées. Cet inconvénient fait qu’elle a été peu
à peu délaissée au profit de l’électrophorèse en champ
pulsé.
Technique d’électrophorèse en champ pulsé
Cette technique, souvent citée sous l’acronyme anglais
PFGE (pulsed field gel electrophoresis), est actuellement
considérée comme le gold standard en matière de génotypage bactérien [10]. Pour palier au problème de lisibilité
des profils de RFLP, le principe est de choisir une enzyme
qui coupe l’ADN génomique en très peu de sites (figure 4).
Il suffit, par exemple, de prendre une enzyme reconnaissant une séquence riche en C et G (exemple : l’enzyme
SmaI qui reconnaît et coupe la séquence « CCCGGG »)
pour digérer le génome d’une bactérie à faible pourcentage en G et C (par exemple : Staphylococcus aureus, 32 %
de G + C) où l’enzyme a peu de chance de rencontrer
son site de coupure. On obtient donc peu de fragments
(quelques dizaines) mais, du coup, des fragments de
très grande taille (centaines de kilobases). Comme ces
grands fragments seraient incapables de migrer dans une
électrophorèse standard, on utilise, pour leur séparation,
une cuve spéciale où le champ électrique va changer
d’orientation au cours du temps selon des pulses produits par un générateur programmable. Ce changement
d’orientation du champ électrique va permettre de dérouler les fragments qui seraient bloqués dans le maillage de
la matrice d’agarose. La séparation de ces grands fragments d’ADN prend du temps (plusieurs dizaines d’heures
selon les programmes) et expose le tampon de migration à une surchauffe qui ferait fondre le gel d’agarose.
Le dispositif inclut donc une pompe qui fait circuler le
tampon en permanence dans un bloc réfrigérant. Autre
contrainte de la technique, les bactéries doivent préalablement être incluses dans une matrice d’agarose (plug),
avant de subir la lyse de leur paroi et la digestion enzymatique de l’ADN, car la manipulation directe de leur
ADN à l’aide d’une pipette pourrait entraîner des cassures
mécaniques et donc des fragments de tailles aléatoires qui
interféreraient avec ceux produits par l’enzyme de restriction. Il en résulte que c’est une technique longue (quatre à
cinq jours) qui nécessite un matériel très spécialisé et onéreux. Seuls certains laboratoires de microbiologie peuvent
se permettre un tel investissement. Mais cette technique
comporte de grands avantages. Les profils obtenus sont
bien lisibles, parfaitement reproductibles, et le nombre de
bandes suffisamment important pour offrir un bon reflet de
l’ensemble du génome de la bactérie analysée. Une fois le
matériel acquis par le laboratoire, il peut être utilisé pour
le typage de n’importe quelle espèce bactérienne cultivable ; il suffit juste de changer d’enzyme de restriction et
de programme de migration. C’est donc une technique
universelle, très discriminante et très fiable. L’analyse
des profils de restriction avec plusieurs enzymes permet
d’accroître avantageusement son pouvoir discriminant et
d’affermir les conclusions. Toute épidémie d’importance
est généralement analysée avec cette technique. Cependant, ses contraintes et le délai de rendu des résultats font
qu’elle est souvent utilisée comme technique de confirmation, plutôt que comme technique de première ligne
en situation d’urgence.
Techniques d’amplification génique
basées sur la PCR
L’amplification génique par PCR consiste à amplifier
un segment d’ADN grâce à deux amorces choisies pour
l’encadrer et une polymérase thermostable, capable de
résister aux cycles de températures (95 ◦ C pour séparer les
brins d’ADN, 50 à 65 ◦ C pour fixer les amorces, 72 ◦ C pour
la polymérisation de l’ADN). La réaction a lieu dans un
appareil capable de faire varier la température en fonction
d’un programme préenregistré (thermocycleur). À chaque
cycle, on multiplie par deux le nombre de copies du segment d’ADN recherché, s’il était présent au départ. Après
30 cycles, on obtient en théorie 230 (109 ) copies, ce qui
rend sa visualisation possible sur une électrophorèse en
gel d’agarose. Développé en 1983 par Kary Mullis, la PCR
est désormais une technique courante, utilisée pour une
grande variété d’applications dans tous les domaines de
la biologie. L’avantage de la PCR est que la plupart des
laboratoires de microbiologie sont équipés du matériel
nécessaire à sa réalisation. C’est devenu une technique
peu coûteuse et rapide. Plusieurs méthodes ont été proposées pour l’adapter au typage des bactéries (figure 5) :
– les techniques de PCR multiplexe ;
– la technique de PCR-ribotypage ;
– les techniques de PCR de séquences répétées (enterobacterial repetitive intergenic consensus [ERIC]-PCR,
repetitive extragenic palindromic [REP]-PCR, multiplelocus VNTR analysis [MLVA]) ;
– les techniques de PCR aléatoire ou « random-PCR »
(arbitrarily primed PCR [AP-PCR], random amplified polymorphic DNA [RAPD]).
