Optimisation du métabolisme énergétique du soufre chez

Aix-Marseille Université
Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé
Thèse de Doctorat d’Université
Mention Microbiologie
Clément AUSSIGNARGUES
Optimisation du métabolisme énergétique
du soufre chez la bactérie hyperthermophile
Aquifex aeolicus
Soutenue le 17 Décembre 2012 devant le jury:
Pr. Frédéric BARRAS
Dr. Laurent COURNAC
Dr. Bruno FRANZETTI
Dr. Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI
Dr. Anne GODFROY
Dr. Marianne ILBERT
Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines
Centre National de la Recherche Scientifique
Aix-Marseille Université
Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé
Thèse de Doctorat d’Université
Mention Microbiologie
Clément AUSSIGNARGUES
Optimisation du métabolisme énergétique
du soufre chez la bactérie hyperthermophile
Aquifex aeolicus
Soutenue le 17 Décembre 2012 devant le jury:
Pr. Frédéric BARRAS
Dr. Laurent COURNAC
Dr. Bruno FRANZETTI
Dr. Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI
Dr. Anne GODFROY
Dr. Marianne ILBERT
Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines
Centre National de la Recherche Scientifique
Sommaire
Sommaire
Introduction
2
Chapitre I- Métabolismes énergétiques du soufre
4
I) Le soufre, un élément essentiel aux multiples facettes
6
II) Le soufre utilisé comme composé énergétique
9
A) Oxydation des composés du soufre
1. Oxydation du sulfure d’hydrogène H2S
10
10
a) La Sulfure Quinone Oxydoréductase (SQR)
10
b) La flavocytochrome c sulfure déshydrogénase (FCSD)
13
2. Oxydation du thiosulfate (S2O32-)
14
a) Thiosulfate : accepteur oxydoréductase (TAOR)
14
b) Le système Sox
16
3. Oxydation du sulfite (SO32-)
20
a) Sulfite : accepteur oxydoréductase (SAOR)
21
b) Voie de l’APS
23
4. Oxydation du soufre stocké dans les globules
26
B) La réduction du soufre : soufre/polysulfure réductase
29
C) Un cas particulier : la dismutation du soufre (SOR)
33
1. Réactions catalysées
34
2. Structure et architecture
34
a) Le monomère
34
Sommaire
b) La protéine entière
3. Vue générale du fonctionnement de la SOR
III) Complexité des métabolismes énergétiques du soufre : quelques exemples
36
38
39
A) Les archées thermoacidophiles : Acidianus ambivalens
39
B) Les bactéries sulfureuses phototrophes
41
C) Les bactéries acidophiles et mésophiles du genre Acidithiobacillus
43
IV) Réflexions sur les modèles des métabolismes énergétique du soufre
46
Chapitre II- Les rhodanèses
48
I) Caractéristiques des rhodanèses
51
A) Organisation en domaines
51
B) Séquence protéique
55
C) Site actif
56
D) Structure tridimensionnelle
57
E) Catalyse et mécanisme catalytique
60
II) Fonction des rhodanèses
A) Les protéines à domaine rhodanèse associé
62
62
Sommaire
B) Rhodanèses à un ou plusieurs domaines
65
1. Chez les eucaryotes
66
2. Chez les procaryotes
67
III) Vue d’ensemble de la superfamille des rhodanèses
69
Chapitre III- Aquifex aeolicus
72
I) Les Aquificales
74
II) Présentation de notre modèle d’étude : Aquifex aeolicus
78
A) Morphologie, motilité et adhérence
79
B) Génome
80
C) Physiologie
81
III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus
83
A) Voie H2S/O2
83
B) Voie H2/S°
86
C) La SOR
88
D) Les rhodanèses
89
E) NADH déshydrogénase (complexe I)
90
Sommaire
F) Vision globale du métabolisme énergétique du soufre chez
Aquifex aeolicus
92
Chapitre IV- Objectifs du travail
94
Matériel et méthodes
98
I) Culture bactérienne
100
A) Aquifex aeolicus
100
B) Escherichia coli
101
II) Obtention du matériel biologique
A) Aquifex aeolicus
102
102
1. Fractionnement cellulaire
102
2. Solubilisation des protéines membranaires
103
3. Globules de soufre
104
B) Escherichia coli
III) Méthodes de purification des protéines
A) Chromatographie d’adsorption
104
105
105
Sommaire
B) Chromatographies d’échange d’ions
105
1. Chromatographie à basse pression
105
2. Chromatographie à haute pression
105
C) Chromatographie d’exclusion
106
D) Protocoles de purification
106
1. La SQR
106
2. Supercomplexe hydrogénase/soufre réductase
106
3. La SOR et Aq-477
107
IV) Techniques d’analyses biochimiques
111
A) Dosage protéique
111
B) Electrophorèse sur gel d’acrylamide
111
1. Condition dénaturante : Tris-glycine SDS-PAGE
111
2. Condition native : Tris-glycine PAGE
111
3. Gel Bleu Natif
112
4. Gels Bleu Natif à pores larges (BNPL)
113
5. Transfert sur membrane
113
C) Techniques de révélation après électrophorèse
1. Colorations
114
114
Sommaire
2. Immunodétection
115
3. Détection d’activités enzymatiques
116
a) Activité Sulfure Quinone Réductase
116
b) Activité hydrogénase
116
c) Activité cytochrome c oxydase
117
d) Activité NADH-déshydrogénase (complexe I)
118
e) Activité thiosulfate : cyanure soufre transférase (rhodanèse)
118
V) Mesures d’activités enzymatiques au spectrophotomètre
119
A) Transfert d’électrons de l’hydrogénase à la soufre réductase
119
B) Activité Soufre Oxygénase Réductase (SOR)
121
C) Activité thiosulfate : cyanure soufre transférase (rhodanèse)
121
VI) Etude d’intéractions protéine-protéine
A) La résonance plasmonique de surface (BIAcore)
122
122
1. Principe de fonctionnement
122
2. Interface utilisée
123
3. Fixation du ligand et mesure de l’interaction
123
B) Pontage covalent in vitro
124
C) Gel retard
124
VII) Analyses protéomiques
125
Sommaire
A. Identification des protéines par séquençage N-terminal
125
B. Identification des protéines par spectrométrie de masse
125
1) Maldi-TOF
126
2) Trappe à ions
126
3) Orbitrap
126
C. Analyse de protéines entières par spectrométrie de masse
VIII) Microscopies
127
127
A) Microscopie optique
127
B) Microscopie électronique
127
IX) Analyses in silico
128
A) Recherches de protéines homologues et alignements multiples de
séquences
128
B) Prédiction de localisation et de structure secondaire
128
C) Modélisations
129
Résultats et discussion
130
Chapitre I- Métabolisme énergétique du soufre chez
Aquifex aeolicus
132
Sommaire
I) Une rhodanèse au cœur du trafic
134
II) Une source potentielle de substrat: les globules de soufre
138
A) Influence des conditions de culture
138
B) Tentative d’isolation des globules de soufre
141
III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus : un nouveau
Modèle
143
A) Identification de systèmes potentiellement impliqués dans le métabolisme
énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus
144
1. Oxydation du thiosulfate
144
2. Oxydation de l’H2S
146
3. Oxydation du soufre
149
4. Oxydation du sulfite
150
a) Voie de l’APS
150
b) Aq_979
150
B) Construction d’un modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex
aeolicus
153
Chapitre II- Recherche d’un niveau d’organisation supérieure dans
l’architecture des voies respiratoires chez Aquifex aeolicus
155
I) Introduction : Organisation des complexes protéiques membranaires
157
Sommaire
II) Développement et optimisation de gels natifs pour la visualisation de
mégacomplexes
163
III) Préparation et optimisation des échantillons pour la détection de
mégacomplexes
166
IV) Développement des gels natifs à larges pores pour la visualisation des
mégacomplexes
169
V) Impact des conditions de culture sur la présence des superédifices
174
VI) Discussion
176
Chapitre III- Mise en évidence d’un nanocompartiment protéique et de sa
ferritine atypique chez la bactérie hyperthermophile
Aquifex aeolicus
178
Conclusions et perspectives
197
Références bibliographiques
203
Introduction
1
Introduction
INTRODUCTION
2
Introduction
3
Introduction
Chapitre I
Métabolismes énergétiques
du soufre
4
Introduction
5
Introduction
Métabolismes énergétiques du soufre
I) Le soufre, un élément essentiel aux multiples facettes
Le soufre, élément connu depuis l‘Antiquité, a depuis toujours intéressé les hommes.
Il était connu pour « éloigner la vermine » selon Homère, utilisé dans la préparation de la
poudre à canons par les chinois au XIe siècle et toujours utilisé dans divers processus
industriels (dont la vulcanisation du caoutchouc) de nos jours.
Le soufre a également un impact environnemental très important, justifiant les
nombreuses études qui lui sont consacrées : le dioxyde de soufre par exemple, rejeté dans
l‘atmosphère par la combustion du pétrole et du charbon ou lors d‘éruptions volcaniques, se
combine avec l‘eau dans les nuages pour donner de l‘acide sulfurique. Ce dernier est
notamment responsable des tristement célèbres pluies acides, mais il a également un effet
refroidissant sur la partie inférieure de l‘atmosphère terrestre en réfléchissant le rayonnement
solaire. C‘est ainsi qu‘une diminution de la température de 0,5°C a été mesurée en 1992 après
l‘éruption du Pinatubo en 1991. L‘injection de particules de soufre dans l‘atmosphère comme
solution d‘urgence au réchauffement climatique a également été discutée dans la communauté
scientifique, notamment par le prix Nobel de chimie Paul Crutzen (Crutzen, 2006).
La chimie du soufre, tant organique que minérale, est très riche, puisqu‘on le retrouve
à des degrés d‘oxydation variés selon les éléments avec lesquels il est combiné. Ainsi, le
soufre du sulfure d‘hydrogène (H2S) est à son plus bas degré d‘oxydation (-2), alors que celui
du sulfate (SO42-) est à +6 (Table 1 formes du soufre). Cette large gamme d‘états d‘oxydation
place le soufre au centre d‘un éventail de réactions d‘oxydoréduction : la théorie du monde
fer-soufre propose ainsi l‘implication de composés du type sulfure de fer (FeS, Fe 2S) comme
permettant la formation des premières molécules organiques à l‘origine de la Vie (Dörr et al.,
2003; Wachtershauser, 2000).
6
Introduction
Composés
Formule
Etat d’oxydation
Sulfate
SO42-
+6
Sulfite
SO32-
+4
Dioxyde de soufre
SO2
+4
Tétrathionate
S4O62-
Thiosulfate
S2O32-
+2
Soufre élémentaire
S0 , S8
0
Polysulfure
+ 2,5 (0 pour les soufres « internes », + 5
pour les deux soufres « externes »)
0 pour les soufres « internes », - 1 pour
-
S-S(n)-S-
les deux soufres « externes »
Pyrite
FeS2
-1
Monosulfure de fer
FeS
-2
Sulfure d‘hydrogène
H2S
-2
Tableau 1. Degrés d’oxydation des composés soufrés. L‘état d‘oxydation de l‘atome est celui de l‘atome de
soufre de la molécule. S8 représente le cyclo-octasoufre.
L‘incorporation du soufre dans des biomolécules telles que les protéines, les
vitamines, les cofacteurs… est connue depuis bien longtemps, ce qui en fait une brique
fondamentale, l‘un des éléments essentiels de la Vie au même titre que le carbone, l‘oxygène,
l‘azote ou l‘hydrogène.
Enfin, c‘est cette versatilité du soufre du point de vue redox qui explique son
utilisation à des fins bioénergétiques par les micro-organismes. En effet, des bactéries et des
archées qui utilisent le soufre comme base de leur métabolisme énergétique colonisent des
environnements riches en molécules soufrées, qu‘elles soient sous forme de solide (soufre
7
Introduction
élémentaire), de gaz (sulfure d‘hydrogène) ou dissoutes dans l‘eau (thiosulfate, polysulfures)
(Figure 1).
Figure 1. Représentation de certaines formes du soufre. A, le cyclo-octasoufre S8 est un solide quasiment
insoluble (19-30 nM à 25°C, 478 nM à 80°C ; (Kamyshny, 2009)) ; B, le tétrathionate S4O62- (l‘oxygène est
représenté en rouge, le soufre en jaune) est soluble tout comme C, polysulfure S(n)2-.
L‘ensemble des recherches sur le soufre, quels que soient leurs domaines d‘études,
pointent toutes vers l‘existence d‘un véritable cycle biogéochimique du soufre, faisant
intervenir des réactions abiotiques aussi bien que des micro-organismes qui y jouent un rôle
absolument prépondérant (Figure 2). Les métabolismes énergétiques qu‘ils mettent en jeu sont
très diversifiés, et cette variété trouve son reflet dans le grand nombre de protéines qui les
constitue. Les parties suivantes seront essentiellement consacrées à la description des
enzymes jouant un rôle prépondérant dans le métabolisme énergétique du soufre des microorganismes. Nous replacerons ensuite ces enzymes dans le contexte global du métabolisme
d‘organismes modèles, dont l‘étude a permis de mieux comprendre ces processus
énergétiques.
8
Introduction
Figure 2. Représentation schématisée du cycle du soufre dans la nature (ressource internet)
II) Le soufre utilisé comme composé énergétique
Comme nous l‘avons vu, le soufre peut tout aussi bien être incorporé dans les
biomolécules qu‘utilisé en tant que ressource énergétique par les micro-organismes. Dans
cette perspective, il faut distinguer les processus d‘oxydation (donneur d‘électrons) et de
réduction (accepteur d‘électrons) du soufre. Ce dernier cas a été extensivement étudié chez les
bactéries sulfato-réductrices qui couplent des chaînes respiratoires anaérobies à la synthèse
d‘ATP, en utilisant le sulfate comme accepteur terminal d‘électrons (Barton and Fauque,
2009; Muyzer and Stams, 2008). A l‘inverse, de nombreux micro-organismes « extraient » les
électrons des composés réduits du soufre qui sont alors le point de départ de leurs chaînes
respiratoires. Nous allons tout d‘abord nous intéresser à ces derniers.
9
Introduction
A) Oxydation des composés du soufre
Les composés réduits du soufre offrent des degrés d‘oxydation variant entre -2 pour
l‘H2S et +4 pour le sulfite. Dans le cadre de leur métabolisme énergétique, les microorganismes ont développé des enzymes, ou des systèmes enzymatiques oxydant
spécifiquement une forme donnée du soufre auxquels nous allons maintenant nous intéresser.
1. Oxydation du sulfure d‘hydrogène H2S
Le sulfure d‘hydrogène a été découvert en 1777 par Carl Wilhelm Scheele. Il est
considéré comme un véritable poison à cause de sa grande réactivité vis-à-vis des ponts
disulfures ou des centres métalliques par exemple mais aussi pour les organismes aérobies
chez lesquels il interfère avec la phosphorylation oxydative par réaction avec l‘oxygène.
Paradoxalement, ce gaz est absolument indispensable à bien des égards : il a été identifié
comme un « gazotransmetteur » chez les eucaryotes (Wang, 2002), et est utilisé par nombre
de micro-organismes comme donneur d‘électrons pour leurs chaînes respiratoires grâce à
deux enzymes principalement, la Sulfure Quinone Oxydoréductase (SQR) d‘une part, et la
flavocytochrome c sulfure déshydrogénase d‘autre part.
a) La Sulfure Quinone Oxydoréductase (SQR)
La SQR fait partie de la grande famille des disulfure réductases à flavine : c‘est une
flavoprotéine d‘environ 50 kDa retrouvée dans toutes les branches du vivant, mis-à-part les
plantes (Shahak and Hauska, 2008). Elle catalyse la réduction d‘un « pool » de quinones grâce
à l‘oxydation de l‘H2S en chaîne de soufre. La nature du produit soufré est d‘ailleurs discutée
dans la littérature : certaines études chez Rhodobacter capsulatus l‘identifient comme étant du
polysulfure (Griesbeck et al., 2002) alors que la résolution récente de la structure de la SQR
d‘Aquifex aeolicus suggère plutôt un cyclo-octasoufre (Marcia et al., 2009). Ainsi le terme de
« polysoufre » est employé pour faire référence à cette chaîne de soufre dont la nature exacte
n‘est généralement pas définie (Cherney et al., 2010).
L‘utilisation d‘un « pool » de quinones comme accepteur d‘électrons implique
nécessairement une localisation membranaire de la protéine. Il a été montré que la SQR est
10
Introduction
une protéine monotopique liée à un seul côté de la membrane et que cet ancrage peu profond
(seulement 12 Å) est dû à deux hélices α amphipathiques (Marcia et al., 2009). De plus,
l‘orientation périplasmique de la SQR a été démontrée chez Rhodobacter capsulatus bien
qu‘aucun peptide signal n‘ait été détecté dans la séquence N-terminale de la protéine. En
revanche, les 38 acides aminés en C-terminal sont nécessaires à sa translocation (Schutz et al.,
1997) (Schutz et al., 1999).
Les membres de la famille des disulfure réductases sont principalement retrouvés sous
forme dimérique, mais dans le cas de la SQR, la question n‘est pas résolue de manière claire.
En effet, si elle a bien été cristallisée sous forme de dimère chez Acidithiobacillus
ferrooxidans et Acidianus ambivalens (Brito et al., 2009; Cherney et al., 2010), on la retrouve
trimérique chez Aquifex aeolicus, que ce soit au cours de sa cristallisation ou lors d‘études
biochimiques (Marcia et al., 2009; Marcia et al., 2010), et monomérique en solution chez
Acidianus ambivalens (Brito et al., 2009).
La protéine elle-même est composée de deux domaines similaires présentant un
repliement de type Rossmann : le domaine N-terminal est celui qui lie le cofacteur à FAD. Ce
dernier constitue avec trois résidus cystéine le site catalytique de l‘enzyme. De manière
intéressante, la liaison du FAD à la protéine est covalente mais labile chez Aquifex aeolicus et
Acidianus ambivalens, mais pas chez Acidithiobacillus ferrooxidans. Ceci est à mettre en
rapport avec la nature hyperthermophile des deux premières espèces chez lesquelles la liaison
covalente pourrait intervenir dans l‘augmentation de la stabilité et de la conformation native
de la protéine, comme cela a été proposé auparavant pour d‘autres flavoprotéines (Nandigama
and Edmondson, 2000). Le site de liaison des quinones est une cavité proche du FAD et du
contact protéine-membrane, accessible à travers un canal hydrophobe (Figure 3).
11
Introduction
Figure 3. Structure tridimensionnelle du monomère de la SQR d’Aquifex aeolicus (PDB 3HYW). La
quinone est représentée en bleu, et le FAD en jaune.
La réduction du « pool » de quinones se fait via le cofacteur FAD. En effet, ce dernier
est le relai électronique qui va dans un premier temps capter les électrons issus de l‘oxydation
des sulfures avant de les transférer aux quinones. Il faut noter qu‘oxydation des sulfures et
réduction des quinones sont séparés dans l‘espace puisqu‘ayant lieu de part et d‘autre du
FAD.
Le rôle des SQR est assez varié suivant les espèces. En effet, son implication, tant
chez les micro-organismes que dans les mitochondries, a été par exemple démontrée dans la
détoxification de l‘H2S (Shahak and Hauska, 2008), la tolérance aux métaux lourds (Vande
Weghe and Ow, 2001) et probablement la signalisation (en contrôlant les concentrations du
neurotransmetteur H2S chez les mammifères). L‘une de ses fonctions les plus importantes
concerne cependant les processus bioénergétiques : récemment découvert dans la
mitochondrie (Yong and Searcy, 2001), ce rôle avait déjà été proposé et démontré dès les
années 1990, notamment chez les bactéries photosynthétiques utilisant l‘H2S comme donneur
d‘électrons (Shahak et al., 1992) (Reinartz et al., 1998).
12
Introduction
b) La flavocytochrome c sulfure déshydrogénase (FCSD)
La réaction catalysée in vitro par la FCSD n‘est pas sans rappeler celle réalisée par la
SQR : l‘H2S est oxydé en une chaîne de soufre, et les électrons issus de cette réaction sont
transférés à un accepteur. Dans le cas de la SQR, il s‘agit d‘un « pool » de quinones, alors que
des cytochromes de type c jouent ce rôle pour la FCSD. Ces derniers peuvent à leur tour
transférer ces électrons à une cytochrome c oxydase ou à un centre réactionnel
photosynthétique suivant les organismes (Brune, 1995a). La nature de l‘accepteur d‘électrons
est en accord avec la localisation de l‘enzyme, la FCSD étant le plus souvent soluble et
périplasmique. Cependant, des cas de FCSD ancrées dans la membrane cytoplasmique par un
peptide signal non-clivé ont également été rapportés (Kostanjevecki et al., 2000; Verté et al.,
2002).
Cette protéine est en réalité constituée de deux sous-unités distinctes : FccB est une
flavoprotéine au repliement très similaire à celui des SQR de 40-47 kDa qui lie l‘H2S, et FccA
est un cytochrome de type c. Ce dernier peut comporter un seul ou deux hèmes c, pour une
masse moléculaire de 10 et 21 kDa respectivement. Par exemple, FccA d‘Allochromatium
vinosum et de Termochromatium tepidum (dont les structures sont connues) possèdent deux
hèmes (Chen et al., 1994; Hirano et al., 2012) (Figure 4).
Figure 4. Structure de la flavocytochrome c sulfure déshydrogénase (FCSD) d’Allochromatium vinosum.
FccA est représentée en bleu, et FccB en gris. Les cofacteurs sont représentés sous forme de bâtonnets, le FAD
est en jaune et les hèmes de type c sont en rouge. L‘identifiant PDB est 1FCD.
13
Introduction
Le rôle in vivo de cette protéine n‘est pas vraiment clair : s‘il ne fait aucun doute sur la
réaction qu‘elle catalyse, des souches mutantes d‘Allochromatium vinosum déficientes en
FCSD, cultivées en présence d‘H2S, présentent un phénotype identique à celui de la souche
sauvage, que ce soit au niveau de la croissance ou des taux d‘oxydation de l‘H 2S (Reinartz et
al., 1998). Ceci indique la présence d‘un système alternatif qui réalise l‘essentiel de
l‘oxydation de l‘H2S, probablement la SQR. Il a en revanche été proposé que la FCSD soit
plus avantageuse dans certaines conditions de croissance non encore identifiées, par exemple
dans le cas de concentrations en H2S bien plus faibles que celles couramment utilisées en
laboratoire (Brune, 1995a).
2. Oxydation du thiosulfate (S2O32-)
Le thiosulfate est une molécule stable et abondante dans l‘environnement, et peut être
réduit ou oxydé par nombre de micro-organismes. Deux voies principales d‘oxydation du
thiosulfate sont prédominantes : la condensation oxydative de deux molécules de thiosulfate
en tétrathionate (S4O62-) par les thiosulfate : accepteur oxydoréductases (thiosulfate
déshydrogénase, EC 1.8.2.2), et l‘oxydation complète en sulfate en plusieurs étapes par le
système Sox (Sulfur Oxidizing system).
a) Thiosulfate : accepteur oxydoréductase (TAOR)
La formation de tétrathionate à partir de thiosulfate est bien documentée chez des
bactéries utilisant le thiosulfate comme substrat supplémentaire (mais pas unique), telles que
les Pseudomonas et les Halomonas (Sorokin et al., 1999), ainsi que chez Allochromatium
vinosum, l‘une des rares bactéries phototrophes sulfureuses à posséder un tel système. Chez
cette dernière, la protéine TsdA oxyde le thiosulfate en tétrathionate avec le ferricyanure
comme accepteur artificiel d‘électrons. C‘est un monomère de 25,8 kDa, présent dans le
périplasme, et contenant deux hèmes de type c (Denkmann et al., 2012; Hensen et al., 2006).
Elle est assez semblable à la thiosulfate déshydrogénase d‘Acidithiobacillus thiooxidans, un
cytochrome de type c de 27,9 kDa (Nakamura et al., 2001). Cependant, la plupart des autres
protéines de cette famille sont assez différentes les unes des autres, ce qui a été interprété
comme une évolution convergente plutôt que divergente (Visser et al., 1996).
14
Introduction
Chez Acidianus ambivalens, une thiosulfate : quinone oxydoréductase (TQOR)
membranaire a été caractérisée (Müller et al., 2004). Ce complexe est composé de quatre
protéines : deux copies de la sous-unité DoxA (28 kDa), et deux copies de la sous-unité DoxD
(16 kDa) (Figure 5). Ni l‘une ni l‘autre ne comporte de cofacteur, mais des quinones ont été
retrouvées liées de manière non-covalente au complexe purifié. Ainsi, le « pool » de quinones
est identifié comme l‘accepteur physiologique des électrons issus de l‘oxydation du
thiosulfate en tétrathionate. Cette découverte a son importance, puisque cet accepteur est
différent de ce qui avait été caractérisé jusque là chez les autres organismes (ferricyanure ou
cytochrome c), révélant ainsi un tout nouveau mécanisme énergétique d‘oxydation du
thiosulfate. Il faut noter que DoxA et DoxD avaient tout d‘abord été identifiées comme des
sous-unités faisant partie de la quinol : oxygène oxydoréductase (cytochrome aa3) au cours de
sa purification (Purschke et al., 1997). Les travaux menés en 2004 par Müller et
collaborateurs (Müller et al., 2004) montrent ainsi qu‘il s‘agit en fait de deux complexes
indépendants, mais fonctionnant en synergie, puisque la réduction de l‘oxygène a été mesurée
sur des membranes quand le thiosulfate était ajouté au test. Pour la première fois, il avait ainsi
été montré une nouvelle voie bioénergétique associant l‘oxydation du thiosulfate et la
réduction du « pool » de quinones par la TQOR, à la réduction de l‘oxygène par l‘oxydase
terminale (Figure 5).
Figure 5. Modèle de la TQOR (DoxAD) d’Acidianus ambivalens et lien avec la réduction de l’oxygène
(DoxBC) (Müller et al., 2004). CQ et CQH2 représentent respectivement la caldariella quinone oxydée et réduite.
a, hème de type a ; a3, hème de type a3 ; CuB, centre cuivre B.
15
Introduction
Le devenir du tétrathionate ainsi formé n‘est pas clair. Il a été proposé que le
tétrathionate soit réduit chimiquement en présence d‘H 2S pour donner du thiosulfate et du
soufre élémentaire (Kletzin et al., 2004) (Figure 6), une réaction possible in vitro qui est de
plus favorisée à haute température (Xu et al., 1998) (Xu et al., 2000) comme c‘est le cas chez
l‘archée hyperthermophile Acidianus ambivalens. A noter toutefois qu‘une tétrathionate
hydrolase a été isolée à partir du pseudo-périplasme d‘Acidianus ambivalens cultivée sur
tétrathionate, protéine absente lorsque les cellules sont cultivées sur soufre. Cette protéine
n‘est donc pas le partenaire de « recyclage » du tétrathionate produit par la TQOR (Protze et
al., 2011).
Figure 6. Cycle hypothétique thiosulfate / tétrathionate (Kletzin et al., 2004). Le thiosulfate est oxydé en
tétrathionate par la TQO (=TQOR), et le tétrathionate réagit chimiquement avec l‘H2S pour donner du soufre
élémentaire S° et du thiosulfate.
b) Le système Sox
Le système Sox périplasmique (aussi appelé TOMES pour Thiosulfate Oxidation
MultiEnzymes System) est constitué de plusieurs enzymes, et est responsable de l‘oxydation
du thiosulfate en sulfate, un cytochrome c jouant le rôle d‘accepteur d‘électrons. Il a été isolé
pour la première fois chez Paracoccus versutus (Lu et al., 1985) et Paracoccus pantotrophus
(Friedrich et al., 2001; Rother et al., 2001). Chez cette dernière, il est essentiel à l‘oxydation
in vivo du thiosulfate, et catalyse in vitro la réduction de cytochrome de type c couplée à
l‘oxydation du thiosulfate, du sulfure, du sulfite et du soufre élémentaire.
Quinze gènes codant pour des protéines Sox, organisés en groupe, sont retrouvés chez
Paracoccus pantotrophus. L‘activité de ce système repose sur le produit de sept gènes codant
pour quatre protéines périplasmiques (SoxAX, SoxB, SoxYZ et SoxCD) représentant le cœur
du système. Si SoxY et SoxZ ne possèdent pas de cofacteurs, SoxX comporte un hème de
16
Introduction
type c, SoxA en compte deux (dont un est redox-inactif et l‘autre directement impliqué dans
la catalyse) (Reijerse et al., 2007), de même que SoxD, alors que SoxC est une
molybdoprotéine (Quentmeier et al., 2000). Enfin, SoxB est monomérique et contient un
centre binucléaire à manganèse (Epel et al., 2005). Un modèle de mécanisme catalytique a été
proposé (Friedrich et al., 2001) dans lequel le complexe SoxYZ peut être vu comme une
plateforme liant le soufre sur lequel les autres acteurs vont agir (Figure 7). En effet, SoxY
possède une cystéine conservée (Quentmeier and Friedrich, 2001) sur laquelle SoxAX fixe
une molécule de thiosulfate, puis SoxB réalise le clivage hydrolytique du groupement
sulfonate (-SO3) du thiosulfate en libérant une molécule de sulfate (SO 4). Sox(CD)2 agit
ensuite comme une soufre déshydrogénase en oxydant le dernier atome de soufre encore lié à
SoxYZ, le transformant en un nouveau groupement sulfonate. SoxB libère alors une dernière
molécule de sulfate, régénérant ainsi SoxYZ en sa forme de départ. La participation de
SoxYZ à toutes les étapes de l‘oxydation du thiosulfate en fait un pivot du système Sox : sa
cystéine, située sur un bras flexible, permet aux intermédiaires soufrés d‘accéder aux sites
actifs des autres partenaires du système (Sauvé et al., 2007).
Figure 7. Mécanisme catalytique du système Sox (Kappler and Maher, 2012). SoxYZ est représenté par les
formes géométriques (rond et triangle). Le soufre de la cystéine de SoxY est également représenté.
17
Introduction
Le rôle des autres protéines du système Sox de Paracoccus pantotrophus n‘est pas
clairement établi, et seule l‘appartenance à une famille protéique, ou un phénotype obtenu
après mutation du gène considéré, ont pu être établis. On sait notamment que les protéines
SoxR (répresseur de la famille ArsR) et SoxS (thiorédoxine) sont impliquées dans la
régulation du système Sox (Rother et al., 2005). La protéine membranaire SoxV et la
thiorédoxine périplasmique SoxW interviendraient dans une étape de réduction nécessaire à la
pleine activité in vivo du système (Bardischewsky et al., 2006a), et SoxF est une flavoprotéine
monomérique possédant une activité sulfure déshydrogénase (Quentmeier et al., 2004) dont
l‘inactivation entraine une diminution de l‘activité d‘oxydation du thiosulfate in vivo
(Bardischewsky et al., 2006b).
Le système Sox a été découvert chez de nombreux autres organismes, et certaines
différences majeures ont été mises en évidence, notamment sur la présence des protéines
« accessoires ». Par exemple, une nouvelle protéine SoxK a été montrée comme liant et
stabilisant le complexe SoxAX (Ogawa et al., 2008). SoxA justement ne contient qu‘un seul
hème chez de nombreuses espèces dont Allochromatium vinosum, Chlorobaculum tepidum ou
Starkeya novella. Le nombre d‘hème(s) de SoxA, la présence ou non de SoxK et la taille de
SoxX ont permis une classification en quatre types phylogénétiquement reliés du complexe
SoxAX (Kappler and Maher, 2012). A noter également qu‘un centre cuivre (II)
mononucléaire potentiellement impliqué dans la catalyse a été découvert dans le complexe
SoxAX de Starkeya novella, une caractéristique qui pourrait être partagée par le même
complexe d‘autres organismes (Kappler et al., 2008).
La principale divergence concerne cependant les constituants du cœur réactionnel,
puisqu‘un nombre conséquent d‘organismes ne possèdent pas le complexe SoxCD. Cette
absence est corrélée à la présence de globules de soufre, généralement dans le périplasme des
bactéries, comme intermédiaire de l‘oxydation du thiosulfate (Hensen et al., 2006) (Frigaard
and Dahl, 2008). Un modèle de mécanisme de ce système Sox tronqué a également été
proposé. La liaison du thiosulfate à SoxYZ par SoxAX est identique, de même que la
libération d‘un sulfate par SoxB. Cependant, l‘atome de soufre restant du thiosulfate ne peut
pas être oxydé plus avant, et il est probablement transféré en l‘état aux globules de soufre en
croissance par un mécanisme encore inconnu. Alternativement, il peut rester lié sur la cystéine
de SoxY, et un nouveau cycle catalytique recommence avec la fixation d‘une nouvelle
molécule de thiosulfate sur ce soufre au lieu de la cystéine. La répétition de ces cycles produit
ainsi une chaîne de soufre dont le devenir est probablement là encore la formation des
18
Introduction
globules de soufre (Kappler and Maher, 2012) (Figure 8). La façon dont cet atome ou cette
chaîne de soufre est retirée de SoxY n‘est pas connue, mais l‘implication de la protéine SoxL,
appartenant à la superfamille des rhodanèses, a été récemment proposée dans ce processus de
recyclage de SoxY (Bagchi, 2012; Welte et al., 2009). Un des éléments en faveur du lien entre
l‘oxydation du thiosulfate par le système Sox et la formation des globules de soufre comme
intermédiaires a été fourni par l‘étude d‘une souche mutante d‘Allochromatium vinosum,
altérée dans sa capacité à produire des globules de soufre (souche déficiente pour les protéines
d‘enveloppe des globules) (Prange et al., 2004). La culture de cette souche sur thiosulfate est
alors rendue impossible.
Figure 8. Mécanisme catalytique du système Sox tronqué (Kappler and Maher, 2012). En l‘absence de
SoxCD, un atome de soufre reste lié sur SoxY, et SoxAX y fixe une nouvelle molécule de thiosulfate. La
répétition de plusieurs de ces cycles entraine la production d‘une chaine de soufre.
Finalement, les mécanismes catalytiques proposés expliquent également la capacité du
système Sox à oxyder in vitro d‘autres composés comme les sulfures, le sulfite ou le soufre
19
Introduction
élémentaire (Sauvé et al., 2007) (Figure 9). Cependant, il est encore difficile aujourd‘hui de
préciser si ce comportement in vitro est le reflet d‘un fonctionnement in vivo du système Sox.
Figure 9. Mécanisme catalytique proposé du système Sox avec des substrats alternatifs (Kappler and
Maher, 2012). A, mécanisme avec les sulfures, et B, mécanisme avec le sulfite.
3. Oxydation du sulfite (SO32-)
Tout comme l‘H2S, le sulfite est à la fois un poison est un élément très important pour
les organismes ayant un métabolisme énergétique basé sur le soufre. C‘est un composé très
réactif capable de réagir avec des biomolécules telles que les protéines et l‘ADN ; ses
propriétés antimicrobiennes sont d‘ailleurs bien connues et mises à profit comme agent de
conservation dans l‘industrie agro-alimentaire, notamment dans les vins (codes européens
E220-228). Mais il est également produit de manière endogène, par exemple au cours de
l‘oxydation de composés soufrés en sulfate, et représente ainsi une étape intermédiaire de ce
type de métabolisme. L‘oxydation des sulfites à des fins bioénergétiques se fait selon deux
voies principales chez les micro-organismes : la première est une voie directe et met en jeu
une sulfite : accepteur oxydoréductase, et la seconde est une voie indirecte utilisant l‘AMP,
avec l‘adénosine-5‘-phosphosulfate (adénylylsulfate ou APS) comme
réactionnel (Figure 10).
20
intermédiaire
Introduction
Figure 10. Les deux voies d’oxydation du sulfite en sulfate (Kappler and Dahl, 2001). La voie de gauche est la
voie directe mettant en jeu une SAOR, la voie de droite est celle de l‘APS, ou voie indirecte impliquant une APS
réductase ainsi qu‘une ATP sulfurylase ou l‘APAT.
a) Sulfite: accepteur oxydoréductase (SAOR)
Ce type d‘enzyme fait partie de la grande famille des sulfites oxydases, des protéines à
molybdène représentées dans toutes les branches de la vie, qui oxydent le sulfite en sulfate
(Kappler, 2011). Les sulfite oxydases sont impliquées dans divers processus comme la
dégradation des organosulfonates (Denger et al., 2008), la résistance de bactéries pathogènes
au système immunitaire (Myers and Kelly, 2005), la détoxification du sulfite ou son
utilisation à des fins bioénergétiques.
L‘un des systèmes les mieux connus chez les bactéries est le complexe périplasmique
SorAB de Starkeya novella, composé d‘une sous-unité à molybdène de 40 kDa et d‘une petite
sous-unité de type cytochrome c de 9 kDa (Figure 11) (Kappler and Bailey, 2005; Kappler et
al., 2000). Cette organisation hétérodimérique, ainsi que le mode d‘action de cette enzyme,
rappelle clairement les FCSD : en effet, le sulfite est oxydé au niveau de la sous-unité à
molybdène, et les électrons sont transférés à l‘hème de la petite sous-unité puis à un autre
cytochrome c de la bactérie. Un système analogue a été montré dans le périplasme de la
bactérie thermophile Thermus thermophilus (Figure 12), bien que le fonctionnement en
21
Introduction
complexe des deux protéines n‘ait pas été montré (Robin et al., 2011). De plus, la plus petite
des sous-unités possède deux hèmes au lieu d‘un seul.
Figure 11. Structure de la sulfite : cytochrome c oxydoréductase de Starkeya novella. SorA est représentée
en gris, et SorB en bleu. Le cofacteur à molybdène (molybdoptérine, en violet) et l‘hème de type c (en rouge)
sont représentés sous formes de bâtonnets. L‘identifiant PDB est 2BPB.
Figure 12. Modèle de l’oxydation du sulfite chez Thermus thermophilus (Robin et al., 2011). La SAOR
oxyde le sulfite en sulfate et transfère les deux électrons libérés à son partenaire, le cytochrome c550, lequel va
ensuite les transférer au cytochrome c552. Ces électrons vont permettre de réduire l‘accepteur terminal,
l‘oxygène, via les oxydases terminales de type ba3 ou caa3. La voie classique complexe bc1-cytochrome c552oxydases terminales est également représentée.
22
Introduction
Une activité SAOR a également été détectée dans les membranes d‘Acidianus
ambivalens et Acidianus tengchongensis (Chen et al., 2005; Zimmermann et al., 1999), mais
l‘enzyme responsable n‘a pas été purifiée. Cette localisation membranaire suggère un « pool »
de quinones comme accepteur d‘électrons, mais l‘activité n‘a pu être mesurée qu‘en présence
de ferricyanure (utilisé pour mimer l‘hème des cytochromes), la catalyse n‘ayant pas eu lieu
en présence de quinones. Aucun cytochrome de type c n‘ayant été détecté chez les
Sulfolobales dont font partie les Acidianus (Laska et al., 2003; Schäfer et al., 1996), les
auteurs envisagent la possibilité d‘un biais expérimental pour expliquer l‘absence d‘activité
quinone-dépendante.. Cependant, des résultats non-publiés mais évoqués dans une revue
(Kletzin et al., 2004) présentent la décylubiquinone comme accepteur artificiel d‘électrons.
Il faut enfin noter que l‘oxydation directe in vitro du sulfite par la cytochrome c
oxydase de type aa3 (oxydase terminale) d‘Aciditiobacillus ferrooxidans a récemment été
rapportée (Sugio et al., 2010).
b) Voie de l‘APS
Cette voie qualifiée d‘indirecte est énergétique par la production d‘ATP qu‘elle génère
à partir du sulfite. La première étape de cette voie de l‘APS est réalisée par une APS réductase
(ou adénylylsulfate réductase, EC 1.8.99.2) qui consomme le sulfite et l‘AMP pour donner de
l‘APS (Figure 13 réaction 1). La seconde partie est plus variable, deux systèmes étant
retrouvés suivant les organismes. Chez Allochromatium vinosum par exemple, une ATP
sulfurylase (ou ATP : sulfate adénylyltransférase, EC 2.7.7.4) utilise l‘APS et un pyrosphate
(PPi) pour générer de l‘ATP et du sulfate (Figure 13 réaction 2), alors que chez Acidianus
ambivalens, deux étapes sont nécessaires pour générer de l‘ATP (Zimmermann et al., 1999).
Une adénylylsulfate : phosphate adénylyltransférase (APAT, anciennement ADP sulfurylase)
produit de l‘ADP et du sulfate à partir d‘APS et de phosphate (Figure 13 réaction 3), puis
l‘adénylate kinase convertit deux molécules d‘ADP en ATP et AMP (Figure 13 réaction 4).
23
Introduction
Figure 13. Réactions catalysées par les différentes enzymes de la voie indirecte de l’APS. Les structures de
l‘AMP, de l‘APS, de l‘ADP et de l‘ATP sont montrées, et la partie qui va subir des modifications est encadrée en
rouge. La première étape est toujours catalysée par l‘APS réductase, alors que la suite de la voie dépend des
organismes. Une première possibilité n‘implique qu‘une seule enzyme (ATP sulfurylase) et une seule réaction
qui génère de l‘ATP et du sulfate ; dans l‘autre cas, l‘action combinée de l‘APAT et de l‘adénylate kinase mène
au même résultat.
Les acteurs de cette voie ont pu être caractérisés chez certains organismes : l‘ATP
sulfurylase de la bactérie symbiote du ver marin Riftia pachyptila est un homodimère de 90
kDa environ (Beynon et al., 2001), alors que celle d‘Allochromatium vinosum a été isolée
sous forme d‘un monomère de 45 kDa (Frigaard and Dahl, 2008). L‘APAT de Thiobacillus
denitrificans est, elle, un homodimère composé de sous-unités de 41,4 kDa. Concernant
l‘APS réductase la forme physiologique est un hétérodimère constitué d‘une sous-unité AprA
de 70-80 kDa liant un FAD et d‘une sous-unité AprB de 18- 23 kDa liant deux centres [4Fe4S] (Fritz et al., 2000; Hipp et al., 1997; Speich et al., 1994). Un mécanisme catalytique a
également été proposé dans lequel le sulfite forme un complexe avec le FAD, puis la réaction
24
Introduction
avec l‘AMP a lieu pour donner de l‘APS, les deux électrons étant transférés via la flavine aux
centres fer-soufre.
Ces réactions ont lieu dans le cytoplasme : APAT et ATP sulfurylase sont clairement
solubles et localisées dans le cytoplasme (Brüser et al., 2000; Brune, 1995a), alors que l‘APS
réductase peut être soit soluble et localisée dans le cytoplasme soit liée à la membrane (et
orientée vers le cytoplasme). On retrouve en effet chez Allochromatium vinosum un opéron
constitué des gènes sat (ATP sulfurylase) et aprMBA (APS réductase), où AprM serait une
ancre membranaire putative non caractérisée (Frigaard and Dahl, 2008). Chez d‘autres
bactéries ne possédant pas AprM, telles que Chlorobaculum tepidum, on retrouve les gènes
codant pour l‘ATP sulfurylase et l‘APS réductase clustérisés avec ceux codant pour un
complexe membranaire nommé Qmo (Quinone-interacting membrane-bound oxidoreductase).
