Génie génétique
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Génie génétique Participez à la recherche sur l’athérosclérose Atelier d’expérimentationMacròfag PROTOCOLE Génie génétique À la recherche d’une cible pour le traitement de l’athérosclérose Introduction La recherche biomédicale comprend l’étude des processus physiques et chimiques se produisant au sein des êtres vivants, ainsi que des processus déclenchant les maladies. L’un des principaux objectifs de ce domaine de recherche est d’identifier des cibles thérapeutiques, c’est-à-dire des parties de l’organisme vers lesquelles diriger de nouveaux traitements stimulant des réponses et permettant de lutter contre les maladies. Ce protocole entre dans le cadre d’une ligne de recherche biomédicale centrée sur l’étude d’une éventuelle cible thérapeutique susceptible d’être reconnue par un médicament contre l’athérosclérose. Comment se produit l’athérosclérose ? L’athérosclérose est une maladie vasculaire due à l’accumulation de graisses sur les parois des vaisseaux sanguins, pouvant provoquer des manifestations très diverses et de sévérité variable en fonction de la localisation des vaisseaux affectés et du stade d’évolution de la maladie. Dans notre société actuelle, la consommation d’aliments très riches en graisses saturées a augmenté considérablement les risques de souffrir de maladies cardiovasculaires. Cet excès de graisse dans notre organisme peut se déposer et s’accumuler au niveau de certains points des parois des artères sous forme de plaques, appelées « plaques d’athérome », pouvant obstruer la lumière des vaisseaux et bloquer la circulation sanguine. ----- Artère normale ----- Athérosclérose modérée ----- Athérosclérose sévère Génie génétique -2- Le cholestérol et les macrophages L’une des substances lipidiques constituant les plaques d’athérome est le cholestérol. Pour empêcher le cholestérol de se déposer sur les parois, notre organisme possède un système de « nettoyage », les macrophages. Ces cellules circulent dans le sang et ont la capacité de capturer les molécules de mauvais cholestérol, connues sous le nom de LDL (Low Density Lipoprotein, ou lipoprotéines de basse densité). Les macrophages les reconnaissent grâce à un récepteur situé sur leur membrane. Ce système de nettoyage est efficace si l’excès de cholestérol LDL n’est pas très important. LDL oxydé Oxydation du LDL Si les quantités de cholestérol sont très abondantes, les macrophages continuent à capturer les LDL. Prolifération de cellules endothéliales Cependant, après avoir ingéré de grandes quantités de LDL, les macrophages se transforment en cellules appelées « spumeuses ». Celles-ci produisent des Activation du système immunitaire substances provoquant l’inflammation et la prolifération de cellules de la paroi artérielle (endothéliales), ce qui entraîne la formation de la Cellule spumeuse plaque d’athérome pouvant bloquer la circulation sanguine. LDL Actuellement, nombre de groupes de recherche partout dans le monde, notamment le Groupe de recherche de récepteurs nucléaires de l’université de Barcelone, visent à mieux comprendre la participation des macrophages à la régulation des taux sanguins de Oxydation du LDL cholestérol et au développement de l’athérosclérose. Plus précisément, les scientifiques étudient le rôle d’une protéine que possèdent les macrophages, appelée « Mylip ». C’est une protéine dont la principale fonction est de dégrader le récepteur situé sur la membrane des macrophages qui leur permet de reconnaître les LDL. Les scientifiques ont constaté qu’une production trop abondante de Génie génétique -3- cette protéine réduit l’ingestion du cholestérol par les macrophages. Cependant, son rôle dans le cadre de l’athérosclérose n’est pas encore clairement défini. Macrophage Compte tenu du fait qu’il a été observé que la protéine Mylip est liée à la régulation du mauvais cholestérol, les scientifiques pensent que ce processus de régulation pourrait constituer une nouvelle cible pour le traitement de LDL oxydé l’athérosclérose. Oxydation du LDL Comment