Techniques de PCR multiplexe
La PCR multiplexe consiste à combiner plusieurs
couples d’amorces (et donc, plusieurs recherches de segments d’ADN différents) dans une même réaction. On
choisit alors les amorces de façon à ce que les segments
mt pédiatrie, vol. 15, supplément 1, novembre 2012
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Apports des marqueurs moléculaires
A-Préparation des échantillons, digestion enzymatique de l’ADN (3 jours)
Culture en
bouillon
J2
Lysozyme + PK :
J1
Moule « Plug »
J3
lyse des bactéries
dans le « plug »
Enzyme Sma I
5’-CCC GGG-3’
5’-CCCGGG-3’
3’-GGG CCC-5’
3’-GGGCCC-5’
Enzyme de restriction :
digestion de l’ADN
J4
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Agarose
fondu
Insertion des plugs
dans un gel d’agarose
B-Électrophorèse en champ pulsé (15 à 30 h), séparation des fragments d’ADN
Pompe
14°C
Bloc
réfrigérant
-
Générateur
programmable
Cuve
+-
A-
+
-
B-
+
120°
α? ==120°
B+
Déroulement des gros fragments d’ADN par
réorientation du champ électrique
A+
C-Acquisition de l’image, comparaison des profils
1
2
3
4
5
6
Marquage de l’ADN par le BET
(agent intercalant fluorescent)
Photographie du gel sur table à UV
Bain de BET
Table à UV
Photographie du gel marqué au BET
Souches 1,2 et 3 : profils identiques (souches clonales)
Souches 4 et 5 : profils proches (souches potentiellement reliées)
Souches 1, 4 et 6 : profils différents (souches non reliées)
Figure 4. Étapes de la technique d’électrophorèse en champ pulsé.
52
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REP
REP
- REP-PCR : amplification de régions situées entre 2 séquences REP
ARNr 16 S
RIG
ARNr 23 S
- PCR-ribotypage : amplification de la région variable entre les gènes d’ARNr 16S et 23S
- AP-PCR / RAPD : fixation aléatoire de l’amorce de PCR
Figure 5. Techniques d’amplification génique basées sur la polymerase chain reaction (PCR).
d’ADN recherchés soient de tailles suffisamment différentes pour être bien séparés lors de l’électrophorèse en
gel d’agarose. Pour utiliser cette méthode comme outil
de typage bactérien, il faut choisir comme cibles recherchées des gènes dont la présence peut varier d’une souche
à une autre. Ces gènes peuvent être des gènes de virulence, des gènes de résistance aux antibiotiques, des gènes
codant des antigènes de surface ou bien des séquences
non codantes comme les séquences d’insertion (IS) [1113]. Une variante de cette méthode est la PCR-single
nucleotid polymorphism (SNP), qui choisit des amorces
sur des mutations différenciant des allèles de gènes (si
la mutation est présente, il n’y a pas d’amplification et
donc disparition de la bande) [14]. Le problème de ces
méthodes est que les gènes étant choisis pour une espèce
bactérienne donnée, la méthode n’est utilisable que pour
cette espèce et pas pour une autre. De plus, le pouvoir
discriminant dépend du nombre de cibles recherchées et
de leur fréquence, or les contraintes techniques limitent
le nombre de cibles à environ une dizaine, au maximum.
mt pédiatrie, vol. 15, supplément 1, novembre 2012
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Apports des marqueurs moléculaires
Ces techniques sont donc reproductibles (car basées sur la
recherche de gènes spécifiques), mais peu discriminantes
et limitées à une seule espèce, ce qui les confine le plus
souvent à des laboratoires spécialisés.
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Technique de PCR-ribotypage
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Cette technique ne doit pas être confondue avec le
ribotypage, autre technique de typage qui a été décrite
précédemment. Elle utilise le polymorphisme de longueur
d’une séquence d’ADN séparant les gènes des ARNr 16S et
23S. Chez certaines espèces appartenant aux genres Clostridium et Bacillus, cette séquence varie suffisamment en
taille pour qu’en choisissant une amorce dans le gène de
l’ARNr 16S et une autre dans le gène de l’ARNr 23S, les
produits d’amplification des différentes copies présentes
sur le chromosome de la bactérie puissent être séparés par
l’électrophorèse. Cette technique n’est utilisée, en biologie médicale, que pour typer l’espèce Clostridium difficile
[15]. Ce n’est donc pas une technique universelle.
Techniques de PCR de séquences répétées (ERIC-PCR, REP-PCR,
MLVA)
L’ADN bactérien comporte toute une série de
séquences répétées non codantes, longues de plusieurs
dizaines de paires de bases, qui sont dispersées sur
le génome. Certaines sont spécifiques d’une famille de
bactéries comme les séquences ERIC, retrouvées chez
les entérobactéries. D’autres sont ubiquitaires, comme
les séquences REP [16]. Ces séquences REP sont présentes en grand nombre sur le chromosome de la plupart
des espèces bactériennes (∼ 1 000 copies chez E. coli).