Ce complexe est composé de trois sous-unités, QmoABC, avec QmoA et QmoB
cytoplasmiques, et QmoC membranaire. Il aurait notamment pour rôle de capter les électrons
produits pendant l‘oxydation du sulfite par l‘APS réductase, et de les insérer dans les chaînes
respiratoires via le « pool » de quinones (Pires et al., 2003; Rodriguez et al., 2011) (Figure
14). Il a donc été proposé que la protéine AprM joue le même rôle que le complexe Qmo chez
les bactéries où elle est présente (Frigaard and Dahl, 2008).
Figure 14. Modèle de la voie de l’APS chez Chlorobaculum tepidum impliquant le complexe membranaire
Qmo (Rodriguez et al, 2011). Les électrons issus de l‘oxydation du sulfite sont captés par le complexe Qmo et
transférés au « pool » de quinones. MK, ménaquinone ; ApsBA, APS réductase ; Sat, ATP sulfurylase ; b, hème
de type b ; FeS, centre [4Fe-4S] ; FAD, site de fixation du cofacteur FAD ; 4C, motif cystéine conservé.
25
Introduction
4. Oxydation du soufre stocké dans les globules
Comme il a été dit précédemment, l‘oxydation du thiosulfate par un système Sox ne
possédant pas la soufre déshydrogénase SoxCD conduit à l‘apparition de globules de soufre
comme intermédiaires réactionnels (Chapitre I, II.A.2.b). D‘autres situations, comme par
exemple l‘oxydation de l‘H2S par les bactéries phototrophes sulfureuses, conduisent
également à la formation de ces globules de soufre (Figure 15). Le mécanisme de stockage de
ce soufre de manière transitoire, dans le périplasme ou à l‘extérieur des cellules, est encore
mal décrit. En revanche, la façon dont il est ensuite utilisé est mieux connue et repose
notamment sur un système nommé Dsr pour « Dissimilatory Sulfite Reductase » (Dahl et al.,
2005; Holkenbrink et al., 2011; Pott and Dahl, 1998). Chez les organismes sulfato-réducteurs,
où le système Dsr a tout d‘abord été décrit, cette voie catalyse la réduction du sulfite en H 2S
au cours de la dernière étape de la respiration du sulfate (Matias et al., 2005). Mais chez les
bactéries phototrophes produisant des globules de soufre, telle qu‘Allochromatium vinosum, la
voie fonctionne en sens inverse, le soufre élémentaire des globules étant oxydé en sulfite.
Figure 15. Bactéries sulfureuses phototrophes présentant des globules de soufre (Frigaard and Dahl, 2008)
(Frigaard et Dahl, 2008). A, Thiocapsa sp. et ses globules intracellulaires (zones claires) vue au microscope
optique. B, globules de soufre à l‘extérieur de Chlorobium phaeovibrioides. C, globules intracellulaires
(périplasmiques) de Thiocystis violaceae. D, globule de soufre chez Thiocapsa roseopersicina dont l‘enveloppe
protéique est bien visible. Le traitement des cellules pour la microscopie électronique (C et D) a provoqué la
disparition du soufre, le globule est ainsi vu comme un ―trou‖ dans la bactérie.
26
Introduction
Chez
Allochromatium
vinosum,
un
groupe
de
quinze
gènes,
désignés
dsrABEFHCMKLJOPNRS, code pour les protéines de ce système pour lesquelles un rôle
précis n‘a pas encore été clairement établi. L‘un des composants majeurs est le complexe
cytoplasmique DsrAB, constitué de deux sous-unités A et deux sous-unités B, qui catalyse
l‘oxydation du soufre issu des globules en sulfite. Le groupement prosthétique de ce
complexe a été identifié comme un siroamide-[4Fe-4S], le siroamide étant une forme
modifiée (amide) du sirohème dont la structure est assez proche de celles des hèmes
classiques. DsrN a été proposée comme une enzyme de maturation catalysant l‘amidation
glutamine-dépendante du sirohème (Lubbe et al., 2006). La fusion des gènes dsrN et dsrR
chez une bactérie chimiotrophe oxydant le soufre, endosymbiote de Calyptogena magnifica
(Newton et al., 2007), a permis d‘envisager que DsrR soit également impliquée dans la
biosynthèse du sirohème. Cependant, des études plus récentes suggèrent plutôt un rôle
essentiel de cette protéine dans la régulation post transcriptionnelle du système Dsr (Grimm et
al., 2010). DsrC est une petite protéine cytoplasmique possédant des résidus cystéine très
conservés en position C-terminale. DsrEFH est un complexe cytoplasmique de 75 kDa de la
forme α2β2γ2 possédant également des cystéines conservées (Dahl et al., 2005). Enfin, un
complexe DsrMKJOP transmembranaire et transporteur d‘électrons est absolument requis
pour l‘oxydation du soufre présent dans les globules (Sander et al., 2006). Il est composé de la
protéine membranaire DsrM comportant deux hèmes b, d‘une seconde protéine membranaire
DsrP, de la protéine cytoplasmique à fer-soufre DsrK, et des protéines périplasmiques DsrJ et
DsrO qui sont respectivement un cytochrome c trihémique et une protéine à centre fer-soufre
(Grein et al., 2010a; Grein et al., 2010b). Enfin, DsrS est cytoplasmique mais sans fonction
attribuée. Le rôle de DsrL n‘est pas non plus clairement établi : c‘est une flavoprotéine
cytoplasmique à centre fer-soufre possédant une activité NADH : accepteur oxydoréductase.
Son importance a pourtant été démontrée par l‘inhibition complète de l‘oxydation des
globules de soufre provoquée par la délétion du gène dsrL (Lubbe et al., 2006).
Le mécanisme par lequel le soufre stocké dans les globules est oxydé par le système
Dsr est encore mal compris. On ignore notamment par quel moyen ce soufre
extracytoplasmique est transporté dans le cytoplasme pour y être utilisé. Un premier modèle a
été proposé dans lequel il est pris en charge sous la forme d‘un persulfure par un transporteur
de type glutathion amide afin de traverser la membrane interne, puis il est libéré par DsrL
sous forme de sulfure d‘hydrogène grâce aux électrons fournis par le NADH. Ce sulfure serait
finalement oxydé par DsrAB, les électrons étant transférés au « pool » de quinones via le
27
Introduction
complexe DsrMKJOP (Frigaard and Dahl, 2008). Cependant, les études menées ces dernières
années ont permis de brosser un tableau un peu différent, mais néanmoins plus précis et plus
complet du mécanisme mis en jeu par le système Dsr. Il a ainsi été montré chez
Allochromatium vinosum que le complexe soluble DsrEFH était capable d‘interagir avec
DsrC, et que la cystéine 78 de DsrE était essentielle à cette interaction (Dahl et al., 2008). Une
autre interaction entre DsrK et DsrC a également été dévoilée, et la réduction par DsrK d‘un
pont disulfure formé par les cystéines 100 et 111 de DsrC a été proposée (Grein et al., 2010a).
Un transfert de soufre de DsrEFH vers DsrC a finalement été démontré ; l‘ensemble de ces
résultats a permis de proposer un nouveau mécanisme catalytique pour le système Dsr (Figure
16) (Stockdreher et al., 2012).
Figure 16. Modèle du mécanisme catalytique du système Dsr chez Allochromatium vinosum (Stockdreher et
al., 2012). Le mécanisme est décrit dans le texte. S° représente les globules de soufre élémentaire
périplasmiques, RSH et RSSH représente le composé navette hypothétique chargé du transport du soufre du
périplasme au cytoplasme, dans sa forme native et persulfurée. DsrEFH ne sont représentées que par EFH pour
des questions de lisibilité.
28
Introduction
Le transport du soufre dans le cytoplasme se fait par un mécanisme encore inconnu, il
est transféré au complexe DsrEFH sur la cystéine 78 de DsrE sous forme de persulfure
probablement via une protéine non-identifiée. L‘atome de soufre est alors transféré sur la
cystéine 111 de DsrC (la cystéine devient persulfurée), puis DsrAB vient oxyder ce soufre lié
en un groupement sulfonate (-SO3-), libérant ainsi six électrons. Le sulfonate fixé sur DsrC est
libéré sous forme de sulfite par la création d‘un pont disulfure intramoléculaire (cystéines 100
et 111 de DsrC). L‘interaction de DsrC avec le complexe DsrMKJOP, et plus particulièrement
avec DsrK, va permettre la réduction de ce pont disulfure grâce aux électrons fournis par le
complexe, probablement à partir de quinones. Dans ce processus, DsrEFH et DsrC agissent
comme un système-relai pour le soufre, DsrAB est le catalyseur de l‘oxydation, et le
complexe membranaire DsrMKJOP permet de régénérer DsrC sous sa forme de départ.
L‘interrogation principale sur ce système est maintenant de comprendre comment le
soufre stocké dans les globules est transporté dans le cytoplasme et transféré à DsrEFH. Il
avait été proposé l‘action d‘un composé de type glutathion amide, mais il a été montré que ni
DsrEFH ni DsrC n‘étaient capables de lier du soufre à partir de composés de faible poids
moléculaire comme le thiosulfate ou le glutathion. L‘intervention d‘une autre protéine liant le
soufre, éventuellement à partir d‘un glutathion amide, et interagissant avec DsrEFH afin de
transférer son substrat est envisagée ; cette interaction pourrait être médiée par la cystéine 20
de DsrH, puisqu‘il a été montré qu‘elle est essentielle à l‘oxydation du soufre contenu dans
les globules par le système Dsr.
B) La réduction du soufre : soufre/polysulfure réductase
De nombreux organismes sont capables de croître en utilisant l‘hydrogène et le soufre
élémentaire ou le polysulfure (deux types de chaînes de soufre, Figure 1) respectivement
comme donneur et comme accepteur d‘électrons. Cette activité d‘oxydation de l‘hydrogène et
de réduction du soufre élémentaire (ou du polysulfure) en H 2S peut être portée par une seule
enzyme, comme c‘est le cas des sulfhydrogénases solubles de Pyrococcus furiosus par
exemple (Ma et al., 1993; Ma et al., 2000). Cependant, le cas général implique plutôt la
présence de deux enzymes membranaires (constituées de plusieurs sous-unités) travaillant de
concert, une hydrogénase et une soufre (ou polysulfure) réductase.
29
Introduction
Chez les archées, deux types d‘organisation ont été dévoilés : Acidianus ambivalens
présente ainsi deux enzymes physiquement séparées mais reliées par des quinones (Laska et
al., 2003), alors que chez l‘hyperthermophile Pyrodictium abyssi, cette voie se retrouve sous
la forme d‘un supercomplexe (Dirmeier et al., 1998), c'est-à-dire l‘association stable et
fonctionnelle de deux complexes (ici le complexe hydrogénase et le complexe soufre
réductase). Dans ce dernier cas, le supercomplexe membranaire, d‘une masse moléculaire de
520 kDa, est composé de neuf sous-unités différentes, parmi lesquelles une hydrogénase à
nickel-fer, la soufre réductase, et des hèmes de type b et c. De manière intéressante, aucune
quinone n‘a été retrouvée dans le supercomplexe purifié, et l‘activité H2 : soufre
oxydoréductase in vitro n‘en nécessite pas non plus. Le séquençage N-terminal des sousunités de 82 et de 24 kDa montre des similarités avec les sous-unités SreA et SreB de la
soufre réductase d‘Acidianus ambivalens, laquelle fait partie des molybdoenzymes de la
famille des DMSO réductases : il en a donc été conclu que la soufre réductase de Pyrodictium
abyssi est également une molybdoenzyme de cette famille, bien que ni molybdène, ni
tungstène (qui le remplace souvent chez les archées) n‘ont été retrouvés dans le
supercomplexe. Les auteurs proposent que ces métaux soient perdus durant les étapes de
purification, mais, le fait qu‘une activité soufre réductase soit observée vient contredire cette
hypothèse.
Dans le cas d‘Acidianus ambivalens, la soufre réductase purifiée à partir des
membranes solubilisées réduit le soufre élémentaire en présence d‘une hydrogénase copurifiée, et de quinones ou de cytochrome c comme transporteurs d‘électrons in vitro.
L‘absence de cytochrome c chez cet organisme a conduit à proposer les quinones comme
navette électronique physiologique. Les deux enzymes peuvent être séparées par des étapes de
purification supplémentaires, mais l‘activité de la soufre réductase est alors perdue, alors que
celle de l‘hydrogénase est conservée. Les deux enzymes ont une même masse d‘environ 250
kDa ; l‘analyse des complexes purifiés ainsi que des groupes de gènes codant pour ces
protéines ont montré qu‘elles sont constituées de plusieurs sous-unités : SreA et SreB
présentent des similarités de séquence avec la sous-unité catalytique et celle à centres [4Fe4S] respectivement des molybdoprotéines de la famille des DMSO réductases (Figure 17).
De plus, SreA contient en N-terminal un motif « twin arginine », indiquant son export vers le
périplasme. SreC est l‘ancre membranaire du complexe, et SreD est une polyferrédoxine
putative contenant 26 cystéines, dont le rôle n‘est pas identifié au sein du complexe. Il existe
30
Introduction
également une protéine SreE qui serait une protéine chaperon spécifique impliquée dans
l‘insertion du cofacteur à molybdène dans la sous-unité SreA.
Figure 17. Modèle de la voie anaérobie hydrogène-soufre chez Acidianus ambivalens (à gauche) et
Wolinella succinogenes (à droite) (Laska et al., 2003). Sre et Psr sont les soufre et polysulfure réductases, Hyn
représente l‘hydrogénase, SQ et MK symbolisent les quinones. Les cofacteurs de chaque sous-unité sont
représentés.
Concernant l‘hydrogénase, elle est codée par un groupe de douze gènes incluant les
sous-unités à nickel-fer catalytique et à centre fer-soufre, ainsi que certaines des protéines de
maturation dédiées à ce système. Là encore, une ancre membranaire ainsi qu‘un motif « twin
arginine » présent dans la séquence de la sous-unité à fer-soufre placent l‘hydrogénase dans la
membrane avec une orientation périplasmique (Figure 17). On a donc deux enzymes séparées
mais reliées par des quinones, constituées de plusieurs sous-unités, ancrées dans la membrane
et orientées vers le périplasme. Cette organisation est très clairement identique à celle de la
voie hydrogène-polysulfure caractérisée chez la bactérie mésophile Wolinella succinogenes,
associant l‘oxydation de l‘hydrogène à la réduction du polysulfure via des quinones, bien que
certaines sous-unités additionnelles soient présentes pour chaque enzyme d‘Acidianus
ambivalens (Figure 17) (Dietrich and Klimmek, 2002) (Laska et al., 2003).
31
Introduction
Le polysulfure peut également servir d‘accepteur terminal d‘électrons lors de la
croissance anaérobie de la bactérie Thermus thermophilus. Sa réduction en H2S est assurée
par une polysulfure réductase utilisant les quinones réduites comme donneurs d‘électrons, et
dont la structure tridimensionnelle a récemment été déterminée (Jormakka et al., 2008)
(Figure 18). L‘enzyme elle-même est composée de trois sous-unités (PsrABC), dont une ancre
membranaire (PsrC) portant le site de fixation des quinones et permettant la dimérisation du
complexe, une sous-unité à quatre centres [4Fe-4S] (PsrB) et une sous-unité catalytique
(PsrA) portant un centre [4Fe-4S] aligné avec ceux de PsrB en plus d‘un cofacteur à
molybdène (bis-MGD). Comme dans le cas des autres molybdoenzymes de la famille des
DMSO réductases, ce site catalytique n‘est donc pas exposé en surface de la protéine mais
enfoui au fond d‘une cavité en forme d‘entonnoir dont l‘entrée est tapissée de résidus
basiques pouvant interagir avec le polysulfure anionique.
Figure 18. Structure de la polysulfure réductase de Thermus thermophilus (Jormakka et al., 2008). Le
cofacteur à molybdène (bis-MGD) est représenté en sphères oranges, le molybdène est une sphère noire. Les
centres [4Fe-4S] sont représentées par des sphères jaunes et rouges, et l‘analogue de quinone est en sphères
noires. La distance entre les centres redox est indiquée à droite de ces derniers en Å. L‘arc rouge représente la
cavité en entonnoir de la sous-unité catalytique PsrA. L‘identifiant PDB est 2VPZ.
32
Introduction
C) Un cas particulier : la dismutation du soufre (SOR)
En 1989, Kletzin publie chez l‘archée thermoacidophile Desulfurolobus ambivalens
(renommée depuis Acidianus ambivalens) la purification à partir du cytoplasme d‘une enzyme
responsable de la dismutation oxygène-dépendante du soufre élémentaire en sulfite,
thiosulfate et sulfure d‘hydrogène. Cette réaction nécessite impérativement de l‘oxygène,
mais aucun cofacteur externe ou donneur d‘électrons n‘est requis. La protéine, portant à la
fois l‘activité d‘oxydation et de réduction du soufre, est ainsi baptisée SOR pour Soufre
Oxygénase Réductase (Kletzin, 1989). Depuis, plusieurs SOR ont été détectées dans les
génomes, certaines ont également été caractérisées biochimiquement et/ou structuralement,
révélant ainsi que cette protéine n‘est pas l‘apanage des organismes hyperthermophiles
comme cela était supposé auparavant (Figure 19) (Veith et al., 2012).
Figure 19. Arbre phylogénétique des séquences de SOR disponibles dans GenBank (d‘après (Veith et al.,
2012)). Le séquences soulignées indiquent qu‘une activité SOR a été démontrée dans l‘extrait cellulaire, en gras
sont représentées les SOR caractérisées biochimiquement, celles soulignées deux fois ont été cristallisées et leur
structure déterminée. La température optimale de croissance de l‘organisme est symbolisée par le code couleur :
rouge, > 70°C ; orange, 51 à 70°C ; vert, 40 à 50°C ; bleu, environ 30°C ; noir, inconnue. Uncult, organisme non
cultivé ; Ferropl, Ferroplasma ; Sulfob, Sulfobacillus ; Desulfom, Desulfomicrobium ; Acidithiob,
Acidithiobacillus ; Halothiob, Halothiobacillus.
33
Introduction
1. Réactions catalysées
En fait, l‘activité de la SOR peut être vue comme deux réactions différentes, mais que
l‘on ne peut pas séparer :
Oxygénase : S° + O2 +H2O  HSO3- + H+
Dismutation : 3S° + 3H2O  2H2S + HSO3- + H+
SOR : 4S° + 3H2O + O2  2H2S + 2HSO3- + 2H+
Cependant, il n‘est toujours pas certain que le thiosulfate soit véritablement un produit
direct de la SOR, puisqu‘en effet, une réaction non-enzymatique entre le sulfite et le soufre
élémentaire en excès a lieu à haute température, avec le thiosulfate comme produit. De
manière pratique, il est difficile de déterminer avec précision le devenir des produits de la
réaction in vitro : outre la formation du thiosulfate déjà mentionnée, une oxydation rapide et
non-enzymatique de l‘H2S par l‘oxygène a également lieu (Veith et al., 2011).
2. Structure et architecture
Si la réaction catalysée par la SOR n‘est déjà pas vraiment conventionnelle, son
organisation architecturale est quant à elle tout à fait remarquable. A l‘heure actuelle, seules
deux structures de SOR sont disponibles : la première provient d‘Acidianus ambivalens
(Urich et al., 2006), et la seconde d‘Acidianus tengchongensis (Li et al., 2008b). Ces deux
structures sont extrêmement proches, et montrent que la forme physiologique de la SOR est
une sphère creuse de 24 sous-unités identiques (icosatétramère) d‘environ 845 kDa pour un
diamètre extérieur de 15 nm.
a) Le monomère
Concernant le monomère, il s‘agit d‘une structure constituée d‘un tonneau β (luimême formé par huit brins β antiparallèles) partiellement entouré de neuf hélices α, pour un
poids moléculaire de 35 kDa. De manière intéressante, il peut être partagé en deux moitiés à
peu près égales pseudo-symétriques. Chaque « moitié » de la protéine présente une topologie
qui rappelle le motif (βαβ)2 des ferrédoxines (Figure 20). La présence de deux domaines
34
Introduction
similaires au sein d‘une protéine, dont les séquences sont généralement peu conservées, est
révélatrice d‘une duplication suivie d‘une fusion d‘un même gène ancestral. Les ferrédoxines
en sont d‘ailleurs l‘exemple de référence (Dayhoff et al., 1983).
Figure 20. Le monomère de la SOR résulte d’un évènement de duplication/fusion d’un gène ancestral
(Urich et al., 2006). A, structure du monomère de la SOR, montrant l‘axe de symétrie partageant la protéine en
deux domaines similaires. B, schéma de la topologie en (βαβ) 2 des ferrédoxines. Les triangles représentent les
brins β et les cercles des hélices α. L‘unité (βαβ) N-terminale est en jaune, celle en C-terminal est en vert. C,
topologie de la SOR, la légende est identique à B. On remarque la ressemblance entre chaque « moitié » de la
SOR et avec les ferrédoxines.
Chaque monomère comporte une poche catalytique enfouie (Figure 21), constituée de
trois cystéines (Cys31, Cys101 et Cys104, numérotation identique pour les deux espèces
d‘Acidianus) et d‘un atome de fer non-hémique de bas potentiel (Urich et al., 2004). Les trois
cystéines sont importantes pour l‘activité : dans le cas d‘Acidianus ambivalens, seule la
cystéine 31 est absolument essentielle, une activité résiduelle étant détectée lorsque l‘une des
autres cystéines est mutée (Urich et al., 2005). En revanche, les trois cystéines semblent
indispensables chez Acidianus tengchongensis (Chen et al., 2005). De plus, la cystéine 31 est
retrouvée sous forme persulfure dans la structure cristallographique de la SOR d‘Acidianus
ambivalens, alors qu‘il s‘agit d‘une cystéine « normale » dans le cas d‘Acidianus
tengchongensis. Cette cystéine est probablement le site de fixation du substrat soufré.
35
Introduction
Figure 21. Site catalytique d’un monomère de la SOR d’Acidianus Tengchongensis (Li et al., 2008b). Les
deux couleurs correspondent simplement à la superposition des structures obtenues avec deux cristaux différents.
Les acides aminés importants sont montrés sous forme de bâtonnets, l‘atome de fer est représenté par une grosse
sphère, et la molécule d‘eau par une petite sphère.
La sphère de coordination de l‘atome de fer comprend deux histidines et un acide
glutamique réunis dans un motif H-X3-H-X23-E, ainsi que deux molécules d‘eau dans le cas
d‘Acidianus ambivalens (une seule pour Acidianus tengchongensis). Cette différence résulte
probablement de conditions de cristallisation différentes, et ces deux structures sont donc
certainement deux états différents de la SOR, ne constituant donc pas une divergence de
caractéristiques entre les deux protéines. La position de cette molécule d‘eau « perdue » a été
proposée comme site de liaison de l‘oxygène au fer au cours de la catalyse (Li et al., 2008b;
Urich et al., 2006). Ce même fer jouerait le rôle d‘activateur de l‘oxygène.
b) La protéine entière
C‘est l‘organisation architecturale globale de la SOR qui en fait une protéine aussi
singulière et intéressante. En effet, la sphère creuse formée par les 24 sous-unités est un
véritable nanocompartiment protéique dans lequel les mouvements des substrats et des
produits sont étroitement contrôlés (Figure 22).
36
Introduction
La première chose à noter est que les 24 sites actifs sont isolés du milieu extérieur,
profondément enfouis dans chaque monomère et accessibles uniquement à partir de la cavité
centrale de la sphère via un canal étroit. La poche catalytique est ainsi fermée par deux
méthionines et une phénylalanine dont les chaînes secondaires sont assez flexibles pour
permettre l‘entrée du substrat (Urich et al., 2006) (Veith et al., 2011).
Figure 22. Cheminement du substrat et des produits dans la SOR (d‘après (Li et al., 2008b) et (Veith et al.,
2011)). Le substrat entre (flèche jaune pleine) dans la SOR via une des cheminées à quatre monomères (A) et
rentre dans un des sites catalytiques en passant par le pore d‘un monomère (entouré en jaune). Les produits
(flèche jaune en pointillés) ressortent par ce même pore et sont finalement évacués de la SOR par un canal
constitué de trois monomères (B). A et B, les canaux sont vus de face.
Ceci pose la question de la voie d‘entrée du substrat à l‘intérieur de la sphère.
L‘examen de la surface de la SOR montre l‘existence de six protubérances, chacune
constituée par quatre monomères indépendants. Ces six protubérances forment chacune une
37
Introduction
sorte de cheminée reliant le milieu extérieur à la cavité centrale (Figure 22). La surface
interne de ces cheminées est uniquement constituée de résidus phénylalanine et valine, ce qui
la rend hautement hydrophobe. Cette caractéristique est en accord avec la nature hydrophobe
du substrat soufré, ce qui fait de ces cheminées un point d‘accès parfaitement plausible à
l‘intérieur de la sphère. D‘un point de vue fonctionnel, on peut les interpréter comme des
sortes de « filtres à substrats » qui préviendraient ainsi l‘oxydation de composés indésirables
(Urich et al., 2006) (Veith et al., 2011).
Une fois le substrat entré dans l‘enzyme et transformé dans la poche catalytique, les
produits de la réaction empruntent un dernier canal pour sortir de la SOR. Ce canal étroit est
formé par trois monomères distincts, la forme physiologique de la protéine possède donc huit
de ces canaux de sortie (Figure 22). Un argument en faveur de cette fonction concerne la
charge de leur surface intérieure : des résidus sérine et arginine confère un caractère
hydrophile et une charge globale positive tout à fait en adéquation avec la nature des produits
(Li et al., 2008b; Veith et al., 2011).
Ces données structurales ont également permis d‘émettre une hypothèse quant à la
nature véritable du substrat. Le test in vitro est en effet réalisé avec de la fleur de soufre, c'està-dire le cyclo-octasoufre insoluble. Les modélisations ont montré que celui-ci est trop
volumineux pour passer par la cheminée d‘entrée ou pénétrer dans la poche catalytique sans
subir d‘importantes modifications structurales. Le polysulfure, linéaire et soluble, est en
revanche un bien meilleur candidat (Urich et al., 2006).
3. Vue générale du fonctionnement de la SOR
Les éléments disponibles en matière d‘architecture et de catalyse permettent de
proposer un ordre séquentiel du fonctionnement de la SOR. En premier lieu, le soufre, sous
forme linéaire, passe dans la cavité centrale de la protéine via une des six cheminées
hydrophobes formées par quatre monomères. Ensuite, il pénètre dans la poche catalytique
enfouie dans chaque monomère via un nouveau canal de ce même monomère. Il se lie
covalemment à la cystéine 31 (persulfurée chez Acidianus ambivalens) et s‘aligne par rapport
à l‘atome de fer non-hémique liant l‘oxygène. La première réaction (oxygénase) a alors lieu,
suivie de la dismutation du soufre dans laquelle les cystéines 101 et 104 jouent probablement
un rôle (en plus de stabiliser le substrat). Les produits sortent finalement de la poche
38
Introduction
catalytique puis de la SOR en empruntant l‘un des huit canaux hydrophiles chargés
positivement formés par trois monomères (Figure 22).
III) Complexité des métabolismes énergétiques du soufre :
quelques exemples
Les organismes capables d‘oxyder le soufre ne présentent généralement pas qu‘un seul
type de protéines correspondant à un composé soufré donné, mais plutôt un ensemble de voies
leur permettant de prendre en charge différents composés captés directement dans le milieu ou
produits comme intermédiaires réactionnels. Parmi ces organismes, certains ont été très
largement étudiés, et si de nombreuses questions attendent encore une réponse, des modèles
de leur métabolisme énergétique basé sur le soufre ont toutefois pu être élaborés.
A) Les archées thermoacidophiles : Acidianus ambivalens
Acidianus ambivalens est une archée de l‘ordre des Sulfolobales : comme tous les
membres de ce groupe, elle se développe à haute température (optimum : 72-86°C) et à pH
très bas (optimum : 2,5) (Fuchs et al., 1996). On la retrouve dans des environnements
d‘origine volcanique de types solfatares, sources chaudes, cheminées hydrothermales
caractérisées entre autre par leur forte teneur en composés soufrés, notamment en soufre
élémentaire et sulfure d‘hydrogène. Il est donc logique que le métabolisme énergétique de ces
organismes soit essentiellement basé sur le soufre.
De nombreuses études ont porté sur le métabolisme énergétique d‘Acidianus
ambivalens, et un modèle assez détaillé de son fonctionnement a ainsi pu être proposé
(Kletzin et al., 2004) (Figure 23).
39
Introduction
Figure 23. Modèle du métabolisme énergétique du soufre en condition aérobie chez Acidianus ambivalens
((Kletzin et al., 2004) et (Brito et al., 2009)). CQ, caldariella quinone ; SAOR, sulfite : accepteur oxydoréductase
; TQO, thiosulfate : quinone oxydoréductase ; SQR, sulfure : quinone oxydoréductase ; SOR, soufre oxygénase
réductase.
Cette archée est capable de croître dans deux types de conditions dans lesquelles le
soufre va être soit oxydé, soit réduit. En condition anaérobie, l‘hydrogène et le soufre
élémentaire servent respectivement de donneur et d‘accepteur d‘électrons. La voie mise en
place, mettant en jeu une hydrogénase et une soufre réductase membranaires orientées vers le
pseudo-périplasme et reliées par un « pool » de quinones, a été précédemment décrite ( Figure
17). Le produit final de cette chaîne respiratoire est le sulfure d‘hydrogène (Laska et al.,
2003). Une seconde condition de croissance, aérobie, repose sur l‘oxydation oxygènedépendante du soufre élémentaire, avec l‘acide sulfurique (H 2SO4) comme produit final du
métabolisme (Kletzin et al., 2004). Il a été montré par les différentes études que la SOR est
l‘enzyme-clé de ce métabolisme énergétique, en réalisant la première étape de l‘oxydation du
soufre élémentaire (Figure 23). Si elle ne fournit aucun potentiel énergétique (pas de
libération d‘électron ou de phosphorylation de substrat), elle permet toutefois de transformer
40
Introduction
le soufre en espèces pouvant être oxydées par d‘autres enzymes au travers de réactions
mettant en jeu des quinones. Ainsi, l‘H2S est oxydé par la SQR en chaîne de soufre (laquelle
peut de nouveau être utilisée comme substrat par la SOR), le sulfite est utilisé soit par la
SAOR membranaire et directement oxydé en sulfate (l‘acide sulfurique H 2SO4 est la forme
protonée de l‘ion sulfate SO42-), soit par la voie de l‘APS au travers des enzymes
cytoplasmiques APS réductase, APAT et adénylate kinase pour donner de l‘ATP et du sulfate.
Enfin, le thiosulfate est oxydé en tétrathionate par la TQOR, ce tétrathionate pouvant être reréduit par l‘H2S en thiosulfate, l‘H2S devenant du soufre élémentaire. Le « pool » de quinones
réduit par la SQR, la SAOR et la TQOR est finalement utilisé par une quinol : oxygène
oxydoréductase pour réduire l‘O2 en H2O, qui fait donc le lien entre les métabolismes du
soufre et de l‘oxygène.
Finalement, ce qui ressort de ce modèle, c‘est une véritable mise à profit des différents
degrés d‘oxydation du soufre, avec des enzymes dont la localisation, membranaire ou
cytoplasmique, et la spécificité de substrat permettent de tirer parti au mieux de chaque étape
de transformation du soufre, optimisant ainsi ce type de métabolisme énergétique.
B) Les bactéries sulfureuses phototrophes
Cette famille regroupant les bactéries sulfureuses vertes et pourpres réalise une
photosynthèse dite anoxygénique, et utilise des composés autres que l‘eau, notamment des
composés réduits du soufre comme l‘H2S ou le thiosulfate comme donneurs d‘électrons. On
les retrouve dans les étendues d‘eau douce ou saumâtre, les environnements marins et d‘autres
habitats combinant la présence de
lumière et de source de soufre réduit à l‘absence
d‘oxygène. Leur importance écologique est considérable, puisqu‘elles permettent de réoxyder
l‘H2S issu de la réduction des sulfates par les organismes sulfato-réducteurs, et contribuent
ainsi de façon majeure au cycle du soufre (Figure 2). De plus, la photosynthèse dont elles sont
capables permet une fixation du carbone atmosphérique en carbone organique utilisable par
d‘autres organismes. On comprend donc pourquoi tant d‘études visant à déchiffrer le
métabolisme énergétique qu‘elles déploient leur sont consacrées.
Le modèle actuel du métabolisme énergétique du soufre des bactéries sulfureuses
phototrophes est présenté Figure 24 ; y sont intégrées toutes les voies découvertes à ce jour
chez l‘ensemble de ces bactéries. Il est donc possible qu‘aucun de ces organismes ne
41
Introduction
possèdent toutes ces enzymes (Frigaard and Dahl, 2008; Gregersen et al., 2011; Sakurai et al.,
2010).
Figure 24. Modèle du métabolisme énergétique du soufre chez les bactéries sulfureuses phototrophes
(Frigaard and Dahl, 2008). Pour le nom des enzymes, se reporter au texte. MK, quinones ; CycA, cytochrome c ;
R-SH, R-S-SH, HSn-… différentes intermédiaires du soufre.
Dans le cas où l‘H2S est le substrat primaire, on constate que deux enzymes, la SQR
membranaire et la FCSD périplasmique, ont la capacité de l‘oxyder en chaînes de soufre
(polysulfures) en transférant les électrons aux quinones ou à un cytochrome. Ces chaînes de
soufre vont alors être transitoirement incorporées en tant qu‘intermédiaire réactionnel aux
globules de soufre en formation (Gregersen et al., 2011) déposés dans le périplasme ou à
l‘extérieur des cellules suivant les organismes. Mais ces globules de soufre sont également
formés d‘une autre manière. En effet, le thiosulfate est également un substrat classique de
nombreuses bactéries sulfureuses phototrophes : celui-ci est oxydé par le système Sox, soit
42
Introduction
complètement lorsque SoxCD est présent (le thiosulfate est alors directement transformé en
sulfate) soit de manière incomplète lorsque SoxCD est absent. Dans ce dernier cas, une seule
molécule de sulfate est libérée, et le soufre restant est incorporé par un mécanisme inconnu
dans les globules de soufre.
La façon dont ce soufre à l‘état d‘oxydation 0 est ensuite mobilisé à partir des globules
reste encore peu comprise : il a été proposé dans ce processus le rôle de petites molécules
organiques telles que les glutathions, mais plus de preuves expérimentales sont nécessaires
pour valider cette hypothèse. Une fois transporté dans le cytoplasme, le soufre est oxydé en
sulfite par le système Dsr. Ce sulfite est finalement pris en charge par la voie de l‘APS pour
générer de l‘ATP et du sulfate dans le cytoplasme. Un complexe membranaire orienté vers le
cytoplasme, nommé PSRLC3 (pour polysulfide-reductase-like complex 3), homologue à la
polysulfure réductase de Wolinella succinogenes, a également été proposé dans un rôle
d‘oxydation du sulfite en sulfate. Cette hypothèse a été formulée après avoir constaté que chez
les organismes où il a été détecté au niveau génomique, les gènes codant pour ce complexe
putatif étaient situés directement en amont du groupe de gènes codant pour le système Dsr. De
plus, son orientation cytoplasmique est en accord avec la production dans le même
compartiment de sulfite par Dsr. Cependant, aucune preuve biochimique de cette activité n‘a
pour l‘instant été rapportée, cette voie reste donc complètement hypothétique. Enfin, l‘analyse
d‘une souche déficiente en SoxY d‘Allochromatium vinosum a montré une diminution
importante de la capacité de la bactérie à oxyder le sulfite ; par ailleurs, le système Sox est
connu pour oxyder le sulfite in vitro. Ceci en fait un bon candidat pour réaliser une oxydation
périplasmique du sulfite après son transport à partir du cytoplasme. Cette question du devenir
du sulfite chez les bactéries sulfureuses phototrophes reste donc ouverte.
C) Les bactéries acidophiles et mésophiles du genre
Acidithiobacillus
Les bactéries du genre Acidithiobacillus sont des gamma-protéobactéries vivant à des
pH très bas (1,5-2,5) et qui sont fréquemment retrouvées dans des environnements de type
drainage minier acide. Elles sont capables d‘oxyder le fer (II), la pyrite (FeS 2) ainsi que les
composés réduits du soufre pour produire de l‘énergie. Cette particularité de solubiliser des
métaux solides comme la pyrite est d‘un grand intérêt biotechnologique, dans les processus de
43
Introduction
biolixiviation notamment. Le métabolisme énergétique du soufre de ces bactéries est étudié
chez
plusieurs
représentants
du
genre
comme
Acidithiobacillus
ferrooxidans
et
Acidithiobacillus caldus. Si ces deux bactéries font partie du même genre, elles présentent
néanmoins quelques différences intéressantes au niveau des enzymes mises en œuvre pour
oxyder les composés du soufre.
Un modèle de ce métabolisme chez Acidithiobacillus ferrooxidans a été proposé en
2009 (Figure 25) (Quatrini et al., 2009) dans lequel il existe un couplage entre oxydation du
soufre et réduction de l‘oxygène.
Figure 25. Modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Acidithiobacillus ferrooxidans (Quatrini et
al., 2009). Pour le nom des enzymes et les réactions qu‘elles catalysent, se reporter au texte.
Il y est ainsi montré l‘existence d‘une SQR oxydant l‘H 2S, un cycle de recyclage entre
une TQOR (TQR dans le schéma) oxydant le thiosulfate en tétrathionate, et une tétrathionate
hydrolase (TetH) qui le retransforme en thiosulfate. L‘oxydation de ces composés du soufre
par la SQR et la TQOR est couplée à la réduction du « pool » de quinones, lesquelles vont
44
Introduction
finalement être utilisées par les oxydases terminales pour réduire l‘oxygène, ou par le
complexe I pour générer le pouvoir réducteur. Cependant, ces voies n‘expliquent pas
l‘oxydation du soufre élémentaire observée lors de croissance dans ces conditions de culture.
Les auteurs ont ainsi proposé l‘implication dans cette activité d‘une nouvelle enzyme
cytoplasmique, potentiellement liée à la membrane, appelée hétérodisulfure réductase
(HdrABC). Chez les archées méthanogènes, ce complexe réduit l‘hétérodisulfure CoB-CoM
(CoBS-SCoM), régénérant chacun des cofacteurs pour une utilisation ultérieure dans la
méthanogénèse. Les auteurs proposent que chez Acidithiobacillus ferrooxidans et d‘autres
organismes oxydant le soufre, l‘hétérodisulfure réductase fonctionnerait à l‘envers, et
oxyderait un intermédiaire à disulfure (issu de l‘internalisation du soufre) en sulfite. Cet
intermédiaire pourrait être de type glutathion-persulfure, comme ce qui a pu être proposé chez
les bactéries phototrophes. La présence des gènes codant pour des protéines impliquées dans
le transfert de soufre dans , l‘opéron codant pour ce complexe, supporte cette proposition.
Cependant, cette hypothèse ne repose sur aucune donnée expérimentale, hormis la
surexpression de l‘opéron lors d‘une croissance sur soufre élémentaire qui suggère
effectivement une implication dans ce métabolisme. Le sulfite produit par cette enzyme doit
être ensuite oxydé par un autre système, que les auteurs proposent être celui de la voie de
l‘APS, puisqu‘en effet, un gène codant pour l‘ATP sulfurylase (Sat, dernière étape de la voie)
est présent dans le génome de la bactérie. Cependant, la première enzyme combinant l‘AMP
et le sulfite en APS (APS réductase) n‘a pas été retrouvée ; une nouvelle voie d‘oxydation du
sulfite encore non identifiée doit probablement être présente. Il faut se rappeler toutefois que
chez une autre souche d‘Acidithiobacillus ferrooxidans, la cytochrome c oxydase de type aa3
est capable in vitro d‘oxyder le sulfite en sulfate (Sugio et al., 2010); ces résultats mériteraient
d‘être vérifiés in vivo.
Chez Acidithiobacillus caldus (Figure 26) (Mangold et al., 2011), outre les systèmes
déjà décrits chez Acidithiobacillus ferrooxidans, il existe également une SOR cytoplasmique
qui offrirait une voie d‘oxydation/réduction du soufre élémentaire, en un schéma qui
rappellerait celui présent chez Acidianus ambivalens. Un système Sox tronqué est aussi
identifié au niveau du génome ; en revanche, malgré la présence de l‘ATP sulfurylase, l‘APS
réductase est toujours manquante.
45
Introduction
Figure 26. Modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Acidithiobacillus caldus (d’après (Mangold
et al., 2011)). ISCs désigne les composés inorganiques du soufre, Omp40 est une porine de la membrane externe.
IV) Réflexions sur les modèles des métabolismes énergétiques du
soufre
Les quelques exemples présentés ici pointent la complexité de tels systèmes. Bâtir de
tels modèles n‘est pas chose aisée, et plusieurs facteurs rendent cette tâche ardue. La
multiplicité des enzymes, adaptées à un type particulier de composé soufré, associée à une
absence de données cinétiques et d‘études sur les conditions d‘expression en fonction des
conditions expérimentales est évidemment un premier point. Mais c‘est aussi la diversité et la
redondance de tels systèmes, entres différents organismes ou parfois dans le même, qui pose
le plus de question. Par exemple, Acidithiobacillus caldus possède à la fois une TQOR et un
système Sox tronqué, tous deux situés dans le périplasme et dédiés à l‘oxydation du
thiosulfate ; Acidianus ambivalens peut oxyder le sulfite par une SAOR membranaire ou la
voie de l‘APS dans le cytoplasme. Un élément de réponse repose peut-être sur la localisation
46
Introduction
de ces systèmes : leur présence dans les différents compartiments cellulaires permettrait
d‘apporter un élément de régulation et de favoriser une voie plutôt qu‘une autre. De plus, les
produits finaux ne sont pas forcément identiques : le produit de la TQOR est le tétrathionate
qui peut être utilisé par la tétrathionate hydrolase qui elle-même régénère le thiosulfate, alors
que le système Sox produit directement du sulfate et éventuellement du soufre élémentaire
dans le cas de l‘absence de SoxCD. Ce recyclage des composés du soufre est particulièrement
visible chez Acidianus ambivalens où l‘on assiste à un véritable cycle entre la SQR qui
produit une chaîne de soufre à partir d‘H2S, laquelle peut-être utilisée par la SOR qui va
donner entre autre de l‘H2S.
Cette apparente complexité et la difficulté de décrypter ces métabolismes reflètent en
réalité la formidable capacité d‘adaptation des micro-organismes à leur environnement, et les
stratégies d‘optimisation qu‘ils ont mis en place afin d‘exploiter au maximum la chimie toute
particulière du soufre au travers de chacune des formes qu‘il peut prendre. Il ne faut pas y voir
un enchevêtrement de substrats, de produits et d‘enzymes, mais plutôt des réseaux
métaboliques hautement performants, organisés et structurés autour d‘un objectif d‘efficacité
maximale dans des environnements dont les conditions physico-chimiques peuvent très
brusquement varier. Ainsi, pour ces organismes, présenter un métabolisme énergétique
polyvalent, ne reposant pas sur un seul type de composé soufré, mais bien capable d‘utiliser
un large éventail de substrats, est finalement un gage de survie.