pouvons-nous étudier la protéine Mylip impliquée dans la régulation du cholestérol ? Pour pouvoir étudier cette éventuelle cible thérapeutique, les chercheurs doivent la produire en laboratoire en grandes quantités. Pour ce faire, ils utilisent une technique de génie génétique, appelée « transformation bactérienne », grâce à laquelle ils transfèrent l’ADN d’un organisme à une bactérie pour que celle-ci produise de grandes quantités d’ADN qu’ils introduisent par la suite dans d’autres types de cellules pour que ces dernières produisent la cible thérapeutique de l’étude. À cet effet, ils travaillent à partir d’une forme purifiée du gène produisant la protéine Mylip. Ils l’unissent à un fragment d’ADN circulaire appelé « plasmide », puis l’introduisent dans des bactéries pour que ces dernières produisent la réplication du matériel génétique. Nous vous proposons dans le cadre de ce protocole de jouer le rôle de biotechnologues et de mener à bien une transformation bactérienne ! Génie génétique -4- Organisation de l’atelier : 1. Nous allons effectuer une transformation de bactéries afin qu’elles contiennent l’ADN responsable de la production de la protéine Mylip, et qu’elles agissent comme des bioréacteurs, fabriquant le matériel génétique en grandes quantités. 2. Nous procéderons à la croissance d’une culture de bactéries dans un milieu adéquat nous permettant de sélectionner les bactéries ayant incorporé le gène. 3. Nous purifierons le matériel génétique comportant le gène responsable de la production de la protéine Mylip afin qu’il puisse être introduit dans d’autres types de cellules qui produiront la protéine*. * Compte tenu du fait que la durée de la croissance des bactéries est d’un jour et demi, la purification sera effectuée à partir d’une culture de bactéries transformées préalablement préparée par les moniteurs. Génie génétique -5- Équipement et matériel nécessaires pour chaque groupe ou paillasse 2 tubes contenant des 1 tube dans de la 1 tube contenant le Micropipette de 20 µl et bactéries dans de la glace contenant l’ADN milieu de culture de 200 µl glace étiquetés avec le circulaire appelé bactérienne « LB » nº 1 et 2. « plasmide pCR2.1- (C) (A) Bac porexpan + Mylip ». glace (B) Pointes pour Pointes pour 2 boîtes de Pétri micropipettes de 20 et micropipettes de 20 et contenant de la gélose 200 µl 200 µl et l’antibiotique Étaleurs en plastique (D) ampicilline Bain-marie contenant Portoir flottant pour Récipient de résidus Récipients de résidus de l’eau distillée tubes solides liquides Chronomètre Ruban adhésif 1 tube contenant 1 ml 1 tube contenant la 1 tube contenant la Feutre indélébile de culture bactérienne « Solution 1 » de « Solution 2 » de (E) Miniprep (F) Miniprep (G) 1 tube contenant la 1 tube contenant du « 1 tube contenant de 1 tube contenant de « Solution 3 » de chloropan » (I) l’« éthanol » Miniprep (H) l’eau ultra pure (mEq). Génie génétique -6- (A) Bactéries permettant l’entrée d’ADN (appelées « compétentes XL1-blue ») (B) ADN circulaire appelé « plasmide » (pCR2.1) (C) Milieu de culture LB (Luria Bertani) : extrait de levure 5 g/l, tryptone 10 g/l, NaCl 5 g/l. Stériliser à l’autoclave. Conserver au réfrigérateur. (D) Boîtes LB/ampicilline : milieu de culture LB, gélose 1,6 %, ampicilline 100 µg/ml. (E) Bactéries cultivées sur un milieu 2XYT, O.N. (16 heures) (F) Solution 1 : 50 mM de glucose/25 mM de TrisHCl à pH 8,0/10 mM d’EDTA. Diluer dans de l’H2O distillée. (G) Solution 2 : 20 µl de détergent SDS (dodécyl sulfate de sodium) 10 %/4 µl de NaOH 10 N/176 µl d’H2O mQ/pour chaque échantillon. Préparer en double exemplaire le jour de l’expérience. (H) Solution de Miniprep 3 : 73,60 g d’acétate de potassium/28,75 ml d’acide acétique. Diluer dans de l’H2O mQ jusqu’à un volume final de 250 ml. (I) Chloropan : 25 ml de phénol équilibré/24 ml de chloroforme/1 ml d’alcool isoamylique. Centrifuger pendant 10 minutes à 3 000 tr/min. Génie génétique -7- Procédures 1 — TRANSFORMATION BACTÉRIENNE Une transformation bactérienne est un processus biotechnologique grâce auquel les scientifiques introduisent