Deux amorces, définies à chacune des deux extrémités
5 des séquences REP vont s’hybrider dans des conditions de forte stringence (hybridation spécifique avec une
séquence complémentaire homologue) puis l’extension
par la polymérase va se poursuivre jusqu’à la séquence
REP suivante si la distance entre les deux n’excède pas
5 000 paires de bases. Comme la distance entre deux
séquences REP peut varier d’une souche à une autre,
les produits d’amplification générés seront spécifiques de
cette souche ou du clone auquel elle appartient et vont
pouvoir être séparés par électrophorèse donnant alors un
profil de bandes d’ADN caractéristique de cette souche ou
de ce clone. Cette technique a été décrite pour la première
fois par Versalovic et al. en 1991 et a depuis été utilisée
pour le typage de nombreuses espèces bactériennes [16].
L’avantage de cette technique est de donner des résultats
rapides. Cependant, les séquences répétées pouvant parfois subir des mutations qui gênent la fixation des amorces,
l’amplification du segment d’ADN qu’elles encadrent peut
échouer, surtout si la distance entre les deux séquences
répétées dépasse les 1 000 paires de bases. Il en résulte
que des bandes peuvent apparaître ou disparaître lorsque
l’on refait la PCR sur la même souche. Cette labilité des
profils entre deux PCR, liées à d’infimes variations dans
l’exécution de la technique est, bien sûr, très embarras-
sante pour la comparaison des souches. Afin de palier
à ce problème, des systèmes standardisés sous forme de
kits prêts à l’emploi sont actuellement commercialisés
(DiversiLabTM , Biomérieux). La migration des fragments
d’ADN amplifiés n’y est pas effectuée sur gel d’agarose
mais dans une puce par microcapillarité avec intégration
de l’électrophorégramme par un automate qui normalise
les électrophorèses en fonction d’un standard interne. Ce
système permet d’améliorer la reproductibilité des profils
et, donc, la fiabilité de la méthode. L’inconvénient est le
coût élevé du matériel (automate, puces et kits commerciaux). Cependant, les résultats sont obtenus en 48 heures,
avec possibilité de les comparer à une banque de donnée
de profils.
La technique MLVA utilise le polymorphisme de
séquences répétées en tandem (variable number tandem
repeat [VNTR]), présentes, en nombre variable, en différents sites du chromosome des bactéries [17]. Cette
technique a été développée par certaines équipes avec
succès. Elle reste cependant encore confinée aux laboratoires qui en ont l’expérience pour une espèce bactérienne
particulière [18].
Techniques de PCR aléatoire ou « random-PCR » (AP-PCR, RAPD)
Il y a quelque chose de déroutant dans la technique
de « random-PCR » (PCR aléatoire), qui prend le contrepied de toutes les règles normalement suivies pour une
PCR diagnostique. Dans une PCR classique, on choisit
deux amorces d’une taille suffisante (20 à 30 paires de
bases) pour que leurs séquences soient spécifiques de la
cible recherchée et l’on fixe des conditions stringentes
(température supérieure à 50 ◦ C) pour que les amorces
ne s’hybrident que sur des séquences parfaitement homologues. Dans la PCR aléatoire, on fait tout le contraire.
L’amorce unique ne comporte qu’une dizaine de bases et
elle est utilisée à une température d’hybridation très basse
(entre 30 et 40 ◦ C). Dans ces conditions de faible stringence, cette petite amorce va être capable de se fixer un
peu n’importe où sur le génome de la bactérie, si elle rencontre une séquence ressemblant un tant soit peu à sa
séquence complémentaire. Si deux amorces se fixent sur
les deux brins d’ADN à une distance suffisamment courte
(moins de 5 000 paires de bases), une amplification va se
produire. Du fait de la fixation au hasard, sur une multitude de sites du génome de la bactérie, on obtient un grand
nombre de produits d’amplification et, donc, de bandes de
tailles différentes sur gel d’agarose. Il existe deux variantes
de cette technique selon la longueur de l’amorce utilisée,
portant les noms de RAPD et AP-PCR [19, 20]. La technique ressemble donc à celle de la REP-PCR, sauf que,
dans la PCR aléatoire, la cible sur laquelle se fixe l’amorce
est inconnue. Mais peu importe, du moment qu’on obtient
des bandes qui reflètent, plus ou moins bien, la séquence
globale du génome. . . On voit bien qu’une telle méthode
comporte, plus encore que la REP-PCR, un risque impor-
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tant de non-reproductibilité des profils. La règle est de
toujours analyser l’ensemble des souches bactériennes au
cours d’une seule et même série afin de s’affranchir des
variations techniques. L’analyse des profils obtenus doit se
faire avec prudence en incluant dans la série des souches
témoins sans lien épidémiologique avec les souches analysées. Il peut être aussi utile de passer chaque souche
en double afin de repérer les bandes reproductibles et
de baser l’analyse uniquement sur celles-ci. En conclusion, malgré de gros problèmes de reproductibilité, cette
technique simple et peu coûteuse constitue un excellent
moyen de débrouiller rapidement un problème urgent (en
moins de 48 heures), sous réserve de s’entourer des précautions méthodologiques que nous avons exposées et de
confirmer, plus tard, les résultats par une technique plus
fiable.
