Techniques de transgénèse
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Techniques de transgénèse Comment faire un transgène ? Pour construire un transgène il faut d'abord construire le cDNA correspondant (ADN codant pour le gène). On isole à cet effet les ARNm du cytoplasme en les reconnaissant par leur queue poly-AAAA et on utilise une transcriptase reverse pour créer les ADN simple brin correspondants. Par la méthode de la PCR on amplifie le segment d'ADN qui reconnait les amorces (d'une vingtaine de nucléotides de long) utilisées, celles qui sont spécifiques du gène auquel on s'intéresse. On obtient ainsi de l'ADN bicaténaire correspondant au gène d'intérêt. Un transgène contient non seulement le cDNA codant pour la protéine d'intérêt mais aussi un certain nombre d'informations qui vont lui permettre de s'exprimer correctement: - un translation starting point (signal de début de transcription) qui forme le site CAP (coiffe) de l'ARN en 5'. Ce site est souvent cloné (au sens de clonage moléculaire) en même temps que le promoteur - un promoteur qui permet la fixation de l'ARNpolymérase , il s'agit souvent d'une boîte TATA (séquence du type TTATAA) ou une boîte CAT (séquence du type CAAAT) - un terminateur qui permet le décrochage du complexe de transcription, il s'agit d'une séquence poly AAA que l'on retrouve sur tous les ARN messagers avant leur maturation Un transgène formé avec ces seuls éléments n'est en général pas exprimé. Il faut ajouter un enhancer (amplificateur) que l'on peut mettre en amont ou en aval de cette construction, sa place importe peu. Son rôle est de recruter des facteurs activateurs de transcription (des protéines nucléaires). De plus, l'endroit où s'intègre le transgène dans le génome hôte peut influencer sur sa lecture. En effet des éléments en amont ou en aval de sa zone d'intégration peuvent interagir avec lui. C'est pourquoi on adjoint à cette construction génique un isolateur, qui va servir de barrière entre loci. Enfin la transgénèse conditionnelle consiste à placer une élément supplémentaire dans le transgène qui reprimera ou entraînera son expression sous l'effet d'un signal extérieur. Cela est fortement intéressant lorsqu'on veut faire une comparaison entre animaux exprimant ou pas un transgène (tous les facteurs impliqués dans l'expérience sont identiques sauf pour l'expression finale du transgène) ou lorsque le transgène qui doit s'exprimer est nocif pour la celllule, son expression sera ainsi momentanée. On utilise par exemple la tétracycline dans des système TET-ON (déclenchement de l'expression par la présence de tétracycline) ou TET-OFF (effet inverse). Schéma d'un transgène L'expression des gènes est contrôlée par des séquences situées essentiellement en amont des gènes. Le promoteur participe directement à la formation du complexe de transcription. Les amplificateurs (enhancer) augmentent la fréquence de fonctionnement du promoteur. Les régions éloignées MAR, ouvreur de chromatin et isolateur, maintiennent la chromatine ouverte et empêchent l'extinction des gènes par la chromatine environnante. Les régions UTR (untranslated region) se retrouvent dans l'ARNm, mais ne seront pas traduites. (diapositive Louis-Marie Houdebine, INRA) La transgénèse "au hasard" Une technique très répandue consiste à injecter le gène (plusieurs milliers de copies du transgène sont injectés dans le pronucleus mâle) dans l'oeuf au stade une cellule, directement dans le pronucleus mâle, le plus gros et le plus proche de la surface. L'embryon commence sa segmentation et est introduit dans une mère porteuse où il termine son développement. En moyenne seulement 1 à 10% des animaux nés expriment le transgène. Micro-injection de milliers de copies du transgène dans le pronucleus mâle d'un ovocyte de lapin (le pronuceus femelle est partiellement caché par le pronucleus mâle et les deux GP sont visibles vers le bas de la cellule) Photo P. Chesné INRA La transgénèse ciblée Il est possible de faire une transgénèse ciblée, par recombinaison homologue. Ceci consiste à non pas ajouter un gène qui s'intègre n'importe où dans le génôme, ce qui peut avoir des conséquences imprévisibles pour la cellule, mais à le faire se placer au locus voulu dans l'ADN. C'est une des méthodes qui permet l'inactivation spécifique d'un gène (gène-KO), afin d'en connaître le rôle précis. Exemple d'une recombinaison homologue Recombinaison homologue permettant d'intoduire le gène neo . Le rôle du gèneTk est de pouvoir discriminer les cellules ayant intégré le transgène de façon aléatoire de celles l'ayant intégré par recombinaison homologue. En effet, si le vecteur s'intègre au hasard dans les cellules, le gène Tk est intégré aussi et il s'exprime en provoquant une sensibilité des cellules à un agent toxique (le gancyclovir). Si le vecteur est intégré par recombinaison homologue, le gène Tk n'est pas intégré et les cellules ne deviennent pas sensibles. L'action du gancyclovir permet alors de discréminer les deux types de cellules et de garder uniquement celles ayant intégré le vecteur par recombinaison homologue.