le matériel génétique responsable de la production d’une protéine en cours d’étude dans une cellule bactérienne. Cette dernière agira comme un bioréacteur et produira des copies de ce matériel génétique, qui pourra être introduit par la suite dans un autre type de cellule pour qu’elle produise la protéine d’intérêt*. Cet atelier se déroulera à partir du gène purifié de notre protéine « Mylip », qui a été introduite dans un plasmide ou fragment d’ADN circulaire. Gène Mylip À partir de ce matériel génétique, nous effectuerons une transformation bactérienne, c’est-à-dire l’introduction du gène responsable de la production de notre protéine dans la bactérie au moyen d’un choc thermique, c’est-à-dire, en soumettant l’échantillon à différentes températures. * Si la protéine d’intérêt est peu complexe, les bactéries transformées peuvent elles-mêmes déjà agir comme des bioréacteurs pour produire la protéine. Génie génétique -8- Protocole pour la transformation bactérienne 1. Nous disposons de deux tubes contenant les bactéries dans de la glace. Chaque tube contient 2 une solution tampon qui favorisera la transformation grâce aux cations Ca + du sel CaCl2 contenu dans le tampon. 2+ Que se passe-t-il ? Les cations Ca préparent par l’action du froid les membranes cellulaires pour qu’elles soient perméables 2+ à l’ADN. Les ions Ca se lient aux phospholipides de la membrane cellulaire, neutralisant leurs charges négatives et formant de petits pores au niveau de la membrane de la bactérie. 2. Ajoutez l’ADN sous forme de plasmide aux bactéries : pipetez 10 µl de plasmide (tube P) à l’aide de la micropipette de 20 µl et ajoutez-les au tube 2 contenant les bactéries. Couvrez le tube puis mélangez délicatement en le tapotant avec le doigt. Le tube 1 sera le témoin contenant des bactéries sans le plasmide. Génie génétique -9- 2+ Que se passe-t-il ? Les ions Ca interagissent aussi avec les groupes phosphates de l’ADN chargés négativement, ce qui leur permet de migrer vers la membrane des bactéries, en l’absence de répulsions dues aux charges électriques. 3. Laissez reposer les tubes 1 et 2 dans la glace pendant 15 minutes. *En attendant, profitez-en pour effectuer la première étape du protocole de « croissance des bactéries transformées » (page 12). 4. Au bout de 15 minutes, placez les tubes 1 et 2 dans le bain-marie à 42 ºC pendant exactement 1 minute et 30 secondes. Que se passe-t-il ? L’ADN circulaire ou plasmide pénètre à travers les pores de certaines bactéries. Comment ? À 42 ºC, l’élasticité de la membrane des bactéries augmente, ce qui favorise l’entrée du plasmide à travers les pores. Génie génétique - 10 - 5. Replacez les tubes 1 et 2 dans la glace pendant 2 minutes. Que se passe-t-il ? La baisse de température provoque la stabilisation des membranes et le plasmide ayant déjà pénétré dans la cellule par les pores restera à l’intérieur des bactéries. Génie génétique - 11 - 2 — MULTIPLICATION DES BACTÉRIES TRANSFORMÉES Après la pénétration du plasmide à l’intérieur des bactéries, il faut faire une multiplication de celles-ci sur un milieu adapté et à une température adéquate. Compte tenu du fait que la transformation bactérienne produit normalement un mélange présentant peu de transformations et des cellules non transformées en abondance, une méthode permettant d’identifier les cellules ayant incorporé le plasmide s’avère nécessaire. Nous nous assurerons que seules les bactéries transformées se multiplient, en les faisant se multiplier dans des boîtes de culture contenant un antibiotique. Vu que le plasmide comporte un gène qui fait que les bactéries soient résistantes à ce médicament, seules les bactéries transformées se développeront sous forme de colonies. À partir de ces colonies, nous pourrons continuer par la suite uniquement la multiplication des bactéries produisant le gène d’intérêt. Gène Mylip Gène de résistance à l’ampicilline Ampicilline Ampicilline Génie génétique - 12 - Protocole pour la croissance des bactéries transformées 1. Étiquetez les boîtes dans lesquelles vous ferez la multiplication des bactéries. Une boîte sera la boîte témoin contenant des bactéries sans plasmide, et l’autre sera celle dans laquelle vous ferez la multiplication des bactéries avec le plasmide. 