Nouvelles techniques de typage
De nouvelles techniques basées sur la digestion
enzymatique (cartographie optique de l’ADN), la PCR
(PCR-high resolution melting analysis [HRM]), les puces
à ADN ou la spectrométrie (spectrométrie de masse et
spectroscopie Raman) sont actuellement en développement dans le domaine du typage bactérien et pourront
peut-être s’ajouter à l’arsenal actuel.
La méthode de cartographie optique par peignage
moléculaire de l’ADN est une technique basée sur le
même principe que l’électrophorèse en champ pulsé
(digestion de l’ADN génomique en grands fragments)
mais sans migration, avec observation microspopique des
brins d’ADN digérés. Couplée à l’analyse de la séquence
complète d’une souche de référence, elle permet la
reconstitution d’une carte du génome de la bactérie analysée. On se rapproche donc ici du séquençage complet.
Cette technique complexe et limitée à des laboratoires très
spécialisés permet de repérer d’infimes variations entre
deux génomes très proches. Elle peut donc s’avérer utile
pour comparer des souches de bactéries connues pour être
clonales, comme les E. coli entérohémorragiques de sérotype O157 : H7 ou certaines shigelles, pour lesquels les
autres techniques sont parfois en échec [21, 22].
La PCR-HRM consiste à amplifier un gène sujet à
des variations alléliques par une technique de PCR en
temps réel avec marqueur fluorescent de l’ADN double
brin (Sybr-green ou autre), puis à analyser la forme de la
courbe de dissociation des brins de l’ADN amplifié en
fonction de la température. Les différents allèles présenteront des courbes différentes, ce qui permet de classer les
souches en groupes alléliques [23]. Il est donc possible
d’utiliser cette technique pour différencier les allèles des
gènes de la méthode MLST que nous avons décrite précédemment. L’avantage est un gain de temps et d’argent
puisqu’il n’est plus nécessaire, alors, de séquencer les
produits d’amplification. Cette technique, promise à un
bel avenir, comporte cependant toujours, comme les PCR
multiplexes et PCR-SNP, l’inconvénient d’être dédiée à
une seule espèce. Il en est de même pour la technique des
puces à ADN. Cette technique consiste à hybrider l’ADN
total d’une bactérie ou des produits de PCR avec plusieurs centaines de sondes représentant différents gènes
de l’espèce étudiée [24, 25]. Cette technique, qui démultiplie les cibles recherchées par rapport à la PCR multiplexe,
nécessite cependant un matériel spécialisé qui, jusqu’à
présent, n’est disponible que dans quelques laboratoires
de recherche.
La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF
(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight),
qui permet l’analyse des protéines ionisées en fonction
de leur temps de vol (donc de leur masse) a été récemment appliquée à la bactériologie. Le spectre obtenu
après ionisation des protéines cellulaires par une matrice
contient certains pics spécifiques d’espèces permettant
l’identification rapide des colonies bactériennes sur milieu
de culture. Plusieurs équipes ont adapté cette technique
au typage bactérien, en analysant d’autres pics du spectre,
spécifiques de clones ou de groupes clonaux [26, 27].
Cette méthode de typage, qui donnerait des résultats très
rapides, va probablement se développer au fur et à mesure
que les spectromètres de masse se généraliseront dans les
laboratoires de bactériologie.
La spectroscopie Raman est une méthode non
destructive, permettant de caractériser la composition
moléculaire et la structure d’un matériau. La méthode
consiste à focaliser un faisceau laser sur l’échantillon à
étudier et à analyser la lumière diffusée sous forme d’un
spectre. Plusieurs études ont montré l’efficacité de cette
méthode pour le typage bactérien [28]. Cette méthode
reste pour l’instant du domaine de la recherche du fait
de son appareillage spécialisé.
Stratégie d’utilisation
des méthodes de typage
Comme nous l’avons vu précédemment, les méthodes
de typage bactérien sont très nombreuses et le choix
de l’une ou l’autre pour analyser une infection nosocomiale ou une épidémie va dépendre de plusieurs éléments
(tableau 1) :
– le degré d’urgence du résultat attendu ;
– l’espèce bactérienne en cause ;
– la disponibilité des techniques et l’expérience du
laboratoire ;
– le degré de discrimination nécessaire ;
– le coût économique.