Ceci nous amène à une dernière piste de réflexion : comment étudier ces
métabolismes ? La réponse est très certainement qu‘il n‘y a pas une seule technique qui doit
prévaloir sur les autres, mais que l‘alliance des études biochimiques in vitro, des prédictions
in silico basées sur les études génomiques et des observations de comportements in vivo des
organismes dans différents contextes génétiques ou conditions de culture semble finalement
être la clé de la compréhension de ces systèmes.
47
Introduction
Chapitre II
Les rhodanèses
48
Introduction
49
Introduction
Les rhodanèses
La découverte de la première rhodanèse a été faite en 1933 par Lang, lorsqu‘il a isolé
une enzyme de mammifères capable d‘ajouter un atome de soufre au cyanure pour le
transformer en une forme bien moins nocive pour les cellules, le thiocyanate (Lang, 1933). Le
nom de rhodanèse a alors été proposé à partir du nom allemand du thiocyanate (rhodanide) et
du suffixe –ese qui désigne le produit d‘une enzyme. Si ce terme est aujourd‘hui encore
couramment employé pour parler de ces protéines, la nomenclature officielle les définit
comme des thiosulfate : cyanure soufre transférases (E.C 2.8.1.1) sur la base de leur activité in
vitro.
Quatre-vingt années de recherches sur ces enzymes ont permis d‘en apprendre bien
davantage et de mettre en évidence un repliement tridimensionnel ubiquitaire de type
« rhodanèse » présent au sein de nombreuses protéines appartenant aux trois domaines de la
Vie. Ainsi, aux protéines constituées uniquement du domaine rhodanèse s‘ajoutent celles
présentant un domaine rhodanèse associé à un ou plusieurs domaines protéiques
supplémentaires. On parle alors de protéines « rhodanèse-like » pour insister sur la présence
de cette structure typique. Ceci a permis de définir les contours d‘une superfamille dont la
caractéristique la plus notable reste son exceptionnelle hétérogénéité. En effet, comme nous
allons le voir dans la suite de ce chapitre, les rhodanèses présentent à bien des égards plus de
diversité que de points communs. C‘est cette même diversité qui fait l‘intérêt de ce véritable
module protéique, non pas dédié à une seule fonction, mais impliqué dans une grande variété
de voies physiologiques.
50
Introduction
I- Caractéristiques des rhodanèses
A) Organisation en domaines
La diversité des rhodanèses et des protéines « rhodanèse-like » s‘illustre tout d‘abord
par les différentes organisations architecturales présentées par cette superfamille.
La rhodanèse « historique », première à avoir été étudiée dès 1933, est issue des
mitochondries du bœuf, et couramment nommée Rhobov dans la littérature. C‘est une
protéine de 293 acides aminés pour une masse moléculaire de 33 kDa environ, qui est
organisée en deux domaines globulaires de taille et de structure équivalentes. Un seul de ces
deux domaines (le domaine C-terminal) possède la cystéine catalytique, celle-ci est remplacée
par un acide aspartique dans le domaine N-terminal (Ploegman et al., 1978). On parle alors de
domaine N-terminal inactif et de domaine C-terminal catalytique, ceux-ci ne partageant
qu‘une faible similarité de séquence (Figure 27).
N-ter
C-ter
MVHQVLYRALVSTKWLAESVRAGKVGPGLRVLDASWYSPGTREARKEYLERH-VPGASFF
--EPAIFKATLNRSLLKTYEQV------LENLESKRFQLVDSRAQGRYLGTQPEPDAVGL
. .:::* :. . *
:.
*. *::. :.
.*: .** : *.* :
N-ter
C-ter
DIEECRDKASPYEVMLPSEAGFADYVGSLGISNDTHVVVYDGDDLG----SFYAPRVWWM
DSGHIRGSVNMPFMNFLTEDGFEKSPEELRAMFEAKKVDLTKPLIATCRKGVTACHIALA
* . *....
: : :* ** .
.*
::: *
:.
.. * ::
N-ter
C-ter
FRVFGHRTVSVLNGGFRNWLKEGHPVTSEPSRP---AYLCGKPDVAIYDGSWFEWFHRAPPETWVSQGKGGKA
: *: *:: :*.: :*::.. * * ..
Figure 27. Alignement des séquences des domaines N-terminal (N-ter) inactif et C-terminal (C-ter)
catalytique de la rhodanèse du bœuf. Le site actif est en vert, et la cystéine catalytique est soulignée. *, acide
aminé strictement conservé ; :, conservation forte ; ., conservation faible.
Cette organisation, dite à domaines en tandem, est longtemps restée la norme des
rhodanèses : il était ainsi communément admis qu‘une rhodanèse fonctionnelle devait être
composée d‘un domaine N-terminal inactif, participant à la stabilité de la protéine, et d‘un
domaine C-terminal catalytique. Néanmoins, il existe des exceptions à cette règle : chez
Halanaerobium congolense (et d‘autres organismes thiosulfato-réducteurs), la protéine à
domaines en tandem RdlA porte un site catalytique potentiel ainsi que la cystéine
51
Introduction
caractéristique sur chacun de ses deux domaines (Ravot et al., 2005). Il en est de même pour
la protéine PhsE de Desulfitobacterium hafniense (Figure 28) et dans ce cas les auteurs ont
montré que chaque domaine contribue de manière indépendante et inégale (76% pour le
domaine N-terminal) à l‘activité totale de la protéine (Prat et al., 2012). Il faut aussi
mentionner la protéine YnjE d‘Escherichia coli comportant deux domaines inactifs et un
domaine C-terminal actif, ainsi que des protéines identifiées par bioinformatique possédant
jusqu‘à six domaines (Hanzelmann et al., 2009).
Figure 28. Représentation des deux domaines rhodanèse de la protéine PhsE de Desulfitobacterium
hafniense (Prat et al., 2012). La position des acides aminés est indiquée au-dessus des domaines, les sites
catalytiques potentiels en-dessous. Les 80 premiers résidus ne sont pas représentés
Cette vision traditionnelle des rhodanèses devant posséder un domaine à vocation
essentiellement structurale a été bouleversée dans les années 2000 avec la caractérisation de la
protéine GlpE d‘Escherichia coli (Ray et al., 2000). Cette protéine de 108 acides aminés ne
possède qu‘un seul domaine, mais présente tout de même une activité thiosulfate : cyanure
soufre transférase. Il faut toutefois noter que les premières études biochimiques montraient
une organisation dimérique de la protéine : l‘association de deux monomères de GlpE
reproduirait ainsi l‘organisation architecturale classique des rhodanèses, mais offrirait
l‘avantage de présenter deux sous-unités catalytiques au lieu d‘un seul domaine actif. Mais
cette information a été remise en question par la résolution de la structure de GlpE,
puisqu‘une organisation monomérique de la protéine a été rapportée par cette étude
(Spallarossa et al., 2001) (Figure 29).
Les données biochimiques et structurales concernant une autre rhodanèse à un
domaine d‘Escherichia coli, PspE, ont démontré son organisation monomérique (Li et al.,
2008a), alors que dans le cas d‘une autre protéine de type rhodanèse (Sud ( sulfide
dehydrogenase) de Wolinella succinogenes) une organisation exclusivement dimérique a été
52
Introduction
clairement établie par le même type d‘approche (Kreis-Kleinschmidt et al., 1995; Lin et al.,
2004) (Figure 30).
Figure 29. Structure tridimensionnelle de GlpE d’Escherichia coli (Spallarossa et al., 2001). Les éléments de
structure secondaire formant la topologie α/β des rhodanèses sont indiqués par la nature de la structure (hélice α
ou brin β) suivie d‘une lettre correspondant à la numérotation adoptée pour Rhobov ou RhdA. Les hélices α sont
représentées en jaune. Les brins β sont représentés en gris. Les boucles sont représentées en vert. Le site actif est
indiqué en rose, et la cystéine catalytique (Cys65) est représentée en bâtons et sphères.
Figure 30. Structure tridimensionnelle de Sud dimérique (Lin et al., 2004). La chaine de polysulfure (substrat
de Sud) est représentée (sphères jaunes) liée à la cystéine catalytique (sphères grises). La boucle du site actif est
représentée en vert.
53
Introduction
Ces différents cas de figure illustrent encore une fois la diversité des protéines de la
superfamille des rhodanèses, puisque même un niveau d‘organisation simple en un seul
domaine catalytique peut donner lieu, ou non, à des associations plus complexes comme le
sont les formes dimériques.
L‘appréhension du domaine rhodanèse comme module protéique universel trouve sa
plus flagrante expression dans les protéines dites « à domaine rhodanèse associé », pour
lesquelles un domaine rhodanèse est combiné à un ou plusieurs autres domaines protéiques.
Dans ce genre de configuration, l‘implication du domaine rhodanèse dans un processus donné
semble dépendre directement du domaine avec lequel il est combiné, et donc de la fonction de
la protéine entière. Il faut ici signaler que le domaine rhodanèse peut être soit catalytique (cas
le plus fréquent) soit dépourvu de la cystéine caractéristique, et donc inactif. Le module
rhodanèse pourrait alors apporter un élément de régulation de l‘activité de l‘enzyme (grâce à
la présence de résidus tyrosine et histidine conservés pouvant servir de cible de tyrosine et
histidine kinases) ou de façon plus générale un rôle de signalisation cellulaire (Han et al.,
2003). Un rôle dans l‘interaction avec d‘autres protéines a également été démontré dans le cas
des protéases ubiquitine-spécifiques (Avvakumov et al., 2006).
Enfin, il faut mentionner les phosphatases Cdc25, qui comportent un domaine Cterminal dont le repliement est typiquement le même que celui des rhodanèses classiques,
mais dont le site actif est légèrement différent. Ces protéines ne fonctionnent pas avec du
soufre mais avec du phosphate, montrant ainsi que les domaines rhodanèse catalytiques
peuvent être totalement dissociés de leur fonction de transfert de soufre selon le contexte dans
lesquels ils sont retrouvés (Bordo and Bork, 2002).
Pour conclure sur cette première partie concernant l‘organisation architecturale des
protéines de la superfamille des rhodanèses, il faut retenir que le domaine rhodanèse
s‘apparente à un véritable module protéique, catalytique ou non, associé ou non à un (ou
plusieurs) autre(s) domaine(s) protéique(s), de type rhodanèse ou autre (Figure 31).
54
Introduction
Figure 31. Représentation des rhodanèses et protéines de type rhodanèse d’Escherichia coli (Cheng et al.,
2008). Les abréviations sont : Rhd, domaine rhodanèse catalytique ; Rhd*, domaine rhodanèse inactif ; ss,
séquence signal ; memb, segment membranaire ; FL, THUMP et PP-loop sont respectivement les domaines de
type ferrédoxine, le domaine de liaison à l‘ARN retrouvé dans les enzymes de modifications des ARN et le
domaine pyrophosphatase ; ATP-binding, domaine de liaison à l‘ATP ; MST, 3-mercaptopyruvate : cyanure
soufre transférase ; H, domaine hypothétique de fonction inconnue ; Cys-rich, domaine riche en cystéine. Le
nom des protéines est indiqué à droite.
B) Séquence protéique
La diversité des membres de cette superfamille se retrouve également au niveau de
leurs séquences protéiques. En effet, les similarités de séquence peuvent être très faibles entre
toutes les protéines, ce qui peut être justifié par leur caractère très ubiquitaire.
Cependant, il existe deux régions d‘acides aminés caractéristiques dans les séquences
protéiques des rhodanèses, qui peuvent être considérées comme de véritables « signatures »
de ces protéines, et dont le taux de conservation est important. Ces régions se trouvent pour
l‘une en position N-terminale ([F/Y]-X3-H-[L/I/V]-P-G-A-X2-[L/I/V/F]) (Figure 32), et pour
l‘autre en C-terminal de tous les membres de la superfamille ([A/V]-X2-[F/Y]-[D/E/A/P]-G[G/S/A]-[W/F]-X-E-[F/Y/W]) (Figure 33) (Cipollone et al., 2007a). C‘est notamment grâce à
cette séquence C-terminale que la protéine GlpE a été identifiée comme faisant partie de la
55
Introduction
superfamille des rhodanèses et qu‘elle est ainsi devenue la protéine type des rhodanèses à un
domaine (Figure 33).
Rhobov
RhdA
MVHQVLYRALVSTKWLAESVRAGKVGPGLRVLDASWYSPGTREARKEYLERHVPGASFFD
MDDFASLPLVIEP----ADLQARLSAPELILVDLTSA------AR--YAEGHIPGARFVD
* . .
::..
.::*
.* * ::* :
** * * *:*** *.*
Rhobov
RhdA
IEECRDKASPYEVMLPSEAGFADYVGSLGISNDTHVVVYDGDDLGSFYAPRVWWMFRVFG
PKRTQLGQPPAPGLQPPREQLESLFGELGHRPEAVYVVYDDE--GGGWAGRFIWLLDVIG
:. :
.*
: *.. : . .*.**
:: ****.: *. :* *. *:: *:*
Rhobov
RhdA
HRTVSVLNGGFRNWLKEGHPVTSEPSRPE
QQRYHYLNGGLTAWLAEDRPLSRELPAPA
::
****: ** *.:*:: * . *
Figure 32. Alignement des séquences des domaines N-terminaux de la rhodanèse du bœuf (Rhobov) et de
RhdA d’Azotobacter vinelandii. La signature N-terminale est en bleu. *, acide aminé strictement conservé ; :,
conservation forte ; ., conservation faible
GlpE
RhdA
CYHGNSSKGAAQYLLQQ--GYDVVYSIDGGFEAWQRQFPAEVAYGA
CQTHHRS-G-LTYLIAKALGYPRVKGYAGSWGEWGNHPDTPVEL-*
: * *
**: : ** * . *.: * .: : *
Figure 33. Alignement des séquences C-terminales de GlpE d’Escherichia coli et RhdA d’Azotobacter
vinelandii. Le site actif est en vert, la cystéine catalytique est soulignée, et la signature C-terminale est en bleu.
*, acide aminé strictement conservé ; :, conservation forte ; ., conservation faible
Il faut néanmoins pondérer, puisque ces motifs sont peu conservés chez la protéine
Sud de Wolinella succinogenes par exemple ainsi que pour une rhodanèse à un domaine de
Thermus thermophilus (TTHA0613). Il n‘y a donc pas de corrélation directe entre le nombre
de domaines de la protéine et la conservation des motifs rhodanèse.
C) Site actif
L‘activité catalytique des rhodanèses est portée par une cystéine requise pour leur
activité soufre transférase, premier résidu d‘une série de six acides aminés constituant le site
catalytique de l‘enzyme. Ici encore, il existe une conservation de la composition de ce site,
56
Introduction
avec comme séquence consensus CRXGX[R/T] (Figure 27). Il existe des exceptions (Figure
33) telle que la rhodanèse à deux domaines RhdA d‘Azotobacter vinelandii qui porte le site
actif CQTHHR, et la rhodanèse à un domaine PspE d‘Escherichia coli de séquence
CNAGRQ.
Il faut cependant remarquer que tous ces sites actifs contiennent des résidus basiques,
dont la charge positive est en adéquation avec les anions thiosulfate et CN- qui sont les
substrats classiques des rhodanèses. Ainsi, le site catalytique du domaine N-terminal de PhsE
de Desulfitobacterium hafniense (qui contribue aux trois quarts de l‘activité totale de la
protéine) possède un résidu basique supplémentaire par rapport à celui du domaine C-terminal
(responsable du dernier quart de l‘activité) (Prat et al., 2012) (Figure 28).
Mais ce critère n‘est à l‘évidence pas le seul influant sur l‘affinité d‘une rhodanèse
pour ses substrats, comme en témoignent les protéines RhdA de Azotobacter vinelandii et
Pseudomonas aeruginosa dont la séquence du site catalytique est identique, mais dont les
activités spécifiques et les valeurs de Km sont différentes (Cipollone et al., 2004; Pagani et al.,
1993). L‘arrangement global des deux domaines de la protéine ainsi que l‘accessibilité du site
actif sont également des paramètres importants, comme en témoignent les différentes
structures tridimensionnelles disponibles.
D) Structure tridimensionnelle
La rhodanèse de bœuf est la première dont la structure tridimensionnelle a été
déterminée (Ploegman et al., 1978) ; elle a donc constitué depuis la référence d‘architecture
des rhodanèses. Comme nous l‘avons vu précédemment, la protéine peut être divisée en deux
domaines de taille équivalente, dont le repliement est également très similaire malgré le peu
de conservation de leur séquence respective. Il s‘agit d‘une topologie de type α/β, plusieurs
hélices α entourant un cœur de brins β parallèles (Figure 34). De plus, les deux domaines sont
reliés par un peptide « linker » en « random coil » qui assure la continuité de la protéine.
57
Introduction
Figure 34. Superposition des structures de la rhodanèse RhdA d’Azotobacter vinelandii (marron) et de la
rhodanèse de boeuf Rhobov (bleu) (Bordo et al., 2000). La boucle du site actif est indiquée en rouge pour
RhdA et en marron pour Rhobov. Le repliement global des deux protéines est très similaire, et le positionnement
du site actif est très proche. On retrouve des boucles plus courtes dans RhdA, notamment la boucle 30-32 proche
du site actif et la boucle 175-190 (numérotation RhdA). Ces boucles sont indiquées en vert pour RhdA et en bleu
turquoise pour Rhobov.
La résolution des structures d‘autres rhodanèses à deux domaines comme RhdA
d‘Azotobacter vinelandii (Bordo et al., 2000) (Figure 34), à un domaine comme GlpE
d‘Escherichia coli (Spallarossa et al., 2001) (Figure 35) ou Sud de Wolinella succinogenes
(Lin et al., 2004), ainsi que de protéines comportant un domaine rhodanèse associé, ont
montré que ce repliement global est absolument conservé pour toutes les protéines de la
famille.
58
Introduction
Figure 35. Superposition des structures tridimensionnelles de GlpE (vert) et RhdA (violet) (Spallarossa et
al., 2001). Les boucles de connexion (plus longues chez RhdA) sont représentées en jaune.
On trouve cependant de petites caractéristiques structurales propres à chaque enzyme :
par exemple, les boucles connectant les éléments α et β sont plus courtes chez GlpE (protéines
de 108 acides aminés), que chez Rhobov (136 acides aminés pour le domaine catalytique), on
note également la présence d‘une hélice α supplémentaire permettant la dimérisation chez Sud
(Figure 30). Concernant le site actif, malgré une relative variabilité de séquence, son
architecture reste sensiblement la même. Il forme une poche superficielle dans laquelle la
boucle de six acides aminés portant la cystéine catalytique adopte une conformation semicirculaire qui permet le positionnement de la chaîne latérale de la cystéine (portant le
groupement sulfhydryle permettant la réaction) vers le centre de la poche catalytique. Il faut
également noter le rôle de certains résidus éloignés en séquence, mais à proximité du site
catalytique et qui peuvent intervenir dans la catalyse. Ainsi les résidus Arg 186 et Lys 249 de
Rhobov ont été identifiés comme nécessaires dans la fonction de la protéine: il a été démontré
que des mutations affectant la charge positive de la Lys 249 modifiaient la stabilité, la
structure et la spécificité de substrat de cette rhodanèse (Luo and Horowitz, 1994). Par
ailleurs, les résidus 230 à 235, constituant la boucle catalytique de RhdA et formant un pôle
de charges positives contre la poche catalytique, peuvent être assistés au niveau
59
Introduction
électrostatique (en établissant des ponts salins) par les résidus Arg 97 et 169 et His 233 et 234
de la protéine. (Bordo et al., 2000).
E) Catalyse et mécanisme catalytique
L‘activité rhodanèse au sens strict, qui correspond à la nomenclature officielle
thiosulfate : cyanure soufre transférase, est décrite par la réaction :
S2O32- + CN-  SO32- + SCNLe mécanisme catalytique décrit pour ces enzymes, qui se fait en deux étapes, est
couramment appelé mécanisme ping-pong ou de double déplacement. En effet, la première
partie de la réaction correspond au transfert d‘un atome de soufre du thiosulfate sur la cystéine
catalytique de l‘enzyme, provoquant le relargage d‘une molécule de sulfite ainsi que la
création d‘un intermédiaire enzyme-persulfure stable. Dans la seconde partie de la réaction, le
soufre est de nouveau transféré, cette fois-ci sur l‘ion cyanure, pour donner du thiocyanate
(Figure 36).
Figure 36. Mécanisme en double déplacement de transfert du soufre des rhodanèses (Hildebrandt and
Grieshaber, 2008).
Il faut insister sur le fait que l‘intermédiaire réactionnel est parfaitement stable, comme
peuvent en témoigner les structures tridimensionnelles de RhdA et GlpE, dans lesquelles la
cystéine catalytique est retrouvée sous forme persulfure. La protéine PspE a également été
isolée par chromatographie échangeuse de cations sous deux formes distinctes, l‘une
contenant un atome de soufre supplémentaire au site actif, l‘autre en présentant deux (Cheng
et al., 2008).
60
Introduction
Cependant, il faut noter que cette activité thiosulfate : cyanure soufre transférase n‘est
testée qu‘in vitro, et il existe par ailleurs de nombreuses indications sur le fait que les substrats
in vivo puissent être différents en fonction des enzymes. Par exemple, le K m de Rhobov pour
le cyanure est de l‘ordre de 60 µM (Wang and Volini, 1973), indiquant ainsi qu‘il s‘agit
probablement du véritable substrat in vivo de la protéine, ce qui est également cohérent avec
sa fonction de détoxification du cyanure dans les cellules. Le K m de la protéine GlpE pour le
cyanure est quant à lui bien plus important, 17 mM, alors que celui déterminé pour la
thiorédoxine 1 de la bactérie est de 34 µM. Les thiorédoxines sont de petites protéines
d‘oxydoréduction présentant dans leur site actif deux cystéines capables de former un pont
disulfure. De telles protéines à dithiol sont donc largement pressenties comme accepteur de
soufre in vivo à la place du cyanure pour GlpE {Ray, 2000 #483 (Figure 37).
Figure 37. Transfert du soufre des rhodanèses sur les thiorédoxines {Nandi, 2000 #393}. RSO2S- représente
un thiosulfonate qui peut servir de donneur de soufre, ES- et ESS- sont respectivement la rhodanèse avec son
thiol libre et l‘intermédiaire rhodanèse-persulfure.
Il faut cependant être prudent lorsque l‘on raisonne avec les valeurs de K m : en effet,
RhdA de Pseudomonas aeruginosa est peu affine pour le cyanure (avec un Km déterminé in
vitro de 12 ou 16 mM suivant le pH), mais l‘importance de cette enzyme a été démontrée pour
la croissance en condition cyanogène de la bactérie (Cipollone et al., 2004; Cipollone et al.,
2007b), ce qui fait du cyanure un accepteur de soufre in vivo parfaitement vraisemblable pour
cette rhodanèse.
Pour ce qui est du donneur de soufre, il a été montré in vitro que la protéine RhdA
d‘Azotobacter vinelandii était capable d‘interagir avec la cystéine désulfurase IscS ; cette
étude a également mis en évidence le transfert d‘un atome de soufre à partir d‘IscS sur la
61
Introduction
cystéine catalytique de RhdA (Forlani et al., 2005). Enfin, il faut citer la protéine rhodanèselike Sud de Wolinella succinogenes, incapable d‘utiliser le thiosulfate, mais réalisant un
transfert de soufre à partir du polysulfure (Km = 20 µM) sur le cyanure, selon un mécanisme
identique aux rhodanèses classiques (Klimmek et al., 1998). Enfin, il faut citer des protéines
dont l‘architecture est identique à celle des rhodanèses à deux domaines, mais qui utilisent du
3-mercaptopyruvate comme donneur de soufre au lieu du thiosulfate. Ces
3-
mercaptopyruvate : cyanure soufre transférases (MST) constituent une sous-famille des
rhodanèses que nous n‘allons pas détailler ici.
Ces exemples permettent de mieux appréhender la différence essentielle entre les
substrats utilisés in vitro pour tester l‘activité rhodanèse, et les candidats retenus dans la
fonction de donneurs et accepteurs de soufre in vivo. Cependant, malgré de très nombreuses
études, dans la majorité des cas, les substrats physiologiques ne sont pas identifiés clairement,
compliquant ainsi la compréhension des rôles assumés par les rhodanèses.
II- Fonction des rhodanèses
L‘incroyable diversité de séquence, de répartition taxonomique, d‘organisation des
domaines, et des donneurs/accepteurs de soufre des protéines de la famille des rhodanèses
suggère bien évidemment une égale variété de fonctions de ces modules protéiques. Le but de
cette partie n‘est pas de dresser une liste exhaustive de toutes les rhodanèses identifiées dans
les génomes et des fonctions associées, mais de donner un aperçu global de leur importance et
de leur intérêt biologique. Il faut d‘ailleurs noter ici qu‘en dehors des protéines à domaine
rhodanèse associé, peu de fonctions biologiques précises ont formellement été attribuées. En
revanche, de nombreuses études indiquent leur implication dans diverses voies au sein des
organismes. En nous basant sur les données de la littérature, nous allons illustrer cette
diversité en nous attachant à quelques protéines pour lesquelles un rôle, ou une implication
dans une voie donnée, a pu être démontré.
A) Les protéines à domaine rhodanèse associé
L‘étude des protéines à domaine rhodanèse associé a permis de leur attribuer des
fonctions précises, généralement en rapport avec la synthèse de biomolécules soufrées.
62
Introduction
Le premier exemple concerne les protéines de type ThiI, impliquées dans des voies de
biosynthèse de la thiamine (vitamine B1) et de la 4-thiouridine (base modifiée de certains
ARN de transfert). Toutes les protéines de ce type présentent un domaine N-terminal THUMP
impliqué dans l‘adressage de l‘enzyme de modification des ARN vers leur cible. De plus, les
études menées sur la protéine ThiI d‘Escherichia coli ont permis d‘identifier en C-terminal un
domaine de type rhodanèse portant la cystéine catalytique caractéristique. Ce domaine est
également retrouvé au sein des protéines ThiI de Salmonella thyphimurium et Haemophilus
influenzae (Palenchar et al., 2000), et également chez certaines espèces d‘archées
(Thermoprotéales et Thermoplasmatales) (Liu et al., 2012). Dans le cas d‘Escherichia coli, les
auteurs ont montré in vitro l‘existence d‘une activité rhodanèse portée par ThiI, qui est abolie
lorsque la cystéine catalytique du domaine rhodanèse est mutée, et qui est absolument
essentielle à la fonction de la protéine entière. Les auteurs ont ainsi proposé un mécanisme de
transfert du soufre de ThiI sur l‘uridine-8 des ARN de transfert (Figure 38).
Figure 38. Mécanisme proposé pour le transfert de soufre de ThiI-persulfure sur l’uridine-8 des ARNt
(Palenchar et al., 2000). Le mécanisme proposé implique la forme persulfurée de ThiI au niveau de la cystéine
du domaine rhodanèse.
63
Introduction
Le second exemple est celui des protéines de type ThiF/MoeB, impliquées dans la
biosynthèse des cofacteurs à molybdène. L‘un des membres de cette famille a été très étudié :
il s‘agit de la protéine humaine MOCS3, qui comporte un domaine N-terminal présentant une
forte similarité avec la protéine MoeB d‘Escherichia coli, et un domaine C-terminal de type
rhodanèse (Figure 39).
Figure 39. Organisation en deux domaines de la protéine MOCS3 humaine (Matthies et al., 2004). MoeBlike domain indique le domaine de type MoeB, et RLD symbolise le domaine de type rhodanèse.
Les études menées sur cette protéine (Matthies et al., 2004) (Matthies et al., 2005) ont
permis de démontrer l‘activité rhodanèse in vitro de ce domaine C-terminal, et sa capacité à
transférer le soufre vers MOCS2A. (Figure 40).
Figure 40. Réaction catalysée par la protéine MOCS3 humaine montrant le transfert de soufre du
domaine rhodanèse de MOCS3 sur la protéine MOCS2A (Cipollone et al., 2007b).
Il a été proposé que le donneur de soufre de MOCS3 soit la cystéine désulfurase Nfs1
chez l‘humain (Marelja et al., 2008). MOCS3 jouerait un rôle critique dans cette voie de
biosynthèse du cofacteur à molybdène, à la fois dans l‘étape d‘addition de l‘AMP grâce à son
64
Introduction
domaine N-terminal de type MoeB, ainsi que lors de l‘addition d‘un atome de soufre par le
domaine rhodanèse C-terminal. La présence de ce module rhodanèse n‘est toutefois pas une
constante puisqu‘il existe plusieurs de ces protéines qui ne le possèdent pas (Cortese et al.,
2002). C‘est par exemple le cas de MoeB d‘Escherichia coli. Mais il faut également noter que
des travaux récents ont démontré l‘implication d‘une rhodanèse à trois domaines, YnjE, dans
cette voie, au travers de son interaction avec les protéines MoeB et IscS permettant également
le transfert d‘AMP et de soufre pour la formation du cofacteur à molybdène (Figure 41) (Dahl
et al., 2011).
Figure 41. Modèle de la biosynthèse de la molybdoptérine chez E. coli (Dahl et al., 2011).
B) Rhodanèses à un ou plusieurs domaines
Si le rôle des protéines à domaine rhodanèse associé semble plutôt orienté vers la
biosynthèse des molécules soufrées, nous allons voir qu‘en ce qui concerne les rhodanèses à
65
Introduction
un ou deux domaines, la question est bien moins tranchée, et si leur fonction précise n‘est
souvent pas connue, leur implication dans différentes voies ou processus cellulaires ne fait en
revanche plus de doute.
1. Chez les eucaryotes
La fonction première de détoxification du cyanure, découverte en même temps que la
première rhodanèse, est aussi l‘une des mieux documentée. Il a ainsi pu être montré que les
rhodanèses à deux domaines sont fortement concentrées dans les tissus et les organes exposés
au cyanure (Sylvester and Sander, 1990) . En effet, même si cette répartition est espècedépendante, ces protéines sont surreprésentées dans les hépatocytes, les cellules épithéliales
des bronchioles (voie d‘entrée du cyanure gazeux) ainsi que dans les cellules du tubule
proximal du rein (facilitant l‘élimination du thiocyanate formé à partir du cyanure). Il est
également intéressant de noter que lors d‘un empoisonnement au cyanure, la thérapie standard
consiste en l‘administration par intraveineuse de thiosulfate, substrat des rhodanèses, ce qui
permet la formation de thiocyanate et donc l‘élimination du cyanure.
Les rhodanèses sont également impliquées dans le métabolisme du sulfure
d‘hydrogène (H2S). Ce gaz sert (i) de molécule-signal cruciale dans la régulation de fonctions
physiologiques importantes, (ii) également comme substrat énergétique chez différents
organismes et (iii) à haute concentration il peut être toxique et agir comme un poison pour la
respiration aérobie (par réaction avec l‘oxygène). Un rôle des rhodanèses a pu être montré
lorsque l‘H2S est utilisé comme substrat énergétique. En effet, il a été mis en évidence, dans la
mitochondrie de foie de rat, une voie d‘oxydation énergétique de l‘H 2S en thiosulfate grâce à
l‘action de trois enzymes, dont une rhodanèse. Cette dernière agirait toujours en tant que
soufre transférase, mais d‘une manière un peu particulière (Figure 42): elle ajouterait un
atome de soufre (à partir d‘un persulfure produit par une SQR) sur une molécule de sulfite
pour en faire du thiosulfate (qui sont respectivement le produit et le substrat des rhodanèses
« classiques »). Cette activité persulfure : sulfite soufre transférase est supporté par des
données cinétiques : in vitro, le glutathion-persulfure (GSSH) et le sulfite sont respectivement
le donneur et l‘accepteur de soufre avec un Km de l‘ordre du µM, alors que celui du
thiosulfate en tant que substrat est de l‘ordre du mM (Hildebrandt and Grieshaber, 2008).
66
Introduction
Figure 42. Modèle de l’oxydation du sulfure d’hydrogène
dans les mitochondries impliquant une
rhodanèse (Hildebrandt and Grieshaber, 2008). Sulfur transferase : rhodanèse ; SQR : sulfure quinone
oxydoréductase ; III et IV : complexes III (complexe bc1) et IV (cytochrome c oxydase) ; Qox et Qred : quinone
oxydée et réduite.
Ces deux rôles démontrés chez les eucaryotes illustrent la capacité des rhodanèses à
intervenir dans différentes voies ; cependant, tout porte à croire qu‘elles sont capables
d‘assumer d‘autres fonctions qui restent encore à découvrir, puisqu‘en effet, bien d‘autres
rôles ont pu être déterminés chez les procaryotes pour ces enzymes.
2. Chez les procaryotes
La fonction de détoxification du cyanure par les rhodanèses est également évoquée
chez les procaryotes dès 1975, grâce à l‘observation de mutants chez Bacillus
stearothermophilus, présentant une activité rhodanèse cinq à six fois plus élevée allant de pair
avec une meilleure aptitude à détoxifier le cyanure (Atkinson, 1975). Egalement, comme
mentionné plus haut, des études ont montré le rôle de RhdA de Pseudomonas aeruginosa dans
ces processus de détoxification (Cipollone et al., 2004; Cipollone et al., 2007b).
Un autre rôle, en lien avec le métabolisme énergétique du soufre, a été montré pour la
protéine Sud de Wolinella succinogenes. Si elle n‘est pas une rhodanèse au sens strict du
terme (incapable d‘utiliser le thiosulfate), elle catalyse néanmoins in vitro la formation de
67
Introduction
thiocyanate à partir de polysulfure. Les travaux effectués sur cette protéine ont permis de
suggérer un rôle dans le transfert du polysulfure vers la polysulfure réductase Psr, l‘un des
accepteurs terminal d‘électrons de la bactérie. En effet, les auteurs ont prouvé l‘existence
d‘une stimulation de l‘activité de réduction du polysulfure de l‘extrait membranaire en
présence de Sud in vitro. Un modèle a ainsi pu être proposé, dans lequel l‘utilisation du
polysulfure par la réductase serait plus efficace lorsque celui-ci est lié à Sud. Les auteurs
proposent également que le transfert du substrat par Sud vers la polysulfure réductase
membranaire se fasse au sein d‘un complexe protéique formé par les deux enzymes (Klimmek
et al., 1998; Klimmek et al., 1999). A ce jour, cet éventuel complexe n‘a toujours pas été
observé, le transfert direct du soufre entre les deux enzymes reste donc à confirmer.
Parmi les autres rôles proposés pour les rhodanèses procaryotes, certains ne font pas
appel à leur activité soufre transférase. On peut ainsi citer la participation de RhdA
d‘Azotobacter vinelandii dans la résistance au stress oxydant. En effet, les travaux effectués
sur une souche mutante de la bactérie ne produisant pas cette protéine ont notamment montré
une diminution de l‘activité des enzymes à Fe-S du cycle des acides tricarboxyliques sans que
l‘expression des gènes correspondants ne soit affectée (Cereda et al., 2007). L‘hypothèse
proposée était alors une protection par RhdA contre le stress oxydatif connu pour
endommager les centres fer-soufre. Des études ultérieures ont permis d‘émettre l‘hypothèse
d‘un pouvoir tampon de RhdA contre les espèces oxydantes grâce à un « switch redox » de sa
cystéine catalytique. En effet, lors d‘un stress oxydant, celle-ci pourrait être oxydée en acide
sulfénique (Cys-SOH) et former ensuite un pont disulfure par réaction avec un thiol libre,
avant d‘être recyclée sous sa forme active par l‘action de systèmes tels que les
thiorédoxines/thiorédoxines réductases (Cereda et al., 2009). Cependant, il s‘agit là d‘un
modèle théorique nécessitant de plus amples études pour être validé.
Le détournement de la cystéine catalytique des rhodanèses dans un processus
d‘oxydoréduction, tel que décrit plus haut, est également proposé dans le cadre d‘une étude du
rôle de la protéine périplasmique PspE d‘Escherichia coli, effectuée sur une souche dans
laquelle le système DsbA/DsbB, permettant la formation de ponts disulfures des protéines
périplasmiques, a été supprimé. Les auteurs ont ainsi montré que la surexpression de PspE
conduisait à son intervention dans un nouveau système PspE/DsbC permettant la restauration
de la fonction normalement assumée par DsbA/DsbB (Figure 43). Si ce système n‘est
manifestement pas nécessaire dans la souche sauvage, il a été proposé que d‘autres espèces de
bactéries ne possédant pas les protéines DsbA/DsbB puissent utiliser une rhodanèse
68
Introduction
périplasmique ainsi que DsbC pour remplir cette fonction (Chng et al., 2012). La véritable
fonction physiologique de PspE chez Escherichia coli demeure toutefois inconnue.
Figure 43. Mécanisme proposé pour la formation des ponts disulfures dans les protéines du périplasme
impliquant PspE/DsbC en absence de DsbA/DsbB (Chng et al., 2012).
III- Vue d’ensemble de la superfamille des rhodanèses
Les rhodanèses sont donc des objets d‘étude intéressants à bien des niveaux. Il s‘agit
d‘une famille dont les membres ne partagent parfois que très peu de similarité de séquence,
mais dont le repliement tridimensionnel (cœur de brins β entourés d‘hélices α) est
parfaitement conservé. C‘est aussi une famille dont les représentants possèdent des
architectures variées : un seul (GlpE, PspE…) ou deux (PhsE, RdlA) domaines catalytiques,
un domaine inactif et un domaine catalytique (RhdA, Rhobov…), une combinaison de
domaines inactifs et catalytiques (YnjE), un domaine catalytique combiné à d‘autres
69
Introduction
domaines protéiques (MOCS3, ThiI…)… Les diverses études montrent que toutes les
combinaisons envisageables semblent trouver des exemples dans la nature, et révèlent ainsi
que le domaine rhodanèse n‘est pas simplement une protéine, mais véritablement un élément
modulaire nécessaire à diverses fonctions physiologiques. Car si la rhodanèse au sens
primaire du terme est une enzyme qui catalyse in vitro le transfert de soufre du thiosulfate au
cyanure, les réactions in vivo semblent bien différentes : en effet, un partenaire protéique
(telles que les cystéines désulfurases) ou un autre substrat soufré (le polysulfure par exemple)
peuvent servir de donneurs de soufre, et l‘accepteur peut être à nouveau une protéine (les
thiorédoxines) ou une autre molécule (sulfite, uridine-8 des ARNt). Les rhodanèses
interviendraient donc dans la synthèse de biomolécules soufrées, la détoxification du cyanure,
le métabolisme de l‘H2S ou du polysulfure, la résistance au stress oxydatif, les processus de
sénescence chez les plantes… D‘un point de vue finaliste, ce domaine rhodanèse est donc une
sorte de boîte à outils très puissante, qui peut être utilisée de différentes manières, dans des
contextes distincts et à des fins diverses.
Mais ces fonctions sont généralement difficiles à établir. D‘une part, les substrats
physiologiques ne sont pas toujours identifiés avec exactitude. D‘autre part, dans un même
organisme, il peut exister plusieurs protéines de type rhodanèses (9 chez Escherichia coli, 10
chez Azotobacter vinelandii), et cette redondance est problématique lorsque l‘on cherche à en
étudier une en particulier, notamment in vivo par des approches de délétants, une autre
rhodanèse pouvant compenser cette absence (Cereda et al., 2009). Cette question des
fonctionnalités des rhodanèses est aujourd‘hui un sujet en pleine expansion, et la
compréhension des rôles physiologiques de cette grande famille de protéines représentée dans
tous les domaines de la vie est bien entendu d‘un grand intérêt, tant fondamental que
biotechnologique, en sciences de la vie.
70
Introduction
71
Introduction
Chapitre III
Aquifex aeolicus
72
Introduction
73
Introduction
Aquifex aeolicus
Le modèle d‘étude de l‘équipe, sur lequel porte cette thèse, est la bactérie
hyperthermophile Aquifex aeolicus. Ce chapitre a pour but de présenter cet organisme, tant au
niveau de ses caractéristiques générales que de son métabolisme énergétique du soufre, objet
d‘étude central de ma thèse.
I) Les Aquificales
Aquifex aeolicus appartient à l‘ordre des Aquificales et à la famille des Aquificaceae.
Tous les membres de cette famille ont été isolés à partir d‘environnements géothermiques tels
que des sources marines hydrothermales, des fumeurs noirs, des geysers de surface ou des
cratères volcaniques (solfatares) (Figure 44).
74
Introduction
Figure 44. Environnements chauds où se développent les organismes hyperthermophiles. A : Fumeur noir
d‘une dorsale océanique. Ce phénomène spectaculaire est la conséquence de la circulation de l‘eau de mer dans
la croûte océanique, au niveau des régions présentant une activité volcanique intense ; B : Geyser de surface
(Islande). L‘eau de pluie infiltrée se réchauffe au contact des poches magmatiques ; C : Solfatare en Italie.
Dégagement de vapeurs d‘eau (160°C) composé entre autre de dioxyde de soufre et de sulfure d‘hydrogène.
75
Introduction
Les Aquificales constituent la branche la plus basse du domaine bactérien, proche du
point de divergence Archaea / Eukarya sur l‘arbre phylogénétique universel (Figure 45)
(Huber, 2002) et constituent un phylum distinct, Aquificae, au sein des Bacteria (Reysenbach,
2001).
Figure 45. Arbre phylogénétique universel basé sur la séquence de la petite sous-unité de l’ARNr 16S
(Stetter, 2006). Les branches rouges sont constituées par les organismes hyperthermophiles.
A ce jour, le phylum Aquificae comprend trois familles (Figure 46) : Aquificaceae
(Reysenbach, 2001), Desulfurobacteriaceae (L'Haridon et al., 2006), et Hydrogenothermaceae
(Eder and Huber, 2002). Cinq genres sont répertoriés dans la famille des Aquificaceae :
Aquifex, Hydrogenivirga, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum et Thermocrinis.
76
Introduction
Figure 46: Arbre phylogénétique basé sur l’ARNr 16S de quelques représentants de l’ordre des
Aquificales. La bactérie d‘étude Aquifex aeolicus est indiquée en rouge. L‘arbre est réalisé selon la méthode des
« neighbor-joining ». Ressource internet.
Les Aquificales sont des bactéries non sporulantes, strictement thermophiles ou
hyperthermophiles, se développant à pH neutre ou légèrement inférieur (excepté pour
Hydrogenobaculum acidophilum) (Table 2). Le genre Aquifex est le plus hyperthermophile
avec une température maximale de croissance de 95°C. Les deux espèces bactériennes du
genre Aquifex caractérisées au niveau physiologique sont Aquifex aeolicus et Aquifex
pyrophilus. Cette dernière, isolée à Kolbensey Ridge au nord de l‘Islande, est anaérobie
facultative et peut fixer l‘azote (Table 2) (Huber, 1992).
Les membres des familles Aquificaceae et Hydrogenothermaceae sont capables
d‘utiliser l‘hydrogène et l‘oxygène respectivement comme donneur et comme accepteur
d‘électrons (appelé « knallgas réaction »). Les membres de la troisième famille
Desulfurobacteriaceae sont quant à eux des anaérobes obligatoires qui utilisent l‘hydrogène
pour la respiration du soufre ou du nitrate. Le thiosulfate et le soufre élémentaire peuvent
également être utilisés comme source d‘énergie par les Aquificales (Table 2). La plupart de
ces bactéries sont autotrophes, utilisant le CO2 comme source de carbone qu‘elles fixent à
partir du cycle de l‘acide tricarboxylique inverse ; cependant quelques espèces peuvent être
hétérotrophes et obtiennent leur carbone via des sources organiques tels que l‘acétate et le
formiate.
