BioGen 07 Fichier - Moodle
publicité
La transcription transcription traduction La transcription Un gène ne code pas directement pour un polypeptide Un intermédiaire est d abord synthétisé : l ARN messager (mRNA). L ADN est transcrit en mRNA. Raisons probables : - Protection de l information de départ dans l ADN - Amplification du signal (1 gène bcp mRNA, chaque mRNA bcp de polypeptides) - Régulation du signal : le mRNA se dégrade facilement, le signal peut donc s éteindre, ce qui arrête la production du polypeptide (la transcription peut être maintenue « on » ou « off »). BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 1 La transcription est réalisée par l'ARN polymérase à partir d un promoteur. unité de transcription Promoteur 1. Initiation ARN polymérase : fixation sur le promoteur Lorsque l ARN polymérase est liée au promoteur les brins d ADN commencent à se séparer. 2. Elongation brin codant brin matriciel 3 5 mRNA Le mRNA est synthétisé dans le sens 5 -3 . Seul un brin est transcrit : brin matriciel. 5 3 L hélice d ADN se reforme immédiatement 5 mRNA BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons - mRNA complémentaire du brin matriciel - même séqu. que brin codant - U à la place des T 2 signal « stop » = terminateur 3. Terminaison mRNA Le mRNA est libéré et l ARN polymérase se détache En résumé : - L ARN polymérase ne fonctionne que dans le sens 5 -3 - Pas d'amorce - Besoin d un promoteur - Seul un brin est transcrit : le brin matriciel Unité de transcription = fragment d ADN transcrit en mRNA Correspond généralement à un ou plusieurs gènes. Rem : ce n est pas toujours le même brin qui est codant (mais c’est toujours le même pour un polypeptide donné) BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 3 Bacteria et Archaea : Un seul type d ARN polymérase Eukarya Trois types d ARN polymérase ARN polymérase I ARN polymérase II ARN polymérase III synthèse rRNA synthèse mRNA synthèse tRNA et pRNA La transcription chez les bactéries Tous les gènes ne sont pas transcrits en même temps. Importance des facteurs sigma (svt : σ" 70) ARN polymérase + 1 facteur sigma : reconnaissance d un promoteur. Promoteur : • Site -10 : boîte Pribnow (généralement TATAAT) • Site -35 : généralement TTGACA BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 4 ARN polymérase + facteurs de transcription = complexe d initiation de la transcription Bacteria ARN polymérase début mRNA facteur sigma (σ) Promoteur Promoteur Promoteur Promoteur 1 2 3 4 : : : : 5 5 5 5 -CTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAG-3 -CTATTCCTGTGGTGGTACTAGCTAATTAGAGTTAGAAAACA-3 -TGGTTCCAAAATGTACCAATTTACGATATACTCACAGCATA-3 -TTTTTGAGTTGTATCACCACTGCGATTCTGATCCCATACGTA-3 Promoteur consensus : TTGACA séquence -35 TATAAT boîte de Pribnow = séquence -10 Site d amorçage (+1) = Début du mRNA Facteurs - petites protéines (σ" 70 = 70 kDa) - principal facteur sigma (σ) chez E. coli : σ"70 Reconnaît les séquences consensus TTGACA et TATAAT. • E. coli : au moins 7 facteurs σ"≠, chacuns reconnaissant ≠ séquences consensus. • Bacillus subtilis :14 facteurs σ ≠. En fonction du facteur σ présent, les gènes exprimés sont ≠ BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 5 Tout le mRNA ne sert pas à synthétiser un polypeptide Un transcrit (mRNA) possède : - une région 5' non traduite : 5 -UTR - une région 3 non traduite : 3 -UTR UTR = Untranslated region mRNA segment codant 5 -UTR 3 -UTR AUG 3 5 polypeptide codon start La terminaison chez les bactéries Un signal « stop » provoque le détachement de l ARN polymérase Deux types de signaux « stop » : - Mécanisme intrinsèque - Mécanisme rho-dépendant BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 6 Mécanisme intrinsèque Apparition d une boucle riche en GC et de 6A Détachement ARN polymérase et