Dans un premier temps, les méthodes phénotypiques
de bases (profil biochimique, antibiotype, sérotypage s’il
est accessible) seront utilisées, en restant prudent dans leur
interprétation.
mt pédiatrie, vol. 15, supplément 1, novembre 2012
55
Apports des marqueurs moléculaires
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Tableau 1. Tableau comparatif des principales techniques de génotypage.
56
Technique
Universelle
Pouvoir
discriminant
Reproductibilité
Analyse globale/
ciblée du génome
Délai (jours) Coût (D /souche)
après culture
Séquençage
complet
Oui
Maximal
Parfaite
Globale
> 30
Très élevé > 5 000 D
Puce à ADN
Non
Bon
Bonne
Ciblée
1- +
Élevé
> 100 D + équipement
Séquençage
d’un gène
Non
Faible ou moyen Parfaite
(selon le gène)
Ciblée
2- +
Moyen 10-20 D
MLST
Non
Bon
Parfaite
Ciblée
2- +
Élevé > 50 D
RFLP
Oui
Moyen
Moyenne
Globale
2
Faible < 10 D
Ribotypagea
Oui
Bon
Très bonne
Intermédiaire
3- +
Moyen
10-20 D + équipement
Électrophorèse
en champ pulsé
(PFGE)a
Oui
Très bon
Très bonne
Globale
3- +
Moyen
10-20 D + équipement
PCR multiplexe
Non
Moyen (selon les Très bonne
gènes)
Ciblée
1
Faible < 10 D
PCR-ribotypagea
Non
Bon (pour
Clostridium
difficile)
Bonne
Ciblée
1
Faible < 10 D
REP-PCRa
Par groupes
de germes
Moyen
Moyenne à bonne Globale
(si kits)
1-2
Élevé (si kits)
> 50 D + équipement
Moyen
Médiocre
1
Faible < 10 D
Oui
PCR aléatoirea
(AP-PCR, RAPD)
Globale
MLST : multi-locus sequence typing ; RFLP : restriction fragment length polymorphism ; PFGE : pulsed field gel electrophoresis ; REP : repetitive
extragenic palindromic ; PCR : polymerase chain reaction ; AP-PCR : arbitrarily primed PCR ; RAPD : random amplified polymorphic DNA.
Les coûts sont donnés à titre indicatif, ne prennent pas en compte le coût en personnel et de l’équipement et varient selon le nombre de
souches analysées en même temps. Les délais ne tiennent pas compte du transport des souches jusqu’au laboratoire, du dessouchage, ni de la
disponibilité du personnel apte à effectuer la technique.
a
Techniques les plus utilisées pour le typage de souches d’infections nosocomiales.
Les techniques de génotypage par PCR, qui donnent
des résultats rapides, seront privilégiées dans les situations où une réponse urgente est attendue. Le choix de
la technique dépendra de l’expérience du laboratoire et
de l’espèce bactérienne. Les deux techniques universelles
les plus utilisées sont la PCR aléatoire (AP-PCR ou RAPD)
et la REP-PCR.
Selon la bactérie en cause, on pourra faire appel à
un laboratoire d’expertise (laboratoire de recherche travaillant sur cette bactérie, Centre national de référence),
qui disposera de méthode de sérotypage ou de PCR spécifiques adaptées.
Enfin, si ces méthodes n’ont pas permis d’exclure une
parenté entre les souches étudiées, on fera appel à des
méthodes de génotypage plus fastidieuses mais très fiables
et très discriminantes, au premier rang desquelles vient
l’électrophorèse en champ pulsé.
Dans tous les cas, le laboratoire exécutant doit inclure,
dans la comparaison des souches à analyser, des souches
témoins appartenant à la même espèce mais sans lien
épidémiologique avec les souches étudiées. En effet, si
ces souches témoins se révélaient indifférenciables avec
la technique utilisée, cela démontrerait un défaut de discrimination de la technique pour l’espèce étudiée et les
résultats seraient donc ininterprétables.
Exemples d’utilisation
des marqueurs moléculaires
dans les infections nosocomiales
Les marqueurs moléculaires trouvent de nombreuses
applications dans le cadre des infections nosocomiales.
Ils peuvent aider à confirmer une infection, reconnaître
mt pédiatrie, vol. 15, supplément 1, novembre 2012
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une épidémie, mettre en évidence une transmission croisée, reconnaître la source de l’infection et distinguer les
rechutes des réinfections en cas d’infections récidivantes
avec une même espèce bactérienne.
cathéter central en comparant les souches des hémocultures à celles isolées au niveau du cathéter (lumière,
pavillon ou point d’insertion) et dans les flores du patient
(figure 6).
Confirmer une infection
Les cathéters veineux centraux sont le principal facteur de risque d’infections nosocomiales chez les enfants,
notamment chez les nouveau-nés et les immunodéprimés,
et les staphylocoques à coagulase négative, le principal agent pathogène en cause. Mais les staphylocoques
à coagulase négative sont fréquemment isolés à partir
d’hémocultures, où ils peuvent être seulement un contaminant. Déterminer si l’isolement d’un staphylocoque
à coagulase négative représente une vraie bactériémie
est donc parfois difficile. Dans ce contexte, l’isolement
répété de la même souche est un critère d’incrimination.