77
Introduction
Genres
Espèces
Temp °C
(min-optmax)
pH (minopt-max)
Donneurs
électrons
Accepteurs
électrons
Produits
formés
Famille Aquificaceae
Aquifex
pyrophilus
67-85-95
5,4-6,87,5
H2, S°, S2O3-2
O2, NO3-
H2O, SO4-2,
N2
Hydrogenivirga
caldilitoris
55-75-77,5
5-6,5-7
H2, S°
O2, NO3-
H2O, SO4-2,
N2O
H2
O2
H2O
O2
H2O, SO4-2,
N2
Famille Hydrogenothermaceae
Hydrogenothermus
marinus
45-65-80
5- ?-7
Persephonella
marina
50-73-80
4,7-6-7,5
H2, S°,
S2O3-2
Famille Desulfurobacteriaceae
Thermovibrio
ruber
50-75-80
5-6-6,5
H2
NO3-, S°
NH4+, H2S
Balnearium
lithotrophicu
m
45-70-80
5-5,4-7
H2
S°
H2S
Table 2: Propriétés physiologiques de différentes espèces appartenant à l’ordre des Aquificales. Temp :
température ; min : minimum, opt : optimum, max : maximum. Le pH optimal de croissance pour
Hydrogenothermus marinus n‘est pas connu. Le tableau est adapté du livre « Aquificales » (Bonchosmolovskaya, 2008).
II) Présentation de notre modèle d’étude : Aquifex aeolicus
La souche d‘Aquifex aeolicus que nous étudions au laboratoire nous a été fournie par
Karl O. Stetter (Université de Regensburg) qui l‘a isolée à partir d‘une source hydrothermale
peu profonde près de l‘île de Vulcano (située au nord de la Sicile). Aquifex aeolicus est une
78
Introduction
bactérie hyperthermophile ayant une température optimale de croissance de 85°C mais qui
peut croître jusqu‘à 95°C, ce qui en fait l‘une des bactéries les plus hyperthermophiles connue
à ce jour. De plus, la position phylogénétique d‘Aquifex aeolicus (Figure 45) en fait un
organisme idéal pour l‘étude du métabolisme énergétique dans le cadre d‘une atmosphère
proche de l‘atmosphère primitive.
A) Morphologie, motilité et adhérence
Aquifex aeolicus est une bactérie Gram négatif en forme de bâtonnet (Figure 47)
mesurant de 2 à 6 µm pour un diamètre compris entre 0,4 et 0,5 µm.
Figure 47. Aquifex aeolicus en microscopie électronique. La flèche indique les flagelles monopolaires
polytriches.
Aquifex aeolicus est dotée de motilité comme Aquifex pyrophilus (Behammer et al.,
1995) car elle possède des flagelles monopolaires polytriches (Figure 47). En effet, plus de 25
gènes codant pour des protéines impliquées dans la biosynthèse et la structure du flagelle ont
été répertoriés dans son génome (Deckert et al., 1998). Récemment, des études réalisées au
sein de l‘équipe ont permis de montrer que la bactérie n‘était mobile qu‘en présence de soufre
soluble (thiosulfate), et que la croissance sur soufre élémentaire insoluble (fleur de soufre)
79
Introduction
conduisait à l‘adhésion de la bactérie sur ce substrat : cette adhésion impliquerait un pili de
type IV, dont les gènes de synthèse sont retrouvés dans le génome de la bactérie. De plus, ceci
a été corrélé à la présence de la protéine FliC, composante majoritaire du flagelle, lors de la
croissance avec le soufre soluble, alors qu‘elle est absente en présence de soufre élémentaire
(Giuliani et al., 2010).
Tout comme Aquifex pyrophilus, elle est également capable de former de larges
agrégats cellulaires pouvant contenir une centaine d‘individus (Figure 48).
Figure 48. Agrégat de cellules d’Aquifex aeolicus vues en microscopie optique.
B) Génome
Le génome d‘Aquifex aeolicus, entièrement séquencé à la fin des années 1990
(Deckert et al., 1998), est constitué de 1 551 335 paires de bases, soit le tiers du génome de la
bactérie Escherichia coli. On y retrouve un taux de GC % élevé (65%), caractéristique des
organismes hyperthermophiles, au niveau des opérons des gènes codant pour l‘ARNr 16S,
23S et 5S. L‘analyse du génome d‘Aquifex aeolicus a montré que 20% de ses gènes
résulteraient d‘un transfert à partir de protéobactéries proches d‘Helicobacter pylori. Le reste
du génome est voisin de celui de bactéries telles que Thermus thermophilus ou encore
Thermotoga maritima (Deckert et al., 1998).
80
Introduction
C) Physiologie
Aquifex aeolicus est une bactérie chimiolithoautotrophe obligatoire, qui n‘utilise que
des composés inorganiques comme source d‘énergie et le CO2 atmosphérique comme source
de carbone. Elle est classiquement cultivée à 85°C sous atmosphère de H 2/CO2/O2 dans un
milieu ne contenant que des composés inorganiques, dont une source de soufre obligatoire
(thiosulfate ou fleur de soufre). A l‘heure actuelle, ces quatre éléments semblent
indispensables puisqu‘aucune croissance de la bactérie n‘a été observée en cas d‘absence de
l‘un d‘eux.
La fixation du carbone chez Aquifex aeolicus se fait, comme chez Aquifex pyrophilus,
via le cycle inverse de l‘acide tricarboxylique (Beh et al., 1993; Hugler et al., 2007). Les
gènes codant pour les enzymes clefs de ce cycle sont présents dans le génome d‘Aquifex
aeolicus. Par ailleurs, aucun élément ne suggère l‘existence d‘une voie alternative de fixation
du CO2 (Deckert et al., 1998).
Aquifex aeolicus est une bactérie microaérophile, capable de croître à des
concentrations en oxygène de 7,5 ppm. Les gènes permettant la mise en place d‘une
respiration aérobie tels que ceux codant pour le complexe bc1, cytochromes c et cytochrome c
oxydases sont présents, de même que ceux codant pour une quinol oxydase (Deckert et al.,
1998) La bactérie possède en outre des gènes codant pour de nombreuses enzymes de
protection contre les espèces réactives de l‘oxygène, comme plusieurs superoxydes
dismutases ou encore des thiol peroxydases (Deckert et al., 1998).
L‘analyse du génome d‘Aquifex aeolicus souligne l‘existence d‘une nitrate réductase
putative. Cependant, contrairement à la bactérie Aquifex pyrophilus, elle semble incapable
d‘effectuer la respiration du nitrate. Le gène codant pour la nitrate réductase se trouvant à côté
de celui d‘un transporteur, il est possible que cette enzyme soit impliquée non pas dans la
respiration de l‘azote, mais plutôt dans son assimilation (Deckert et al., 1998).
81
Introduction
Enfin, lors d‘une croissance en présence de soufre élémentaire, des inclusions
contenant du soufre apparaissent dans le cytoplasme de la bactérie (Figure 49) (Guiral et al.,
2005b).
Figure 49. Image en microscopie électronique d’Aquifex aeolicus cultivée en présence de soufre
élémentaire. A l‘intérieur du cytoplasme de la bactérie, les globules de soufre sont visibles pointés par des
flèches blanches (Guiral et al., 2005b).
Comme nous l‘avons vu précédemment (Chapitre I, II.A.4), de tels globules de soufre
ne sont pas rares chez les bactéries capables d‘oxyder ce substrat, et peuvent représenter soit
un intermédiaire réactionnel, soit un produit final du métabolisme énergétique (Dahl and
Prange, 2006). Cependant, ils sont majoritairement retrouvés dans le périplasme ou à
l‘extérieur des cellules, leur localisation cytoplasmique chez Aquifex aeolicus est donc tout à
fait particulière. Chez Allochromatium vinosum, ces globules sont entourés d‘une enveloppe
protéique formée des protéines SgpA, SgpB et SgpC (Brune, 1995b; Pattaragulwanit et al.,
1998), mais chez Aquifex aeolicus, aucun des gènes codant pour ces protéines n‘a été retrouvé
dans le génome, posant ainsi la question de l‘existence d‘une telle enveloppe. La forme sous
laquelle ce soufre est stocké n‘est pas non plus connue.
82
Introduction
III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex
aeolicus
La production d‘énergie chez Aquifex aeolicus est due à une ATP synthase, complexe
membranaire absolument indispensable qui a été purifié et caractérisé (Peng et al., 2006).
L‘enzyme est fonctionnelle, et ses neuf sous-unités ont été identifiées, à savoir α, β, γ, δ, ε de
la partie F1 et les sous-unités a et c de la partie F0. Deux versions dupliquées de la sous-unité b
ont également été retrouvées et formeraient un hétérodimère. Les études menées dans l‘équipe
ont permis de montrer que l‘ATP synthase d‘Aquifex aeolicus est monomérique pour une
masse moléculaire d‘environ 600 kDa (Guiral et al., 2009).
Plusieurs enzymes et voies métaboliques participant directement ou indirectement à la
création du gradient de protons nécessaire au fonctionnement de l‘ATP synthase sont présents
dans la bactérie.
A) Voie H2S/O2
Une première étude réalisée au début des années 2000 sur des membranes d‘Aquifex
aeolicus cultivée en présence de thiosulfate avait proposé que l‘oxydation de l‘H 2S par la
SQR soit associée à la réduction de l‘oxygène par une cytochrome c oxydase via le complexe
bc1 et le « pool » de quinones. Une partie des électrons serait également transférée à une autre
oxydase terminale, la quinol : oxygène oxydoréductase (Nübel et al., 2000).
Cette voie H2S/O2 a été confirmée par des travaux réalisés dans l‘équipe. Il a en outre
été montré que cette voie était portée par un unique supercomplexe regroupant tous les
éléments nécessaires au transfert d‘électrons à partir d‘un donneur primaire d‘électrons
(l‘H2S) jusqu‘à l‘accepteur terminal (l‘oxygène) (Guiral et al., 2009; Prunetti et al., 2010).
Cette entité complètement autonome est appelée « respirasome » (Figure 50).
83
Introduction
Figure 50. La voie H2S/O2 est portée par un supercomplexe composé d’une SQR, d’un dimère de complexe
bc1 et d’une cytochrome c oxydase.
Elle est ainsi constituée d‘une SQR, d‘un dimère de complexe bc1 et d‘une cytochrome c
oxydase de type ba3. Le « pool » de quinones assure le transfert d‘électrons entre la SQR et le
complexe bc1 et un cytochrome c est impliqué dans le transfert d‘électrons du complexe bc1 à la
cytochrome c oxydase. Il a également été montré que ce supercomplexe, bien que très stable, peut
toutefois être dissocié, par un traitement au SDS, en deux parties distinctes, à savoir la SQR d‘un côté,
et le sous-supercomplexe bc1/cytochrome c oxydase de l‘autre. Ce dernier édifice est en revanche
extrêmement stable et de multiples étapes de purification et de traitements chimiques sont nécessaires
pour le dissocier.
Concernant la SQR, cette dernière peut être retrouvée dans le supercomplexe, mais aussi libre
dans la membrane. Elle a ainsi été cristallisée sous la forme d‘un trimère (Figure 51) (Marcia et al.,
2009).
84
Introduction
Figure 51. Structure 3D de la SQR trimérique d’Aquifex aeolicus. En rouge : cofacteur FAD (PDB 3HYV).
Cependant, l‘état d‘oligomérisation physiologique de la SQR n‘est pas connu : on la
retrouve en solution sous forme monomérique, dimérique et trimérique, et chacune de ces
formes est active. L‘existence d‘un équilibre et d‘une inter conversion entre ces différentes
formes est une possibilité que l‘on ne peut pas écarter. Son orientation était également au
début de ma thèse une question sans réponse tranchée : en tant que protéine membranaire
monotopique, la SQR est orientée soit vers le périplasme, soit vers le cytoplasme. Aucune
séquence signal ou motif « twin arginine » en N-terminal n‘est détecté, suggérant ainsi une
orientation cytoplasmique, cependant, chez Rhodobacter capsulatus, c‘est une séquence Cterminale qui assure l‘export de la SQR du côté périplasmique de la membrane (Schutz et al.,
1999). De plus, la résolution de la structure de la SQR d‘Aquifex aeolicus a montré que le
domaine C-terminal des monomères est stabilisé par deux ponts disulfure, ce qui corrobore
l‘idée de la localisation du côté périplasmique (Marcia et al., 2009). Aucune preuve directe
n‘avait toutefois été apportée quant à la véritable orientation de cette protéine chez Aquifex
aeolicus. Au cours de ma thèse, cette question a été résolue par les travaux de l‘équipe.
85
Introduction
B) Voie H2/S°
Lors d‘une culture d‘Aquifex aeolicus en présence de soufre élémentaire, on assiste à
l‘apparition dans le milieu d‘H2S résultant de la réduction du soufre. En 2005, l‘équipe a
identifié un supercomplexe membranaire d‘environ 600 kDa composé d‘une hydrogénase et
d‘une soufre réductase : cet édifice supramoléculaire est capable de coupler l‘oxydation
périplasmique de l‘hydrogène en protons et électrons à la réduction cytoplasmique du soufre
élémentaire en H2S, le « pool » de quinones jouant le rôle de navette électronique entre les
deux partenaires (Guiral et al., 2005b).
Ce supercomplexe présente des points communs ainsi que des différences avec les
voies H2/S° déjà décrites dans la littérature (Chapitre I, II.B).
Hydrogénase II
H2
2H++2eNi
Périplasme
Sre C
Q
bII
Sre B
Membrane
Cytoplasme
Sre A
Mo
S°
H2 S
Soufre Réductase
Figure 52. Modèle de la voie de réduction du soufre élémentaire chez Aquifex aeolicus. L‘hydrogène est
oxydé au niveau du site catalytique de l‘hydrogénase II (centre [NiFe]). Les électrons sont transférés aux centres
[Fe-S] puis au cytochrome bII de l‘hydrogénase, puis par le « pool » de quinones et les centres [Fe-S] de la soufre
réductase à la sous-unité à molybdène, où la réaction de réduction du soufre est réalisée. Le transfert d‘électrons
est représenté par les flèches en pointillés, le site catalytique de l‘hydrogénase par Ni, les centres [Fe-S] par les
ronds bleus, le cytochrome bII par b II, le « pool » de quinones par Q, et le site catalytique de la soufre reductase
par Mo.
86
Introduction
Tout d‘abord, sa composition est identique à ce que l‘on peut trouver chez Wolinella
succinogenes et Acidianus ambivalens, à savoir une hydrogénase, constituée d‘une grande
sous-unité catalytique à nickel-fer et d‘une petite sous-unité à centres fer-soufre ancrées à la
membrane par un cytochrome b, et une soufre réductase, molybdoenzyme de la famille des
DMSO réductases (Figure 52). Cette dernière est constituée des trois sous-unités SreA (113
kDa), SreB (29 kDa) et SreC (39 kDa) qui sont respectivement la sous-unité catalytique à
molybdène, la sous-unité à quatre centres fer-soufre et l‘ancre membranaire portant le site de
fixation des quinones. SreA comporte également un centre fer-soufre ainsi qu‘un site de
fixation du NADPH, lequel est nécessaire à une activité optimale de la protéine. Cependant, la
stœchiométrie exacte du supercomplexe n‘est pas connue (Guiral et al., 2005b). La présence
de tous les acteurs réalisant le transfert d‘électrons du donneur primaire à l‘accepteur final en
fait un second exemple de « respirasome » présent chez Aquifex aeolicus.
Cette organisation en supercomplexe de la voie H2/S° chez Aquifex aeolicus est
retrouvée chez Pyrodictium abyssi mais pas chez les autres organismes comme Acidianus
ambivalens et Wolinella succinogenes (Dietrich and Klimmek, 2002; Dirmeier et al., 1998;
Laska et al., 2003). Cependant, la grande différence entre Aquifex aeolicus et les autres
organismes tient à l‘orientation des protéines. En effet, si l‘hydrogénase membranaire est
toujours orientée vers le périplasme, il n‘en va pas de même pour la soufre réductase.
Périplasmique chez tous les organismes sauf Aquifex aeolicus, pour laquelle la séquence
d‘export avec le motif « twin arginine » caractéristique est absente, suggérant ainsi sa
localisation cytoplasmique. Ceci en fait un exemple unique d‘une voie de transfert d‘électrons
du périplasme au cytoplasme, de l‘hydrogène vers le soufre (Figure 52).
Il faut noter qu‘il existe plusieurs hydrogénases chez Aquifex aeolicus : l‘une d‘entre
elles (hydrogénase III) est soluble et pourrait participer à la fixation du carbone
atmosphérique via une ferrédoxine et le cycle des acides tricarboxyliques inverse (Guiral et
al., 2005a). Une autre (hydrogénase I) est membranaire, résistante à l‘oxygène et au
monoxyde de carbone, et directement impliquée dans le métabolisme énergétique de la
bactérie : les électrons issus de l‘oxydation périplasmique de l‘hydrogène sont transférés via
un cytochrome b au « pool » de quinones, lesquelles vont être utilisées par le supercomplexe
bc1/cytochrome c oxydase pour réduire l‘oxygène. Ceci constitue donc une véritable voie
H2/O2. Toutefois, une interaction physique entre l‘hydrogénase et le supercomplexe n‘a pas
encore été mise en évidence (Guiral et al., 2009).
87
Introduction
C) La Soufre Oxygénase Réductase (SOR)
Un gène codant pour une SOR putative a été détectée dans le génome d‘Aquifex
aeolicus, puis la présence de la protéine correspondante a été démontrée dans le cytoplasme
de la bactérie avant d‘être finalement purifiée après clonage chez Escherichia coli (Pelletier et
al., 2008). Il a ainsi été démontré que la protéine possède la même activité
oxygénase/dismutation du soufre à partir de soufre élémentaire et d‘oxygène que les autres
SOR caractérisées chez les archées, ainsi que l‘atome de fer indispensable à cette activité. Les
expériences de chromatographie d‘exclusion ainsi que de migration sur gel bleu natif
(permettant de déterminer la masse native d‘une protéine) ont montré qu‘elle était composée
de 16 sous-unités pour une masse moléculaire d‘environ 600 kDa. Il faut cependant remarquer
que les premières caractérisations des SOR d‘archées, ayant utilisées le même type de
technique, avaient conduit à une sous-estimation de la masse de la protéine (550 kDa contre
850 kDa), et donc du nombre de sous-unités qui la composent. Il a fallu attendre les données
cristallographiques de la SOR d‘Acidianus ambivalens et celle d‘Acidianus tengchongensis
pour attribuer un nombre de 24 sous-unités à la forme complète de l‘enzyme (Li et al., 2008b;
Urich et al., 2006). La modélisation du monomère de la SOR d‘Aquifex aeolicus a montré une
forte similarité de structure avec celles des deux espèces d‘Acidianus. Ces éléments, combinés
avec l‘architecture particulière de cette enzyme, nous poussent à croire que la forme
physiologique de la SOR d‘Aquifex aeolicus est également une sphère de 24 sous-unités
(Figure 53).
La découverte de cette enzyme chez Aquifex aeolicus était tout à fait singulière,
puisque l‘on pensait que la SOR était l‘apanage des archées hyperthermophiles, leur
fournissant ainsi un moyen unique d‘oxyder le soufre élémentaire. Elle est donc restée un cas
particulier jusqu‘à la découverte de nouvelles SOR bactériennes, et notamment celle de la
bactérie mésophile Halothiobacillus neapolitanus (Veith et al., 2012). A ce jour, ce sont les
deux seules SOR bactériennes à avoir été purifiées et caractérisées.
88
Introduction
B
A
Figure 53. Modélisation de la SOR d’Aquifex aeolicus à partir de celle d’Acidianus tengchongensis. A,
superposition des deux monomères de SOR (en bleu Aquifex aeolicus, en vert Acidianus tengchongensis, la
sphère rouge correspond à l‘atome de fer non-hémique). B, forme complète modélisée (24-mers) de la SOR
d‘Aquifex aeolicus. Le canal d‘entrée formé par quatre monomères est visible au centre.
D) Les rhodanèses
Les premières analyses du génome d‘Aquifex aeolicus ont permis de détecter deux
gènes codant pour des rhodanèses à deux domaines, rhdA1 et rhdA2. Cependant, ces protéines
n‘ont jamais été purifiées ou détectées dans les extraits cellulaires de la bactérie.
En revanche, des études menées dans l‘équipe ont démontré l‘existence de deux
rhodanèses supplémentaires à un seul domaine. La première, Aq_1599, renommée RhdB2, est
un dimère périplasmique potentiellement impliquée dans une voie de signalisation de la
bactérie, et plus particulièrement dans la régulation de la motilité et l‘adhésion au substrat
soufré (fleur de soufre) (Giuliani et al., 2010). Des travaux récemment publiés sur la protéine
PspE d‘Escherichia coli (Chng et al., 2012) ont montré que cette rhodanèse périplasmique
pouvait partiellement assumer le rôle du système DsbA/DsbB dans la formation des ponts
disulfures des protéines du périplasme. Il a ainsi été proposé par les auteurs que des
rhodanèses périplasmiques puissent jouer ce rôle chez les bactéries dépourvues de
89
Introduction
DsbA/DsbB, et que RhdB2 d‘Aquifex aeolicus (qui ne possède pas DsbA/DsbB) puisse être
l‘archétype d‘un tel système. Cette hypothèse intéressante reste encore à tester.
La seconde rhodanèse, Aq_477, est cytoplasmique, et présente un comportement
inhabituel pour une protéine de cette famille : en effet, la forme monomérique de la protéine
existe en équilibre avec des formes dimériques et tétramériques (Giuliani et al., 2007). Il a pu
être démontré par des méthodes biochimiques et physico-chimiques que cette augmentation
du degré d‘oligomérisation apporte une meilleure stabilité à l‘enzyme ; cette caractéristique
est très probablement une stratégie d‘adaptation à l‘hyperthermophilie de la bactérie. Un
second point intéressant concerne les substrats utilisables par Aq_477, puisqu‘elle est capable
d‘utiliser in vitro le thiosulfate (substrat classique des rhodanèses), mais aussi le tétrathionate
ainsi que le polysulfure. Les paramètres cinétiques indiquent en outre une bien meilleure
affinité pour le polysulfure que pour le thiosulfate, indiquant ainsi que le polysulfure est
probablement le substrat physiologique. Il faut rappeler que contrairement à Aq_477, la
protéine Sud de Wolinella succinogenes est également capable d‘utiliser le polysulfure, mais
pas le thiosulfate (Klimmek et al., 1998). Ces deux caractéristiques, état d‘oligomérisation
non-conventionnel et possibilité d‘utiliser différents substrats, font de cette protéine une
rhodanèse tout à fait atypique. En dépit de ceci, aucun rôle physiologique pour cette protéine
n‘avait pu être dévoilé au début de ma thèse.
E) NADH déshydrogénase (complexe I)
La NADH déshydrogénase est le point d‘entrée des électrons pour la plupart des
chaînes respiratoires (Weiss et al., 1991). En effet, ce complexe protéique couple le transfert
d‘électrons du NADH vers un pool de quinones à la translocation de protons à travers la
membrane plasmique, contribuant ainsi à la création de la force proton motrice (Figure 54).
Le génome d‘Aquifex aeolicus révèle la présence de 24 gènes nuo codant pour des
sous-unités de la NADH déshydrogénase. Il faut toutefois noter que le complexe I bactérien
n‘est constitué que de 14 sous-unités. En fait, sept gènes sont présents sous forme dupliquée
ou tripliquée. De plus, à l‘inverse des autres procaryotes, les gènes codant pour le complexe I
ne sont pas retrouvés sous forme d‘un opéron, ou en groupe de gènes, mais sont présents dans
différents locus. Cette organisation inhabituelle pourrait être liée au niveau évolutif à
l‘acquisition tardive de certains gènes (Scheide et al., 2002).
90
Introduction
Figure 54: Représentation schématique de la NADH déshydrogénase montrant son organisation en trois
modules (Friedrich and Bottcher, 2004). Le module NADH-déshydrogénase est représenté en jaune, le module
hydrogénase en rouge, et le module de transport des protons en bleu. Les centres [Fe-S] sont notés N1a, N1b,
N2, N3, N4, N5, N6a, et N6b. Q: quinone; QH2: quinol.
La NADH déshydrogénase d‘Aquifex aeolicus a été purifiée en 2003 dans un état
fonctionnel (Peng et al., 2003). Le complexe I comporte 13 sous-unités, les sous-unités NuoC
et NuoD étant fusionnées, pour une masse moléculaire de 550 kDa, et présente une structure
typique en L (Peng et al., 2003). Des études protéomiques menées par l‘équipe sur des
membranes solubilisées (Guiral et al., 2009) ont permis d‘identifier les copies alternatives
(duplicatas) des sous-unités NuoD et NuoI du complexe I. Ceci montre que différentes
isoformes de ce complexe sont présente dans les conditions de culture que nous utilisons au
laboratoire, traduisant probablement une certaine flexibilité de la composition du complexe I
chez Aquifex aeolicus. Ceci semble être une caractéristique des Aquificales, puisque des
duplicatas des sous-unités D et I sont également retrouvées chez Persephonella marina,
Sulfurihydrogenibium azorense et Hydrogenobaculum Y04AAS1 par exemple. .
Le complexe I réduit le pool de quinones par l‘oxydation réversible du NADH.
Cependant, le rôle de la NADH déshydrogénase chez Aquifex aeolicus n‘a pas été élucidé : en
effet, le couplage NADH/cytochrome c oxydase classiquement observé dans les membranes
des mitochondries n‘a pas été montré. Il a ainsi été proposé le transfert des électrons du
complexe I vers une quinol oxydase ; une autre possibilité pourrait être le fonctionnement en
sens inverse pour la régénération du pouvoir réducteur fourni par le NADH.
91
Introduction
F) Vision globale du métabolisme énergétique du soufre chez
Aquifex aeolicus
Comme bien souvent chez les organismes capables d‘oxyder le soufre à des fins énergétiques,
Aquifex aeolicus possède un métabolisme complexe et composé de plusieurs enzymes responsables de
l‘oxydation et de la réduction de différentes espèces soufrées (Figure 55).
Figure 55. Schéma du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus. Seules les voies et les
enzymes caractérisées avant mon arrivée au laboratoire sont représentées. Les ronds noirs symbolisent les
quinones, celui en rouge représente le cytochrome c.
Ce métabolisme est également indissociable de ceux de l‘hydrogène et de l‘oxygène qui sont
respectivement des donneurs et des accepteurs d‘électrons pour la bactérie. On retrouve ainsi une
première voie hydrogène/oxygène indépendante du soufre, faisant intervenir une hydrogénase et le
supercomplexe bc1/cytochrome c oxydase. Cependant, la bactérie a impérativement besoin d‘un
composé soufré (classiquement le soufre élémentaire ou le thiosulfate) pour sa croissance, cette
première voie n‘est donc clairement pas suffisante. Une seconde voie couple l‘oxydation du sulfure
d‘hydrogène H2S à la réduction de l‘oxygène : cette activité est portée par un supercomplexe composé
d‘une SQR et du supercomplexe bc1/cytochrome c oxydase. Une troisième voie, reposant sur le
92
Introduction
supercomplexe transmembranaire hydrogénase/soufre réductase, associe l‘oxydation de l‘hydrogène à
la réduction du soufre élémentaire. Il est intéressant de remarquer que la SQR et la soufre réductase
catalysent des réactions strictement inverses : le substrat de l‘une est le produit de l‘autre, puisque
l‘H2S est le substrat de la SQR et le produit de la soufre réductase, et qu‘à l‘inverse, la chaîne de
soufre produite par la SQR peut être utilisée par la soufre réductase. Loin d‘être un « cycle futile »,
pour reprendre le terme employé par les enzymologistes, dans lequel on revient constamment au point
de départ, il faut voir ce système comme un processus de recyclage du soufre afin d‘exploiter au
mieux sa capacité énergétique. En effet, à chaque passage, des quinones sont impliquées et un gradient
de protons est créé, permettant ainsi le fonctionnement de l‘ATP synthase et la production d‘énergie
pour la bactérie. A ce cycle composé des deux voies citées se rajoute un troisième acteur
cytoplasmique, la SOR, qui utilise des chaînes de soufre pour produire de l‘H 2S, mais aussi du sulfite,
et d‘une manière non-enzymatique, du thiosulfate.
Le devenir de ces produits est incertain, et nous avons vu que chez les autres organismes, des
systèmes supplémentaires étaient capables d‘utiliser ce type de composés afin d‘en réaliser une
oxydation complète. De plus, Aquifex aeolicus est capable d‘utiliser le thiosulfate pour sa croissance,
et aucune des voies ou enzymes décrites n‘en permet l‘utilisation. Enfin, le produit final du
métabolisme de la bactérie est le sulfate, ainsi que l‘H2S lors d‘une croissance sur soufre élémentaire.
Il est donc logique de penser que des systèmes autres que ceux déjà caractérisés doivent exister chez
Aquifex aeolicus. A mon arrivée dans l‘équipe, ces pistes n‘avaient été que peu explorées, et une partie
de ma thèse a consisté à tenter d‘identifier de nouvelles voies et enzymes impliquées dans le
métabolisme énergétique du soufre. Une sous-partie des résultats y est consacrée.
93
Introduction
Chapitre IV
Objectifs du travail
94
Introduction
95
Introduction
Objectifs du travail
J‘ai réalisé ma thèse au laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines dans
l‘équipe « Métabolisme énergétique des organismes extrêmophiles », qui s‘intéresse à la
compréhension des stratégies d‘adaptation aux environnements extrêmes des microorganismes, notamment en ce qui concerne leur métabolisme énergétique.
Aquifex aeolicus est l‘un des modèles d‘études de l‘équipe. Cette bactérie est tout à fait
remarquable à bien des niveaux. En premier lieu parce qu‘elle est l‘une des plus
hyperthermophiles décrites à ce jour, avec une température optimale de croissance de 85°C, et
une tolérance proche des 100°C. Sa position phylogénétique est également exceptionnelle,
puisque c‘est l‘un des organismes les plus proches de LUCA, le dernier ancêtre commun à
toutes les formes de vie; ce caractère ancien se retrouve également au niveau de son
métabolisme énergétique. En effet, Aquifex aeolicus est capable d‘utiliser le soufre
élémentaire, insoluble, pour sa croissance. Ce type de processus date de plus de 3,5 milliards
d‘années, et c‘est donc l‘une des premières stratégies mises en place pour la production
d‘énergie par les être vivants (Philippot et al., 2007).
Les travaux de l‘équipe consistent à analyser les voies énergétiques existantes chez cet
organisme dont les conditions de croissance optimales nécessitent la présence d‘une source de
soufre, mais aussi d‘oxygène et d‘hydrogène. L‘identification des enzymes impliquées dans
ces voies énergétiques peu habituelles a été un des premiers objectifs de recherche. L‘équipe
est ainsi parvenue à mettre en évidence l‘existence de trois voies énergétiques coexistant dans
les conditions de culture utilisées : une première voie associe l‘hydrogène au soufre
(supercomplexe hydrogénase / soufre réductase), une seconde, le soufre à l‘oxygène
(supercomplexe SQR / complexe bc1 / cytochrome c oxydase) et la troisième, l‘hydrogène à
l‘oxygène (voie hydrogénase / complexe bc1 / cytochrome c oxydase). En plus de ces trois
voies majeures, une enzyme particulière nécessitant du soufre et de l‘oxygène, la SOR, avait
été caractérisée. Enfin, deux soufre transférases de la superfamille des rhodanèses, Aq_477 et
Aq_1599, ont été caractérisées, sans que leur rôle physiologique ait pu être clairement établi.
96
Introduction
Si l‘on se focalise sur le métabolisme énergétique du soufre, deux points sont
notables : le premier concerne la complexité d‘un tel métabolisme mettant en jeu différentes
enzymes capables d‘utiliser et de produire différents composés soufrés, lesquels peuvent être
à la fois substrats et produits pour ces protéines, ce qui pose la question d‘une éventuelle
interconnexion entre ces voies. Le deuxième point est en rapport avec la circulation et le
transfert des molécules soufrées au sein de ces systèmes certes complexes mais surtout
hautement organisés.
Au cours de ma thèse, je me suis essentiellement attaché à comprendre le métabolisme
énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus à travers deux axes principaux, décrit au sein de
la première partie de ce manuscrit. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle de la
rhodanèse de fonction inconnue Aq_477, et nous avons ainsi pu mettre en évidence son rôle
central de transport de substrat au sein du métabolisme énergétique du soufre. Un deuxième
axe a été de porter un regard plus large et plus global sur ce métabolisme, en recherchant des
systèmes supplémentaires d‘utilisation du soufre, qui pourraient par exemple expliquer le
devenir de certaines molécules soufrées telles que le sulfite produit au cours de l‘oxydation du
soufre. Ceci nous a permis de proposer un modèle général du métabolisme énergétique du
soufre chez Aquifex aeolicus intégrant ces nouveaux systèmes et l‘interconnexion de ces
différentes voies.
Dans une seconde partie, nous avons cherché à savoir si les complexes et enzymes des
voies respiratoires de la bactérie pouvaient s‘associer entre elles afin de former des structures
de très haut poids moléculaire, nommées mégacomplexes, qui permettraient une certaine
compartimentalisation, et donc une efficacité accrue des processus bioénergétiques.
En recherchant ce type de structures, nous avons découvert un nanocompartiment
protéique appelé encapsuline, dans lequel est capable de s‘ancrer une autre protéine. Cette
dernière, présentant des caractéristiques inhabituelles, nous permet de proposer qu‘elle soit le
prototype d‘une nouvelle sous-famille des ferritines, des protéines impliquées dans le
stockage du fer.
97
Matériels et méthodes
MATERIELS
ET
METHODES
98
Matériels et méthodes
99
Matériels et méthodes
I) Cultures bactériennes
A) Aquifex aeolicus
La souche d‘Aquifex aeolicus a été fournie au laboratoire par le Pr. Karl O. Stetter de
l‘Université de Regensburg en Allemagne. La souche est cultivée à 85°C sous agitation à 350
rpm et à pH 6,8 sous H2 / CO2 (80 : 20 à une pression de 1,35 bar) (Huber et Stetter, 1999). La
culture est réalisée en bouteille de 2 litres, contenant 400 ml d‘un milieu minéral non dégazé
(Tableau 6), dans lequel est ajouté du soufre élémentaire (7,5 g.l-1) ou du thiosulfate (1 g.l-1).
Le rendement est de 50 à 80 g de cellules pour 100 litres de culture. En fin de phase
exponentielle (correspondant à 18 h de croissance sur soufre élémentaire), les bactéries sont
récoltées par centrifugation, et le culot bactérien est refroidi dans l‘azote liquide et conservé à
-80°C.
NaCl
30 g
Acide nitriloacétique
1,5 g
MgSO4, 7 H2O
76 g
MgSO4, 7 H2O
3g
MgCl2, 6H2O
3,5 g
MnSO4, H2O
0,5 g
KCl
0,65 g
NaCl
1g
NaBr
0,1 g
FeSO4, 7 H2O
0,1 g
NaHCO3
2g
CoSO4, 7 H2O
0,18 g
NH4Cl
0,15 g
CaCl2, 2 H2O
0,1 g
K2HPO4
0,15 g
ZnSO4, 7 H2O
0,18 g
CaCl2, 2 H2O
0,5 g
CuSO4, 5 H2O
0,01g
Oligo Balch-Aquifex
10 ml pour 1 litre
H3BO3
0,01 g
Table 3 : Composition du milieu de culture d’Aquifex aeolicus pour 1 litre. La composition pour 1 litre de
solution « oligo de Balch Aquifex » est indiquée dans le tableau de droite.
100
Matériels et méthodes
Dans la cadre de la collaboration avec le MIO (collaboration avec Y. Combet-Blanc et
R. Auria, Institut Méditerranéen d‘Océanologie, Marseille), la souche a été cultivée, en
fermenteur de 8 litres, en Fed-Batch à 80°C sous agitation en présence d‘hydrogène, de
dioxyde de carbone, de thiosulfate et d‘oxygène. Contrairement à nos conditions de
croissance en bouteilles, tout au long de la culture (18h à 20h) la pression partielle d‘oxygène
est maintenue à une concentration fixée. Les cellules utilisées dans nos études on été obtenues
avec une concentration d‘oxygène de 50 % (correspondant à 1,5 mg d‘O 2.l-1, condition
optimale de croissance). A 80°C, la concentration de l‘oxygène à l‘équilibre dans le milieu
pour une atmosphère gazeuse contenant 21% d‘oxygène est de 3 mg.l-1. 3 mg.l-1
correspondent au 100% d‘oxygène dissout à cette température.
B) Escherichia coli
Pour l‘expression hétérologue de la protéine Aq_477 (SbdP) et de la SOR, nous avons
utilisé la souche BL21- CodonPlus (DE3)-RIPL d‘Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA)
qui contient un plasmide permettant l‘expression des gènes des ARNt correspondant aux
codons rares. Les cultures d‘Escherichia coli ont été réalisées dans le milieu Luria Betani
(LB) auquel est rajouté 14 g.l-1 d‘agar dans le cadre de cultures sur milieu solide. La bactérie
Escherichia coli est cultivée à 37°C dans des volumes de 500 ml en conditions aérobies. Une
fois que les cellules ont atteint une densité optique à 600 nm égale à O.6, la production de la
protéine désirée est induite à 37°C durant 3 h par l‘ajout d‘isopropyl β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale 1 mM. Les cellules sont ensuite
récupérées par centrifugation à 10 000 g pendant 30 min.
101
Matériels et méthodes
II) Obtention du matériel biologique
A) Aquifex aeolicus
1. Fractionnement cellulaire
Afin d‘étudier la localisation précise de la rhodanèse Aq_477 (SbdP), nous avons
séparé les différents compartiments cellulaires de la bactérie. La première étape d‘extraction
périplasmique est réalisée en resuspendant les cellules dans un tampon Tris-HCl 100 mM,
EDTA 100 mM pH 9, à raison de 20 ml de tampon par gramme de cellules (poids humide).
L‘incubation est réalisée à 37°C pendant 30 min sous agitation douce, puis l‘extrait
périplasmique est récupéré en centrifugeant les cellules à 10 000 g pendant 10 min. Le culot
contenant les cellules est resuspendu dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6 (20 ml de TrisHCl pour 12 g de bactéries), en présence d‘inhibiteurs de protéases (1 pastille pour 50 ml de
tampon, Cocktail d‘enzymes, Roche) et cassé par deux passages au désintégrateur de cellules
(Constant Systems Ltd.) à une pression de 1,6 kBar. Les cellules non cassées sont éliminées
par une centrifugation à 10 000 g pendant 15 min. Les membranes sont séparées des protéines
du cytoplasme par ultracentrifugation à 170 000 g pendant 1 h. Le culot de membranes est
alors lavé dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5% (volume/volume), 0,5%
acide amino caproïque (ACA) (poids/volume) pour éviter une contamination par les protéines
du cytoplasme. Afin de dissocier les protéines faiblement associées à la membrane, le culot
est lavé dans le tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5% (volume/volume), 0,5% acide
amino caproïque (ACA) (poids/volume) additionné de bromure de sodium (NaBr) 1,5 M
pendant 30 min à température ambiante sous agitation douce puis ultracentrifugé comme
précédemment. Le surnageant (« Lavage NaBr ») contient les protéines décrochées de la
membrane et le culot contient les membranes lavées. Ce culot est ensuite resuspendu dans le
tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5% (volume/volume), 0,5% acide amino caproïque
(ACA) (poids/volume) et dilué pour obtenir une concentration protéique de 10 mg.ml -1 et
solubilisé avec du déoxycholate de sodium (détergent anionique) à une concentration finale de
2% (poids/volume) à 37°C pendant 1 h sous agitation. Les protéines membranaires
solubilisées
(« Membranes
solubilisées
lavées
102
au
Nabr »)
sont
récupérées
par
Matériels et méthodes
ultracentrifugation et sont présentes dans le surnageant. Une fraction appelée « Membranes
solubilisées » est obtenue de la même manière mais sans réaliser le lavage au NaBr.
2. Solubilisation des protéines membranaires
Plusieurs protocoles de solubilisation des protéines membranaires ont été employés en
fonction de l‘objectif recherché.
Pour la purification de la SQR, après casse des cellules et élimination des protéines
solubles, les membranes sont lavées au NaBr comme précédemment indiqué, puis
resuspendues dans du tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, ACA 750 mM, glycérol 5% afin
d‘avoir une concentration en protéine de 20 mg/ml. La solubilisation se fait au DDM (nDodécyl-β-D-maltoside) 2% (concentration finale, poids/volume) pendant 1 h à 37°C sous
agitation douce, puis après ultracentrifugation à 170 000 g pendant 1 h, les protéines
solubilisées sont récupérées dans le surnageant.
Pour la purification du supercomplexe hydrogénase/soufre réductase, le protocole est
le même, mais le lavage au NaBr n‘est pas effectué pour ne pas perturber l‘organisation du
complexe. Les membranes sont diluées à 10 mg.ml-1 et solubilisées au DDM 1%
(concentration finale, poids/volume) pendant 1 h à 37°C sous agitation douce, puis après
ultracentrifugation à 170 000 g pendant 1 h, les protéines solubilisées sont récupérées dans le
surnageant.
Pour la recherche des structures de haut poids moléculaires (mégacomplexes), les
membranes ne sont pas lavées au NaBr avant solubilisation afin de ne pas déstabiliser les
interactions entre protéines. La fraction membranaire est diluée à 10 mg.ml-1 dans un tampon
Imidazole-HCl 50 mM pH 7, ACA 500 mM, EDTA 1 mM et la solubilisation des complexes
membranaires est réalisée pendant 30 min à 37°C sous agitation douce. Plusieurs détergents
ont été testés au cours de cette étude et sont détaillés dans la Partie II des Résultats. La
récupération des protéines solubilisées se fait par une ultracentrifugation plus lente et moins
longue que dans les cas précédents (20 000 g pendant 30 min) afin de ne pas culoter
d‘éventuels mégacomplexes de haut poids moléculaire.
103
Matériels et méthodes
3. Globules de soufre
Un premier protocole, basé sur celui établi pour Allochromatium vinosum (Brune,
1995b), a été employé pour purifier les globules de soufre : après lavage et casse des cellules
cultivées en présence de soufre élémentaire, les globules sont sédimentés par centrifugation à
500 rpm pendant 1 min puis lavés plusieurs fois dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6,
NaCl 100 mM.
Cette méthode n‘ayant pas apporté les résultats escomptés, un autre protocole a été
développé. Après sédimentation, la fraction contenant les globules de soufre est déposée sur
un gradient de densité à base de Percoll constitué de trois couches contenant respectivement
de haut en bas 25%, 50% et 75% de Percoll, diluées dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6.
Une centrifugation à 5 000 g est réalisée pendant 20 minutes, et le culot contenant les globules
de soufre est récupéré et lavé plusieurs fois dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, NaCl
100 mM.
B) Escherichia coli
Les cellules d‘Escherichia coli sont resuspendues dans du Tris-HCl 50 mM pH 7,6 en
présence d‘inhibiteurs de protéases (Cocktail d‘enzymes, Roche). Les cellules sont cassées à
la presse de French sous une pression de 500 bars environ. Les cellules non cassées sont
éliminées par une centrifugation à 10 000 g pendant 15 min à 4°C. Après ultracentrifugation 1
h à 170 000 g, le surnageant contenant les protéines solubles est immédiatement chauffé à
80°C pendant 40 min pour précipiter les protéines d‘Escherichia coli sensibles à la chaleur.