terminaison Mécanisme rho-dépendant - Pas de boucle - Séquence riche en C - Intervention du facteur « rho » : polypeptide hexamérique Détachement ARN polymérase et terminaison BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 7 La transcription chez les eucaryotes Processus plus complexe que chez les bactéries car : - Génomes plus grands, plus d ADN non-codant « Difficile » de trouver les gènes E. coli : 106 bases = 900 gènes Homme : 106 bases = 9 gènes - Epissage des introns - ADN associé à des protéines : histones (chromatine) - ADN dans noyau. La traduction doit se faire après (peut se faire en même temps chez les bactéries) Les facteurs généraux de transcription (FGT) chez les eucaryotes • Protéines sr fixant sur les promoteurs (boite TATA) avant l arrivée de l ARN polymérase. Formation d un gros complexe de pré-amorçage comportant 6 GTF (=FGT) • Premettent de réguler l'expression BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 8 Les facteurs généraux de transcription (FGT) TFIIA TFIIB TFIID TFIIE TFIIF TFIIHH Ordre d'assemblage précis Importance des protéines activatrices reconnaissant les amplificateurs (en amont ou en aval du promoteur) BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 9 Epissage du pre-mRNA chez les eucaryotes Bactéries : un gène est presque toujours colinéaire avec sa protéine Un gène de 3N nucléotides code pour N acides aminés. gène mRNA N C protéine Chez les eucaryotes les gènes sont interrompus par des introns : séquences d ADN non codantes gène Exon 1 Intron 1 transcription épissage Exon 2 Intron 2 Exon 3 pre-mRNA mRNA traduction protéine Epissage = délétion précise des introns du pre-mRNA Essentiellement via le spliceosome BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 10 Taille des exons Tend à être petite : 100 - 200 pb 6% Homo sapiens Taille exon en pb 900 100 200 300 80% des exons < 200 pb pb = paires de base Taille des introns Tend à être grande. Grande variabilité de leur taille 20% H. sapiens Taille intron en kb 1 BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 5 10 15 20 25 30 11 Importance de l'épissage Epissage alternatif exon1 exon1 exon2 exon2 exon3 exon4 exon3 exon4 exon2 exon1 mRNA 1 exon4 mRNA 2 protéine 1 protéine 2 Maturation du mRNA : ajout 5'-CAP (eucaryotes) et queue polyA Dans le noyau chez eucaryotes Fonctions 5 -CAP et queue poly(A) : - Export facilité vers cytoplasme - Protection de la dégradation - Fixation sur ribosome BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 12 Remarques générales sur la transcription - L ARN polymérase n a pas d activité correctrice - Vitesse de propagation : 60 nucléotides / sec. (eucaryotes) - Un gène peut être transcrit par plusieurs ARN polymérases en même temps : amplification signal. En résumé : La transcription ! mRNA Procaryotes : mRNA 5 -UTR Eucaryotes : mRNA BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 13 La traduction RIBOSOME mRNA Polypeptide Le code génétique Le mRNA va être traduit en un polypeptide par un ribosome. Séquence de nucléotides séquence d’acides aminés. 4 nucléotides principaux 20 acides aminés principaux Lien? Si 1 nucléotide = 1 acide aminé Il n’y aurait que 4 acides aminés... Si 2 nucléotides = 1 acide aminé Il n’y aurait que 16 acides aminés... (24) BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 14 Trois nucléotides codent un acide aminé Il y a donc 43 = 64 combinaisons possibles Trop, mais le code est dégénéré (redondant) : plusieurs triplets peuvent correspondre à un acide aminé. Un triplet de nucléotides est appelé codon AUG UAC CGG UUA AGC GCG AGU AAA GCG ... codon codon sérine Il faut donc 3N nucléotides pour coder une protéine de N acides aminés. Le décryptage du code Premier codon déchifré en 1961 par Nirenberg et Matthaei Synthèse d un mRNA artificiel : UUUUUU (polyU) Ajout du polyU dans une éprouvette avec des ribosomes et des acides aminés (+ autres facteurs). Formation de polypeptides de phénylalanine : -Phe-Phe-PheConclusion : UUU = Phe Même expérience avec polyA, polyG et polyC : AAA = Lys BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons GGG = Gly CCC = Pro 15 Décodage de triplets mixtes : AUA, CGA, etc... Emploi de techniques plus élaborées 1965 : les 64 codons étaient déchiffrés gâce aux travaux de Khorana, Holley and Nirenberg. Prix Nobel en 1968 Holley Khorana Nirenberg Trp et Met : 1 seul codon Autres aa : 2-6 codons BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 16 Codons « stop » : UAA, UAG et UGA : fin de la traduction Codon « start » : AUG. Double fonction : - code pour la méthionine (Met) - signal de départ (tous les mRNA commencent par AUG) Tous les polypeptides commencent donc par Met ou fMet, mais celui-ci peut être clivé par la suite. Remarques Un acide aminé = plusieurs codons Mais aucun codon ne code pour plus de un acide aminé La redondance n est pas le fait du hasard : souvent, les codons synonymes ne diffèrent que par la 3e base du triplet. Le cadre de lecture est important! Le message est complètement changé si le cadre est décalé. Le code génétique est universel : Archaea, Bacteria, Eukarya. Il est apparu tôt dans l’histoire de la vie. Preuve de l évolution et de l unicité du vivant. (il existe quelques exceptions, ou quelques codons ont un code ≠ de la majorité des organismes. Ex : paramécies et dans les organites de certaines espèces). BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 17 Preuve de l universalité du code génétique : Insertion d un gène humain dans une bactérie production d un polypeptide, 100% identique au polypeptide correspondant chez l homme ADN humain (un gène) E. coli polypeptide humain Traduction : mRNA polypeptide ARN de transfert (tRNA) : porteurs d aminoacides 3 site de liaison de l aa : 3 , tjs triplet CCA 5 80 nucléotides Anticodon BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons Forme de L inversé 18 20 acides aminés 20 tRNA ≠ Phe Phénylalanine tRNA : « traducteur » AAA Anticodon AAA UUU mRNA codon UUU Principe de la formation d un polypeptide : - Les tRNA se placent côte-à-côte sur le mRNA (codon-anticodon) - Les acides aminés sont reliés les uns aux autres - Les tRNA « vides » se détachent et vont rechercher un aa libre dans le cytoplasme. Le processus se déroule dans le cytoplasme (Bacteria et Eukarya) au niveau des ribosomes. BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 19 Chargement des tRNA : Les enzymes liant les acides aminés aux tRNA sont les aminoacyl-tRNA-synthétases : 20 types (car 20 aa) P P aa libre P ATP tRNA « vide » anticodon P P P P P P aa aa aa-AMP 1. Liaison ATP et aa. BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 2. L ATP perd un P-P et se lie à l aa sous forme d AMP 20 P AMP 3. Formation d une liaison covalente entre le tRNA et l aa et largage de l AMP liaison covalente aa aa-tRNA tRNA aa aminoacyl-tRNA (tRNA « chargé ») 4. L enzyme libère l aa activé BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 21 Nombre de tRNAs Si un tRNA pour chaque codon il y aurait 61 tRNA (64–3 stop) Or, il n y en a que 45 Certains tRNA (portant un aa particulier) peuvent se lier à plusieurs codons ≠. Phénomène d’oscillation. Thr 5 UGI ACU Thr 5 Présence de nucléotides particuliers (I) dans le tRNA UGI ACC mRNA 3e base du codon Trp et Met : 1 seul codon Autres aa : 2-6 codons BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 22 Ribosomes Permettent l appariement des anticodons et des codons Synthétisent les polypeptides à partir du mRNA. Organites cytoplasmiques, visibles au microscope électronique 2 sous-unités : une grande, une petite Chaque sous-unité