Dans la plupart des cas, l’antibiotype (antibiogramme)
et le biotype permettent de conclure avec suffisamment
de confiance. Cependant, dans certains cas difficiles à
interpréter, l’utilisation de méthodes de génotypage permet de résoudre le problème en démontrant l’identité
des bactéries isolées sur le plan génétique [29]. Les
marqueurs moléculaires peuvent aussi, dans ce cadre,
être utilisés pour distinguer entre bactériémie d’origine
endogène et bactériémie liée à une contamination du
Distinguer les rechutes des réinfections
en cas d’infections récidivantes
Les cas d’infections récidivantes avec une même
espèce bactérienne doivent être interprétés différemment
selon qu’ils sont liés à la même souche ou à une autre
souche non reliée sur le plan génétique [30]. En effet, dans
le premier cas, la rechute, donc un défaut d’éradication,
il s’agit d’un échec du traitement antibiotique. La cause
peut en être une résistance méconnue, une posologie
ou une durée insuffisante, une pharmacocinétique anormale ou un problème de diffusion de l’antibiotique au site
infectieux. Il importe alors de modifier le traitement et de
vérifier son efficacité par des dosages adéquats. Dans le
second cas, la réinfection, le traitement n’est pas en cause.
Ce peut être lié à une susceptibilité de l’hôte à l’infection
comme un déficit du système immunitaire (défaut de
vaccination, immunodépression) ou une anomalie anatomique ou physiologique favorisant l’infection, comme
le reflux vésico-urétéral dans les infections urinaires
ou une brèche méningée dans les méningites récidivantes à Haemophilus ou pneumocoque [31-33]. Dans
Diversilab v3.3
PC
# 178
Souche Origine
86 88 90 92 94 96 98 100
Profile REP
1
Patient 1
2
Patient A, non relié
3
Patient 1
Sang
15/08/2007
3
4
Patient 1
Sang
17/08/2007
3
5
Patient 1
Cathéter 18/08/2007
3
6
Patient B, non relié
Fèces
15/08/2007
1
2
é
4
REP-PCR (DiversiLab™ Biomérieux)
% Similarité
Figure 6. Bactériémie à Enterococcus faecalis liée à une contamination d’un cathéter central : analyse des souches par repetitive extragenic
palindromic (REP)-polymerase chain reaction (PCR). Souche 1 : E. faecalis de portage dans la flore digestive du patient ; souches 3 et 4 :
souches isolées des hémocultures du patient ; souche 5 : souche isolée du cathéter du patient ; souches 2 et 6 : souches témoins, non
reliées à l’épisode analysé. La souche isolée du cathéter est semblable à celle de la bactériémie alors qu’elle diffère de celle du portage
digestif. La bactériémie n’est donc pas d’origine endogène mais liée à une contamination du cathéter central.
mt pédiatrie, vol. 15, supplément 1, novembre 2012
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Apports des marqueurs moléculaires
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les cas d’infections nosocomiales sur terrains fragilisés, où
immunodépression et multirésistance sont souvent associées, les marqueurs moléculaires permettent de trancher
entre ces deux hypothèses.
Reconnaître ou infirmer une épidémie
Lorsqu’on assiste à une augmentation de l’incidence
de cas d’infections avec une même espèce bactérienne
dans un service, il est crucial de savoir s’il s’agit d’une
véritable épidémie, liée à la diffusion d’une même souche,
ou d’une accumulation de cas sporadiques liée au hasard.
L’utilisation des marqueurs phénotypiques et notamment
de l’antibiotype peut parfois induire en erreur. Une
augmentation du nombre d’infections à entérobactéries
résistantes aux céphalosporines de troisième génération
(C3G) peut être liée à des changements dans l’utilisation
des antibiotiques au sein du service et ne pas refléter
l’émergence d’une souche épidémique. L’utilisation des
marqueurs moléculaires pour comparer les souches permettra de trancher. Ainsi, la survenue de six septicémies,
d’une chorioamniotite et d’une infection urinaire à Enterobacter cloacae résistant aux C3G chez neuf patients
de trois services contigus de l’hôpital Robert-Debré sur
une période de quatre mois avait entraîné un isolement
des patients en 1991. Toutes ces souches avaient le
même biotype et le même antibiotype, caractérisé par
l’hyperproduction d’une céphalosporinase, ce qui avait
fait craindre, à l’époque, la survenue de contaminations
croisées. Le ribotypage avait permis de montrer que les
souches n’avaient pas de liens sur le plan génétique [8].
En effet, de telles souches émergent naturellement, par
sélection de mutants, dans la flore des patients traités
par C3G. Plus récemment, la survenue de cas groupés de pullulation digestive de Klebsiella pneumoniae
chez des nouveau-nés en réanimation néonatale avait
fait craindre l’existence de contaminations nosocomiales.