Une centrifugation à 10 000g pendant 30 min permet d‘éliminer le précipité et de récupérer la
protéine surproduite.
104
Matériels et méthodes
III) Méthodes de purification des protéines
A) Chromatographie d’adsorption
La résine d‘hydroxylapatite (HTP, Biorad) est un phosphate de calcium (Ca3(PO4)2)
qui retient certaines protéines dont les hydrogénases et les cytochromes. Les interactions se
font par les charges négatives et positives des protéines et les ions phosphate et calcium du
support. Le tampon d‘équilibration est du Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%,
DDM 0,05% et l‘élution se fait par un gradient 0-1 M de tampon phosphate de potassium pH
7,6 dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%.
B) Chromatographies d’échange d’ions
On utilise des résines hautement polymérisées où sont greffés des groupements acides
ou basiques.
1. Chromatographie à basse pression
La DiEthylAminoCellulose (DEAE cellulose, Whatman) est une échangeuse d‘anions
chargée positivement qui, à pH 7,6, retient les protéines acides. L‘élution se fait par un
gradient de force ionique 0-1 M NaCl dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%,
ACA 0,5%, DDM 0,05%.
2. Chromatographie à haute pression
La Mono Q (1ml, GE Healthcare) est une chromatographie Fast Protein Liquid
Chromatography (GE Healthcare). C‘est une échangeuse d‘anions qui permet de retenir les
protéines acides à pH 7,6. La résine est équilibrée dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6,
glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%. L‘élution se fait par un gradient de NaCl 0-500 mM
105
Matériels et méthodes
(40 minutes) dans du Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05% à un
débit de 0,5 ml/min.
C) Chromatographie d’exclusion
Le support poreux de billes permet de séparer les protéines en fonction de leur masse
moléculaire. La colonne Superdex 200 (120 ml, GE Healthcare) est utilisée en FPLC avec une
gamme de résolution de 10 à 600 kDa. Elle est équilibrée et éluée avec du tampon Tris-HCl
50 mM pH 7,6, NaCl 100 mM à un débit de 0,6 ml/min.
D) Protocoles de purification
1. La SQR
Après solubilisation, l‘extrait membranaire est chargé sur une DEAE (80 ml)
équilibrée avec le tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%
(tampon A) à température ambiante. Dans chaque fraction éluée, l‘activité SQR a été testée au
spectrophomètre (Guiral et al., 2009). La SQR est éluée à 100-150 mM NaCl dans le tampon
A. La fraction est concentrée et lavée dans le même tampon sur « Vivaspin » (seuil de
coupure 50 kDa). L‘échantillon est chargé sur une HTP, et la SQR est éluée à 150 mM
phosphate dans le même tampon. Les fractions présentant l‘activité SQR sont concentrées
(« Vivaspin» seuil de coupure 50 kDa) et chargées sur une Mono Q. La SQR est éluée à 175
mM NaCl. L‘échantillon est concentré et lavé avec le tampon A sur « Vivaspin » (seuil de
coupure 50 kDa) puis stocké à -80°C. Pour 60 grammes de bactéries, environ 2 mg de SQR
pure sont obtenus.
2. Supercomplexe hydrogénase/soufre réductase
Les protéines solubilisées sont séparées par une première étape de DEAE (xx ml)
équilibrée avec le tampon A. Les fractions éluées à 100-200 mM NaCl, contenant l‘activité
soufre réductase, sont dialysées dans le tampon A et chargées sur une colonne d‘HTP.
L‘élution du supercomplexe se fait à 500 mM phosphate. Cette fraction enrichie en
106
Matériels et méthodes
supercomplexe est dialysée et concentrée par « Vivaspin » (seuil de coupure 10 kDa) puis
stockée à -80°C.
3. La SOR et Aq_477
La SOR recombinante ainsi que Aq_477 recombinante sont purifiées à partir de
l‘extrait cellulaire d‘Escherichia coli préparé comme décrit dans le paragraphe II.B. Après
chauffage, une étape supplémentaire est nécessaire pour obtenir chacune de ces enzymes
pures. Le surnageant obtenu est concentré sur « vivaspin » (seuil de coupure 5 kDa pour
Aq_477 et 100 kDa pour la SOR) et chargé sur une colonne Superdex 200 (FPLC). Les
fractions éluées actives sont concentrées et stockées à -80°C.
107
Matériels et méthodes
60 g de cellules d’Aquifex aeolicus
Obtention de la fraction membranaire
Solubilisation 1h à 37°C DDM 2%
DEAE
Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%
Elution NaCl 0-500 mM
NaCl 100-150 mM NaCl
HTP
Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%
Elution phosphate de potassium 150 mM
Mono Q
Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%
Elution NaCl 0-500 mM
Elution NaCl 175 mM
SQR
Figure 56 : Protocole de purification de la SQR.
108
Matériels et méthodes
60 g de cellules d’Aquifex aeolicus
Obtention de la fraction membranaire (10mg/ml de protéines)
Solubilisation 1h à 37°C DDM 1%
DEAE
Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%
Elution NaCl 0-500 mM
NaCl 100-200 mM NaCl
HTP
Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%
Elution phosphate de potassium 500 mM
Concentration et dialyse
Supercomplexe hydrogénase/soufre réductase
Figure 57 : Protocole de purification du supercomplexe hydrogénase/soufre réductase
109
Matériels et méthodes
Cellules d’Escherichia coli resuspendues dans du Tris-HCl 50 mM pH 7,6
Casse à la presse de French
Obtention de la fraction soluble
(Ultracentrifugation 1h à 170 000g)
Chauffage à 80°C pendant 40 min
Elimination des protéines précipitées d’Escherichia coli
(Centrifugation à 10 000g pendant 10 min)
Concentration du surnageant contenant la
protéine surproduite sur “vivaspin”
Superdex 200
Tris-HCl 50 mM pH 7,6, NaCl 100 mM
SOR
ou
Aq_477
Figure 58 : Protocole de purification de la SOR recombinante et de Aq_477 recombinante
110
Matériels et méthodes
IV) Techniques d’analyses biochimiques
A) Dosage protéique
La concentration en protéines totales est déterminée à l‘aide de la méthode de Lowry
modifiée selon le protocole établi dans la littérature (Markwell et al., 1978). Aucune
interférence du détergent et des autres composants présents dans le tampon avec la réaction
colorimétrique du dosage protéique par cette méthode n‘a été observée. La Bovine Serum
Albumine (BSA) est utilisée comme protéine standard pour l‘établissement de la courbe
étalon.
B) Electrophorèses sur gel d’acrylamide
1. Condition dénaturante : Tris-glycine SDS-PAGE
L‘électrophorèse en présence de détergent, le Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), permet
de séparer les protéines préalablement dénaturées en fonction de leur masse moléculaire. Les
échantillons sont traités avec du tampon de dénaturation (Tris-HCl 125 mM pH 6,8, βmercaptoéthanol 20 mM, SDS 4%, glycérol 20%, bleu de bromophénol 0,01%) selon un ratio
de 1 : 1 puis portés à ébullition pendant 5 min. Le SDS, molécule chargée négativement, va
dénaturer les protéines en se fixant selon le ratio d‘une molécule de SDS pour deux acides
aminés. Les protéines dénaturées seront toutes chargées négativement et migreront
uniquement en fonction de la masse moléculaire. La migration s‘effectue sur un gel de
polyacrylamide (5-20% pour le cas général) à un ampérage constant de 25 mA et à
température ambiante dans du tampon de migration Tris 25 mM, glycine 190 mM, SDS 0,1%
~ pH 8,3. Des marqueurs de poids moléculaire (Fermentas) sont utilisés.
2. Condition native : Tris-glycine PAGE
La séparation des protéines se fait en fonction de la masse moléculaire et de la charge
protéique. Les échantillons sont préparés avec du tampon de charge (Tris-HCl 125 mM pH
111
Matériels et méthodes
6,8, glycérol 20%, bleu de bromophénol 0,01%). L‘électrophorèse est effectuée dans les
mêmes conditions énoncées précédemment, dans le même tampon sans ajout de SDS, sur gel
de polyacrylamide 3-8%.
3. Gel Bleu Natif
Contrairement au gel natif classique, le gel Bleu Natif (BN) permet de séparer les
protéines uniquement en fonction de leur poids moléculaire. Cette technique a été mise au
point pour la séparation de complexes respiratoires membranaires mitochondriaux. L‘emploi
du bleu de Coomassie G250 dans l‘échantillon (quantité détergent/quantité bleu= 4) permet
d‘uniformiser la charge des protéines et des complexes. Le bleu G 250 se lie ainsi aux protéines
de façon non covalente par ses groupements hydrophobes, et apporte sans les dénaturer une
charge globale négative (par ses groupement SO3-) ainsi que la solubilisation des protéines
hydrophobes à l‘intérieur du gel (Figure 59) (Schagger and von Jagow, 1991; Wittig et al.,
2006).
Figure 59 : Structure du bleu G250 de Coomassie. Le bleu G250 permet la migration de toutes les protéines
(même les basiques), il diminue l‘agrégation des protéines et augmente la solubilité des protéines membranaires
(Ressource internet).
La migration s‘effectue sur un gel de polyacrylamide (Tampon Imidazole-HCl 25 mM
pH 7, ACA 0,5 M) à un ampérage constant de 10 mA et à température ambiante. Le tampon
Imidazole-HCl 25 mM, pH 7 est à l‘anode et le tampon Imidazole 7,5 mM, tricine 50 mM,
112
Matériels et méthodes
bleu de Coomassie G250 0,02%, pH 7 est à la cathode. Après que le front de migration ait
atteint le premier tiers du gel, le tampon cathode est enlevé et remplacé par du tampon
cathode Imidazole 7,5 mM, tricine 50 mM, bleu de Coomassie G 250 0,002%, pH 7. La
migration est poursuivie avec ce tampon afin de diminuer la coloration du gel en bleu, pour
permettre une meilleure lisibilité des activités enzymatiques effectuées sur le gel. Les
échantillons sont préparés avec de l‘ACA 0,5 M et du bleu G250 2,5 % ou 0,5% suivant la
quantité de détergent présent. Des marqueurs de poids moléculaires natifs (Invitrogen) sont
utilisés.
4. Gel Bleu Natif à pores larges (BNPL)
Ce type de gel a récemment été développé pour faire migrer sur gel bleu natif des
complexes protéiques de très haut poids moléculaire (Strecker et al., 2010). Ces gels
possèdent un ratio acrylamide/bisacrylamide supérieur aux gels ordinaires, ce qui permet
d‘obtenir un maillage plus lâche tout en conservant une certaines maniabilité des gels. Dans la
nomenclature classique, on définit T comme la concentration totale des monomères
d‘acrylamide et de bisacrylamide et C le pourcentage de bisacrylamide par rapport au total
des deux espèces. Les gels utilisés ici sont des gels présentant un gradient de [3% T, 20% C] à
[9% T, 6%C]. Le gel de concentration est à 2,5% T, 25% C. Les tampons utilisés (tampon de
préparation du gel et tampons de migration), ainsi que les conditions de migration sont
identiques à ce qui a été décrit précédemment pour les gels bleus natifs.
5. Transfert sur membrane
Après migration en conditions native ou dénaturante, les protéines peuvent être
transférées sur membrane de nitrocellulose ou PVDF en vue d‘une immunodétection
ultérieure. Le gel, la membrane de nitrocellulose ou PVDF ainsi que 6 feuilles de papier
Whatman sont équilibrés dans le tampon de transfert (éthanol 20%, Tris 25 mM, glycine 190
mM, SDS 0,1%, ~pH 8,3). Trois feuilles de papier Whatman sont disposées à l‘anode, puis la
membrane de nitrocellulose ou PVDF, le gel et enfin trois nouvelles feuilles de papier
Whatman. Le transfert a lieu pendant 45 min à 5 mA.cm-2 sur un appareil de type Trans blot
semi-dry electrophoretic transfer cell (Biorad). Lorsque le transfert est effectué à partir d‘un
113
Matériels et méthodes
gel natif, ou lorsqu‘il concerne des protéines membranaires ou de haut poids moléculaire, sa
durée est augmentée pour atteindre environ 1h.
C) Techniques de révélation après électrophorèse
1. Colorations
Trois protocoles de coloration des protéines sur gel ont été utilisés. Le premier utilise
le bleu de Coomassie (éthanol 45%, acide acétique 9%, bleu R250 0,25%) dans lequel les gels
sont incubés 1h30 puis décolorés dans un tampon éthanol 30%, acide acétique 10%.
Une alternative, plus sensible et permettant d‘éviter les phénomènes de « surcoloration », repose sur une solution de Page Blue commercial (Fermentas) : les gels sont
incubés une nuit puis décolorés à l‘eau distillée. Dans le cas de gels dénaturants, des bains
d‘eau distillée de 5 min renouvelés trois fois sont nécessaires pour éliminer le SDS du gel
avant coloration. La coloration au Page Blue peut avoir lieu après une coloration au bleu de
Coomassie, il faut simplement que le fond du gel soit correctement décoloré.
Enfin, lorsqu‘une coloration réversible des protéines, d‘une sensibilité équivalente au
bleu de Commassie veut être obtenue, le protocole utilisé est la coloration négative au zinc /
imidazole / SDS (Hardy and Castellanos-Serra, 2004). Après migration, le gel est rincé dans
l‘eau distillée, puis incubé dans une solution d‘imidazole 200 mM, SDS 0,1% pendant 15
min. Après rinçage dans l‘eau distillée, il est placé dans du sulfate de zinc 200 mM jusqu‘à ce
que les bandes de protéines soit révélées (environ 5 min) : le fond du gel se colore en blanc,
les protéines restent incolores, elles sont également fixées de manière réversible. Lorsqu‘un
gel natif est utilisé, le SDS est concentré à 0,5% dans la solution de sensibilisation. Pour
décolorer entièrement le gel (afin d‘en éluer les protéines par exemple), il est incubé deux fois
cinq minutes dans une solution de complexation des ions zinc (Tris 25 mM, glycine 300 mM,
pH 8) puis rincé plusieurs fois dans l‘eau distillée.
Les membranes de nitrocellulose sont colorées au Rouge Ponceau afin de vérifier si le
transfert des protéines du gel sur la membrane s‘est déroulé correctement.
114
Matériels et méthodes
2. Immunodétection
La membrane de nitrocellulose ou de PVDF sur laquelle les protéines ont été
transférées est incubée 1 h dans du tampon « Phosphate Buffered Saline » (PBS) (NaCl 143
mM, Na2HPO4 10 mM, NaH2PO4 1,7 mM) additionné de 5% (poids/volume) de lait en
poudre qui va permettre de saturer la membrane. La membrane est ensuite incubée 1h30 à
température ambiante ou pendant la nuit à 4°C sous agitation dans le même tampon contenant
l‘anticorps primaire dirigé contre la protéine d‘intérêt. La membrane est rincée 3 fois 10 min
dans du tampon PBS, Tween 20 0,05% (volume/volume), puis elle est incubée 45 minutes
dans l‘anticorps secondaire anti-IgG de lapin couplé à la péroxydase dilué au 1/10000 dans le
PBS, Tween 20 0,05%, lait 5%. Trois rinçages de 10 min dans du tampon PBS, Tween 20
0,05% sont à nouveau effectués avant l‘étape de détection. Cette dernière est réalisée à l‘aide
du kit Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) en suivant les
recommandations du fournisseur.
Lorsqu‘une seconde protéine veut être détectée sur la même membrane, le premier
anticorps est retiré par incubation dans du Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce) à
37°C pendant 15 min, puis rincé dans le tampon PBS, Tween 20 0,05%. Le protocole reprend
alors à l‘étape de saturation de la membrane dans le lait.
Afin d‘obtenir une meilleure spécificité de détection de la protéine cible avec
l‘anticorps primaire, ce dernier est purifié par affinité pour l‘antigène qu‘il reconnait : la
protéine cible est déposée sur gel dénaturant et transférée sur membrane de nitrocellulose
suivant le protocole classique. Elle est détectée par coloration réversible au Rouge Ponceau, et
la bande correspondante est découpée, puis incubée dans le tampon PBS, Tween 20 0,05%,
lait 5% pendant 1 h avant d‘être transférée dans le sérum contenant l‘anticorps à purifier dilué
au 1/50 dans du PBS, Tween 20 0,05%, lait 5%. Après trois rinçages, les anticorps sont élués
par une incubation de 5 min dans 1 ml de tampon glycine 100 mM pH 2,9. Immédiatement
après élution, le pH est neutralisé par ajout de 30 µl de Tris 1 M (dont le pH n‘a pas été
modifié par ajout d‘acide).
115
Matériels et méthodes
3. Détection d‘activités enzymatiques
a) Activité Sulfure Quinone Réductase
L‘activité Sulfure Quinone Oxydoréductase (SQR) sur gel bleu natif (ou natif) utilise
la Décylubiquinone (DB) comme accepteur d‘électrons et le Na2S comme substrat (Figure
60). L‘activité est réalisée en condition anaérobie, à 85°C.
Après migration, le gel est équilibré 10 min dans du tampon Bis-Tris-HCl 50 mM pH
7. Le tampon et le gel sont ensuite dégazés sous argon pendant 15 min, puis la DB et le Na 2S
sont ajoutés. Le 2,3,5-Triphényltétrazolium Chloride (2,3,5 TTC) est ajouté dans le milieu
afin de piéger la quinone réduite. Le 2,3,5 TTC réduit devient rouge et précipite au niveau de
la bande d‘activité.
Le milieu final contient: Bis-Tris-HCl 50 mM, pH 7, DB 40 µM, Na2S 850 µM, 2,3,5
TTC 2 mM.
Figure 60 : Révélation de l’activité SQR sur gel. La SQR présente dans la bande protéique oxyde le Na 2S et
réduit la DB, qui va se réoxyder en réduisant le 2,3,5-Triphényltétrazolium Chloride (2,3,5 TTC) qui, réduit, se
colorera en rouge.
b) Activité hydrogénase
L‘activité hydrogénase est visualisée sur gel bleu natif (ou natif) en utilisant
l‘hydrogène comme donneur d‘électrons et le méthylviologène (MEV) comme accepteur
d‘électrons (Figure 61). Les électrons produits par l‘oxydation de l‘hydrogène par
l‘hydrogénase sont transférés au MEV. Le MEV réduit va à son tour réduire le 2,3,5 TTC
additionné au milieu ce qui va permettre de fixer cette réaction. L‘activité est réalisée en
condition anaérobie.
116
Matériels et méthodes
Après migration, le gel est préalablement équilibré 10 min dans du tampon Tris-HCl
50 mM pH 7,6. Puis, le tampon et le gel sont dégazés sous argon pendant 15 min puis sous
hydrogène à 80°C pendant 20 min en présence de MEV 1 mM et de 2,3,5 TTC 2 mM. Le
milieu final contient : Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, MEV 1 mM, 2,3,5 TTC 2 mM, H2.
Figure 61 : Révélation de l’activité hydrogénase sur gel. L‘hydrogénase est réduite par un excès d‘hydrogène
et les électrons sont transférés au MEV oxydé qui devient réduit, puis au 2,3,5 TTC.
c) Activité cytochrome c oxydase
L‘activité cytochrome c oxydase est visualisée sur gel bleu natif (ou natif) en utilisant
un milieu réactionnel contenant du DiAminoBenzidine (DAB) qui va permettre la réduction
de cytochrome c. Ce cytochrome c est utilisé comme substrat par la cytochrome c oxydase
dans le gel. Le DAB oxydé forme un précipité marron sur le gel, là où la cytochrome c
oxydase est présente (Figure 62) (Sabar et al., 2005).
Figure 62 : Révélation de l’activité cytochrome c oxydase sur gel. Le DAB réduit le cytochrome c qui est
oxydé par la cytochrome c oxydase. Le DAB oxydé précipite au niveau de la bande protéique où l‘oxydase est
présente. Oxydase : cytochrome c oxydase.
117
Matériels et méthodes
Le gel est équilibré pendant 10 min dans du tampon phosphate 50 mM pH 7, puis
incubé dans le milieu réactionnel contenant du cytochrome c 0,1% (cœur de cheval, Sigma),
du DiAminoBenzidine (DAB) 0,1% et du tampon phosphate 50 mM, pH 7. La révélation de
l‘activité se fait à 40°C.
d) Activité NADH-déshydrogénase (complexe I)
Cette activité est visualisée sur gel bleu natif (ou natif) à une température de 40°C. La
NADH-déshydrogénase utilise le NADH comme donneur d‘électrons et le nitro-blue
tetrazolium (NBT) comme accepteur d‘électrons. La formation de NBT réduit induit la
formation d‘un précipité violet, le formazan (Figure 63) (Sabar et al., 2005).
Le gel est équilibré dans du tampon Tris-HCl 100 mM, pH 7,6 pendant 10 min. Le
milieu réactionnel utilisé pour révéler l‘activité sur gel est composé de Tris-HCl 100 mM, pH
7,6, de NADH 0,2 mM, et NBT 0,2%.
Figure 63 : Révélation de l’activité NADH-déshydrogénase sur gel. Lors de l‘oxydation du NADH par la
NADH-déshydrogénase, le NBT accepte directement l‘hydrogène formant un précipité violet (le formazan).
NADH-Dase : NADH-déshydrogénase (ou complexe I).
e) Activité thiosulfate : cyanure soufre transférase (rhodanèse)
L‘activité rhodanèse est visualisée sur gel natif en utilisant le thiosulfate comme
donneur de soufre et le cyanure comme accepteur de soufre. Le sulfite produit par la réaction
va réduire le NBT avec la phénazine éthosulfate (PES) jouant le rôle d‘intermédiaire dans le
transport électronique. La formation de NBT réduit induit la formation d‘un précipité violet,
le formazan (Figure 64) {Cannella, 1984 #55.
118
Matériels et méthodes
Après migration, le gel est préalablement équilibré 10 min dans du tampon Tris-HCl
100 mM pH 9 puis incubé 20 min à 80°C dans le milieu réactionnel contenant du tampon
Tris-HCl 100 mM pH 9, thiosulfate de sodium (Na2S2O3) 10 mM, cyanure de potassium
(KCN) 10 mM, PES 0,5 mM et NBT 2 mM.
Figure 64 : Révélation de l’activité rhodanèse sur gel. Le sulfite produit par la rhodanèse réduit la phénazine
éthosulfate (PES) qui elle-même réduit le NBT en formazan.
V)
Mesures
d’activités
enzymatiques
au
spectrophotomètre
A) Transfert d’électrons de l’hydrogénase à la soufre
réductase
Le transfert d‘électrons depuis l‘hydrogénase jusqu‘à la soufre réductase est mesuré en
suivant la formation de sulfure d‘hydrogène. L‘hydrogène est utilisé comme donneur
d‘électrons et le soufre élémentaire comme accepteurs d‘électrons.
119
Matériels et méthodes
Le tube bouché contenant du tampon Hepes 50 mM pH 7,6, fleur de soufre 5%
(poids/volume), 2-OH-1,4-naphtoquinone 40 μM et NAPDH 20 μM est dégazé 10 min sous
argon, puis 15 min sous hydrogène. L‘échantillon est ajouté et le tube est incubé 40 minutes à
80°C. La réaction est stoppée au bout 40 min par ajout de 100 μl de FeCl3 30 mM dans 1,2 M
HCl. Puis 100μl de N,N-diméthyl-p-phénylénédiamine dihydrochlorure 20 mM dans 7,2 M
HCl, permettant la formation de bleu de méthylène à partir du sulfure d‘hydrogène, est ajouté
(Figure 65). Après 20 min à l‘obscurité à température ambiante et une centrifugation de 5 min
à 10000 rpm afin de culoter la fleur de soufre, la quantité de bleu de méthylène formée est
donnée par la mesure de la densité optique à 670 nm. La quantité de bleu de méthylène est
directement proportionnelle au sulfure d‘hydrogène formé. Le sulfure d‘hydrogène pourra être
quantifié par rapport à une courbe de référence réalisée avec du Na2S.
Figure 65 : Quantification du sulfure d’hydrogène (H2S) par la réaction de synthèse du bleu de méthylène.
L'H2S réagit avec deux molécules d'aniline (N,N-diméthyl-p-phénylénédiamine) et forme un intermédiaire
incolore (blanc de méthylène). Celui-ci est alors oxydé par le Fe3+ et forme ainsi le Bleu de méthylène.
Pour l‘étude de l‘influence d‘Aq_477 (SbdP) sur l‘activité hydrogénase/soufre
réductase, la rhodanèse est ajoutée en quantités variables avant l‘incubation à 80°C. La
réaction a été stoppée à différents temps, et l‘H2S produit est mesuré par la méthode du bleu
de méthylène.
120
Matériels et méthodes
B) Activité Soufre Oxygénase Réductase (SOR)
Le suivi de purification de la SOR a été effectué en testant la production d‘H 2S et de
sulfite dans les échantillons considérés. La SOR produit à partir de soufre élémentaire et
d‘oxygène, de l‘H2S, du sulfite, et de manière non enzymatique, du thiosulfate (par réaction
du sulfite avec le soufre élémentaire). Le test est réalisé dans 1 ml de tampon Tris-HCl 50
mM pH 7,6 contenant de la fleur de soufre (5%, poids/volume) et du DDM (0,05%,
poids/volume). L‘échantillon est ajouté et le tube est incubé 40 minutes à 80°C. La production
d‘H2S est mesurée par la méthode du bleu de méthylène précédemment décrite pour la
détermination de l‘activité hydrogénase/soufre réductase. Le sulfite est mesuré comme suit :
700 µl de milieu réactionnel sont prélevés, et 200 µl d‘acétate de zinc 2% (poids/volume) y
sont ajoutés. 100 µl de réactif Fuchsine (Fuchsine basique 0,04% dans H 2SO4 10%) sont
également ajoutés, puis une première incubation de 10 min à température ambiante est
réalisée. 10 µl de Formalin (formaldéhyde 37%) sont ajoutés, suivi d‘une nouvelle incubation
de 10 min à température ambiante. La densité optique est alors mesurée à 570 nm. Le sulfite
pourra être quantifié par rapport à une courbe de référence réalisée avec des concentrations
connues de sulfite.
C)
Activité
thiosulfate :
cyanure
soufre
transférase
(rhodanèse)
L‘activité rhodanèse est mesurée par quantification du produit de la réaction, le
thiocyanate SCN-. Le test contient 10 mM de cyanure de potassium KCN et 10 mM de
thiosulfate de sodium Na2S2O3 dans du Tris-HCl 100 mM pH 9. La réaction démarre par ajout
de l‘échantillon. Le test est incubé 10 min à 80°C puis la réaction est arrêtée par ajout de 200
μl de FeCl3 50 g.l-1 dans 65% HNO3 200 ml.l-1 qui réagit avec le thiocyanate pour former du
Fe(SCN)3. Après centrifugation 3 min à 10 000 rpm, la densité optique à 460 nm est mesurée
et permet le dosage du thiocyanate formé par rapport à une courbe standard effectuée avec du
NaSCN.
L‘inhibition irréversible de la rhodanèse est obtenue par un traitement d‘alkylation de
sa cystéine catalytique. Cette modification est réalisée en incubant une nuit à température
ambiante la protéine (0,3 mg.ml-1) dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 9 contenant de
121
Matériels et méthodes
l‘acide iodo acétique 20 mM. Après dialyse de la protéine pour éliminer toute trace d‘agent
alkylant, un test rhodanèse est réalisé pour s‘assurer de l‘inactivation de la protéine.
VI) Etude d’interactions protéine-protéine
A) La résonance plasmonique de surface (BIAcore)
L‘appareil BIAcore (GE Healthcare) permet de visualiser, en temps réel, des
interactions entre molécules. Pour détecter ces interactions, il utilise le phénomène optique de
résonance plasmonique de surface (SPR).
1. Principe de fonctionnement
Un des partenaires, le ligand, est fixé de façon covalente ou par interaction forte sur
une interface appelée sensor chip. L‘autre partenaire de l‘interaction (l‘analyte) est injecté à
un débit constant au contact de l‘interface et peut donc interagir avec le ligand. Le BIAcore
présente l‘avantage de n‘utiliser que de faibles quantités de protéines. Son défaut le plus
important est l‘immobilisation d‘un des partenaires sur une matrice, ce processus pouvant
générer un blocage du site d‘interaction. L‘autre problème le plus rencontré est un effet du
transport de masse lors d‘une immobilisation trop importante ou l‘utilisation d‘une protéine
d‘un poids moléculaire élevé. Dans ce cas, la vitesse de diffusion du ligand devient limitante.
Selon l‘angle d‘incidence d‘un faisceau de lumière polarisée monochromatique
arrivant sur une interface séparant deux milieux d‘indices de réfraction différents, toute la
lumière est réfléchie. Dans ce cas, une onde évanescente se propage perpendiculairement à
l‘interface créant un champ évanescent. Si l‘interface est recouverte d‘une fine couche de
métal, les photons entrent en résonance avec les nuages électroniques du métal, ce qui crée
une chute d‘intensité du faisceau réfléchi à un angle défini. Ce phénomène est appelé SRP et
cet angle, d‘intensité minimale, angle de résonance. Cet angle varie en fonction de la
122
Matériels et méthodes
température et de l‘indice de réfraction du milieu dans lequel le champ évanescent se propage,
donc de toute variation de masse dans ce champ. L‘appareil enregistre la variation de l‘angle
de résonance en fonction du temps et le signal obtenu (sensorgramme) est exprimé en unité de
résonance (RU) (Figure 66). Les expériences sont réalisées à 25°C.
Figure 66 : Principe de résonance plasmonique de surface.
2. Interface utilisée
Il existe plusieurs types de surface hydrophiles ou hydrophobes pour l‘analyse des
interactions. Les sensors chips CM5 présentent une interface hydrophile constituée d‘un
support de verre recouvert d‘une fine couche d‘or (50 nm) sur laquelle une matrice de dextran
carboxyméthylé (100 nm) est attachée de façon covalente. Les groupements carboxyliques
permettent la fixation covalente des molécules ligands par couplage chimique.
3. Fixation du ligand et mesure de l‘interaction
La SQR, le supercomplexe hydrogénase/soufre réductase, la SOR ou la rhodanèse
Aq_477 (SbdP) ont été fixés à la matrice.
La fixation est réalisée par un couplage par les groupements amines des protéines. Ce
couplage consiste en l‘établissement d‘une liaison covalente entre les groupements amines de
123
Matériels et méthodes
la protéine et les carboxyles de la matrice. Pour le couplage, les échantillons sont dilués dans
un tampon acétate de sodium 10 mM pH 5, DDM 0,02%. Le couplage des protéines est
réalisé comme suit:
-Activation des COOH de la matrice par un mélange (ratio 1/1) N-hydroxysuccinimide (NHS)
50 mM et N-ethyl-N‘-[3-(dimethylamino)propyl]-carbodiimide hydrochloride (EDC) 200 mM
pendant 420 secondes à un débit de 10 µl.min-1.
-Injection de la protéine à coupler dont les NH 2 réagissent spontanément avec les esters
formés, pendant 420 secondes à un débit de 5 µl.min-1.
-Saturation des COOH activés restants par l‘éthanolamine 1M pendant 420 secondes à un
débit de 10 µl.min-1.
Lors des mesures d‘interactions, le tampon de course est de l‘Hepes 50 mM pH 7,6,
Tween 20 0,05%, NaCl 50 mM. Le temps de contact ligand-analyte est de 150 secondes avec
un débit de 50 µl/min et un temps de dissociation de 500 secondes.
B) Pontage covalent in vitro
Des expériences de pontages covalents entre Aq_477 (SbdP) et la SOR ont été réalisées. Les
protéines ont été préalablement dialysées dans du tampon phosphate 40 mM pH 5,7 sur
« vivaspin » (seuil de coupure 5 kDa pour Aq_477 et 100 kDa pour la SOR) afin d‘éviter
toute réaction croisée entre le Tris et l‘agent pontant. Aq_477 (2,5 µg.ml-1) et la SOR (0,25
mg.ml-1) ont été mélangées et incubées dans un tampon phosphate 20 mM pH 5,7 en présence
de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, réagit avec les amines primaires)
à 37°C pendant 1 h sous agitation douce. La réaction est stoppée par ajout de Tris-HCl pH 6,8
à une concentration finale de 50 mM. Les échantillons sont ensuite chargés sur un gel natif
comme décrit précédemment.
C) Gel retard
Les protéines dont on veut tester une éventuelle interaction (Aq_477 et SQR ou soufre
réductase) sont mélangées et incubées à 80°C pendant 30 min dans un tampon Tris-HCl 50
124
Matériels et méthodes
mM pH 7,6, puis déposées sur gel natif (Tris glycine PAGE). Un complexe formé par deux
protéines partenaires ayant une masse moléculaire supérieure à celle de chacun de ses
constituants isolé, une interaction se traduira par un changement dans le profil de migration
(migration ralentie).
VII) Analyses protéomiques
A) Identification des protéines par séquençage N-terminal
Après migration sur gel SDS et transfert sur membrane de PVDF (révélation au rouge
Ponceau), les protéines peuvent être identifiées par séquencage N-terminal. La détermination
des séquences en acides aminés se base sur la méthode de dégradation d‘Edman. Cette
dernière est réalisée par le clivage séquentiel des acides aminés à partir de l‘acide aminé N
terminal. Cette étape génère des dérivés phénylthiohydantoines qui sont identifiés par
chromatographie liquide haute performance (HPLC) par comparaison avec un mélange
témoin. Le processus est automatisé et s‘effectue grâce à un micro séquenceur en phase
gazeuse Applied Biosystems A470. Cette analyse a été réalisée par la plate-forme
Protéomique de l‘Institut de Microbiologie de la Méditerranée.
B) Identification des protéines par spectrométrie de masse
L‘analyse des peptides trypsiques d‘une protéine par spectrométrie de masse permet
son identification lorsque sa séquence est déposée dans une banque de données. Après
séparation par électrophorèse (dénaturante, native, BN), les bandes de protéines colorées sont
découpées du gel et les protéines présentes sont hydrolysées par la trypsine. Les peptides
obtenus sont extraits du gel et analysés par spectrométrie de masse. L‘identification des
protéines est réalisée grâce à l‘utilisation de logiciels qui comparent la carte peptidique
massique obtenue expérimentalement avec les cartes théoriques des protéines répertoriées
dans les banques de données. Les analyses ont été réalisée en collaboration avec R. Lebrun, S.
125
Matériels et méthodes
Lignon et R. Puppo, au sein de la plateforme protéomique (labellisée IBiSA) de l‘Institut de
Microbiologie de la Méditerranée (IMM).
1. MALDI-TOF
Le MALDI-TOF (MALDI-TOF Microflex II, Bruker) est utilisé pour analyser un
mélange peu complexe de protéines provenant d‘échantillons simples tels qu‘un gel SDS.
L‘identification des protéines est réalisée grâce à l‘utilisation du logiciel MASCOT en
utilisant la banque de donnée de NCBI limitée aux génomes de bactéries.
2. Trappe à ions
Ce type de spectromètre est généralement utilisé pour identifier un mélange protéique
complexe. Les protéines sont hydrolysées par la trypsine et les peptides obtenus analysés par
spectrométrie de masse de type trappe à ions. Cet appareil (ESI-IT LCQ Deca XP ,
Thermofinnigan) est couplé à une nanochromatographie liquide qui permet la séparation des
peptides avant la détermination de leur masse par le spectromètre. L‘identification des
protéines est réalisée grâce à l‘utilisation du logiciel TurboSEQUEST en utilisant la banque
de données de NCBI limitée au génome d‘Aquifex aeolicus. Une protéine est considérée
comme identifiée, donc présente dans la bande de gel, à partir de la détection d‘au moins deux
peptides différents correspondant à cette protéine.
3. Orbitrap
La spectrométrie de masse de type Orbitrap est utilisée lorsque l‘on a besoin d‘une
technique très sensible et précise, et lorsque l‘échantillon est très complexe ou qu‘il contient
des structures de très haut poids moléculaire. Le spectromètre de masse employé est un LTQ
Velos Orbitrap (ThermoFisher) (Trappe ionique linéaire avec une cellule C-trap et une
Orbitrap) équipé d‘une source d‘ions nanospray et couplé à une nanochromatographie
Ultimate NCS 3500 (Dionex) permettant la séparation des peptides avant la détermination de
leur masse par le spectromètre. L‘identification des protéines est réalisée grâce à l‘utilisation
du logiciel MASCOT en utilisant la banque de donnée de NCBI limitée au génome d‘Aquifex
126
Matériels et méthodes
aeolicus. Un résultat est considéré comme valide lorsqu‘une protéine est identifiée avec au
moins deux peptides différents.
C) Analyse de protéines entières par spectrométrie de masse
Pour déterminer la capacité de Aq_477 (SbdP) à lier des atomes de soufre en présence
d‘un composé soufré, la protéine (2 mg/ml) a été incubée avec du thiosulfate (10 mM) ou de
la fleur de soufre (5% poids/volume), dans du tampon Tris-HCl 100 mM pH 9. Après cette
incubation de 20 min à 85°C, Aq_477 a été soumise à une analyse de masse entière à l‘aide
d‘un spectromètre de masse MALDI-TOF Microflex II (Bruker). Cette analyse a été réalisée
par la plate-forme Protéomique de l‘Institut de Microbiologie de la Méditerranée.
VIII) Microscopies
A) Microscopie optique
Les cellules entières d‘Aquifex aeolicus ont été directement observées entre lames et
lamelles sur un microscope Axio (Zeiss Axiovert 200M) de la plate-forme de Microscopie de
l‘IMM.
B) Microscopie électronique
Afin d‘observer la présence de globules de soufre cytoplasmiques, les cellules
d‘Aquifex aeolicus ont été observées après coupe ultrafine, en microscopie électronique. Ces
préparations et observations ont été réalisées par la plate-forme de Microscopie de l‘IMM, en
collaboration avec Alain Bernadac. Pour cela, la culture de cellules est centrifugée et les
cellules sont rincées deux fois avec du milieu neuf pour éliminer le soufre provenant de la
culture. Arès fixation au glutaraldéhyde puis OsO4, les culots cellulaires sont déshydratés à
127
Matériels et méthodes
l‘alcool et inclus dans de l‘Epon. Des coupes ultrafines sont obtenues à l‘aide du microtome
Leica EM FC/UC6 et colorées à l‘acétate d‘uranyle et au citrate de plomb, puis observées au
microscope électronique Zeiss EM109.
Les expériences d‘immunomarquages à l‘aide d‘anticorps anti-Aq_477 purifiés sur des
coupes de cellules d‘Aquifex aeolicus, ont été faites en collaboration avec J.-P. Chauvin
(IBDML, AMU, Marseille). Un microscope électronique Zeiss EM 192 a été utilisé.
IX) Analyses in silico
A) Recherches de protéines homologues et alignements
multiples de séquences
Les algorithmes BLASTP et DELTA-BLASTP (Domain Enhanced Lookup Time
Accelerated BLAST) sont utilisés pour retrouver des séquences protéiques homologues à une
séquence « requête ».
Les alignements entre séquences protéiques sont générés en utilisant ClustalW sur le
serveur du Pôle Bioinformatique Lyonnais (http://pbil.univ-lyon1.fr/).
B) Prédiction de localisation et de structure secondaire
Le serveur PSORT (http://www.psort.org/) est utilisé pour prédire la localisation des
protéines dans la cellule.
La prédiction de la structure secondaire des protéines (hélices α et brins β) est
effectuée sur le serveur JPRED (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/).
128
Matériels et méthodes
C) Modélisations
Les structures tridimensionnelles de protéines sont modélisées sur le serveur SWISSMODEL (http://swissmodel.expasy.org/) à partir de structures tridimensionnelles déjà établies
pour d‘autres protéines.
Le
« docking » entre deux protéines est
réalisé grâce au
serveur
Hex
(http://hexserver.loria.fr/), et le logiciel AutoDock Vina a permis de réaliser celui entre la
rhodanèse Aq_477 et une chaîne de polysulfure.
Le logiciel PyMOL est utilisé pour visualiser les structures et pour générer des
alignements structuraux entre protéines homologues.
129
Résultats et discussion
RESULTATS
ET
DISCUSSION
130
Résultats et discussion
131
Résultats et discussion
Chapitre I
Métabolisme énergétique du soufre
chez Aquifex aeolicus
132
Résultats et discussion
133
Résultats et discussion
Métabolisme énergétique du soufre
chez Aquifex aeolicus
I) Une rhodanèse au cœur du trafic
Dans ce premier chapitre, nous nous intéresserons au transfert des substrats soufrés au
sein du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus, et plus précisément au rôle
d‘une protéine faisant partie de la famille des rhodanèses. Cette protéine, annotée Aq_477
dans les bases de données bioinformatiques, a été rebaptisée par nos soins SbdP pour Sulfur
binding- donating- Protein. Ce changement de nom a fait suite à la caractérisation
fonctionnelle de Aq_477 qui a concerné l‘essentiel de ma thèse et que nous présentons dans
cette première partie de résultats. Ces travaux ont fait l‘objet d‘une publication en 2012 dans
« Journal of Biological Chemistry » sous le titre « Rhodanese Functions as Sulfur Supplier for
Key Enzymes in Sulfur Energy Metabolism ».
Dans cet article, nous avons tout d‘abord montré que cette rhodanèse cytoplasmique
pouvait être retrouvée en interaction avec les membranes de la bactérie, probablement via un
partenaire protéique (Article 1, Figure 1). Nous avons ensuite démontré, grâce à des
techniques de biochimie et de physico-chimie, que SbdP était capable d‘interagir avec deux
acteurs majeurs du métabolisme du soufre de la bactérie, la soufre réductase d‘une part et la
SOR d‘autre part (Article 1, Figures 3 et 7). Cette aptitude à interagir avec différents
partenaires indépendants n‘a jamais, à notre connaissance, été observée pour une rhodanèse,
ce qui souligne le côté atypique de SbdP. Une interaction avec un autre composant majeur des
voies bioénergétiques de la bactérie, la SQR, a également été testée et invalidée, résultat
cohérent avec l‘orientation périplasmique de cette dernière (Article 1, Figure 6).
Nous avons ensuite démontré qu‘à la différence des autres protéines de la famille des
rhodanèses, SbdP est capable de lier des chaînes de soufre relativement longues, et ce à partir
de plusieurs substrats dont le soufre élémentaire S° (Article 1, Figure 4). L‘utilisation par ces
134
Résultats et discussion
deux enzymes partenaires de longues chaînes de soufre comme substrat d‘une part et la
capacité de SbdP à « charger » de longues chaînes de soufre d‘autre part nous a poussés à
chercher si un transfert de soufre pouvait avoir lieu entre SbdP et la soufre réductase et/ou la
SOR. Nous avons ainsi mis en évidence une augmentation, SbdP-concentration dépendante,
de l‘activité catalytique de la soufre réductase (Article 1, Figure 5). Nous en avons conclu que
la rhodanèse SbdP est une protéine capable de se « charger » en chaînes de soufre dans le but
de les présenter comme substrats aux enzymes cibles, ce qui permettrait ainsi d‘optimiser le
système. Nous avons également modélisé la structure de SbdP à partir de celle déterminée
pour une rhodanèse à un domaine de la bactérie thermophile Thermus thermophilus,
TTHA0613, et nous avons utilisé un logiciel de « docking » pour ancrer une chaîne de
polysulfure sur la cystéine catalytique de SbdP (Article 1, Figure supplémentaire 1). Un
modèle de l‘interaction entre la soufre réductase et SbdP a ensuite été réalisé (Figure 67),
montrant que la rhodanèse s‘intègre parfaitement à la cavité menant au site catalytique de la
soufre réductase, ce qui soutient l‘idée d‘un transfert de soufre direct de SbdP à son
partenaire.