est composée de protéines et d ARN ribosomial (rRNA). Le ribosome site P site E site de liaison du mRNA tunnel de sortie (de l aa) site A E P A Grande sous-unité ribosomique (Bact. 23S, Euc. 28S) Petite sous-unité ribosomique (Bact. 16S, Euc. 18S) Site E : « exit », site de sortie du tRNA déchargé de son aa. Site P : site de liaison du « peptidyl-tRNA » : retient le tRNA qui porte la chaîne polypeptidique Site A : site de liaison de l « aminoacyl-tRNA » : entrée du tRNA qui porte le prochain aa. BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 23 Trois étapes dans le traduction : (i) Initiation (ii) Elongation (iii) Terminaison En plus du mRNA, tRNA et ribosome, nécessité de : - facteurs de traduction (protéiques) - énergie : GTP Traduction chez les Bacteria 1. Initiation (a) Met site de liaison du mRNA tRNA d initiation (porte une Methionine modifiée fMet : formylméthionine). 5 -UTR 5 UAC AUG 3 mRNA petite ss-unité Le site de liaison du mRNA reconnaît une séquence spécifique en amont du codon « start » (AUG) BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 24 1. Initiation (b) : liaison de la grande sous-unité : formation du complexe d initiation Met E 5 UAC AUG A 3 - la formation du complexe consomme du GTP - fMet se place au site P - Nécessité de facteurs d initiation protéiques : eIF Rem : - pas de fMet chez Eucaryotes et Archées - Bacteria : dans la 1/2 des cas fMet est clivé en fin de synthèse. transformylase H3C Formylméthionine fMet Méthionine Met La transformylase agit une fois que la Met est sur le tRNA BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 25 2. Elongation (cycle d élongation) Arg Met UCU E 5 UAC AUGAGA 3 P A A L anticodon d un aminoacyl-tRNA adéquat se lie au codon du site A. L hydrolyse de GTP augmente l exactitude et l efficacité de cette étape. Met Met Arg E UACUCU AUGAGA P A A Arg E UACUCU AUGAGA P A A Formation d une liaison peptidique entre le nouvel aa apporté au site A et l extrémité carboxyle du polypeptide en cours de synthèse au site P. Le polypeptide se lie au tRNA au site A. BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 26 Met Met Arg Arg UAC E E UACUCU AUGAGA UCU AUGAGA P A A P A A Translocation. Le ribosome fait avancer le mRNA. Le tRNA déchargé du site P se retrouve en au site E et se détache ; le peptidyl-tRNA du site A se retrouve au site P. Un nouveau cycle recommence avec un nouvel aminoacyl-tRNA. Le ribosome se déplace sur le mRNA de 5 en 3 Met extrémité amine (N-terminale) Arg UAC E 5 UCU NNN AUGAGA P A A 3 Start BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 27 Remarques Le polypeptide sort du ribosome par son extréminé N-terminale Le ribosome « avance » sur le mRNA de 5 en 3 A chaque instant, 10 codons se trouvent à l intérieur du ribosome ( 30 nucléotides) 1 cycle d élongation = 1/10e de seconde (Bacteria) 3. Terminaison Arrivée à un codon « Stop » E 5 A NNN NNNUAG P A 3 Stop (UAG, UAA, UGA) BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 28 b. Hydrolyse de la liaison entre le polypeptide et le tRNA du site P E 5 NNN NNNUAG A P A a. Le site A accepte un facteur de terminaison (protéique) 3 Libération du polypeptide E 5 BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons NNN NNNUAG A P A 3 29 Dissociation du complexe 5 3 Remarques : - 1 seul ribosome met 1 minute pour synthétiser un polypeptide de taille moyenne. - Plusieurs ribosomes traduisent le mRNA en même temps : formation d une file de ribosomes = polyribosome ou polysome Trouvés chez procaryotes et eucaryotes (plus longs chez les procaryotes) 1 mRNA BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons synthèse de multiples polypeptides à la fois 30 Repliement des polypeptides et modifications post-traductionnelles : Pendant la synthèse la chaîne polypeptidique peut se