(diapositive Denise Aubert, PBES) Association de la technique de transgénèse à celle du clonage (au sens de transfert nucléaire) Depuis que l'on sait cultiver des cellules somatiques suffisamment longtemps, il est possible de les modifier durant leur culture in vitro. On transfère donc le transgène dans les fibroblastes en culture (c'est à ce moment que l'on peut pratiquer une transgénèse ciblée) et c'est l'une de ces cellules modifiées qui est utilisée comme donneuse de noyau par transfert nucléaire sur un ovocyte. Après fusion et activation l'oeuf génétiquement modifié ainsi créé (toutes les cellules de l'embryon sont transgéniques) est replacé dans une mère porteuse. Le rendement d'animaux transgéniques ainsi obtenu est considérablement augmenté (environ 50%). Il faut également deux à trois fois moins de mère porteuses que dans la méthode précédente. Une technique de transgénèse assez ancienne implique l'utilisation de cellules modifiées, porteuses d'un gène étranger véhiculée par un rétrovirus. Ces cellules sont introduites sous la zone pellucide (à travers cette dernière) d'un embryon en cours de segmentation au stade deux celulles (voir le film de l'INRA intitulé "Transfert de gènes", sur des embryons de lapin). Ces cellules fusionnent ensuite avec les blastomères. Toutes les cellules de l'embryon ne sont pas forcément modifiées. Chez les espèces pour lesquelles on a isolé et cultivé des cellules embryonnaires souches (la souris par exemple), on peut utiliser des cellules ES modifiées pour créer un animal génétiquement modifié. Les cellules ES modifiées sont transférées directement dans la cavité du blastocyste ce qui donnera un organisme chimère dont certaines cellules sont modifiées et pas d'autres. Cependant la répartition des cellules ES (migration) se faisant dans tous les types de tissus au cours du développement embryonnaire, l'ensemble des tissus de l'animal parait transgénique. Croisé à des souris suvages ces animaux transgéniques chimères donneront des transgéniques hétérozygotes. Injection de cellules ES de souris modifiées (par recombinaison homologue) dans la cavité d'un blastocyste de souris. Photo D. Aubert ENS-Lyon Transplantation d'embryons génétiquement modifies dans une mère porteuse (lapin) Embryons transgéniques de lapin au stade une cellule, observés à la loupe binoculaire. Photo F. Jauzein INRP/labo INRA Une dizaine de ces Ces embryons sont L'ovaire apparaît rouge embryons est contenue placés dans une lapine sombre au centre de dans la goutte de porteuse. On voit ici le l'image. La pipette milieu située à champ opératoire avec contenant les embryons l'extrêmité de la pipette la vessie (rabattue vers est glissée dans la ayant servi à leur le bas) de l'animal, et la trompe, maintenue aspiration. pipette dirigée vers (ainsi que des tissus de Photo F. Jauzein l'une des trompes soutien) entre les doigts INRP/labo INRA utérines. de la technicienne. Photo F. Jauzein Photo F. Jauzein INRP/labo INRA INRP/labo INRA Comment prouver la présence d'un transgène ? Technique d'électrophorèse d'ADN permettant de déceler la présence d'une séquence d'ADN recherchée (par exemple lors d'un contrôle sur un aliment susceptible de contenir un transgène). Le fait de déceler la présence du transgène ne présume en rien de son expression. Recherche de la présence d'un transgène de porc (gène WAP pour Whey Acid Protein, d'une protéine du petit lait) dans des cellules de souris (électrophorèse d'ADN après PCR, segments les plus légers, 100pb, au bas des colonnes). Le temoin positif est à droite. L'eau, notée E, sert de témoin négatif. Les animaux 239 et 240 (en haut à gauche), par exemple, ont intégré le transgène, mais pas les 241 et 242. La bande claire présente chez tous les animaux , à la base de la colonne, correspond aux amorces utilisées dans la PCR. Photo C. Morgenthaler INRA On ne pourra savoir qu'un animal est transgénique de façon mosaïque (seules certaines de ces cellules sont transgéniques), que par le taux d'animaux transgéniques dans sa descendance, qui sera inférieur à 50%. En effet un animal dont toutes les cellules sont transgéniques, donne, une fois croisé avec un animal sauvage, 50% d'individus transgéniques. Si jamais on trouve un taux supérieur, c'est que le transgène s'est inséré à plusieurs endroits différents du génome.