Figure 67 : Modèle de l’interaction entre SbdP et la soufre réductase. SbdP (bleu clair) a été
modélisée à partir de la rhodanèse TTHA0613 de Thermus thermophilus, et la structure cristallographique de la
Psr (en dimère) de la même bactérie est utilisée pour mimer la soufre réductase d‘A. aeolicus. En rose, PsrC
(membranaire), bleu PsrB et vert, PsrA (sous-unité catalytique).
135
Résultats et discussion
Nous avons donc proposé un rôle de fournisseur de soufre pour la protéine SbdP et
l‘avons intégrée au modèle global du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex
aeolicus (Article 1, Figure 8).
Mais la portée de ces travaux ne se limite pas seulement à la bactérie que nous
étudions, puisque ce type de métabolisme existe chez un grand nombre de micro-organismes,
et que les rhodanèses se retrouvent chez tous les êtres vivants. Ainsi, il avait été montré chez
Wolinella succinogenes qu‘une protéine de type rhodanèse semblait capable d‘améliorer
l‘activité de la polysulfure réductase, qui elle aussi utilise des chaînes de soufre comme
substrat {Klimmek, 1998 #12}. En revanche, une interaction entre les deux protéines n‘avait
pas été mise en évidence aux cours de ces travaux. De plus, chez différentes bactéries, une
rhodanèse se trouvant dans le même compartiment cellulaire que les enzymes de réduction du
soufre a été mise en évidence au niveau du génome (Campbell et al., 2009; Yamamoto et al.,
2010). Nous nous sommes donc appuyés sur ces données de la littérature ainsi que sur nos
propres résultats pour proposer l‘existence d‘une nouvelle famille de rhodanèses, basée sur
une fonctionnalité précise d‘approvisionnement des protéines du métabolisme énergétique du
soufre en substrat. Cette hypothèse semble aujourd‘hui trouver des échos à travers des
publications récentes (Stockdreher et al., 2012) qui mettent l‘accent sur la nécessité de
protéines dédiées au transfert de soufre au sein de ces métabolismes.
136
Résultats et discussion
137
Article 1
Rhodanese functions as sulfur supplier for key
enzymes in sulfur energy metabolism.
Aussignargues Clément, Giuliani Marie-Cécile, Infossi
Pascale, Lojou Elisabeth, Guiral Marianne, Giudici-Orticoni
Marie-Thérèse, Ilbert Marianne
Journal of Biological Chemistry (2012) Jun 8;287(24):19936-48.
Supplemental Material can be found at:
http://www.jbc.org/content/suppl/2012/04/10/M111.324863.DC1.html
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 24, pp. 19936 –19948, June 8, 2012
© 2012 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Published in the U.S.A.
Rhodanese Functions as Sulfur Supplier for Key Enzymes in
Sulfur Energy Metabolism□
S
Received for publication, November 24, 2011, and in revised form, March 15, 2012 Published, JBC Papers in Press, April 10, 2012, DOI 10.1074/jbc.M111.324863
Clément Aussignargues1, Marie-Cécile Giuliani2, Pascale Infossi, Elisabeth Lojou, Marianne Guiral,
Marie-Thérèse Giudici-Orticoni, and Marianne Ilbert3
From the Unité de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines, Institut de Microbiologie de la Méditerranée-CNRS, Aix-Marseille
University, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille Cedex 20, France
Background: The function of SbdP, a cytoplasmic rhodanese from Aquifex aeolicus, is unknown.
Results: SbdP is involved in sulfur energy metabolism via its interaction with key redox enzymes.
Conclusion: SbdP supplies long sulfur chains to enzyme-active sites.
Significance: Rhodaneses are part of the substrate traffic in sulfur energy metabolism.
Sulfur is a ubiquitous element in the earth’s crust, well known
as an essential component of life. It has come even closer to the
center of attention in the light of current views of the origin of
life (1, 2). In nature, elemental sulfur (S0, a cyclic chain of sulfur)
and sulfur compounds are found in particularly high concentrations in extreme environments, usually volcanic or geothermically active (deep-sea vents and hot springs) (3). In these
environments, the reduction and oxidation of these com□
S
This article contains supplemental Figs. S1–S6 and additional references.
Recipient of a fellowship from the Ministère de l’Enseignement Supérieur et
de la Recherche.
2
Supported by the “Collectivité Territoriale Corse.” Present address: Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire du Végétal, UMR-CNRS 6134
SPE, Université de Corse, Campus Grimaldi, 20250 Corte, France.
3
To whom correspondence should be addressed. Tel.: 33-491164524; Fax:
33-491164097; E-mail: [email protected].
1
19936 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
pounds are vital processes for many microorganisms that use
sulfur as a basis for their energy metabolism (4, 5). Despite its
central importance, however, the metabolism of sulfur is still
not fully understood, probably because of the high reactivity of
its compounds.
Aquifex aeolicus, isolated from a hydrothermal system at
Vulcano in Italy, is one of the most hyperthermophilic bacteria
known, with an optimum growth temperature of 85 °C (6, 7). It
also represents the earliest branching order in the bacterial
domain (8). A. aeolicus is able to grow chemolithoautotrophically and obtains energy for growth in the presence of H2, O2,
and CO2, but it also requires the presence of a sulfur compound
such as S0, sodium sulfide (Na2S), or sodium thiosulfate
(NaS2O3) (9). After several years of study of the enzymes
involved in the respiratory pathways of A. aeolicus growing in
presence of S0, we have a better overall picture of its complex
energy metabolism. Under these growth conditions, we have
demonstrated the existence of three different respiratory
pathways as follows: two aerobic from H2 to O2 and from H2S
to O2 and one anaerobic from H2 to S0. Two of them (H2/S0
and H2S/O2) have been shown to be organized into supramolecular structures (9 –11) that contain enzymes known to
be involved in sulfur energy metabolism as follows: a sulfur
reductase (SR)4 in H2/S0 pathway and a sulfide quinone
reductase (Sqr) in H2S/O2 pathway. A. aeolicus is the sole
organism known to date that possesses simultaneously these
two complementary energy pathways (both reduction and
oxidation of sulfur compounds), and we have proposed an
energy coupling between these two pathways (11). A cytoplasmic sulfur oxygenase reductase (SOR), which catalyzes,
in the presence of oxygen, the simultaneous oxidation and
reduction of elemental sulfur into oxygen sulfur species and
H2S, is also present in A. aeolicus (12). In addition, the presence of cytoplasmic sulfur globules of as yet unknown function has been observed in whole cells of A. aeolicus grown on
S0 (9). The simultaneous presence of all these sulfur
enzymes, sulfur compounds and sulfur-containing struc4
The abbreviations used are: SR, sulfur reductase; Sqr, sulfide quinone reductase; SOR, sulfur oxygenase reductase; Psr, polysulfide reductase; SPR, surface plasmon resonance; RU, resonance unit; EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide.
VOLUME 287 • NUMBER 24 • JUNE 8, 2012
Downloaded from www.jbc.org at CNRS, on July 3, 2012
How microorganisms obtain energy is a challenging topic,
and there have been numerous studies on the mechanisms
involved. Here, we focus on the energy substrate traffic in the
hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. This bacterium can use insoluble sulfur as an energy substrate and has
an intricate sulfur energy metabolism involving several sulfur-reducing and -oxidizing supercomplexes and enzymes.
We demonstrate that the cytoplasmic rhodanese SbdP participates in this sulfur energy metabolism. Rhodaneses are a
widespread family of proteins known to transfer sulfur atoms.
We show that SbdP has also some unusual characteristics
compared with other rhodaneses; it can load a long sulfur
chain, and it can interact with more than one partner. Its
partners (sulfur reductase and sulfur oxygenase reductase)
are key enzymes of the sulfur energy metabolism of A. aeolicus and share the capacity to use long sulfur chains as substrate. We demonstrate a positive effect of SbdP, once loaded
with sulfur chains, on sulfur reductase activity, most likely by
optimizing substrate uptake. Taken together, these results
lead us to propose a physiological role for SbdP as a carrier
and sulfur chain donor to these key enzymes, therefore enabling channeling of sulfur substrate in the cell as well as
greater efficiency of the sulfur energy metabolism of A.
aeolicus.
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
JUNE 8, 2012 • VOLUME 287 • NUMBER 24
Analysis of the subcellular localization of Aq-477 as well as
the characterization of its partners allow us to propose a potential role for this protein in the sulfur energy metabolism of A.
aeolicus. A clear effect of Aq-477, which we rename SbdP (for
sulfur-binding-donating protein), on the SR activity supports
this model. SbdP might represent a prototype of rhodanese that
uses its sulfurtransferase activity to transfer substrates to corresponding enzymes such as SR and SOR. A proposed mechanism for SbdP as a sulfur shuttle in the sulfur energy pathway is
further discussed.
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Organisms and Growth Conditions
A. aeolicus VF5 was grown at 85 °C in 2-liter bottles containing 400 ml of modified SME medium (29) at pH 6.8 in the
presence of flowers of sulfur (7.5 g䡠liter⫺1) (which will be
referred to as “S0” in this paper) and under 1.4 bar of H2/CO2
(80:20) as described previously (9). Cells were harvested in the
late exponential growth phase and stored at ⫺80 °C.
Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL, transformed
with the pET22aq477 or pET22SOR plasmids, was grown in LB
medium at 37 °C supplemented with 0.5 mM ampicillin (12, 26).
Cell Fractionation
Periplasmic fraction was obtained as described previously
(30). After periplasmic extraction, cell material (spheroplasts)
was broken. Debris and unbroken cells were removed by centrifugation (10,000 ⫻ g, 15 min). Membrane and soluble proteins were separated by ultracentrifugation at 170,000 ⫻ g. The
membrane fraction was then washed with 50 mM Tris-HCl, pH
7.6, 5% (v/v) glycerol, 0.5% (w/v) aminocaproic acid (buffer A)
to avoid cytoplasmic contamination. To dissociate poorly
membrane-associated proteins from anchored membrane proteins, the resulting membrane pellet was washed with the same
buffer plus 1.5 M NaBr for 30 min at room temperature under
gentle shaking and ultracentrifuged as above. The supernatant
was kept to identify poorly associated membrane proteins and
is named “NaBr supernatant” in this study. NaBr-washed membranes (resulting pellet) were resuspended in buffer A to give a
protein concentration of 10 mg䡠ml⫺1 and solubilized with 2%
deoxycholic acid sodium salt (w/v) for a final concentration
(37 °C for 1 h under gentle shaking). After solubilization of the
membrane proteins, the supernatant called “solubilized NaBrwashed membranes” was recovered after ultracentrifugation.
The fraction called “solubilized membranes” was obtained by
the same procedure, with the exception of NaBr washing.
Protein Purification
Hydrogenase-Sulfur Reductase Complex Enrichment (“SR
Complex”)—Solubilized membranes from 50 g of cells were
obtained as described above but with the detergent n-dodecyl␤-D-maltoside (DDM) at 1% (w/v) used instead of sodium
deoxycholate and without the NaBr washing step. Membranes
were then applied on a DEAE-52 column (Whatman) equilibrated with buffer A with 0.05% DDM (buffer B). Proteins were
eluted with a 50 mM step gradient of 0 –500 mM NaCl in buffer
B. The 100 –200 mM NaCl fractions that contained sulfur
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
19937
Downloaded from www.jbc.org at CNRS, on July 3, 2012
tures, is puzzling, and the interconnection between all these
sulfur enzymes and pathways is our current main focus.
The use of S0 in energy metabolism has also been described in
the archaeon Acidianus ambivalens. A model of its intricate
sulfur energy metabolism has been proposed involving several
sulfur oxidation or reduction enzymes, but the interconnection
between all of the produced and consumed sulfur compounds,
even though suggested, has never been demonstrated (13, 14).
Another bacterium, Wolinella succinogenes, can reduce polysulfide (Sn2⫺), a soluble form of S0, with a membrane polysulfide
reductase (Psr) enzyme but seems to have a simpler sulfur
energy metabolism in comparison with A. aeolicus and A.
ambivalens (15, 16). In W. succinogenes sulfur metabolism,
membrane extract studies have suggested that a soluble
periplasmic rhodanese-like protein (Sud) could act as a sulfur
donor to the terminal electron acceptor, the periplasmic oriented Psr, revealing a potential protein involved in energy sulfur traffic (17).
Rhodaneses (PF00581) belong to the sulfurtransferase family
of enzymes that are found in organisms from all three domains
of life. They catalyze in vitro the transfer of a sulfur atom from
thiosulfate (sulfur donor) to cyanide (sulfur acceptor) (18, 19).
Rhodanese-like proteins share a common characteristic “rhodanese-fold” and catalyze a similar reaction using other sulfur
donors (like polysulfide for Sud) to transfer sulfur to nucleophilic sulfur acceptors. Rhodanese and/or rhodanese-like proteins are known to play a critical role in sulfur traffic by delivering sulfur in a “safe” chemical species to biosynthetic
pathways, using their labile persulfide group. Despite numerous studies, the physiological role of rhodaneses as well as their
physiological substrates remain unclear and are still widely
debated. It has been proposed that they accomplish essential
cell functions as they may be involved in the maintenance of
redox homeostasis (20), in the elimination of toxic cyanide (21),
and in the biosynthesis of several other cellular metabolites
such as vitamins, enzymes, and cofactors that include a step of
sulfur transfer (22–25).
A. aeolicus is a convenient model for studying intricate sulfur
energy metabolism and the potential role of rhodaneses in it.
The presence of a rhodanese (Aq-477) of unknown function in
the cytoplasmic compartment of A. aeolicus raised our curiosity about its potential role in this metabolism. Aq-477 presents
in vitro the classical thiosulfate cyanide sulfurtransferase activity (26). Previous biochemical characterizations of Aq-477 have
shown that it can also use in vitro at 85 °C tetrathionate (S4O62⫺)
and polysulfide instead of thiosulfate (S2O32⫺) as sulfur donor
(26). The existence of an equilibrium between monomers,
dimers, and tetramers of Aq-477 has also been observed, and
this oligomerization appears important for thermostability and
thermoactivity, which is not surprising for a protein present in
a hyperthermophilic bacterium (27, 28). Even though Aq-477
has been biochemically characterized, its function remains
unknown. Unfortunately, no genetic tools are available in this
organism to observe on growth the effect of the absence of
Aq-477. In this study, we have accordingly used alternative
approaches to describe the potential function of Aq-477 in A.
aeolicus, and we took advantage of our ability to purify and
produce different proteins involved in its energy pathways.
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
reductase activity were dialyzed and loaded onto a hydroxyapatite column equilibrated with buffer B. Sulfur reductase activity was eluted with 500 mM potassium phosphate in the same
buffer. After removal of phosphate and concentration, the SR
complex was frozen with liquid nitrogen and stored at ⫺80 °C.
We obtained an enriched fraction containing SR clearly identified by mass spectrometry that we will call the SR complex for
reasons of clarity.
Sqr Purification—Free Sqr was also purified from solubilized
membranes of A. aeolicus as described previously (11).
SbdP Purification—Recombinant SbdP was obtained from
E. coli as described previously (26). Previous studies showed
that recombinant SbdP behaves similarly to SbdP from A. aeolicus (26).
SOR Purification—Recombinant SOR was obtained from
E. coli as described previously (12).
Activity Measurements
S 2 O 32⫺ ⫹ Rhod 3 SO 32⫺ ⫹ Rhod-S
Rhod-S ⫹ CN ⫺ 3 Rhod ⫹ SCN ⫺
REACTION 1
Sulfur Reductase Activity—Sulfur reductase activity was
determined by quantifying the H2S formed by the reduction of
S0 with H2, as described previously (9), but performed in 50 mM
Hepes, pH 7.6. To study the influence of SbdP on SR activity,
SbdP (1, 5, 10, 15, and 20 ␮g䡠ml⫺1, final concentrations) was
added to the assay before the incubation at 85 °C. Measurements were made at different reaction times, with constant
amounts of SR complex or solubilized NaBr-washed membranes (50 ␮g䡠ml⫺1 each, final concentration). Controls were
done without SbdP, with SbdP alone and no SR, or with SbdP
inactivated by cysteine alkylation treatment (0.3 mg䡠ml⫺1 SbdP
was incubated with 0.5 mM iodoacetic acid overnight in 50 mM
Tris-HCl, pH 7.6, 100 mM NaCl).
Cross-linking
In Vitro Cross-linking—After dialysis in 40 mM sodium phosphate, pH 7.4, to avoid cross-reaction with Tris, SbdP (2.5
␮g䡠ml⫺1) and SOR (0.25 mg䡠ml⫺1) were incubated in 20 mM
phosphate buffer, pH 5.7, in the presence of 15 mM 1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) at 37 °C for 1 h
under gentle shaking. The reaction was stopped by addition of
Tris-HCl, pH 6.8, at a final concentration of 50 mM and then
loaded on a native gel.
In Vivo Cross-linking—A. aeolicus cells grown on S0 were
resuspended in 50 mM Hepes, pH 7.0, and were incubated with
1 mM dithiobis(succinimidyl propionate) for 30 min at 37 °C.
The reaction was stopped with 100 mM Tris-HCl, pH 7.6. Cells
were broken, and membranes were solubilized as described
above. Membranes were loaded onto a 20 – 40% sucrose density
gradient in 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, and ultracentrifuged overnight at 185,000 ⫻ g (50.2 Ti rotor, Beckman-Coulter). The
gradient was separated into 11 fractions. The fraction containing most of the rhodanese activity was dialyzed and loaded onto
native gel. The band corresponding to SbdP was sliced and analyzed by ion trap mass spectrometry.
Surface Plasmon Resonance (SPR) Binding Experiments
Analytical Procedures
Native Gel Electrophoresis—Proteins were loaded on 3– 8%
polyacrylamide gels (Mini-Protean II; Bio-Rad). After migration, proteins were either stained with PageBlue (Fermentas) or
detected with specific antibodies, or the gels were used to determine hydrogenase or rhodanese activity.
Denaturing Gel Electrophoresis—Proteins were incubated at
95 °C for 5 min in the denaturing Laemmli buffer, and loaded on
a 4% stacking, 5–20% running polyacrylamide gel (Mini-Protean II; Bio-Rad). After migration, gels were stained with PageBlue or used for Western blotting.
Western Blotting—After protein migration in gels, Western
blot was performed using standard procedures (11). Anti-SbdP
19938 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
A BIAcore T100 apparatus was used to investigate interaction between SbdP and SR complex, Sqr or SOR. SbdP and SR
complexes were immobilized on a CM5 sensor chip (BIAcore)
in 10 mM sodium acetate, pH 5.0, by amine coupling using a kit
supplied by BIAcore. Running buffer, used when interactions
were tested, contained 50 mM Hepes, pH 7.6, 50 mM NaCl, and
0.05% Tween 20 with a flow rate of 50 ␮l/min. Samples were
diluted in the same buffer with 100 mM NaCl. Control experiments were done on sensor chips in the absence of immobilized
proteins. Because of the difference between the index of refraction of the running buffer and the sample buffer, a burst phase
could be observed at the beginning and the end of sample
injection.
VOLUME 287 • NUMBER 24 • JUNE 8, 2012
Downloaded from www.jbc.org at CNRS, on July 3, 2012
Rhodanese (Thiosulfate Cyanide Sulfurtransferase) Activity—
Rhodanese activity consists of the transfer of a persulfide group
from thiosulfate to cyanide, leading to the formation of sulfite
and thiocyanate (see Reactions 1). In vitro, this activity is followed by quantifying the product of the reaction, the thiocyanate (SCN), as described previously (26), in the absence of
reducing agent.
antibodies, anti-Sqr antibodies, and anti-SOR antibodies were
used.
In Gel Enzymatic Activities—Hydrogenase activity on native
gel was detected as described previously (31). Rhodanese activity was revealed at 85 °C by nitro blue tetrazolium chloride
reduction by sulfite (a by-product of rhodanese, see Reaction 1)
with phenazine ethosulfate as intermediate electron carrier.
The reduction of nitro blue tetrazolium chloride allows the formation of a purple formazan precipitate visible on gel (32). The
assay mixture contained 100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 2 mM nitro
blue tetrazolium chloride, 0.5 mM phenazine ethosulfate, 10
mM Na2S2O3, and 10 mM KCN.
Gel Shift Assay—SR complex (0.5 mg䡠ml⫺1) or Sqr (0.25
mg䡠ml⫺1) was incubated with SbdP (2.5 or 50 ␮g䡠ml⫺1, respectively) in 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, for 30 min at 85 °C and
loaded on a native gel.
Protein Concentrations—Protein Concentrations were
determined with the modified Lowry method (33) and are
expressed in milligrams䡠ml⫺1 for most samples. Molar concentrations cannot be expressed because stoichiometry of the
active proteins/supercomplexes is yet unknown.
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
Mass Spectrometry (MS)
Microscopy
Spheroplasts Immunolabeling—For this experiment, spheroplast formation was optimized as described; fresh cells grown
on S0 were resuspended in a buffer C containing 50 mM TrisHCl, pH 7.5, 0.75 M sucrose, 1.5 mM EDTA. The cell suspension
was frozen and thawed and centrifuged at 10,000 ⫻ g for 20 min
to weaken the cells. The pellet was resuspended in buffer C
supplemented with lysozyme from chicken egg (0.4 mg䡠ml⫺1)
and then incubated at 37 °C for 24 h. The efficiency of cell wall
degradation was monitored by microscopy. The spheroplast
suspension was centrifuged at 1,500 ⫻ g for 20 min at 4 °C, and
the pellet containing the spheroplasts was washed in buffer C.
To be able to visualize the proteins of interest directly on the
spheroplast preparation, purified immunoglobulins raised
against Sqr, hydrogenase, or SbdP were labeled using the Alexa
Fluor 488 protein labeling kit (Invitrogen). To determine the
degree of labeling, the ratio of absorbance of Alexa Fluor 488 at
494 nm was compared with absorbance at 280 nm for proteins.
We obtained a ratio between 5 and 7 mol of Alexa Fluor 488 dye
per mol of antibody. The spheroplasts were then adsorbed on
polylysine-treated slides, fixed with 2% paraformaldehyde,
blocked with 5% BSA in PBS buffer, and immunolabeled with
anti-hydrogenase- or anti-Sqr-conjugated antibodies for 1 h at
room temperature in a moist chamber. Then the slides were
washed twice in PBS buffer and mounted with VectaShield
(Vector Laboratories). An Olympus confocal microscope (IX
81 with FluoView 1000) was used to visualize the immunolabeled spheroplast.
Immunogold Labeling Procedures—Harvested cells were
fixed using 2% paraformaldehyde ⫹ 0.1% glutaraldehyde in 0.1
M phosphate buffer, pH 6.8, and washed. Cells were then pelleted in 2% agarose and cryoprotected with 2.3 M sucrose in 0.1
M phosphate buffer. Samples were frozen in liquid nitrogen and
cryosubstituted during 72 h at ⫺85 °C in methanol containing
1.5% uranyl acetate. Several washes were performed for 4 h
JUNE 8, 2012 • VOLUME 287 • NUMBER 24
RESULTS
SbdP, a Soluble Rhodanese That Interacts with Membrane—
SbdP has been previously characterized as a rhodanese protein
with sulfurtransferase activity in vitro (26). It has been purified
from the cytoplasmic compartment of A. aeolicus spheroplasts,
but its exact subcellular localization had never been investigated. For this purpose and as a first approach, cells grown in
the presence of S0 have been analyzed by immunogold labeling
using specific SbdP antibodies in thin sections of intact cells
(Fig. 1A). We confirmed a cytoplasmic localization of SbdP, and
its presence near the membrane was less expected. However, it
has been reported that a purely cytoplasmic protein is likely to
be partially stained in a manner indistinguishable from a membrane-associated protein (34). To further confirm a potential
localization of SbdP at the membrane, periplasmic extraction
has been performed, and the resulting cells have been fractionated into membrane and cytoplasmic fractions. Western blot
analysis with SbdP-specific antibodies was performed on these
fractions after migration on denaturing gel. SbdP is mainly
found in the cytoplasmic fraction with a main band corresponding to the monomeric form (Fig. 1B, 4th lane). Even in
denaturing and reducing conditions, some tetrameric forms
can be observed due to the high stability of the oligomeric state
that we have previously shown to be thermostable (26). Once
again, a non-negligible amount of SbdP is found in the solubilized membrane fraction (Fig. 1B, 1st lane) even though no evidence from the primary sequence of SbdP could explain this
result. The absence of the tetrameric form in the membrane
could either have a physiological signification, yet unknown, or
could be due to experimental procedures (use of different buffers and SbdP concentrations). To better understand the potential interaction of SbdP with the membrane, the samples were
treated with NaBr, a chaotropic reactant, that allowed the
strength of the protein/membrane association to be estimated.
Proteins interacting partially with the membrane are then usually separated from membrane-anchored proteins. Under these
conditions, the majority of SbdP is released from the membrane
(Fig. 1B, 2nd lane) and is found in the soluble washed fraction
called the NaBr supernatant (Fig. 1B, 3rd lane). This result was
confirmed by a quantitative measurement of the rhodanese
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
19939
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Protein Identification—Tryptic digestion of excised gel plugs,
ion trap, and MALDI-TOF MS protein identification were
done as described previously (10).
MS Analysis of Nondigested Proteins—To determine the
binding of sulfur atoms on SbdP, the protein (2 mg䡠ml⫺1) was
incubated in 100 mM Tris-HCl, pH 9.0, with thiosulfate (10 mM)
or with flowers of sulfur (5% w/v) or without any sulfur source
for 20 min at 85 °C and then subjected to mass analysis of nondigested proteins. MALDI-TOF analyses were performed on a
Microflex II mass spectrometer (Bruker, Germany). A saturated solution of sinapinic acid in 50:50 acetonitrile/water, 0.1%
trifluoroacetic acid was used as matrix. A 0.7 mg䡠ml⫺1 protein
solution was used for the deposit according to the thin layer
method; mixtures were dried at room temperature. Data were
acquired in a positive linear mode, range was set from 2 to 20
kDa, and pulsed ion extraction was fixed to 200 ns. External
mass calibration was done just before the acquisition of the
sample using protein calibration standard I (Bruker Daltonics).
Mass spectra were treated in Flex Analysis software by a Gaussian smoothing (width ⫽ 2 cycles ⫽ 2).
until the temperature reached ⫺40 °C. Then the samples were
embedded in Lowicryl HM20. Polymerization was done during
48 h at ⫺40 °C using UV light. Thin sections of 80 nm were cut
with an ultramicrotome RMC MTX and collected onto nickel
grids. They were incubated into 0.5 M ammonium chloride in
TBS for 5 min. After washing in TBS, sections were incubated
into TBS-saturating solutions containing 0.5% BSA for 10 min
followed by a wash containing 0.1% BSA. Sections were then
incubated for 3 h using primary antibody solution (anti-SbdP
antibodies) diluted 1:100 in TBS containing 0.1% BSA. After
washing in the same buffer, samples were labeled with 15 nm
colloidal gold anti-rabbit IgG diluted 1:30 in the same buffer for
1 h as done previously. After several washes, fixation was performed with 2% glutaraldehyde for 5 min and washed in distilled water several times. Grids were examined using an electron microscope Zeiss EM 912, and digital images were
acquired with CCD camera Gatan Bioscan model 792.
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
19940 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
VOLUME 287 • NUMBER 24 • JUNE 8, 2012
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FIGURE 1. Localization of SbdP in A. aeolicus. A, immunogold labeling of
SbdP on ultrathin sections of A. aeolicus. White arrows point to cytoplasmic
SbdP, and the black arrow represents membrane-associated SbdP. The bar
represents 200 nm. B, 30 ␮g of solubilized (sol) membranes (1st lane),
solubilized NaBr-washed membranes (2nd lane), NaBr supernatant (3rd
lane), or “cytoplasm” (4th lane) were loaded onto denaturing reducing gel,
and SbdP (12.8 kDa) was detected using specific antibodies. The molecular mass markers are indicated in kDa on the left. C, rhodanese activity of
solubilized membranes (column 1), solubilized NaBr-washed membranes
(column 2), and NaBr supernatant (column 3). 100% represents the maximal rhodanese activity measured in the membrane fraction (200
␮mol䡠min⫺1, specific activity ⫽ 4.8 ␮mol䡠min⫺1䡠mg⫺1) and corresponds
to 10% of the total rhodanese activity. The results shown are averages of
three independent experiments.
activity determined in vitro in each fraction (Fig. 1C). This correlates perfectly with SbdP activity because no other active
cytoplasmic rhodanese is present in this organism under these
growth conditions (26).
Overall, these results highlight the existence of a fraction of
SbdP in contact with the membrane, which, to our knowledge,
is the first experimental characterization of a membrane localization for a soluble rhodanese. This raises the question of the
role of such interaction and the identity of the potential membrane protein partners of SbdP.
Identification of Potential Membrane Protein Partners of
SbdP—To determine the physiological membrane protein
partners interacting with SbdP, we incubated cells with a crosslinking agent (dithiobis(succinimidyl propionate)) that has
been shown to diffuse across the membrane. After treatment of
the cells with dithiobis(succinimidyl propionate), the membrane fraction was isolated, solubilized, and separated on a
sucrose gradient. Most of the membrane-bound SbdP proteins
were found in the heavy fractions (high percentage of sucrose
that contains heavy proteins, data not shown). To identify SbdP
partners, the fraction containing SbdP activity was loaded on a
native gel to allow in gel enzymatic activity detection. Hydrogenase activity could then be observed in the same band that
was revealed by specific SbdP antibodies (Fig. 2A). To precisely
define the composition of this potential complex, the protein
band was cut out, digested with trypsin, and analyzed by ion
trap MS. In this band, the presence of SbdP was confirmed, and
several membrane proteins, either cross-linked to SbdP or just
co-migrating with SbdP due to their intrinsic properties, were
clearly identified (supplemental Fig. S1). By using this
approach, we noticed that several identified proteins belong to
a similar pathway as follows: SR (with its two subunits SreA and
SreC), hydrogenase (which belongs to the SR supercomplex),
and Sqr. These proteins are involved in sulfur energy metabolism (Fig. 2B) that makes them likely candidates as rhodanese
partners. This first screen using intact cells for doing the crosslinking and trying to snapshot potential transient complexes
allowed us to direct our research toward membrane proteins
involved in sulfur energy metabolism as potential partners for
the rhodanese SbdP.
SbdP and Sulfur Reductase, Two Proteins Involved in the
Same Pathway?—Its membrane localization and the identification of the SR in the in vivo cross-linked complex led us to
test in vitro whether SbdP interacts with partially purified SR
complex. Both proteins were preincubated at 85 °C for 30
min and subsequently loaded on a native gel (gel shift assay).
The migration pattern of SbdP was then visualized with specific antibodies (Fig. 3A). Strikingly, a completely different
migration pattern of SbdP was observed when SbdP was
incubated with the SR complex. A gel shift of SbdP due to
interaction with a protein present in the enriched fraction of
SR was observed. The corresponding band had been cut out
from the native gel, and MS allowed the identification of
SbdP as well as of the subunit SreA of SR. As these two
proteins co-migrate in native conditions, a direct interaction
between the rhodanese SbdP and the sulfur reductase SR was
strongly supported. To confirm this result, we decided to
detect SbdP by following rhodanese activity on gel, a method
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
FIGURE 2. Analysis of solubilized membranes from cross-linked intact cells. A, native gels loaded with heavy fraction of solubilized membranes from
sucrose gradient. Lane 1, Hydrogenase activity; lane 2, SbdP detection via Western blot. The arrow indicates the position of SbdP and hydrogenase in the gel.
B, protein identification of the band sliced from the native gel (marked with a box) using ion trap MS analysis. Only proteins identified with at least five unique
peptides and involved in energy electron transfers are included in this table. Table headings are as follows: protein name, name in NCBI data base; NCBI entry,
accession number; coverage %; protein sequence coverage by the matching peptides; total peptides, number of total peptides matching to protein sequence;
unique peptides, number of different peptides matching the protein sequence.
previously described for other rhodaneses that we have
adapted to our system (32). The presence of SbdP in the
additional band is consistent with the previous result
JUNE 8, 2012 • VOLUME 287 • NUMBER 24
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
19941
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FIGURE 3. Interaction between SbdP and SR complex. After preincubation of
0.5 mg䡠ml⫺1 SR complex (lane 1), 2.5 ␮g䡠ml⫺1 SbdP (lane 2), or SbdP ⫹ SR complex (lane 3), proteins were loaded onto a native gel. SbdP was detected either by
Western blot using specific antibodies (A) or by in gel rhodanese activity (B). The
arrow represents the complex formed between SbdP and SR complex, which has
been confirmed by proteins identification via MS. C, SPR experiment. SbdP was
immobilized at 426 resonance units (RU) on a CM5 sensor chip, and increasing
concentrations of the analyte (SR complex, 3.75, 7.5, 15, and 22.5 ␮g) were
injected. As mentioned under “Experimental Procedures,” molar ratio between
the two proteins could not be determined due to the existence of an equilibrium
between multimeric forms for the different proteins.
obtained by Western blot and MS (Fig. 3B). This also indicates that SbdP retains rhodanese activity when joined to SR.
A complementary approach, using SPR, was carried out to
observe potential binding between these two partners in real
time. We covalently immobilized SbdP on a chip, and we
sequentially injected SR complex at different concentrations, in
a continuous flow that passed over the chip and monitored
binding events. The data show an unambiguous interaction
between the two partners (Fig. 3C). Nevertheless, because of the
presence of an equilibrium between multimeric forms of SbdP
and the heterogeneity of SR samples, the sensorgrams obtained
could not be fitted with the simplest 1–1 reaction model, preventing us from estimating kinetic constants.
The physical interaction between the SbdP and SR complex
explains the finding of part of SbdP at the membrane. It also
raises the question of the role of such an interaction.
SbdP, a Rhodanese Able to Bind Long Sulfur Chain—Sulfur
reductase is known to reduce sulfur chains (such as S0 or polysulfide) to H2S. We hypothesized that soluble SbdP might bring
the sulfur substrate to membrane SR. To fulfill such a function,
SbdP should be able to load sulfur chains. In previous studies,
SbdP has been shown to transfer sulfur atoms in vitro
from S2O32⫺ to the sulfur acceptor KCN. To better understand
which SbdP form is involved in the presence of S2O32⫺, the
molecular masses of both SbdP and SbdP incubated with this
substrate were determined by MALDI-TOF MS. Additional
sulfur atoms bound to SbdP catalytic cysteine was expected, as
observed for other rhodaneses (35). As shown in Fig. 4, purified
SbdP without any treatment (“as prepared”) already shows
three distinct masses in approximately equivalent amounts. (i)
An ion had been measured at m/z 12805.64 and could be
assigned to unmodified SbdP (theoretical average m/z 12805).
(ii) A population with an m/z of 12837.98 could correspond to
one sulfur (mass of a sulfur atom, 32 Da) bound to SbdP (called
SbdP-S-SH). (iii) The third population appeared at m/z
12867.77 and matched SbdP binding two sulfur atoms (SbdPS-S-SH). After S2O32⫺ incubation, all three initial species
(unmodified SbdP-SH, SbdP-S-SH, and SbdP-S-S-SH) might
react similarly with S2O32⫺ because no drastic change in the
proportions of these initial species could be observed. Additional masses were detected (Fig. 4A), which probably corre-
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
spond to addition of oxygen and sulfur atoms (from the S2O32⫺)
to the various initial SbdP species (Fig. 4B). As we were able to
show that in vitro this rhodanese could catalyze the transfer of
sulfur atom to KCN with S0 as sulfur donor (data not shown), an
identical approach was performed using S0 as sulfur donor for
SbdP. The MS results also show that this rhodanese can bind up
to five sulfur atoms (m/z 12963.06) under our experimental
conditions (Fig. 4). Additional peaks (with higher m/z) are
clearly visible on the mass spectrum; however, it is difficult to
know exactly which forms of SbdP they match.
In summary, this experiment shows that SbdP can covalently
bind several sulfur atoms on its unique catalytic cysteine. We
confirmed it by using an alkylating agent that reacts specifically
with cysteine residues. No sulfur fixation on SbdP could then be
observed after S0 addition (supplemental Fig. S2). These overall
data support our hypothesis of a potential role as sulfur donor
to enzyme using long sulfur chains as substrate.
Positive Effect of SbdP to Key Enzyme of Sulfur Energy
Metabolism—SPR was previously used to visualize the interaction in real time between the SbdP and SR complex (Fig. 3C).
We postulate that if SbdP plays a critical role in transfering
sulfur to SR, the presence of sulfur bound to SbdP may modify
the kinetics or the level of interaction between these two pro-
19942 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
teins. To test it, we carried out an experiment that consisted of
immobilizing the SR complex on the chip and injecting SbdP in
the presence or not of a sulfur compound. As we could not use
insoluble S0 with the BIAcore apparatus, S2O32⫺ was chosen for
the experiment. As observed in Fig. 5A, the interaction between
SR complex and SbdP “loaded” with sulfur is drastically modified, with a faster complex formation and higher stability of the
resulting complex. As SR cannot catalyze the reduction of
S2O32⫺ to H2S (9), we assume that the effect is mainly due to
SbdP loaded with sulfur atoms that might stabilize the interaction of SbdP to SR.
On the basis of this experiment, we proposed that SbdP could
indeed act as a sulfur donor for SR once it is loaded with sulfur
atoms. To test this potential functional role of SbdP on SR, we
measured sulfur reductase activity in the presence of its usual
substrate (S0) as well as in the presence of different amounts of
SbdP. A difference observed in H2S production of SR due to
SbdP might reflect a modification of SR-specific activity or a
change of substrate accessibility to the SR-active site. As
observed in Fig. 5B, whatever the presence of SbdP, the rate of
H2S production increases steeply with time and reaches
approximately the same plateau value. Interestingly, the curves
were not superimposable; for some time points (30, 40, and 60
VOLUME 287 • NUMBER 24 • JUNE 8, 2012
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FIGURE 4. Loading of SbdP with sulfur atoms. A, analysis of covalent modification of SbdP by MS: SbdP as prepared (top) or incubated with either S2O32⫺
(middle) or S0 (bottom). The mass (m/z) of each species is given above the corresponding peaks, and the distance (molecular mass) between peaks is also
reported on the spectra. B, assignment of potential modifications of SbdP to some peaks observed on mass spectra. Atoms added on the catalytic cysteine of
SbdP are shown in bold.
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
JUNE 8, 2012 • VOLUME 287 • NUMBER 24
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
19943
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FIGURE 5. Investigation of SbdP-SR complex partnership. A, SPR experiment; SR complex was immobilized at 4710 RU on a CM5 sensor chip, and
SbdP (0.6 ␮g) incubated or not with 10 mM thiosulfate (S2O32⫺) was injected.
Thiosulfate alone was also injected as a control, without modification of the
signal. B and C, sulfur reductase activity measurements of SR complex (50
␮g䡠ml⫺1, final concentration) (B) or solubilized NaBr-washed membranes (50
␮g䡠ml⫺1, final concentration) (C) performed with the insoluble S0 in presence
(white circles) or absence (black circles) of exogenous SbdP (5 ␮g䡠ml⫺1, final
concentration) as well as in presence of increasing concentrations of SbdP (1,
5, 10, 15, and 20 ␮g䡠ml⫺1, final concentration) (inset, B and C) after 40 min of
incubation. Ratio between the different proteins, however, cannot be calculated because the oligomerization state of the active form of both proteins is
yet unknown. A clear concentration dependence illustrates that we are most
likely not in an excess of one over the other. Results presented correspond to
an average of three independent experiments.
min), we clearly and reproducibly detected higher H2S production by SR in the presence of SbdP and in a concentration-dependent manner (as observed in Fig. 5B, inset). Comparison of
the two curves shows that the slopes are quite similar (Fig. 5B).
The observed difference seems due to a shorter lag phase in H2S
production in the presence of SbdP. As we know that SbdP can
bind sulfur compounds and that SbdP alone is not able to produce H2S in these conditions, we propose an active effect of
SbdP on SR activity. In our experimental conditions, SbdP
might increase the availability of the substrate toward the buried SR-active site. A similar trend was observed using membrane fractions and following SR activity in presence of exogenous SbdP (Fig. 5C). Slopes are, however, slightly different and
are most likely due to additional proteins, yet unknown, present
in the membrane extract that would optimize SbdP effect on
SR. This experiment not only confirms the positive effect of
SbdP on SR activity but also shows an amplified effect of SbdP
compared with the purified SR complex, which is probably due
to a better physiological environment for both proteins. Taken
together, we observed a clear role of exogenous SbdP on SR
activity. A control experiment was made using the alkylated
form of SbdP that is inactive as a rhodanese in vitro and is not
able to increase SR activity (supplemental Fig. S3), and this further demonstrates a role of SbdP in substrate presentation and
is not a consequence of SbdP interaction to SR.
These in vitro experiments support the hypothesis of a role of
SbdP as a sulfur donor to SR. In vivo, SbdP might play a role of
a cytoplasmic shuttle that would not only convert the sulfur
compound into a more “usable” substrate but also bring it to its
membrane partner.
Link between SbdP and Another Membrane Protein Involved
in Sulfur Metabolism?—Another protein, Sqr, involved in sulfur energy metabolism, has been identified in the in vivo crosslinking experiment (Fig. 2). It catalyzes the oxidation of H2S to
S0 (11), and we hypothesized that SbdP could take care of the
product of the reaction and per se would allow sulfur recycling.
Interaction between Sqr and SbdP was therefore investigated
using gel shift assay, as described previously. There was no significant difference in the migration pattern of SbdP or of Sqr
when they were incubated alone or together (Fig. 6, A and B).
The absence of interaction between the two proteins was further confirmed with SPR experiments (supplemental Fig. S4).
In addition, A. aeolicus Sqr has been classified as an integral
monotopic membrane protein, meaning that this protein is
only exposed to one side of the membrane, for which the
periplasmic orientation has been suggested (36). In parallel to
our in vitro interaction studies, we investigated the orientation
of Sqr; we consequently designed an optimized method adapted
for this extremophile organism to create spheroplasts. As
observed in Fig. 6, C, E, and G, the cells show a characteristic
round shape after treatment due to the depletion of their external membrane and of their periplasmic compartment. We then
incubated these cells with fluorescent antibodies directed
against Sqr (Fig. 6D), hydrogenase (Fig. 6F), or SbdP (Fig. 6H). A
fluorescent staining using confocal microscopy should be visualized only if the protein of interest is oriented toward the
periplasm. Hydrogenase, known to be oriented toward the
periplasm in A. aeolicus, was used as a positive control. In con-
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
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FIGURE 6. Absence of interaction between SbdP and Sqr. After preincubation of SbdP (lane 1), Sqr (lane 2), or Sqr ⫹ SbdP (lane 3), proteins were loaded
onto a native gel. SbdP (A) or Sqr (B) was detected by Western blot using
specific antibodies. C, E, and G, Nomarski contrast microscopy; D, F, and
H, immunofluorescence (D, using anti-Sqr antibodies; F, using anti-hydrogenase antibodies; or H, using anti-SbdP antibodies) on spheroplasts. The bar
represents 10 ␮m.
trast to SbdP, fluorescence could be clearly detected, revealing
the periplasmic orientation of Sqr (Fig. 6D). This experiment
confirms that SbdP cannot bind Sqr in vivo and is consistent
with the absence of interaction observed in vitro. This indicates
that Sqr functions independently of SbdP.