L’analyse des souches par REP-PCR en 48 heures, confirmée par électrophorèse en champ pulsé, démontra que
ces souches n’avaient aucun lien entre elles (figure 7). De
nouveau, c’était l’antibiothérapie qui était seule responsable de ces pullulations : tous ces nouveau-nés avaient
reçu de l’amoxicilline.
Démontrer ou infirmer l’existence d’une épidémie
peut avoir comme conséquence ultime la décision de fermer un service [34]. Il est donc crucial d’utiliser plusieurs
approches afin d’être certain de l’identité ou de la différence des souches.
Origine de la contamination :
source commune ou transmission croisée ?
Lorsque l’identité des isolats sur le plan génétique est
prouvée, confirmant l’existence d’une épidémie dans un
service, la seconde question à laquelle le médecin doit
répondre est l’origine de la contamination. Le risque de
transmission croisée est particulièrement important dans
le cas des agents infectieux à transmission aérienne : virus
M
Diversilab v3.3
PC
# 179
Souche Patient
1
1
2
3
4
5
6
7
8
M
Profile REP Profile ECP
Patient 2
1
1
2
Patient 1
2
2
3
Patient 3
3
3
4
Patient 4
4
4
5
Patient 5
5
5
6
Patient 6
6
6
7
Patient non relié 7 7
7
8
Patient non relié 7 8
8
65 70 75 80 85 90 95 100
% Similarité
REP-PCR (DiversiLab™ Biomérieux)
Électrophorèse en champ pulsé (ECP)
Figure 7. Cas groupés de pullulation digestive de Klebsiella pneumoniae chez des nouveau-nés en réanimation néonatale : analyse des
souches par repetitive extragenic palindromic (REP)-polymerase chain reaction (PCR) et électrophorèse en champ pulsé. M : marqueur
(ou « échelle ») de poids moléculaires ; 1 à 6 : six nouveau-nés colonisés par K. pneumoniae ; 7 et 8 : souches témoins, non reliées à
l’épisode analysé. Toutes les souches présentent des profils différents excluant l’hypothèse épidémique.
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SITE OP.
SITE OP.
NEZ
C
SITE OP.
NEZ
B
SITE OP.
NEZ
A
Figure 8. Infections postopératoires (scolioses) à Staphylococcus
aureus : analyse des souches par random amplified polymorphic
DNA (RAPD) (polymerase chain reaction [PCR] aléatoire). Les profils des souches des patients (A, B et C) sont différents (absence
de transmission croisée) mais, pour chaque patient, la souche de
l’infection est identique à celle du portage nasal.
respiratoires, tuberculose, coqueluche, streptocoque du
groupe A dans une maternité. Il en est de même pour
l’acquisition de germes multirésistants tels que S. aureus
résistant à la méthicilline (SARM), les entérocoques résistants à la vancomycine (ERV) et les entérobactéries
productrices de ␤-lactamases à spectre étendu (EBLSE)
ou de carbapénèmases. Dans tous ces cas, l’utilisation
des méthodes de typage permet de suivre le processus
de transmission et, une fois l’historique des transmissions
reconstitué, de prendre les mesures d’hygiène adaptées
afin de prévenir la survenue de cas secondaires [35, 36].
Même lorsque l’existence d’une épidémie est infirmée, les méthodes de typage sont utiles pour comprendre
le mécanisme d’acquisition des infections nosocomiales.
Ainsi, lors d’une augmentation des cas d’infections postopératoires de scoliose à S. aureus dans un service de
chirurgie orthopédique en 1996, il avait été démontré,
grâce à la technique de PCR aléatoire, que les souches
des patients étaient toutes différentes, excluant un problème de transmission croisée, mais que chaque patient
s’infectait avec sa propre souche de portage (écouvillon
nasal) (figure 8). Le problème était lié à désinfection insuffisante du site opératoire avant l’opération.
Dans le cas où une source commune est suspectée,
notamment dans les infections à bacilles à Gram négatifs
non fermentaires à tropisme hydrique, comme les genres
Pseudomonas, Burkholderia, Ralstonia ou Stenotrophomonas, il conviendra de rechercher la bactérie incriminée
dans l’eau, les produits perfusés, les flores des patients
(oropharyngées, cutanées et digestives) et même les antiseptiques. L’enquête doit être la plus minutieuse possible
du fait du caractère ubiquitaire des infections. Ainsi, au
cours de l’hiver 2001 à 2002, huit septicémies à Burkholderia cepacia chez des enfants porteurs d’un cathéter
central pour nutrition parentérale exclusive sont survenues dans deux services de l’hôpital Robert-Debré sur une
période de sept mois. La recherche de la bactérie dans
tous les prélèvements réalisés par le service d’hygiène hospitalière (points d’eau, surfaces, matériel, antiseptiques,
produits perfusés, flores des enfants) était négative. Le
recoupement de l’ensemble des produits perfusés au cours
de l’enquête épidémiologique révélait cependant un point
commun aux huit patients : la perfusion d’émulsions lipidiques qui pourtant étaient négatives en culture. Il fallut
l’œil attentif de l’hygiéniste pour repérer la présence d’une
petite goutte de condensation sous l’opercule plastique
recouvrant le bouchon. Sa mise en culture révéla qu’elle
était contaminée avec une grande quantité de B. cepacia.