2. À l’aide de la micropipette de 200 µl, ajoutez 500 µl de milieu de culture bactérienne « LB » contenant des nutriments aux tubes 1 et 2. Couvrez les tubes puis mélangez délicatement en les tapotant avec le doigt. 3. Incubez le mélange dans le bain-marie à une température de 37 ºC pendant 30 minutes. Que se passe-t-il ? Pendant la durée de cette phase d’incubation, les bactéries ont le temps de se multiplier, de manière que lors de la duplication de leur ADN elles génèrent aussi une copie de l’ADN plasmidique contenant le gène d’intérêt. * En attendant la multiplication des bactéries, vous pouvez commencer la troisième étape de cet atelier qui consiste à isoler le matériel génétique des bactéries (page 16). Génie génétique - 13 - 4. À l’aide de la micropipette de 200 µl (utilisez une nouvelle pointe à chaque prélèvement), ajoutez les bactéries (100 à 200 µl) des tubes 1 et 2 aux boîtes de gélose contenant aussi l’antibiotique ampicilline. 5. Étalez les bactéries sur la surface de chaque boîte de gélose à l’aide d’un étaleur en plastique stérile pour chacune. Appliquez un mouvement circulaire à la boîte tout en déplaçant l’étaleur d’avant en arrière. Fermez les boîtes avec un peu de ruban adhésif et annotez dessous vos initiales, la date et le type de bactérie. Génie génétique - 14 - 6. Incubez les boîtes retournées à 37 ºC et observez le résultat obtenu le lendemain. Si vous ne disposez pas d’un incubateur, laissez simplement les bactéries se multiplier pendant deux jours à température ambiante. Génie génétique - 15 - 3 — NOUS ISOLONS LE MATÉRIEL GÉNÉTIQUE OBTENU À partir des bactéries transformées qui se sont multipliées en formant des colonies, les scientifiques prélèvent un échantillon et l’ensemencent sur un autre milieu de culture contenant des nutriments afin d’en obtenir de grandes quantités. Il faut isoler par la suite le matériel génétique produit par les bactéries, c’est-à-dire, le séparer des autres composants bactériens tels que l’ARN, l’ADN de la bactérie ou les protéines. Pour isoler le plasmide, les scientifiques suivent un protocole connu sous le nom de Miniprep. Cette technique permet de séparer l’ADN sous forme de plasmide au moyen de différents solvants et de centrifugations, qui écartent les différents composants cellulaires. L’ADN purifié sera très utile pour les scientifiques pour mener à bien des expériences ultérieures afin d’étudier sa fonction dans la régulation du cholestérol et dans l’athérosclérose et de mettre au point de nouveaux médicaments. Compte tenu du fait que le processus de multiplication de grandes quantités de bactéries nécessite plus d’un jour et demi, nous utiliserons pour l’atelier une culture préalablement préparée par les moniteurs. SOLUTION 2 CHLOROPAN SOLUTION 2 Génie génétique - 16 - ÉTHANOL Gène Mylip Gène de résistance à l’ampicilline Protocole pour purifier l’ADN plasmidique de la culture bactérienne (Miniprep) 1. Centrifugez le tube de culture bactérienne à la vitesse maximale pendant 30 secondes, puis éliminez le liquide surnageant. Que se passe-t-il ? Les cellules se séparent du milieu de culture dans lequel elles se sont multipliées, qui contient normalement des restes de cellules et d’autres molécules que nous voulons éliminer. 2. Éliminez ensuite le liquide surnageant et remettez en suspension le précipité avec 100 µl de la solution 1 à l’aide de la micropipette de 200 µl, puis mélangez avec la même pipette. Que se passe-t-il ? Les bactéries sont remises en suspension pour continuer la purification, mais à une concentration plus élevée car elles seront dans un moindre volume. La solution 1 est une solution tampon qui empêchera la dénaturalisation de l’ADN circulaire sous forme de plasmide, qui se produit si le pH dépasse 12,6. 