SOR, Another Partner of SbdP—We propose that SbdP plays
a role of a shuttle transferring long sulfur chains to enzymes
that require this substrate for fulfilling their enzymatic reactions. Another enzyme (SOR) uses S0 as substrate and has been
proposed to be involved in the energy pathway in various Acidianus species (13, 14, 37). As SOR is present and active in A.
aeolicus cytoplasm under our growth conditions, we first
19944 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
FIGURE 7. Interaction between SbdP and SOR. A, 30 ␮g of cytoplasm (lane
1), solubilized membranes (lane 2), solubilized NaBr-washed membranes
(lane 3), and NaBr supernatant (lane 4) were loaded onto denaturing gel, and
SOR was detected by Western blot with specific antibodies. The molecular
mass markers are indicated in kDa on the left. B, cross-linking experiment;
after preincubation of SbdP (lane 1), SbdP ⫹ EDC (lane 2), SOR (lane 3), SbdP ⫹
SOR (lane 4), SbdP ⫹ SOR ⫹ EDC (lane 5), proteins were loaded onto a native
gel. SbdP was detected by Western blot using specific antibodies. The arrow
represents the complex formed between SbdP and SOR complex. C, SPR
experiment; SbdP was immobilized at 426 RU on a CM5 sensor chip, and
increasing concentrations of the analyte (SOR, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, and 0.5 ␮g)
were injected.
decided to test if SOR from A. aeolicus was also able to interact
partially with the membrane to determine whether it could be
part of the sulfur energy metabolism. As shown in Fig. 7A, a
portion of SOR can be found in the membrane fraction and is
released after treatment with a chaotropic agent.
As SR and SOR use the same substrate (S0), we considered
that SbdP might play a central role in sulfur energy metabolism
VOLUME 287 • NUMBER 24 • JUNE 8, 2012
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
DISCUSSION
In this study, we have described the use of in vitro approaches
to determine the function of SbdP, a cytoplasmic rhodanese
present in A. aeolicus. This enzyme has unique features as it can
load, on its catalytic cysteine, long chains of sulfur atoms after
incubation with S0. Another unusual feature among rhodaneses
is that SbdP has two different partners, SR and SOR. Both
enzymes use long sulfur chains as substrates, and both are key
players in sulfur energy metabolism. The presence of SbdP
would optimize substrate presentation to its partner enzymes.
On the basis of these data, we propose that SbdP might play a
central role in sulfur energy pathways as a shuttle in the transfer
of sulfur substrate to catalytically active enzymes (SR or SOR).
We present alternative approaches to describe rhodanese function. Indeed, characterizing rhodanese physiological function
in an organism is a challenge due to the abundance of potential
rhodanese/rhodanese-like proteins within the same genome.
As an example, E. coli and Pseudomonas aeruginosa have,
respectively, 9 and 10 annotated rhodaneses or rhodanese-like
proteins in their genome (18, 35). This redundancy supports
the notion that rhodaneses are involved in distinct cellular processes. However, this makes it difficult to attribute a defined in
vivo function just by analyzing the phenotype of the corresponding mutant. Indeed, a different rhodanese can compensate for the absence of an other one (22, 35).
SbdP, a Rhodanese That Binds Long Sulfur Chains—Our
attempt to determine the number of sulfurs bound to SbdP
shows that, after incubation of SbdP in the presence of S0 and
S2O32⫺, several species of the protein can be identified by MS.
Some of them bind as many as five sulfur atoms. To our knowledge, this result has never been observed by MS for other rhodaneses, although binding of sulfur compounds has already
been studied (35, 38). In most cases the presence of only one or
JUNE 8, 2012 • VOLUME 287 • NUMBER 24
two sulfur atoms bound to the catalytic cysteine has been
observed. It is however noticeable that the rhodanese-like protein Sud from W. succinogenes has been suggested to be able to
bind up to 10 sulfur atoms per monomer, based on biochemical
studies (17). However, only two sulfur atoms bound to Sud were
detected by MS (39) and five were observed after determination
of the NMR structure (40). The authors explained this difference by suggesting that some sulfur atoms bind more tightly
due to their protection by the active site, whereas a long chain of
sulfur exposed might easily dissociate upon MS procedures
(39). This explanation may also apply to SbdP, for which we did
not see a homogeneous population binding five sulfur atoms.
The docking of a pentasulfide-sulfur molecule on the modeled
structure of SbdP (supplemental Fig. S6) shows that the sulfur
chain is exposed, meaning that it could be used as a substrate for
SR and SOR enzymes.
SbdP, a Shuttle for Carrying Reactive Sulfur Compounds to
Enzymes of Sulfur Metabolism—The fact that SbdP has the
potentiality to interact with at least two partners (SR and SOR)
is another unusual feature for rhodaneses. The complex SRSbdP is reminiscent of the Psr-Sud system of W. succinogenes,
whereas the complex formed between SbdP and SOR has not
yet been observed. SOR and SR have some common characteristics. One of them is the ability to use a long chain of sulfur
atoms as substrates. In A. aeolicus, both enzymes are present
simultaneously in the cell and have a similar location; SR is a
three-subunit membrane enzyme oriented toward the cytoplasm, and SOR is a soluble cytoplasmic enzyme that we show
to be partially located at the membrane. Moreover, both
enzymes possess buried active sites. As an example, the structure of Psr, an SR homologous protein from Thermus thermophilus, has been resolved (41), and it has been shown that its
active site is located in the subunit A buried at the end of a
narrow funnel, as for other molybdoenzymes of this family.
How the substrate can get access to this active site is still
unclear (42). Likewise, the structure of A. ambivalens SOR
shows that the SOR active site is also not very accessible and
a chimney-like protrusion has been suggested to be the likely
entry routes for a linear sulfur chain (43). We proposed that
SbdP might act as a sulfur supplier by providing long sulfur
chains to these buried active site enzymes. Once loaded with
sulfur chain, SbdP could bind the catalytic subunits of its
partners and the long chain could then be optimally presented to the cavity leading to the active site. The stabilization of the SbdP-SR complex observed in presence of the
substrate supports this hypothesis (Fig. 5A). Overall, we proposed that SbdP might increase the efficiency of sulfur
energy metabolism in this bacterium by optimizing the presentation of the substrate to its partner enzymes. We were
able to strengthen this theory by demonstrating that SbdP
presence accelerates H2S production of its partner enzyme
SR (Fig. 5, B and C). This impressive effect due to an active
role of SbdP might be explained by the following facts: (i)
SbdP binds a chain of sulfur and by an appropriate interaction with SR, the substrate is correctly and efficiently presented to the active site of the SR; (ii) SbdP increases both the
local concentration of substrate and the time of substrate
presentation to the active site of the enzyme by forming a
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
19945
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and could supply sulfur substrate to the SOR as well. Unfortunately, gel shift assay does not give clear results (supplemental
Fig. S5A). The formation of a very large complex (SOR being at
least a 16-mer and SbdP oligomerizing), might prevent the
incorporation into the gel under the conditions tested. We thus
modified the physicochemical conditions (pH and temperature), and we used a cross-linking agent (EDC) to lock this complex and stabilize the interaction. As observed in Fig. 7B (5th
lane), a band corresponding to the SbdP-SOR complex is
clearly detected. The presence of SbdP and SOR in the crosslinked complex was not only observed using antibodies (supplemental Fig. S5, B and C) but also when rhodanese activity
assay was performed in gel and showed a similar pattern (supplemental Fig. S5D). This result also shows that in these conditions, even in the presence of a cross-linking agent, SbdP in the
complex is still active as a rhodanese. We decided to confirm
the interaction between both purified proteins by SPR. Despite
the fact that they present different oligomerization states making it difficult to obtain kinetic constants, the result obtained
supports the conclusion of an interaction observed for the first
time between SOR and a rhodanese (Fig. 7C). This interaction
suggested a potential role of this rhodanese, as for SR, to bring
SOR substrates and optimize their presentation to the active
site of SOR.
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
stable complex; and (iii) the substrate (sulfur chain) supplied
by SbdP is more efficiently used by the enzyme than the
initial cyclic sulfur S8 substrate, for example.
We propose that SbdP plays a similar function of substratedonating protein for the SOR enzyme. However the impact of
SbdP on the kinetics of SOR product formation is difficult to
detect on account of the simultaneous reduction and oxidation
of S0 to SO32⫺, S2O32⫺, and H2S. Moreover, some products of the
reaction (SO32⫺ and H2S) are unstable, and others (S2O32⫺) can
be used by SbdP as a substrate.
Sulfur globules have been observed in A. aeolicus cytoplasm
(9). These kind of sulfur structures are usually present either in
the periplasmic compartment or in the extracellular environment (44). In any case, the chemical nature of sulfur in the
globules is still a debated question, and it seems that three different forms could be found, depending on the approach used:
cyclo-octasulfur (S8), polythionates ([(SnSO3)2]2⫺), and sulfur
chains (45). These three forms can all be used as substrates by
SbdP. In A. aeolicus, a role as sulfur storage has been suggested
based on previous studies showing that in the absence of exogenous S0, these inclusions disappeared over time.5 The fact that
A. aeolicus possesses two enzymes that use long sulfur chains in
the cytoplasm allows us to speculate that sulfur globules might
be one of their sources of substrate, with SbdP acting as a
shuttle.
Sulfur Energy Metabolism of A. aeolicus, an Overview—As
illustrated in Fig. 8, a broad picture of A. aeolicus sulfur energy
metabolism is becoming visible. Pieces of this intricate puzzle
of sulfur metabolism are now better defined by the association
of complementary approaches (proteomics and enzymatic
5
M.-T. Giudici-Orticoni, unpublished results.
19946 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
studies) with the main players, SR, Sqr, SOR, well characterized
(as described in Fig. 8 legend) (9, 11, 12). A role of SOR in the
sulfur energy pathway is strongly supported by its membrane
location also observed in Acidianus tengchongensis (37), which
would allow transfer of its products to membrane energy
enzymes (13, 14). Here, we define the function of an additional
protein involved in this complex sulfur energy metabolism of A.
aeolicus. We propose a model in which SbdP would be at the
central position of this sulfur energy network, as represented in
Fig. 8, playing the role of a shuttle to carry a sulfur chain from
different sources (such as the sulfur globules) to the cytoplasmic or membrane-located enzymes and allowing a better availability of the substrate to optimize the sulfur traffic. This substrate channeling toward its targets would also allow us to
prevent any interference with other pathways, a reasonable
possibility on account of the reactivity of sulfur compounds, in
a similar way as metallochaperones for highly reactive metals
(46). SbdP may represent the prototype of a new subfamily of
rhodanese involved in sulfur traffic in cells. The periplasmic
rhodanese-like protein Sud from W. succinogenes, which presents 32% of identity with SbdP, might as well belong to this
family especially because biochemical data and metabolic context suggest that it might supply sulfur substrate to the Psr
enzyme (17). In other organisms such as Acidithiobacillus ferrooxidans (47), A. ambivalens and some green sulfur bacteria
(48), with similar sulfur metabolism, rhodanese or rhodaneselike proteins, might play an identical function.
Finally, our findings not only allow a better understanding of
the functional role of the rhodanese enzymes but also open the
way to a deeper investigation of the sulfur compounds traffic
and recycling between the actors of an intricate sulfur energy
metabolism network.
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Downloaded from www.jbc.org at CNRS, on July 3, 2012
FIGURE 8. Central role of SbdP in the model of energy sulfur recycling in A. aeolicus. After growth with S0 as sulfur source, membrane-bound hydrogenase/SR (9) and Sqr/bc1 complex/cytochrome c) oxidase supercomplexes (11) are present and active, as well as cytoplasmic and membrane-associated SOR
enzyme (Ref. 12 and this paper). H2S gas, produced by SR and SOR, might be used by Sqr as a substrate and converted into polysulfide or elemental sulfur that
has been proposed to be incorporated into cytoplasmic sulfur globules (36). These sulfur globules (9), which probably serve as sulfur storage for the bacteria,
might be in turn used by SbdP as an alternative sulfur source. Finally, sulfite and thiosulfate produced by SOR might be used by still unknown systems
participating in sulfur energy metabolism as proposed previously (13, 14). By interacting with both SOR and SR, the rhodanese SbdP is at a key position in this
scheme, delivering substrate as a long chain of sulfur atoms, a very suitable form of substrate for these enzymes and, finally, might increase the efficiency of the
sulfur energy metabolism of A. aeolicus. Continuous lines represent the pathways demonstrated in this paper; dotted lines represent proposed sulfur traffic. Black
points represent quinone molecules; Sn is for sulfur (the physiological substrate and the number of sulfur atoms in the molecule in vivo are not known); cyt c
oxidase is for cytochrome c oxidase, and c is for monoheme cytochrome c555.
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
Acknowledgments—We gratefully acknowledge the contribution of
Marielle Bauzan (Fermentation Plant Unit, Institut de Microbiologie
de la Méditerranée, Marseilles, France) for growing the bacteria;
Alain Bernadac (Institut de Microbiologie de la Méditerranée, CNRS,
Marseilles, France) and Jean-Paul Chauvin (Institut de Biologie du
Développement de Marseille-Luminy, University Aix-Marseille II,
Marseilles, France) for microscopy; Remy Puppo, Régine Lebrun, and
Sabrina Lignon (Proteomic Analysis Center, Marseilles, France) for
mass spectrometry analyses; Alexandre Ciaccafava for help with
SbdP modeling; and Corinne Aubert for kindly supplying the
pET22SOR plasmid. We also thank Laurence Prunetti, Valérie Belle,
and Maria Luz Cardenas for helpful discussions and Athel CornishBowden for reviewing the manuscript. The Proteomic Analysis Center
of IFR88 is part of MaP (Marseille Protéomique, Infrastructure en
Biologie Santé et Agronomie).
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
REFERENCES
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24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
19947
Downloaded from www.jbc.org at CNRS, on July 3, 2012
1. Philippot, P., Van Zuilen, M., Lepot, K., Thomazo, C., Farquhar, J., and
Van Kranendonk, M. J. (2007) Early Archaean microorganisms preferred
elemental sulfur, not sulfate. Science 317, 1534 –1537
2. Wächtershäuser, G. (2000) Origin of life. Life as we don’t know it. Science
289, 1307–1308
3. Montegrossi, G., Tassi, F., Vaselli, O., Buccianti, A., and Garofalo, K.
(2001) Sulfur species in volcanic gases. Anal. Chem. 73, 3709 –3715
4. Bonch-Osmolovskaya, E. (September 2007) Microorganisms in high temperature sulfur environments. eLS. John Wiley and Sons Ltd., Chichester.
els.net (DOI:10.1002/9780470015902.a0000405.pub2)
5. Amend, J. P., and Shock, E. L. (2001) Energetics of overall metabolic reactions of thermophilic and hyperthermophilic Archaea and bacteria. FEMS
Microbiol. Rev. 25, 175–243
6. Huber, R., and Stetter, K. O. (August 2002) eLS. John Wiley and Sons Ltd.,
Chichester. els.net (DOI:10.1038/npg.els.0000442)
7. Huber, R., Wilharm, T., Huber, D., Trincone, A., Burggraf, S., Konig, H.,
Rachel, R., Rockinger, I., Fricke, H., and Stetter, K. O. (1992) Aquifex pyrophilus gen. nov., sp. Nov., represents a novel group of marine hyperthermophilic hydrogen-oxidizing bacteria. System Appl. Microbiol. 15,
340 –351
8. Olsen, G. J., Woese, C. R., and Overbeek, R. (1994) The winds of (evolutionary) change. Breathing new life into microbiology. J. Bacteriol. 176,
1– 6
9. Guiral, M., Tron, P., Aubert, C., Gloter, A., Iobbi-Nivol, C., and GiudiciOrticoni, M. T. (2005) A membrane-bound multienzyme, hydrogen-oxidizing, and sulfur-reducing complex from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. J. Biol. Chem. 280, 42004 – 42015
10. Guiral, M., Prunetti, L., Lignon, S., Lebrun, R., Moinier, D., and GiudiciOrticonit, M. T. (2009) New insights into the respiratory chains of the
chemolithoautotrophic and hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. J. Proteome Res. 8, 1717–1730
11. Prunetti, L., Infossi, P., Brugna, M., Ebel, C., Giudici-Orticoni, M. T., and
Guiral, M. (2010) New functional sulfide oxidase-oxygen reductase supercomplex in the membrane of the hyperthermophilic bacterium Aquifex
aeolicus. J. Biol. Chem. 285, 41815– 41826
12. Pelletier, N., Leroy, G., Guiral, M., Giudici-Orticoni, M. T., and Aubert, C.
(2008) First characterization of the active oligomer form of sulfur oxygenase reductase from the bacterium Aquifex aeolicus. Extremophiles 12,
205–215
13. Brito, J. A., Sousa, F. L., Stelter, M., Bandeiras, T. M., Vonrhein, C., Teixeira, M., Pereira, M. M., and Archer, M. (2009) Structural and functional
insights into sulfide:quinone oxidoreductase. Biochemistry 48, 5613–5622
14. Kletzin, A., Urich, T., Müller, F., Bandeiras, T. M., and Gomes, C. M.
(2004) Dissimilatory oxidation and reduction of elemental sulfur in thermophilic archaea. J. Bioenerg. Biomembr. 36, 77–91
15. Klimmek, O. (2005) The biological cycle of sulfur. Met. Ions Biol. Syst. 43,
105–130
16. Hedderich, R., Klimmek, O., Kroger, A., Dirmeier, R., Keller, M., and Stet-
ter, K. O. (1999) Anaerobic respiration with elemental sulfur and with
disulfides. FEMS Microbiol. Rev. 22, 353–381
Klimmek, O., Kreis, V., Klein, C., Simon, J., Wittershagen, A., and Kröger,
A. (1998) The function of the periplasmic Sud protein in polysulfide respiration of Wolinella succinogenes. Eur. J. Biochem. 253, 263–269
Cipollone, R., Ascenzi, P., and Visca, P. (2007) Common themes and variations in the rhodanese superfamily. IUBMB Life 59, 51–59
Papenbrock, J., Guretzki, S., and Henne, M. (2011) Latest news about the
sulfurtransferase protein family of higher plants. Amino Acids 41, 43–57
Remelli, W., Cereda, A., Papenbrock, J., Forlani, F., and Pagani, S. (2010)
The rhodanese RhdA helps Azotobacter vinelandii in maintaining cellular
redox balance. Biol. Chem. 391, 777–784
Cipollone, R., Frangipani, E., Tiburzi, F., Imperi, F., Ascenzi, P., and Visca,
P. (2007) Involvement of Pseudomonas aeruginosa rhodanese in protection from cyanide toxicity. Appl. Environ. Microbiol. 73, 390 –398
Kessler, D. (2006) Enzymatic activation of sulfur for incorporation into
biomolecules in prokaryotes. FEMS Microbiol. Rev. 30, 825– 840
Dahl, J. U., Urban, A., Bolte, A., Sriyabhaya, P., Donahue, J. L., Nimtz, M.,
Larson, T. J., and Leimkühler, S. (2011) The identification of a novel protein involved in molybdenum cofactor biosynthesis in Escherichia coli.
J. Biol. Chem. 286, 35801–35812
Matthies, A., Rajagopalan, K. V., Mendel, R. R., and Leimkühler, S. (2004)
Evidence for the physiological role of a rhodanese-like protein for the
biosynthesis of the molybdenum cofactor in humans. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 101, 5946 –5951
Palenchar, P. M., Buck, C. J., Cheng, H., Larson, T. J., and Mueller, E. G.
(2000) Evidence that ThiI, an enzyme shared between thiamin and 4-thiouridine biosynthesis, may be a sulfurtransferase that proceeds through a
persulfide intermediate. J. Biol. Chem. 275, 8283– 8286
Giuliani, M. C., Tron, P., Leroy, G., Aubert, C., Tauc, P., and GiudiciOrticoni, M. T. (2007) A new sulfurtransferase from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Being single is not so simple when temperature gets high. FEBS J. 274, 4572– 4587
Tanaka, Y., Tsumoto, K., Yasutake, Y., Umetsu, M., Yao, M., Fukada, H.,
Tanaka, I., and Kumagai, I. (2004) How oligomerization contributes to the
thermostability of an archaeon protein. Protein L-isoaspartyl-O-methyltransferase from Sulfolobus tokodaii. J. Biol. Chem. 279, 32957–32967
Vieille, C., and Zeikus, G. J. (2001) Hyperthermophilic enzymes. Sources,
uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol. Mol. Biol.
Rev. 65, 1– 43
Baymann, F., Tron, P., Schoepp-Cothenet, B., Aubert, C., Bianco, P., Stetter, K. O., Nitschke, W., and Schütz, M. (2001) Cytochromes c555 from the
hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus (VF5). 1. Characterization
of two highly homologous, soluble and membranous, cytochromes c555.
Biochemistry 40, 13681–13689
Giuliani, M. C., Jourlin-Castelli, C., Leroy, G., Hachani, A., and GiudiciOrticoni, M. T. (2010) Characterization of a new periplasmic single-domain rhodanese encoded by a sulfur-regulated gene in a hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Biochimie 92, 388 –397
Brugna-Guiral, M., Tron, P., Nitschke, W., Stetter, K. O., Burlat, B., Guigliarelli, B., Bruschi, M., and Giudici-Orticoni, M. T. (2003) [NiFe] hydrogenases from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Properties,
function, and phylogenetics. Extremophiles 7, 145–157
Cannella, C., Berni, R., and Ricci, G. (1984) Determination of rhodanese
activity by tetrazolium reduction. Anal. Biochem. 142, 159 –162
Markwell, M. A., Haas, S. M., Bieber, L. L., and Tolbert, N. E. (1978) A
modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in
membrane and lipoprotein samples. Anal. Biochem. 87, 206 –210
Bukau, B., Reilly, P., McCarty, J., and Walker, G. C. (1993) Immunogold
localization of the DnaK heat shock protein in Escherichia coli cells. J. Gen.
Microbiol. 139, 95–99
Cheng, H., Donahue, J. L., Battle, S. E., Ray, W. K., and Larson, T. J. (2008)
Biochemical and genetic characterization of PspE and GlpE, two singledomain sulfurtransferases of Escherichia coli. Open Microbiol. J 2, 18 –28
Marcia, M., Ermler, U., Peng, G., and Michel, H. (2009) The structure of
Aquifex aeolicus sulfide:quinone oxidoreductase, a basis to understand
sulfide detoxification and respiration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106,
9625–9630
A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism
37. Chen, Z. W., Jiang, C. Y., She, Q., Liu, S. J., and Zhou, P. J. (2005) Key role
of cysteine residues in catalysis and subcellular localization of sulfur oxygenase-reductase of Acidianus tengchongensis. Appl. Environ. Microbiol.
71, 621– 628
38. Forlani, F., Cereda, A., Freuer, A., Nimtz, M., Leimkühler, S., and Pagani, S.
(2005) The cysteine-desulfurase IscS promotes the production of the rhodanese RhdA in the persulfurated form. FEBS Lett. 579, 6786 – 6790
39. Klimmek, O., Stein, T., Pisa, R., Simon, J., and Kröger, A. (1999) The single
cysteine residue of the Sud protein is required for its function as a polysulfide-sulfurtransferase in Wolinella succinogenes. Eur. J. Biochem. 263,
79 – 84
40. Lin, Y. J., Dancea, F., Löhr, F., Klimmek, O., Pfeiffer-Marek, S., Nilges, M.,
Wienk, H., Kröger, A., and Rüterjans, H. (2004) Solution structure of the
30-kDa polysulfide-sulfurtransferase homodimer from Wolinella succinogenes. Biochemistry 43, 1418 –1424
41. Jormakka, M., Yokoyama, K., Yano, T., Tamakoshi, M., Akimoto, S., Shimamura, T., Curmi, P., and Iwata, S. (2008) Molecular mechanism of
energy conservation in polysulfide respiration. Nat. Struct. Mol. Biol. 15,
730 –737
42. Rothery, R. A., Workun, G. J., and Weiner, J. H. (2008) The prokaryotic
43.
44.
45.
46.
47.
48.
complex iron-sulfur molybdoenzyme family. Biochim. Biophys. Acta
1778, 1897–1929
Urich, T., Gomes, C. M., Kletzin, A., and Frazão, C. (2006) X-ray structure
of a self-compartmentalizing sulfur cycle metalloenzyme. Science 311,
996 –1000
Dahl, C., and Prange, A. (2006) in Inclusions in Prokaryotes (Shively, J. M.,
ed) pp. 21–51, Springer, Berlin
George, G. N., Gnida, M., Bazylinski, D. A., Prince, R. C., and Pickering, I. J.
(2008) X-ray absorption spectroscopy as a probe of microbial sulfur biochemistry. The nature of bacterial sulfur globules revisited. J. Bacteriol.
190, 6376 – 6383
Robinson, N. J., and Winge, D. R. (2010) Copper metallochaperones.
Annu. Rev. Biochem. 79, 537–562
Acosta, M., Beard, S., Ponce, J., Vera, M., Mobarec, J. C., and Jerez, C. A.
(2005) Identification of putative sulfurtransferase genes in the extremophilic Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 genome. Structural and
functional characterization of the proteins. Omics 9, 13–29
Frigaard, N. U., and Bryant, D. A. (2008) in Sulfur Metabolism in Phototrophic Organisms (Hell, R., Dahl, C., Knaff, D. B., and Leustek, T., eds)
pp. 337–355, Springer, Berlin
Downloaded from www.jbc.org at CNRS, on July 3, 2012
19948 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
VOLUME 287 • NUMBER 24 • JUNE 8, 2012
Supplemental Figure S1, Aussignargues et al.
Protein name
gene
NCBI
entry
Coverage
Total
%
Peptides
Unique
peptides
Putative protein
aq_863
2983410
45.3
69
42
Hydrogenase large subunit
Sulfide quinone reductase
Putative protein
Sulfur reductase chain A
60 kDa chaperonin
Hypothetical protein Aq_1259
Glutamine synthetase
mbhL1
sqr
aq_1862
sreA
groL
aq_1259
glnA
2983267
2984385
2984145
2983678
6225112
7429670
6225457
53.1
67.2
70.4
21.9
33
43.6
39.4
83
58
200
29
27
26
23
39
29
27
18
16
16
16
Ferredoxin oxidoreductase alpha subunit
forA2
2983615
34.2
16
13
Hydrogenase small subunit
Alkyl hydroperoxide reductase
mbhS1
ahpC1
2983268
2983132
37.7
46.4
19
11
11
10
Hypothetical lipoprotein Aq_1262
aq_1262
7460067
22.3
13
9
Putative protein
Hypothetical protein Aq_814
Hypothetical protein Aq_1790
Hypothetical protein Aq_1763
ATP synthase subunit beta
SbdP
aq_1558
aq_814
aq_1790
aq_1763
atpD
aq_477
2983921
2983372
2984088
2984073
3913128
2983145
28.2
22.2
29.4
22.3
16.3
38.2
21
10
14
7
7
20
9
8
7
6
6
6
Ferredoxin oxidoreductase alpha subunit
forA1
2983644
15.6
12
6
ATP synthase subunit alpha
atpA
3913127
15.7
10
6
Ni-Fe hydrogenase b-type cytochrome
hoxZ
2983263
10.9
11
5
Supplemental FIGURE S1. Protein identification of the band sliced from the native gel (Fig. 2) using ion trap MS analysis.
Only proteins identified with at least 5 unique peptides are included in this table. Table heading: Protein name, name in NCBI
database; NCBI entry, accession number; Coverage %, protein sequence coverage by the matching peptides; Total peptides, number
of total peptides matching to protein sequence; Unique peptides, number of different peptides matching the protein sequence.
Supplemental Figure S2, Aussignargues et al.
12862.86
SbdP + IAA
12837.33
1500
Intens. [a.u.]
SbdP + IAA + S0
1000
500
0
12700
12750
12800
12850
12900
12950
13000
13050
13100
13150
m/z
Supplemental FIGURE S2. Cysteine-alkylation of SbdP prevents sulfur atoms fixation. SbdP was treated with iodoacetic
acid, incubated at 85°C with (grey curve) or without (black curve) flowers of sulfur and then subjected to MS analysis. The first
peak (12837.33 Da) corresponds to the persulfide form of SbdP (SbdP-S-SH) which, for unknown reason, has not been modified,
and the second one (12862.86 Da) corresponds to the native form modified with iodoacetic acid (the alkylation by iodoacetic acid
lead to a mass increase of 58 Da).
Supplemental Figure S3, Aussignargues et al.
20
18
16
[H2S] µM
14
12
10
8
6
4
-Sb
dP
alk
SR
+
3-
2-
SR
+
Sb
d
SR
1-
0
P
2
Supplemental FIGURE S3. Inactivated SbdP is not able to increase SR activity. H2S
production by SR complex (50 µg.mL-1) is measured after 40 minutes of incubation in absence of
SbdP (column 1), in presence of native SbdP (5µg.mL-1) (column 2) or in presence of alkylated
SbdP (5µg.mL-1) (column 3). After alkylation, SbdP is inactive as a rhodanese in vitro (data not
shown).
Supplemental Figure S4, Aussignargues et al.
SbdP immobilized
50
40
[Sqr]
RU
30
20
10
0
100
200
300
400
500
600
Time
(s)(s)
Temps
Supplemental FIGURE S4. SPR experiment showing no interaction between SbdP and Sqr.
SbdP was immobilized at 426 RU on a CM5 sensor chip, and Sqr (0.48 and 0.24 µg) was
injected.
A
ED
C
SO
R+
P+
Sb
d
3-
Sb
d
2-
P
Sb
d
1-
C
P+
SO
R
SO
R+
P+
SO
R
Sb
d
3-
2Sb
dP
+
SO
R+
P+
Sb
d
3-
1SO
R
B
2Sb
dP
+
SO
R
SO
R
P+
SO
R
Sb
d
P+
5-
Sb
d
4-
P+
Sb
d
3-
SO
R
2-
1-
Sb
d
P
SO
R
ED
C
ED
C
Supplemental Figure S5, Aussignargues et al.
D
Supplemental FIGURE S5. Interaction between SbdP and SOR. A. After preincubation of SbdP (2.5 µg.mL-1) (lane
1), SOR (0.25 mg.mL-1) (lane 2) or SbdP + increasing concentrations of SOR (0.1, 0.25, 0.4 mg.mL-1, lanes 3, 4 and 5
respectively), proteins were loaded onto a native gel, and SbdP was detected by Western Blot using specific antibodies. B,
C, D, cross-linking experiment: after preincubation of SbdP (lane 1), SbdP + SOR (lane 2), SbdP + SOR + EDC (lane 3),
proteins were loaded onto a native gel. SbdP (B) and SOR (C) were detected by Western Blot using specific antibodies.
SbdP was also detected by in gel rhodanese activity (D). The arrow represents the complex formed between SbdP and
SOR complex.
Supplemental Figure S6, Aussignargues et al.
A
B
Supplemental FIGURE S6. Modelisation of SbdP based on the known structure of the rhodanese homologue TTHA0613
from Thermus thermophilus (1) using SWISS-MODEL (2). Pentasulfide sulfur (yellow spheres) was docked on the unique
catalytic cysteine of SbdP using AutoDock Vina (3). A. Characteristic rhodanese-fold (β-strands core surrounded by α-helices) of
SbdP is shown. B. Blue and red colors correspond to positive and negative-charged regions respectively, white is for
neutral/hydrophobic surface. Pymol was used to generate the final figures.
1. Hattori, M., Mizohata, E., Tatsuguchi, A., Shibata, R., Kishishita, S., Murayama, K., Terada, T., Kuramitsu, S., Shirouzu, M. and Yokoyama,
S. (2006), Crystal structure of the single-domain rhodanese homologue TTHA0613 from Thermus thermophilus HB8. Proteins, 64: 284–287
2. Arnold K., Bordoli L., Kopp J., and Schwede T. (2006). The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure
homology modelling. Bioinformatics, 22,195-201
3. Trott, O. and Olson, A. J. (2010), AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient
optimization, and multithreading. J. Comput. Chem., 31: 455–461
Résultats et discussion
II) Une source potentielle de substrat: les globules de
soufre
La protéine SbdP a donc été caractérisée fonctionnellement comme étant un
fournisseur de soufre pour des enzymes clés du métabolisme énergétique de la bactérie. Et si
l‘existence d‘un véritable « réseau du soufre » a été suggérée par cette étude, l‘origine de ce
soufre distribué restait à être déterminée.
Une hypothèse séduisante repose sur les globules de soufre présents chez la bactérie
lors d‘une croissance sur fleur de soufre. Leur localisation cytoplasmique, comme la protéine
SbdP et ses partenaires SOR et soufre réductase, en font de bons candidats pour être une des
sources de substrat du système. De plus, très peu de choses sont connues à propos de ces
inclusions. C‘est pourquoi nous avons décidé de les étudier plus en détail à travers deux axes
majeurs, à savoir la caractérisation des conditions de croissance influençant leur présence
dans la bactérie, ainsi que leur purification en vue d‘études biochimiques plus poussées.
A) Influence des conditions de culture
L‘équipe avait auparavant montré que les globules de soufre ne se formaient qu‘au
cours d‘une croissance sur fleur de soufre, et avait proposé que ces inclusions pouvaient être
une réserve de soufre que la bactérie utiliserait en cas de carence en composé soufré (Guiral et
al., 2005b). Nous avons donc cultivé Aquifex aeolicus en présence de fleur de soufre, vérifié
que les globules de soufre étaient bien présents (Figure 68), puis nous avons transféré les
bactéries, après avoir éliminé l‘excès de fleur de soufre, sur un milieu contenant du thiosulfate
en concentration non limitante ou carencé en soufre. Dans les deux cas, on obtient une
croissance de la bactérie ainsi qu‘une perte complète des globules de soufre (Figure 69).
138
Résultats et discussion
Figure 68 : Cellules entières d‘Aquifex aeolicus observées en microscopie optique (contraste de phase) (A), et
coupes de cellules observées en microscopie électronique (B). Les cellules proviennent de la même culture en
présence de fleur de soufre (7,5 g.L-1). Les globules de soufre sont clairement visibles sur ces clichés. La flèche
fine indique un globule de soufre intact, et la flèche épaisse montre l‘emplacement d‘un globule de soufre perdu
lors du traitement des cellules pour la microscopie.
Figure 69 : Des cellules d‘Aquifex aeolicus cultivées en présence de fleur de soufre (7,5 g.L-1) et
récoltées en fin de phase exponentielle de croissance ont été transférées sur milieu carencé en soufre (ni
thiosulfate, ni soufre élémentaire) (A) ou en présence de thiosulfate (1 g.L-1, concentration classiquement
utilisée lors d‘une croissance en présence de ce composé) (B). Ces clichés de microscopie optique (contraste de
phase) ont été réalisé après un croissance sur la nuit et sont représentatifs de l‘ensemble des bactéries qui ne
présentent plus de globules de soufre.
Ce comportement est intéressant, car si l‘hypothèse d‘un stockage de soufre en vue
d‘une utilisation ultérieure en cas de carence semble confirmée, ces globules sont également
139
Résultats et discussion
consommés lorsqu‘une source différente de soufre, comme le thiosulfate, est présente. Pour
expliquer ceci, on peut émettre l‘hypothèse que le soufre contenu dans les globules soit plus
« énergétique » ou « rentable » que le thiosulfate présent dans le milieu et qu‘il serait donc
utilisé en priorité. Si l‘on pousse le raisonnement, on peut imaginer que ce soufre ait un degré
d‘oxydation inférieur à celui du thiosulfate (et serait donc une forme plus réduite), ce qui
signifie que son oxydation apporterait comparativement plus d‘électrons (et donc d‘énergie)
que celle du thiosulfate. Ce modèle est supporté par le fait que ce sont des chaînes de soufre
qui constituent les globules chez Allochromatium vinosum et d‘autres bactéries sulfureuses
phototrophes (Prange et al., 2002). De plus, le mécanisme d‘internalisation du soufre dans la
bactérie est actuellement inconnu, on peut penser que ce processus requiert de l‘énergie de la
part de la bactérie, alors que le soufre contenu dans les globules serait une source directement
disponible, et finalement peu « chère » (énergétiquement parlant) à mobiliser.
Un autre point intéressant a été dévoilé au cours du test d‘une autre condition de
culture, c‘est-à-dire la présence simultanée des deux types de composés soufrés (fleur de
soufre insoluble et thiosulfate soluble) dans le milieu de culture. Les résultats, présentés en
figure 70, montrent que la présence de soufre insoluble induit automatiquement un stockage
de soufre sous forme de globules.
Figure 70 : Aquifex aeolicus cultivée sur un milieu contenant à la fois du soufre soluble (thiosulfate, 1 g.L-1) et
insoluble (fleur de soufre, 7,5 g.L-1). La majorité des cellules présentent des globules de soufre.
La présence d‘H2S en fin de culture (jamais détectée lors d‘une croissance en présence
de thiosulfate) semble également suggérer que la fleur de soufre a été utilisée pour la
croissance. Nous ne pouvons cependant pas conclure sur l‘utilisation du thiosulfate dans de
telles conditions de culture, mais il serait intéressant de déterminer les concentrations de
140
Résultats et discussion
thiosulfate dans le milieu, avant et après culture, lorsqu‘il est seul ou couplé à la fleur de
soufre, afin de déterminer les « préférences alimentaires » de la bactérie.
Cette approche permet de dégager quelques tendances à propos de ces globules : ce
stock de soufre est automatiquement créé lorsqu‘une source de soufre insoluble est présente
dans le milieu, il peut servir de réserve de substrat en cas de carence en soufre, enfin il est
consommé en priorité même si une autre source de soufre est disponible. Forts de ces
éléments, nous avons décidé de purifier ces inclusions afin de déterminer si elles pouvaient
être une source de substrat pour le métabolisme énergétique d‘Aquifex aeolicus, et notamment
pour la protéine SbdP.
B) Tentative d’isolation des globules de soufre
Le protocole de référence de purification des globules de soufre est celui développé
par (Brune, 1995b) pour la bactérie Allochromatium vinosum cultivée en présence de Na2S
qui possède également des
globules de soufre périplasmiques. Il consiste en une
sédimentation des globules de soufre par centrifugation à très basse vitesse après casse des
cellules. Nous avons donc employé la même méthode, mais le suivi de purification par
microscopie optique a vite révélé que la fraction contenant les globules de soufre était
également contaminée par du soufre insoluble du milieu de culture ainsi que par des bactéries
encore intactes. Afin de se débarrasser au maximum du soufre du milieu, plusieurs lavages
des cellules ont été effectués et seule la partie homogène correspondant au culot bactérien
sans dépôt de soufre a été utilisée. Un gradient de densité à base de Percoll (voir section
Matériel et Méthodes) a également été employé pour tenter de séparer complètement les
différents éléments. L‘observation au microscope des fractions obtenues a montré que seul le
culot contenait du soufre, et donc probablement les globules. Cependant, elle a également
révélé la présence majoritaire de globules réfringents (globules de soufre) d‘une taille
supérieure à celle des bactéries, mais différents du soufre du milieu classiquement observé,
lequel est visible comme un amas cristallin contrairement aux globules de forme très arrondie.
Une éventuelle fusion entre les globules libérés des bactéries pourrait expliquer une telle
observation. On note également la présence très minoritaire de bactéries intactes et d‘amas de
soufre provenant du milieu de culture. Afin de connaitre un peu mieux ces globules
(recherche de protéines d‘enveloppe comme chez Allochromatium vinosum, ou d‘autres
141
Résultats et discussion
protéines interagissant spécifiquement avec les globules…), cette fraction a été déposée sur
gel dénaturant, et une révélation de la présence de la protéine SbdP (qui pourrait utiliser le
soufre contenu dans ces globules cytoplasmiques comme substrat) ainsi que de la SQR
(contrôle négatif, son orientation périplasmique rendant impossible son interaction avec les
globules cytoplasmiques) a été réalisée à l‘aide d‘anticorps spécifiques. Les résultats
présentés figure 71 montrent la présence de Sbdp. Toutefois, le résultat positif obtenu avec les
anticorps dirigés contre la SQR suggère que la fraction étudiée contient encore des bactéries
intactes et/ou des débris cellulaires en quantité significative par rapport aux globules de
soufre. Afin d‘affiner cet enrichissement, nous avons déposé la fraction d‘intérêt sur un
coussin de Percoll pur. Malheureusement, le culot récolté présentait le même type de profil
que celui précédemment obtenu, et les protéines SbdP et SQR ont encore été révélées.
A
B
130
95
72
55
43
34
26
17
10
Figure 71 : Immunodétection sur gel dénaturant de SbdP (A) et de la SQR (B) dans la fraction enrichie
en globules de soufre. La présence de la SQR est révélatrice d‘une contamination par des bactéries et/ou des
débris cellulaires.
En conclusion, la stratégie utilisée n‘a pas permis la purification des globules de soufre
cytoplasmiques d‘Aquifex aeolicus. La fraction obtenue est en effet encore trop contaminée
par des bactéries/débris et du soufre du milieu pour permettre une étude correcte de ces
inclusions. En particulier, il semble très difficile de séparer complètement les bactéries du
soufre du milieu, même après plusieurs lavages. Ce problème avait déjà été évoqué
auparavant (Franz et al., 2009; Franz et al., 2007) au cours de travaux sur la bactérie
142
Résultats et discussion
Allochromatium vinosum cultivée en présence de fleur de soufre (les globules de soufre isolés
le sont à partir de cultures où la source de soufre est soluble), et doit être mis en relation avec
le processus d‘adhésion au soufre insoluble observé chez plusieurs bactéries, dont Aquifex
aeolicus (Giuliani et al., 2010; He et al., 2009; Mangold et al., 2011). Malgré cela, un point
peut être discuté : il a été montré que la nature du soufre contenu dans les globules était
dépendante de l‘espèce étudiée, par exemple chez Allochromatium vinosum il s‘agit de
chaînes de soufre, alors que chez Beggiaota alba et Thiomargarita namibiensis, ce soufre se
retrouve sous forme de cycles identiques à la fleur de soufre que nous utilisons comme
substrat (Prange et al., 2002). Au cours de notre étude, nous avons montré que SbdP était
capable d‘utiliser ces deux types de composés pour former une longue chaîne de soufre
utilisable par la SOR et la soufre réductase. On peut donc raisonnablement penser que si la
nature du soufre des globules d‘Aquifex aeolicus se rapproche de celles décrites dans la
littérature, ceux-ci peuvent servir de substrat à SbdP, et représenter une source de soufre
alternative pour le métabolisme énergétique de la bactérie.