replier spontanément : elle adopte une conformation 3D spécifique. Gène structure primaire conformation 3D Souvent, une chaperonine contribue à plier correctement le polypeptide. Modifications post-traductionnelles : - ajout de glucides, lipides, phosphates, etc., à certains aa. - clivage de certains aa de l extrémité N-terminale (Met) - clivage du polypeptide en plusieurs morceaux. Ex : insuline. - union de plusieurs polypeptides ≠. Ex : Hb. BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 31 Mutation et recombinaison L information génétique peut être modifiée : Mutation : changement stable et héréditaire qui intervient au niveau d une paire de base. Effets souvent limités. Production de mutants. Recombinaison génétique : combinaison de deux brins d ADN pour former un brin d ADN hybride. • Recombinaison homologue • Recombinaison spécialisée Classification des mutations 1. Selon type cellulaire : mutations somatiques et germinales Organismes pluricellulaires : Milliards de cellules forte probabilité d avoir quelques cellules mutées. Leur qté ↑ avec âge. Effets variables : - cellules reproductrices : mutations germinales. Transmises aux descendants. - cellules non reproductrices : mutations somatiques. • Non transmises chez organismes ou la reproduction est uniquement sexuée (mammifères) • Transmises chez organismes à repro. non sexuée (plantes, cnidaires, ... ) Organismes unicellulaires : pas de distinctions entre les 2 types. BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 32 2. Selon leur cause Spontanées (erreurs de réplication, dépurination : perte A ou G) ou induites (agents physiques : rayons X, γ, UV; chimiques : hydroxylamine, bromure éthidium, acétaldéhyde; biologiques). 3. Selon leur effet sur codon. Mut. Ponctuelles : 1 paire de bases affectée (sont réversibles) Silencieuses : ne modifiant ni l acide aminé ni la protéine (code génétique dégénéré : 3e base du codon) Faux-sens : modifie 1 acide aminé (surtout 1ere ou 2e base codon). Impact variable. Les plus fréquentes. Non-sens : apparition d un codon stop. Par décalage du cadre de lecture : insertion ou délétion d une paire de bases. Effet très néfaste; changements majeurs. Trp et Met : 1 seul codon Autres aa : 2-6 codons BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 33 4. Selon le type de changement nucléotidique Mutations de transition et de transversion De transition : purine →"purine fréquentes pyrimidine → pyrimidine De transversion : purine → pyrimidine. Mutations par insertion ou délétion de séquences Inactivation d un gène. Ex : insertion d un transposon. Mutations par translocation Simple déplacement d un gène dans le génome. Perte possible des éléments régulateurs. Mutations par inversion Effets variables BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 34 5. Selon leur effet sur le polypeptide ou l organisme Mutations silencieuses : pas d effet visible Mutation perte de fonction : un polypeptide est produit mais son activité est différente. Perte totale ou partielle de fonction. Résultent par exemple d une mutation faux-sens. Mutation nulle : plus de polypeptide produit (ex : mutation fauxsens : apparition d un codon stop). Mutation gain de fonction : apparition d une nouvelle fonction. Dominant ou codominant chez les diploïdes. Rem : Mutations nulles Pour caractériser l effet d un gène sur le phénotype il est essentiel d examiner un mutant nul. Si le gène est essentiel la mutation nulle est létale. Si le phénotype n est pas affecté le gène n est « pas essentiel » à la survie de l espèce. nulle • Mutant « knockout » - non sens - décalage BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 35 Fréquence des mutations Les mutations de transition sont plus communes Car c est toujours une purine (G, A) face à une pyrimidine (C, T) Exemple : G C A T Mutagenèse Induction de mutations (svt ponctuelles) par des agents chimiques, physiques ou biologiques : agents mutagènes. Agents mutagènes chimiques Trois modes d action : • analogues de bases : ressemblent aux bases puriques et pyrimidiques et les remplacent. Nécessité de réplication du DNA. Ex : 5-BrU. • agents alkylants : modifient la structure d une base et ses propriétés d appariement. Pas besoin de réplication du DNA (plus puissants mutagènes que analogues). Ex : MNNG. • agents intercalants : plans, s insèrent entre les bases. Conformation anormale lors réplication. Ex : acridine orange, proflavine, bromure éthidium. BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 36 Analogue de base : 5-BrU = 5BU = 5-Bromo-uracile Est incorporé dans l ADN à la place de T Forme lactame : appariement avec A une autre forme tautomérique : forme lactime Syllabus : remplacer - « céto » par lactame - « énol » par lactime Appariement avec guanine (G) Mutations si réplication Il faut une réplication incorporation réplication A T A 5BU réplication (5BU lactime) mutation ponctuelle (de transition) fixée A T G 5BU BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons G C réplication G 5BU 37 Agents alkylants Ajoutent des groupements alkyles Modification covalente de bases guanidine R-N=O nitroso N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine = MNNG Si arrêt de la transcription, arrêt de la division cellulaire Agents alkylants monofonctionnels Ne forment qu un seul lien avec l ADN Provoquent des mutations, pas d arrêt de division Agents alkylants bifonctionnels Formation de liens intra- ou inter-brin. Arrêt de division. Utilisé pour combattre le cancer. Ex : cyclophosphamide S attache à l N n des guanines BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 7 38 Agents intercalants Proflavine Agent intercalant causant des délétions ou des insertions de paires de bases (pas de substitutions). Utilisé aussi comme désinfectant bactériostatique actif contre les Gram+ Agents mutagènes physiques • Radiations non ionisantes : UV à 260 nm : formation de dimères de pyrimidine (T-T, ou C-C) entre deux bases adjacentes sur un brin. TT AA Bcp utilisés en bactériologie : utilisation d une dose létale tuant 50-90% des cellules d une culture. Isolation des mutants. BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 39 Importance de l ozone UV-A : 400-315 nm UV-B : 315-280 nm UV-C : 280-100 nm Les plus mutagènes • Radiations ionisantes (X, , cosmiques) Pouvoir mutagène plus puissant que les UV Arrachages d e- (formation d ions) Cassent des liaisons hydrogène Oxydation de doubles liaisons Génération de radicaux libres (OH-, etc.) • Chaleur Le taux de mutation augmente significativement avec la t C. Même pour des ≠ de l’ordre de 0.1 C. BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 40 Agents mutagènes biologiques • Erreurs de l'ADN polymérase • Erreurs des systèmes de réparation de l'ADN : ADN polymérases à faible fidélité : ADN polymérase IV et V. • Certains transposons (éléments génétiques mobiles) • Certains virus Obtention (sélection) de mutants chez les bactéries Le criblage (= screening) : identification de mutants par l observation d un grand nombre de souches. • Technique des répliques (des empreintes) de Lederberg Exemple : isolation de mutants nutritionnels (mutants auxotrophes) p/r souche parentale (prototrophe). boite de Petri tampon de velours (réplicateur) BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 41 Milieu complet Réplique sur milieu sans histidine •• • • • • • • • • • •• • • • • • • • • Colonie His– Colonie His– absente sélection négative Les mutations sont : - rares (peu de His–) - aléatoires - sélectionnées par le milieu (environnement) BioGen 7 - 2016-2017 DC Gillan UMons 42
