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Pour certaines réactions enzymatiques, le changement de signal due à la
consommation du substrat ou l’accumulation du produit peut être utilisé.
Le choix d’espèce dépend des propriétés du substrat et du produit et de la
technique de mesure employée; une comparaison des sensibilités et limites
de détection s’impose.
Par exemple, si le substrat et produit sont tous les deux fluorescents et
possèdent des absorptivités molaires et des rendements quantiques
comparables, mais des longueurs d’onde d’excitation et d’émission
différentes, la quantification du produit est préférable puisqu’une petite
augmentation de la fluorescence est facilement mesurable sur un signal de
fond quasi-nul.
La décision devient plus compliquée dans le cas de la spectroscopie
d’absorption si le substrat et le produit possèdent des absorptivités molaires
égales. Puisque des spectromètres d’absorption mesurent la quantité de
lumière transmisse par un échantillon, le plus grand signal (avec une
précision plus petite) est obtenu à des concentrations faibles d’analyte.
Même si l’on choisit normalement de mesurer l’accumulation du produit en
spectrophotométrie d’absorption, il est important de comparer les courbes
de calibration pour la consommation du substrat et l’accumulation du
produit afin d’identifier la méthode optimale.
157
4.1 Mesures directes et couplées
Certaines réactions enzymatiques peuvent être suivies directement
(consommation du substrat ou accumulation du produit) avec une
précision adéquate pour un essai enzymatique direct.
Par contre, plusieurs enzymes catalysent des réactions impliquant
des espèces qui ne sont pas facilement détectables.
Dans ces situations, le produit est converti en une espèce
détectable dans une réaction subséquente («réaction couplée»
ou «réaction indicatrice»):
Analyte Produit primaire Produit détecté
La réaction indicatrice peut être de nature chimique ou enzymatique;
le critère principal étant que la conversion du produit primaire en
produit détecté doit être rapide et quantitative.
Eprim Eind