3. Ajoutez 200 µl de la solution 2 puis mélangez délicatement par retournement. Que se passe-t-il ? La solution 2, contenant un détergent, détruit les membranes de phospholipides des bactéries, libérant ainsi SOLUTION 2 l’ensemble du contenu cellulaire dans le milieu, grâce à un processus appelé « lyse bactérienne ». Cette solution contient aussi une base forte (hydroxyde de sodium, NaOH) qui provoque la dénaturalisation des protéines impliquées dans le maintien de la structure de la membrane cellulaire du propre ADN de la bactérie. En revanche, l’ADN plasmidique n’est pas affecté en raison du pH inférieur à 12,6. Génie génétique - 17 - 4. Ajoutez 150 µl de la solution 3 puis mélangez par retournement. Que se passe-t-il ? La solution 3 est une solution acide d’acétate de sodium, permettant de neutraliser SOLUTION 3 le pH de la solution et d’interrompre le processus de lyse. Au cours de cette étape, la plus grande partie du contenu cellulaire, tel que les protéines et les phospholipides des membranes ainsi que le propre ADN de la bactérie, précipite pour former un précipité blanc. Le propre ADN de la bactérie, déjà dénaturalisé, forme un complexe insoluble qui précipite, + grâce au fait que les ions K se lient aux groupes phosphates de l’ADN, neutralisant ainsi leur charge négative. 5. Ajoutez 350 µl de chloropan, mélangez bien par retournement puis centrifugez pendant 3 minutes à la vitesse maximale pour séparer le plasmide contenant le gène de la Mylip. Que se passe-t-il ? Cette étape permet de séparer l’ADN plasmidique des autres contenus cellulaires tels que les protéines, les lipides et d’autres acides CHLOROPAN nucléiques. Le chloropan est un mélange de solvants organiques contenant du phénol et du chloroforme. Ces solvants dissolvent les molécules hydrophobes, telles que les lipides de la membrane, et dénaturalisent les protéines en les rendant insolubles dans l’eau. Lors de la centrifugation, nous séparons le mélange en deux phases : les phospholipides et les protéines cellulaires restent en solution dans la phase inférieure de chloropan ou attrapées dans l’interphase entre les deux phases sous forme d’un précipité blanc. L’ADN plasmidique restera dans la phase aqueuse supérieure, car ses charges électriques n’ont pas été neutralisées, et il est donc soluble dans l’eau. 6. Transférez la phase aqueuse supérieure transparente dans un nouveau tube à l’aide de la pipette de 200 µl. Génie génétique - 18 - 7. Ajoutez 900 µl d’éthanol à 100 % à l’aide de la pipette de 200 µl, puis mélangez bien. L’éthanol provoque la précipitation de l’ADN plasmidique de la solution aqueuse. ÉTHANOL Gène Mylip Gène de résistance à l’ampicilline 8. Centrifugez pendant 5 minutes à la vitesse maximale. Observez le précipité qui est l’ADN sous forme de plasmide. 9. Enlevez la TOTALITÉ de l’éthanol à l’aide de la pipette de 200 µl. 10. Remettez en suspension le précipité d’ADN plasmidique dans 20 µl d’H2O purifiée. Génie génétique - 19 - Résultats et discussion 1. Faites un schéma du processus de transformation bactérienne et expliquez à quoi il sert dans la ligne de recherche de la mise au point de nouveaux médicaments contre l’athérosclérose. 2. Expliquez, à l’aide d’un schéma, ce qu’est un choc thermique. 3. Pour que les bactéries se multiplient, vous devez utiliser une boîte de culture contenant un antibiotique. Pourquoi ? 4. Qu’est-ce qu’une colonie de bactéries ? 5. Dans laquelle des deux boîtes ensemencées, la boîte témoin ou celle des bactéries transformées, obtiendrez-vous des colonies ? Pourquoi ? Génie génétique - 20 - 6. À partir des colonies qui se sont formées, comment obtient-on de multiples copies du gène d’intérêt ? 7. Comment peut-on faire précipiter l’ADN bactérien et l’ADN d’intérêt ? Complétez l’explication à l’aide d’un schéma. 8. Vous avez réussi à isoler de multiples copies de l’ADN d’intérêt grâce à la technique de séparation appelée « Miniprep ». Que font les scientifiques après avoir obtenu cet ADN ? Chercheurs ayant contribué avec des contenus : Theresa León, Jonathan Matalonga, Université de Barcelone AUTEUR FINANCÉ PAR : MEMBRES DU CONSORTIUM : Cet ouvrage est sous une licence Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ Génie génétique - 21 -