L’analyse des souches d’hémocultures et de celle de l’eau
de condensation par ribotypage confirmait que l’on avait
bien affaire à la même souche (figure 9). L’enquête se
T
MII
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
Figure 9. Bactériémies à Burkholderia cepacia liées à des perfusions d’intralipides : analyse des souches par ribotypage. MII :
marqueur (ou « échelle ») de poids moléculaires ; A à F : souches
des patients (hémocultures) ; G et H : souches isolées sur le bouchon de flacons d’intralipides ; I à K : souches témoins, non reliées
à l’épisode analysé. Les profils des souches des patients sont identiques entre elles (épidémie confirmée) et à ceux des souches
retrouvées sur les bouchons des flacons (origine de la contamination). Les souches témoins présentent des profils différents, ce
qui valide les conclusions.
mt pédiatrie, vol. 15, supplément 1, novembre 2012
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Apports des marqueurs moléculaires
60
poursuivit jusque chez le fabriquant qui approvisionnait
toute l’Europe. La bactérie fut finalement retrouvée dans
l’eau de refroidissement des flacons après leur autoclavage
dans l’usine. À l’hôpital, la contamination était associée
à un temps insuffisant d’application de l’antiseptique sur
le bouchon, avant de prélever l’émulsion du flacon à
l’aiguille [37]. Cette histoire complexe montre bien que
l’enquête d’hygiène préalable est fondamentale et que les
marqueurs moléculaires interviennent dans un deuxième
temps pour confirmer ou infirmer les hypothèses, de la
même manière que, dans une enquête policière, l’analyse
des traces d’ADN permet de confondre ou de disculper un
suspect.
cliniques et d’environnement hospitalier nécessaires à
l’élucidation des mécanismes d’acquisition. Les méthodes
de typage complètent donc l’enquête épidémiologique
mais ne se substituent en aucun cas à elle.
Conflits d’intérêts : Aucun.
Références
1. Ford-Jones EL, Mindorff CM, Langley JM, et al. Epidemiologic
study of 4684 hospital-acquired infections in pediatric patients.
Pediatr Infect Dis J 1989 ; 8 : 668-75.
2. Aujard Y, Rajguru M, Bingen E. Infections nosocomiales en pédiatrie – problèmes et perspectives. Pathol Biol (Paris) 2000 ; 48 : 909-20.
Conclusion
La prévention des cas secondaires, lors de la survenue de cas groupés d’infections nosocomiales, nécessite,
d’une part, de confirmer l’existence d’une épidémie liée
à une même souche et, d’autre part, de déterminer la
voie de contamination afin de prendre les mesures préventives adaptées. Les nombreuses méthodes de typage
développées au cours des 20 dernières années permettent
de répondre à ces questions avec un degré de confiance
tout à fait satisfaisant. Le choix de la méthode à utiliser
dépend du degré d’urgence de la réponse attendue, de
l’espèce bactérienne en cause, de l’expérience du laboratoire qui effectuera le typage. Si certaines techniques
sont limitées à une seule espèce bactérienne, d’autres sont
dites « universelles » car utilisables pour typer n’importe
quelle espèce cultivable. Les plus utilisées sont, en premier lieu, les techniques de PCR qui ont l’avantage de la
rapidité. Jusqu’à récemment, la plus utilisée était la technique de PCR aléatoire (AP-PCR et RAPD) qui est d’un
grand secours dans les situations d’urgence mais dont les
résultats sont parfois difficiles à interpréter du fait d’une
mauvaise reproductibilité. Cette technique est en cours
de remplacement par la REP-PCR semi-automatisée, disponible sous forme de kits commercialisés, et qui donne
des résultats fiables et rapides. Enfin, les laboratoires
spécialisés utilisent comme technique de confirmation
l’électrophorèse en champ pulsé qui combine un grand
pouvoir discriminant et une reproductibilité parfaite. Les
qualités de cette dernière technique en font la méthode
de référence dans le domaine du typage bactérien. Il
convient cependant de combiner plusieurs techniques
afin de confirmer les résultats obtenus et, si besoin, de
faire appel à un laboratoire de référence pour certaines
espèces bactériennes plus rarement impliquées dans les
infections nosocomiales (mycobactéries, bordetelles. . .).
Dans tous les cas, l’analyse des marqueurs moléculaires
vient dans un deuxième temps pour confirmer ou infirmer
les hypothèses émises au cours de l’enquête épidémiologique. Il faudra donc d’abord réaliser tous les prélèvements
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