III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex
aeolicus : un nouveau modèle
Nous avons vu en introduction (Chapitre III) que si certaines enzymes et voies du
métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus avaient été caractérisées par
l‘équipe, plusieurs questions se posent encore, notamment à propos de l‘utilisation de
composés comme le thiosulfate ou le sulfite. La comparaison avec les modèles établis chez
d‘autres organismes (Introduction I, Figures 23, 24, 25 et 26) suggère l‘existence de systèmes
supplémentaires d‘utilisation du soufre à des fins énergétiques chez Aquifex aeolicus. En nous
appuyant sur la description des enzymes et systèmes composant le métabolisme énergétique
du soufre de ces organismes modèles, nous avons entrepris de rechercher dans le génome
d‘Aquifex aeolicus de nouveaux acteurs de ce métabolisme, afin d‘en proposer un modèle le
plus complet possible (Figure 76).
143
Résultats et discussion
A) Identification de systèmes potentiellement impliqués dans le
métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus
1. Oxydation du thiosulfate
Nous savons qu‘Aquifex aeolicus est capable de croître en utilisant le thiosulfate
comme substrat soufré, cependant, aucun système d‘utilisation de ce composé, hormis SbdP,
n‘a encore été caractérisé chez cette bactérie. La recherche dans le génome d‘une TQOR
putative (similaire à DoxDA d‘Acidianus ambivalens, Introduction I, II.2) ou d‘une
thiosulfate déshydrogénase (comme TsdA d‘Allochromatium vinosum par exemple,
Introduction I, II.2) n‘a pas été fructueuse. On ne peut toutefois pas écarter complètement la
présence de ce type de protéines puisque les thiosulfate déshydrogénases présentent peu de
similarité de séquence entre elles, rendant difficile leur identification dans les génomes
(Visser et al., 1996). Il ne semble pas non plus y avoir de gène codant pour une tétrathionate
hydrolase (l‘enzyme capable d‘utiliser le tétrathionate produit par les thiosulfate
déshydrogénases) dans le génome de la bactérie.
En revanche, un groupe d‘au moins dix gènes codant pour le système Sox a été
retrouvé (Figure 72 et Table 4). Plusieurs points le concernant sont à noter. En premier lieu,
les enzymes principales (SoxAX, SoxB et SoxYZ, prédites pour résider dans le périplasme)
sont présentes, ce qui implique un système fonctionnel (Figure 8). Le complexe SoxAX serait
d‘ailleurs assez particulier, puisqu‘il emprunterait des caractéristiques propres à chacun des
groupes I et II de la classification récemment proposée par Kappler et co-auteurs (Kappler and
Maher, 2012) : en effet, la présence de deux sites de fixation des hèmes c dans la séquence de
SoxA le rapprocherait du groupe I, alors que la masse moléculaire de SoxX (environ 20 kDa)
le placerait plutôt dans le groupe II. L‘absence de la protéine SoxK, qui peut interagir avec
SoxAX, permet toutefois de l‘exclure avec certitude du groupe III.
P. pantothrophus
A. aeolicus
T
R S V
W
X Y Z
soxB
A
C
D
E
F
G
H
aq1803
Figure 72 : Comparaison des opérons codants pour le système Sox chez Paracoccus pantothrophus et
Aquifex aeolicus.
144
Résultats et discussion
Gène
Locus
Protéine
trxA2
aq_1810
aq_1809
aq_1807
aq_1806
soxB
aq_1802
aq_1800
rhdA2
cphA1
aq_1811
aq_1810
aq_1809
aq_1807
aq_1806
aq_1803
aq_1802
aq_1800
aq_1799
aq_1798
Thiorédoxine (SoxW)
SoxY
SoxZ
SoxA
SoxX
SoxB
Protéine hypothétique
Protéine hypothétique
Thiosulfate soufre transférase (rhodanèse, SoxL)
SoxH
Table 4 : Composition du système Sox d’Aquifex aeolicus.
Autre point intéressant, SoxCD qui permet une oxydation complète du thiosulfate en
sulfate n‘est pas retrouvé : il est tentant de faire un parallèle avec des bactéries, telles que
Allochromatium vinosum, pour lesquelles l‘absence de SoxCD conduit à l‘apparition de
globules de soufre, périplasmiques ou extracellulaires, comme intermédiaires réactionnels
obligatoires lors de l‘oxydation du thiosulfate. Cependant, la situation chez Aquifex aeolicus
est assez différente, puisque ces globules se retrouvent dans le cytoplasme de la bactérie,
compartiment différent du système Sox périplasmique. Mais surtout, chez Aquifex aeolicus,
ces globules n‘apparaissent que lorsque la bactérie est cultivée en présence de soufre
élémentaire, et non pas de thiosulfate. On peut dès lors imaginer un processus de formation
des globules différent de ce qui est décrit dans la littérature, n‘impliquant pas le système Sox
mais d‘autres protéines encore non identifiées. Le système Dsr, responsable de l‘utilisation
ultérieure de ce soufre stocké chez Allochromatium vinosum et d‘autres bactéries, n‘existe pas
non plus chez Aquifex aeolicus. Le système responsable de la consommation de ces globules
reste donc à être découvert : nous avons toutefois proposé que SbdP puisse utiliser le soufre
de ces inclusions comme substrat, afin de l‘apporter à la SOR et la soufre réductase.
Si l‘on continue à comparer les systèmes Sox d‘Allochromatium vinosum et d‘Aquifex
aeolicus, il faut mentionner la protéine SoxL appartenant à la superfamille des rhodanèses.
Les études menées chez Allochromatium vinosum ont permis de proposer un rôle pour SoxL :
elle permettrait de recycler le complexe SoxYZ en ôtant de SoxY le dernier atome de soufre
(ou la chaîne de soufre) résultant de l‘oxydation incomplète du thiosulfate en absence de
SoxCD (Bagchi, 2012; Welte et al., 2009). Chez Aquifex aeolicus, un gène nommé rhdA2 (ou
aq_1799) codant pour une rhodanèse est retrouvé dans le groupe de gènes sox : ceci nous
145
Résultats et discussion
permet de proposer un rôle pour une autre rhodanèse d‘Aquifex aeolicus, à savoir une
implication dans le système Sox et le recyclage de SoxYZ.
Bien que nous n‘ayons pas encore étudié le système Sox autrement qu‘in silico, sa
présence dans les cellules est cependant assez certaine, puisque certains composants (tels
SoxB) ont déjà été identifiés au cours d‘analyses par spectrométrie de masse de la fraction
soluble d‘Aquifex aeolicus cultivée en présence de soufre élémentaire. La présence du
système Sox dans de telles conditions de culture peut paraitre curieuse, puisqu‘on aurait pu
penser qu‘il ne soit utile que lorsque le thiosulfate est utilisé comme substrat soufré au cours
de la culture. On peut avancer deux hypothèses pour expliquer cette observation : pour la
première, le système Sox serait exprimé à un niveau basal et serait surexprimé lors d‘une
croissance en présence de thiosulfate. Ce dernier agirait donc comme un activateur de
l‘expression des gènes codant pour le système Sox. Cette hypothèse est confortée par les
résultats publiés chez Allochromatium vinosum (Grimm et al., 2011), montrant que les gènes
sox sont plus fortement exprimés lors d‘une croissance en présence de thiosulfate. Une
deuxième hypothèse repose sur l‘idée que le thiosulfate pourrait être un intermédiaire
réactionnel obligatoire au cours de l‘oxydation du soufre élémentaire, produit par exemple de
manière indirecte par la SOR. La présence d‘un système permettant l‘utilisation de ce
composé serait alors parfaitement compréhensible et nécessaire.
L‘ensemble de ces éléments fait de l‘étude du système Sox d‘Aquifex aeolicus une
voie de recherche à privilégier dans les futurs investigations pour une meilleure
compréhension du métabolisme énergétique du soufre de cette bactérie.
2. Oxydation de l‘H2S
Comme nous l‘avons vu précédemment, l‘oxydation de l‘H2S chez Aquifex aeolicus
est dû à la SQR membranaire, laquelle peut s‘associer à la voie de l‘oxygène au sein du
supercomplexe bc1/cytochrome c oxydase. L‘analyse du génome de la bactérie révèle
également la présence de deux gènes codant pour des protéines potentiellement impliquées
dans l‘oxydation de l‘H2S : aq_232 ou dhsU, et aq_235 ou fccB’. Les deux protéines putatives
seraient des flavoprotéines de la famille des flavocytochromes c sulfure déshydrogénases
(FCSD, Introduction I, II.A.1.b) homologues à la sous-unité à flavine FccB d‘Allochromatium
vinosum et d‘autres représentants de la même famille (Figure 73). Ces deux gènes font partie
146
Résultats et discussion
d‘un opéron putatif contenant aussi le gène soxF (ou aq_234) qui n‘a rien à voir avec le
système Sox déjà présenté, mais qui coderait pour une protéine de Rieske-I à centre fersoufre. Il faut noter que les deux protéines DhsU et FccB‘ ont une taille relativement
identique (49 et 47,5 kDa respectivement) et partage une très forte similarité de séquence
(70%), ce qui permet d‘envisager une duplication d‘un gène ancestral (Figure 73).
Une question peut se poser concernant ces deux protéines : si elles correspondent à la
sous-unité à flavine des FCSD, on devrait retrouver la seconde sous-unité de type cytochrome
c dans le même opéron, or ce n‘est pas le cas. Elle n‘est pas non plus retrouvée dans le reste
du génome. On peut alors supposer que les électrons issus de l‘oxydation de l‘H 2S soient
directement transférés à un cytochrome c plus « général ». Une autre hypothèse concerne la
protéine de Rieske codée par aq_234 : les protéines de cette famille étant connues pour jouer
un rôle dans les transferts électroniques, on peut imaginer qu‘elle soit le partenaire de
DhsU/FccB‘, ce qui expliquerait également sa présence au sein de l‘opéron putatif. Une autre
possibilité quant à un rôle possible de DhsU/FccB‘ serait leur implication dans le système Sox
dans lequel on peut parfois retrouver une flavoprotéine monomérique possédant une activité
sulfure déshydrogénase baptisée SoxF. Cette protéine a récemment été proposée comme
« réactivateur » du complexe SoxYZ inactivé avec lequel elle pourrait interagir physiquement
(Bagchi, 2011; Ogawa et al., 2010). On peut ainsi supposer que DhsU et/ou FccB‘ serait en
réalité des composants du système Sox d‘Aquifex aeolicus. Ces protéines (DhsU et FccB‘)
avaient d‘ailleurs été nommées SoxF1 et SoxF2 au cours d‘une étude sur la conservation du
système Sox de la bactérie Chlorobium limicola (Verté et al., 2002).
Enfin, il faut noter que DhsU et FccB‘ sont exprimées puisqu‘elles ont été identifiées au cours
d‘analyses par spectrométrie de masse, lors d‘études réalisées dans l‘équipe sur Aquifex
aeolicus cultivée en présence de soufre élémentaire.
147
Résultats et discussion
A. vinosum
T. marina
Beggiatoa
DhsU
FccB’
---MTLNRRDFIKTSGAAVAAVGILGFPHLAFGAGR-----------KVVVVGGGTGGAT
---MKINRRDFVKVAGAAT-AVGLVGAPHLAFGATQ-----------KVVIVGGGTGGAT
--MSNITRRNFIKIAAGTA-AAGMVSFPFIAYGAKK-----------QVVVVGGGAGGAT
---MGVNRRDVFKLAGLGV-ALGALQLPSIACAAKTSNSLLSPSKGKRIVIVGGGWAGVT
MKSFTVDRRNLLLAGGIG--LLG-------VYVSKS--LVFGETKGNRVVVLGGGYGGVT
: **:.. ..
*
. :
::*::*** .*.*
A. vinosum
T. marina
Beggiatoa
DhsU
FccB’
AAKYIKLADPSIEVTLIEPNTDYYTCYLSNEVIGGDRKLESIKHGYDG-LRAHGIQVVHD
AAKYIKMADSSIDVTVIEPNKEYITCYLSNEVLGGDRAFDTLKVSYDG-LKALGVNVVHD
AAKYIAITDSSIEVTLIEQNPKYHTCFMSNEVLTGERSLDYIQFGYDS-LAKYGINVVHS
AAKYIRKEIPDAEVVLIEQRKMFMSCPISNVWLGGLVDLEFLIHDFLTPAAKYGYTFINA
TAKYVKKLYPDAEVVLVEKNPMFVSCPLSNLYLVGLVPYEQLCYPYNNLVTKYGVNFVND
:***:
.. :*.::* . : :* :** : *
: :
:
* .::
A. vinosum
T. marina
Beggiatoa
DhsU
FccB’
SATGIDPDKKLVKTAGGAEFGYDRCVVAPGIELIYDK----IEGYSEEAAAKLPHAWKAG
TASGIDAEKKVVKTAGGTEFGYDRCIVAPGVQILYDK----VEGYSEEAAQKAPHAWKAG
RVTGIDSVAKKVTTQNGNTFTYERLIVAPGIDFKWEA----IDGYNERIAEKIPHAWLAG
TVTDIDRDKRRVYTEDG-YVEYDYLILAPGIRYNYDAWFNGDKDMARYAQTHYPSAFIPG
EVIGIELDKREVILGNG-RLKYDYLVISLGIEYDYE-----ENPALKEVYWSYPPAFRQG
. .*:
: *
.* . *: ::: *:
::
.
.
* *: *
A. vinosum
T. marina
Beggiatoa
DhsU
FccB’
EQTAILRKQLEDMADGGTVVIAPPAAPFRCPPGPYERASQVAYYLKAHKPKSKVIILDSS
EQTLILRKQLEDMADGGVVVISAPANPFRCPPGPYERASQIAHYFKANKPKSKVIILDSK
NQTTILRDQLHAMKDGGKIIIAVPPKPFRCPPGPYERVSLVAHYLKHHKPKSKILIFDAN
SEHLRLKKKVENFE-EGTFVLVVPPPPHRCPPAPYERAAMIAHVFRQNEAKAKLIILDPK
SEHLYLKRMLEGFE-GESILISVPKMPYRCPSAPYERAALILSYAKKEGLKVHLYFVDEN
.:
*: :. :
.:: * *.***..****.: :
: . * :: :.* .
A. vinosum
T. marina
Beggiatoa
DhsU
FccB’
QTFSKQSQ-FSKGWERLYGFGTENAMIEWHPG-PDSAVVKVDGGEMMVET-AFGDEFKAD
QAFSKQAL-FTQAWERLYGFGTDDSLIEWRPG-PDAAVSLVKVDEMMVET-GFGDEIKAD
QAFSKQGL-FTQGWEKLYGFGTDKSLIEWIPADKDGTVIGIDADNMTVIAGEFEDEHQVD
EKIAPKGPGFRMAYEQLY-----LDIIEYVPN---AKIKEVDPVKKVIKT--TAGDFKFD
ERPPVLTKGFLKAYQDFY-----KDDATYLTS---TKVLEVDPVKKVART--TKGDIKFS
: .
* .:: :*
: .
: :. :
:
.: : .
A. vinosum
T. marina
Beggiatoa
DhsU
FccB’
VINLIPPQRAGKIAQIAGLTN-DAGWCPVDIKTFESSIHKGIHVIGDACIANPMPKSGYS
VINIIPPQRAGEIAQTAGLAD-DSGWCPVEAISFESKLQKGIHVIGDACIAGAMPKSGYA
VINLIPPQKAGKIAFDSGLTN-ESGWCPVNPKSFESTLQKDIHVIGDAAIASPMPKSAYA
DANLNPPHQAADIAWKAGLVNPKTGWCDVDPITLQSKVDKRIFIPGDANSVKGFPKSGDM
MANFIPPMRAPKLLEKAGLLKKGEKWVKVDPMTFETSVKN-VFVIGDS-AFTYLPKSGYA
*: ** :* .:
:** .
* *: ::::.:.: :.: **:
:***.
A. vinosum
T. marina
Beggiatoa
DhsU
FccB’
ANSQGK-VAAAAVVALLK--GEEPGTPSYLNTCYSILAPAYGISVAAIYRPNADGSAIES
ANSQAK-VAAAAVVAMLK--GEEPGTPSYVNTCYSIVGTDYGISVAGVYRMSADGSTIDS
ANSQAK-VCAMAVVAALQ--GIEMGKPSYINTCYSMIGEDYAVSVAAVYRLEGD--KIVS
ANNQTKFMLVKAIKAMIEGKDPLEYVKAPTNTCYSMVNGDPKEAIVINVVYDIDK----AHSQGK-VVAKVIASRLR-KKPWEGELIQQAVCYAMVN--LKQAIMMNVEYKYN-----*:.* * : . .: : :.
.**:::
::
. :
A. vinosum
T. marina
Beggiatoa
DhsU
FccB’
VPDSGGVTPVDAPDWVLEREVQYAYSWYNNIVHDTFG
VEGSGGVTPIDAPDWAHAREVQYAYSWYKNIVKDSFG
VTGAGGLSPMDASAEDRKREVLYAHSWFKNITHDMFG
QKRMPVKKKVNVENERSQRLARATFEWAKAMYRDMFS
LKTKEIKKEIYEDDTWKVSTAKRYIEWARGLWRDMFT
. :
.
.* . : :* *
Figure 73 : Alignement des séquences de DhsU et FccB’ d’Aquifex aeolicus avec des représentant de la
sous-unité à flavine de la famille des FCSD. *, acide aminé strictement conservé ; :, conservation forte ; .,
conservation faible. A. vinosum, Allochromatium vinosum ; T. marina, Thiocapsa marina ; Beggiatoa, Beggiatoa
sp.
148
Résultats et discussion
3. Oxydation du soufre
Il a été proposé chez Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidithiobacillus caldus
l‘implication d‘une hétérodisulfure réductase cytoplasmique, potentiellement liée à la
membrane (HdrABC, contenant des centres fer-soufre et du FAD), dans l‘oxydation du soufre
sous forme persulfure à partir notamment de molécules organiques transportant le soufre
telles que les glutathions (forme GSSH). Cette hypothèse se base sur le fait que les gènes
codant pour ce complexe sont plus exprimés lors d‘une culture en présence de soufre
élémentaire ou de tétrathionate que de fer (ces substrats sont tous utilisés par ces bactéries
comme donneurs d‘électrons) (Mangold et al., 2011; Quatrini et al., 2009).
Chez Aquifex aeolicus, il existe un opéron (de aq_389 à aq_400) semblable à celui
d‘Acidithiobacillus codant pour une (ou plusieurs) hétérodisulfure réductase (un gène hdrA, 3
gènes hdrB et deux gènes hdrC), ainsi que pour des protéines potentiellement impliquées dans
le transfert de soufre (Figure 74 et Table 5).
rdh
A. ferrooxidans
tusA dsrE hdrC1hdrB1 hdrA orf2 hdrC2 hdrB2
dsrE2
A. aeolicus
Figure 74 : Comparaison des opérons codants pour une hétérodisulfure réductase chez Acidithiobacillus
ferrooxidans et Aquifex aeolicus.
Gène
Locus
Protéine
aq_389
aq_390
aq_391
aq_392
aq_394
hdrA
aq_397
hdrC
hdrB
aq_389
aq_390
aq_391
aq_392
aq_394
aq_395
aq_397
aq_398
aq_400
Protéine hypothétique (famille DsrE/F)
Protéine hypothétique (famille DsrE/F)
Hétérodisulfure réductase sous-unité C, HdrC
Hétérodisulfure réductase sous-unité B, HdrB
Hétérodisulfure réductase sous-unité B, HdrB
Hétérodisulfure réductase sous-unité A, HdrA
Protéine hypothétique
Hétérodisulfure réductase sous-unité C, HdrC
Hétérodisulfure réductase sous-unité B, HdrB
Table 5 : Composition de l’opéron Hdr d’Aquifex aeolicus. Les protéines de la famille DsrE/F pourraient être
impliquées dans le transfert de soufre.
149
Résultats et discussion
Sur la base de ce qui a été proposé pour Acidithiobacillus, le complexe HdrABC
pourrait oxyder en sulfite le soufre porté par des molécules de type glutathion (Figure 25).
Ceci est à mettre en relation avec l‘absence chez Aquifex aeolicus et Acidithiobacillus
ferrooxidans du système Dsr (Figure 16) connu pour produire du sulfite à partir de soufre sous
forme persulfure (provenant des globules de soufre). Cependant, cette
réaction
potentiellement catalysée par Hdr n‘est pour l‘instant appuyée par aucune donnée
expérimentale, il conviendra dans un premier temps de démontrer l‘activité portée par ce
complexe afin de donner plus de poids à l‘hypothèse de son implication dans le métabolisme
énergétique du soufre.
4. Oxydation du sulfite
a) Voie de l‘APS
Chez Aquifex aeolicus, du sulfite est produit par la SOR cytoplasmique, et peut-être
par Hdr. Ce sulfite pourrait être consommé par la voie de l‘APS (Figure 13) puisqu‘une ATP
sulfurylase (Sat) capable de produire de l‘ATP et du sulfate à partir d‘APS et de
pyrophosphate a été retrouvée dans le génome de la bactérie. Cette protéine a également été
cristallisée et son activité confirmée au cours d‘études d‘enzymologie (Hanna et al., 2002; Yu
et al., 2007). Cependant, la première étape de cette voie, la production d‘APS à partir de
sulfite et d‘AMP, est habituellement assurée par une APS réductase, absente du génome
d‘Aquifex aeolicus ; cette situation est analogue à celle rencontrée chez Acidithiobacillus, on
peut donc supposer qu‘une autre enzyme non caractérisée puisse remplacer cette APS
réductase, ou qu‘une autre voie soit responsable de l‘oxydation du sulfite.
b) Aq_979
Comme nous l‘avons vu, la voie de l‘APS chez Aquifex aeolicus est incomplète, nous
avons donc cherché à savoir si un autre système d‘oxydation du sulfite pouvait être retrouvé
dans le génome de la bactérie. Nous avons ainsi identifié le gène aq_979 codant pour une
sulfite oxydase putative. L‘analyse de la séquence de cette protéine a révélé plusieurs
informations intéressantes : c‘est une molybdoprotéine de 23,6 kDa, prédite pour résider dans
le cytoplasme et appartenant au groupe 3B suivant la classification des sulfite oxydases
150
Résultats et discussion
proposée par Kappler (Kappler, 2011). En effet, les protéines de ce groupe ne possèdent pas le
motif « twin arginine » nécessaire à leur export dans le périplasme, leur domaine de fixation
du cofacteur à molybdène est raccourci par rapport aux autres familles, et la cystéine
conservée liant le molybdène est incluse dans une séquence DFHCVTxWS caractéristique. A
l‘heure actuelle, aucune sulfite oxydase du groupe 3 n‘a été caractérisée, de futurs études sur
Aq_979 permettront donc une meilleure compréhension de cette famille.
En revanche, la comparaison avec la sulfite : accepteur oxydoréductase périplasmique
SorAB de Starkeya novella (Figure 11) permet d‘aller un peu plus loin. La première chose à
remarquer concerne leur repliement tridimensionnel : lorsque l‘on superpose la structure
modélisée de Aq_979 sur celle obtenue par cristallographie de SorAB, on s‘aperçoit que
Aq_979 présente un repliement similaire à celui du domaine N-terminal de SorA (Figure 75),
ce qui permet de suggérer une similarité de fonction entre les deux protéines. Lors de son
cycle catalytique, SorA oxyde le sulfite en sulfate grâce à son cofacteur à molybdène,
transmet les électrons à l‘hème c de la sous-unité SorB avec laquelle elle est en complexe, et
cette dernière va finalement les transférer à un cytochrome c. L‘analyse du contexte génétique
de aq_979 montre que la sous-unité de type cytochrome c est absente, et elle n‘est pas non
plus retrouvée ailleurs dans le génome. Ceci n‘est finalement pas surprenant puisque Aq_979
est prédite pour être cytoplasmique, et qu‘aucun cytochrome c n‘est retrouvé dans le
cytoplasme de la bactérie ; on ne connait donc pas la nature de l‘accepteur d‘électrons de ce
système.
151
Résultats et discussion
Figure 75 : Alignement des structures de SorAB de Starkeya novella et de Aq_979 d’Aquifex aeolicus. SorA
est représentée en gris, SorB en bleu, Aq_979 en jaune, le cofacteur à molybdène de SorA est en violet et l‘hème
de type c de SorB est en rouge.
Nous avons tenté de détecter une activité sulfite oxydase à partir de fractions solubles
et membranaires d‘Aquifex aeolicus. Une première approche a consisté à suivre par
spectrophotométrie la réduction du ferricyanure (accepteur artificiel d‘électrons) en présence
de sulfite, mais la haute température nécessaire à l‘activité des protéines d‘Aquifex aeolicus
entraine également une réduction chimique importante du ferricyanure, masquant ainsi une
éventuelle activité. Une seconde approche reposait sur la détection sur gel natif de cette
activité. Cette fois, c‘était la production de sulfate qui était suivie : celui-ci forme un précipité
blanc en présence de chlorure de baryum, une bande blanche sur le gel aurait indiqué la
présence d‘une protéine oxydant le sulfite en sulfate. Cependant, si on ne se trouve pas en
condition très acide, le sulfite également précipite avec le chlorure de baryum ; cette condition
de pH est incompatible avec les conditions requises par l‘enzyme pour fonctionner
correctement. Ces contraintes techniques nous ont donc empêchés de détecter l‘activité sulfite
oxydase, mais d‘autres protocoles sont à tester, et ceci reste une piste intéressante à exploiter.
152
Résultats et discussion
B) Construction d’un modèle du métabolisme énergétique du
soufre chez Aquifex aeolicus
A la suite de ces études in silico associées à certaines données expérimentales, nous
avons été en mesure de proposer de nouveaux partenaires que nous avons intégrés à un
nouveau modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus (Figure 76).
L‘H2S pourrait ainsi être oxydé par deux systèmes différents, la SQR d‘une part et les sulfure
déshydrogénases DhsU et FccB‘ d‘autre part. Deux systèmes d‘alimentation peuvent être
proposés pour ces enzymes : l‘H2S en provenance du milieu bien sûr, mais aussi celui produit
par la soufre réductase et par la SOR à partir de chaînes de soufre, lesquelles sont les produits
de la SQR et des sulfure déshydrogénases. Ces enzymes constitueraient ainsi un cycle de
recyclage du soufre performant permettant d‘optimiser sa capacité énergétique, couplé à la
fois au métabolisme de l‘hydrogène (supercomplexe hydrogénase / soufre réductase) et à celui
de l‘oxygène (supercomplexe SQR / complexe bc1 / cytochrome c oxydase).
Mais notre étude a également permis de proposer des voies supplémentaires qui
n‘avaient pas encore été envisagées. La présence d‘un système Sox comportant les éléments
essentiels à l‘oxydation du thiosulfate en sulfate est d‘une importance capitale, puisqu‘il
permet d‘expliquer par quel moyen le thiosulfate du milieu de culture est utilisé par la
bactérie. On ne peut pas non plus exclure une utilisation par Sox du thiosulfate indirectement
produit par la SOR. Classiquement, les électrons produits par l‘oxydation du thiosulfate sont
transférés à un cytochrome c, lequel peut ensuite être pris en charge par la cytochrome c
oxydase. Ceci met en lumière un nouveau couplage entre le métabolisme du soufre (en
l‘occurrence, du thiosulfate) et le métabolisme de l‘oxygène chez Aquifex aeolicus.
Enfin, on peut proposer une dernière voie basée sur l‘oxydation du soufre (sous forme
persulfure) en sulfite par l‘hétérodisulfure réductase. Ceci rappelle de façon claire le système
Dsr des bactéries phototrophes sulfureuses, qui utilise également du soufre sous forme
persulfure, issu des globules de soufre, pour donner du sulfite. On peut émettre l‘hypothèse
que l‘hétérodisulfure réductase d‘Aquifex aeolicus pourrait assumer le même rôle que le
système Dsr, et qu‘elle serait ainsi responsable de la dégradation des globules de soufre
cytoplasmiques de la bactérie. Le sulfite produit par ce complexe ainsi que par la SOR, serait
finalement oxydé en sulfate via la voie directe impliquant une sulfite oxydase cytoplasmique,
Aq_979, ou via la voie indirecte de l‘APS matérialisée par une protéine non caractérisée
assumant le rôle de l‘APS réductase et par l‘ATP sulfurylase.
153
Résultats et discussion
Figure 76 : Modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus. Les notions de recyclage
des composés soufrés, ainsi que les nouvelles voies proposées sont intégrées dans ce modèle essentiellement
décrit dans le texte principal. Le soufre élémentaire est internalisé sous une forme inconnue notée S* par des
transporteurs également inconnus.
154
Article 2 (revue)
The Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus:
From Respiratory Pathways to Extremely Resistant
Enzymes and Biotechnological Applications.
Guiral Marianne, Prunetti Laurence, Aussignargues Clément,
Ciaccafava Alexandre, Infossi Pascale, Ilbert Marianne, Lojou
Elisabeth, Giudici-Orticoni Marie-Thérèse.
Advances in Microbial Physiology (2012) 61:125-94
CHAPTER FOUR
The Hyperthermophilic Bacterium
Aquifex aeolicus: From Respiratory
Pathways to Extremely Resistant
Enzymes and Biotechnological
Applications
Marianne Guiral1, Laurence Prunetti2, Clément Aussignargues,
Alexandre Ciaccafava, Pascale Infossi, Marianne Ilbert,
Elisabeth Lojou, Marie-Thérèse Giudici-Orticoni
Unité de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines, UMR7281-FR3479, CNRS, Aix-Marseille Université,
Marseille, France
1
Corresponding author: e-mail address: [email protected]
2
Present address: Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, Gainesville, Florida,
USA.
Contents
1. The Extreme Heat-Loving Bacterium Aquifex aeolicus
1.1 The Aquificales
1.2 Aquifex aeolicus
2. Hydrogenases and Hydrogen Metabolism in Aquifex aeolicus
2.1 Possible involvement of hydrogenase III in carbon assimilation pathway
2.2 Focus on the super-resistant hydrogenase I
2.3 The hydrogen–oxygen bioenergetic pathway
3. Hydrogen Sulfide Utilization Pathway
3.1 Sulfide-dependent electron transport
3.2 The highly active and thermostable Sqr from A. aeolicus
3.3 The new sulfide-oxidase and oxygen-reductase supercomplex of A. aeolicus
3.4 Putative A. aeolicus enzymes involved in sulfide oxidation
4. Elemental Sulfur and Oxidized Sulfur Compounds Energy Metabolism
4.1 Many enzymes. . .
4.2 . . .many possibilities
5. A Model of Intricate Bioenergetic Pathways in Aquifex aeolicus
6. Concluding Remarks
Acknowledgments
References
Advances in Microbial Physiology, Volume 61
ISSN 0065-2911
http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-394423-8.00004-4
#
2012 Elsevier Ltd.
All rights reserved.
127
127
129
134
137
140
149
153
153
154
160
164
169
169
176
181
183
184
184
125
126
Marianne Guiral et al.
Abstract
Aquifex aeolicus isolated from a shallow submarine hydrothermal system belongs to the
order Aquificales which constitute an important component of the microbial communities
at elevated temperatures. This hyperthermophilic chemolithoautotrophic bacterium,
which utilizes molecular hydrogen, molecular oxygen, and inorganic sulfur compounds
to flourish, uses the reductive TCA cycle for CO2 fixation. In this review, the intricate energy
metabolism of A. aeolicus is described. As the chemistry of sulfur is complex and multiple
sulfur species can be generated, A. aeolicus possesses a multitude of different enzymes
related to the energy sulfur metabolism. It contains also membrane-embedded [NiFe] hydrogenases as well as oxidases enzymes involved in hydrogen and oxygen utilization. We
have focused on some of these proteins that have been extensively studied and characterized as super-resistant enzymes with outstanding properties. We discuss the potential
use of hydrogenases in an attractive H2/O2 biofuel cell in replacement of chemical catalysts. Using complete genomic sequence and biochemical data, we present here a global
view of the energy-generating mechanisms of A. aeolicus including sulfur compounds
reduction and oxidation pathways as well as hydrogen and oxygen utilization.
ABBREVIATIONS
A. aeolicus Aquifex aeolicus
APS adenylylsulfate
ATP adenosine-50 -triphosphate
DET direct electron transfer
D. gigas Desulfovibrio gigas
Df Desulfovibrio fructosovorans
DMK demethylmenaquinone
EPR electron paramagnetic resonance
FAD flavin adenine dinucleotide
FCC flavocytochrome c sulfide dehydrogenase
GSH glutathione
Hdr heterodisulfide reductase
LPS lipopolysaccharide
MET mediated electron transfer
MGD molybdopterin guanine dinucleotide
NADH nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form
NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form
Psr polysulfide reductase
R. eutropha Ralstonia eutropha
rRNA ribosomal ribonucleic acid
rTCA reductive tricarboxylic acid cycle
SDS sodium dodecyl sulfate
SOR sulfur oxygenase reductase
SPR surface plasmon resonance
Sqr sulfide:quinone reductase
SR sulfur reductase
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
127
During the past 30 years, numerous microbial species belonging to the Archaea
or the Bacteria were isolated from hydrothermal springs. The biodiversity of microorganisms thriving in these environments is broad, with the thermophilic
and hyperthermophilic chemolithoautotrophic bacteria playing a predominant
role in the biogeochemical cycles of carbon, sulfur, and nitrogen. These bacterial communities use carbon from CO2 and energy from the oxidation of
minerals. Members of the phylum Aquificae are ubiquitous and particularly profuse in the marine or terrestrial hydrothermal systems.
Aquifex aeolicus, which is the focus of this review, possesses outstanding
features as it develops at extremely high temperatures using simple nutrients
which are exclusively gases and mineral compounds. The exceptional adaptation and metabolic capabilities as well as enzyme properties make of
A. aeolicus an organism of choice for respiratory pathway and protein studies
and biotechnological development.
1. THE EXTREME HEAT-LOVING BACTERIUM AQUIFEX
AEOLICUS
1.1. The Aquificales
A. aeolicus belongs to the order Aquificales of bacteria containing thermophilic
members. They flourish in shallow or deep-sea marine habitats and terrestrial
hydrothermal environments but also have been isolated from hot composts or
deep gold mines (Bonch-Osmolovskaya, 2008; Reysenbach et al., 2005).
These bacteria, which constitute an important component of the microbial
communities at elevated temperatures, were observed throughout the world
over decades (Reysenbach et al., 2005); however, this order was created
only at the beginning of the 1990s (Pitulle et al., 1994; Reysenbach, 2001;
Reysenbach, Wickham, & Pace, 1994). Hydrogenobacter thermophilus was
the first species to be described (Kawasumi, Igarashi, Kodama, & Minoda,
1984). Besides the unclassified Aquificales, the order consists to date of three
families Aquificaceae, Desulfurobacteriaceae, and Hydrogenothermaceae
(Bonch-Osmolovskaya, 2008; Eder & Huber, 2002; L’Haridon et al., 2006;
Reysenbach, 2001). Aquifex pyrophilus (Huber et al., 1992) and A. aeolicus
(Deckert et al., 1998) belong to the genus Aquifex which is listed in the
Aquificaceae family together with Hydrogenivirga, Hydrogenobacter,
Hydrogenobaculum, and Thermocrinis. A. aeolicus is unquestionably the model
organism not only of the Aquifex genus but also of the Aquificaceae family
and the order Aquificales.
128
Marianne Guiral et al.
Bacteria
Spirochetes
Proteobacteria
Cyanobacteria
Planctomyces
Bacteroides
Cytophaga
Archaea
Eucarya
Green
Myxomycota
Filamentous
Animalia
Entamoebae
bacteria
Fungi
Gram
Methanosarcina
positives
Methanobacterium
Halophiles
Plantae
Methanococcus
Ciliates
T. celer
Thermoproteus
Pyrodicticum
Flagellates
Trichomonads
Microsporidia
Thermotoga
Diplomonads
Aquifex
Figure 4.1 Phylogenetic Tree of Life, based on 16S RNA sequences, showing the position
of Aquifex in the deepest known branch within the domain Bacteria (from NASA Astrobiology Institute, http://nai.arc.nasa.gov/news_stories/news_detail.cfm?ID¼274).
Based on 16S RNA gene sequences, the Aquificales represent the deepest
known branch within the domain Bacteria of the Universal Phylogenetic
Tree of Life (Burggraf, Olsen, Stetter, & Woese, 1992; Eder & Huber,
2002) (Fig. 4.1). Although most of the studies locate these bacteria close to
the Thermotogales, the phylogenetic position of the Aquificales is debated and
another view places them close to the epsilon-proteobacteria and proposes
a late divergence of this order based on the sequence analysis of various
proteins (Griffiths & Gupta, 2004). The difficulty to obtain a clear picture
of the Aquificales phylogeny is due to many horizontal gene transfers
undergone by the lineage (Boussau, Guéguen, & Gouy, 2008; Coenye &
Vandamme, 2004). The complete or incomplete genomic sequences of 10
members of the Aquificales (belonging to the three known families) are
currently available through National Center for Biotechnology Information
(Reysenbach et al., 2009). Two genome shotgun sequencing projects are
also usable. These genomic sequences will probably give the opportunity
to address the problem of evolution of these organisms.
The Aquificales are the bacteria known to grow at the highest temperatures
(with the Thermotogales). Indeed, they are thermophilic or hyperthermophilic
describing an optimal growth between 60 and 90 C. Most of them are gram
negative, nonsporulating, motile bacteria. They grow usually at neutral
or slightly acidic pH. Aquificales are mostly metabolically versatile
chemolithoautotrophs using the reductive tricarboxylic acid (rTCA) cycle
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
129
for CO2 fixation (Hügler, Huber, Molyneaux, Vetriani, & Sievert, 2007). Indeed, at high temperatures, microorganisms use CO2 assimilation pathways
other than the Calvin–Benson–Bassham cycle which is well known from cyanobacteria, plants, and a variety of proteobacteria (Hügler et al., 2007). The
rTCA cycle has been proposed as a likely candidate for the earliest autotrophic
pathway that evolved on Earth (Smith & Morowitz, 2004). Some species are
able to grow chemoorganoheterotrophically on formamide, formate, or acetate. Aquificales oxidize molecular hydrogen, elemental sulfur, or thiosulfate
as energy substrates (sulfide or ferrous iron can also be used). Members of
the two families Aquificaceae and Hydrogenothermaceae are aerobic (microaerophilic), while those affiliated to the third family Desulfurobacteriaceae are
strictly anaerobes using nitrate, elemental sulfur, thiosulfate, or sulfite as electron
acceptors (Bonch-Osmolovskaya, 2008; Miroshnichenko & BonchOsmolovskaya, 2006; Reysenbach et al., 2005) (Table 4.1).
1.2. Aquifex aeolicus
A. aeolicus was isolated by Huber and Stetter from a shallow submarine
hydrothermal system at Vulcano in Italy (Huber & Stetter, 2001a, 2001b). As
mentioned above, A. aeolicus is so far the best-known bacterium belonging to
Aquificales, probably because it was among the first to be characterized and
the first whose genome was completely sequenced (Deckert et al., 1998).
1.2.1 Genome features
A. aeolicus was the first hyperthermophilic bacterium to have its genome
sequence completely determined (Deckert et al., 1998; Swanson, 2001).
This genome, which is only one-third the size of the Escherichia coli
genome, has a length of 1.55 million bp (Deckert et al., 1998). One
thousand five hundred and twelve open-reading frames were detected.
Another striking feature is the organizational relationship of the genes
relative to one another. Most genes appear to be expressed in polycistronic
operons, with an unexpected composition, and many convergently
transcribed overlap slightly. An extrachromosomal element containing
39,456 bp is present at twice the copy number of the chromosome.
1.2.2 Morphology and motility
Cells of A. aeolicus are gram negative rods with rounded ends. They are
2–6 mm long and 0.4–0.5 in diameter. Their cell envelope is thus composed
of an outer and an inner membrane (Fig. 4.2). The complex cell wall consists
at least of a peptidoglycan layer, which contains diaminopimelic acid typical
Table 4.1 Some physiological features of marine species within the order Aquificales
T ( C)
pH
Electron
Electron
(min–opt–max)
range donor
acceptor Products
References
Family Aquificaceae
Aquifex aeolicus
58–95
5.5–8
H2, S0, S2 O3 2 O2, S0
H2O, SO4 2 , H2S
Deckert et al. (1998), Huber
and Eder (2006), Guiral,
Tron, et al. (2005)
Aquifex pyrophilus
67–85–95
5.4–
7.5
H2, S0, S2 O3 2 O2,
NO3 H2O, SO4 2 , N2
Huber et al. (1992)
Hydrogenivirga
caldilitoris
55–75–77.5
5–7
H2, S0
O2,
NO3 H2O, SO4 2 , N2O
Nakagawa et al. (2004)
O2
H2O
Stohr, Waberski, Völker,
Tindall, and Thomm (2001)
Family Hydrogenothermaceae
Hydrogenothermus
marinus
45–65–80
5–7
H2
Persephonella
marina
55–73–80
4.7–
7.5
H2, S0, S2 O3 2 O2,
NO3 ,
S0
H2O, SO4 2 , N2, H2S Götz et al. (2002)
Family Desulfurobacteriaceae
Thermovibrio ruber
50–75–80
5–6.5
H2
NO3 ,
S0
NH4 þ , H2S
Huber, Diller, Horn, and
Rachel (2002)
Balnearium
lithotrophicum
45-70-80
5–7
H2
S0
H2S
Takai, Nakagawa, Sako, and
Horikoshi (2003)
Based on Bonch-Osmolovskaya (2008).
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
131
Figure 4.2 Transmission electron micrographs of A. aeolicus cultured with thiosulfate,
hydrogen, and oxygen. Arrows indicate unidentified structures resembling stacks of
membrane. Cells were prepared as described in Guiral, Tron, et al. (2005).
for gram negative bacteria (Huber et al., 1998) and the outer membrane.
A well-ordered regular surface layer, composed of hexagonal protein complexes, was identified in A. pyrophilus (Huber et al., 1992). The composition
of the A. aeolicus lipopolysaccharide (LPS) associated with the outer leaflet of
the outer membrane has been determined and is different from the one of
A. pyrophilus. However, lipid A, anchoring the LPS molecule to the outer
membrane and found to be structurally novel, is identical for both bacteria
(Mamat et al., 2009; Plötz, Lindner, Stetter, & Holst, 2000). The protein
Aq_1862 from A. aeolicus was identified as the major porin of the outer
membrane (Wedemeyer, Peng, Michel, & Hartung, 2007). Unidentified
structures resembling stacks of membrane are clearly visible in the
cytoplasmic compartments (Fig. 4.2). Such structures of unknown
composition and function were reported also for other Aquificales and
might be internal membranes used to align enzymes for complex metabolic
reaction (Aguiar, Beveridge, & Reysenbach, 2004).
In line with the presence of more than 25 genes coding for proteins involved in biosynthesis and structure of flagelles, A. aeolicus cells are highly
motile because they possess monopolar polytrichous flagella (Behammer
et al., 1995; Deckert et al., 1998). Recently, it was shown that the
motility of A. aeolicus in a liquid medium depends on the sulfur source
supplied (the soluble thiosulfate or the insoluble elemental sulfur). In the
presence of elemental sulfur, Aquifex is able to adhere to the substrate and
this sulfur-dependent bacterial adherence seems to be linked to an
absence of flagellin (Giuliani, Jourlin-Castelli, Leroy, Hachani, &
Giudici-Orticoni, 2010).
132
Marianne Guiral et al.
1.2.3 Adaptation at high temperatures
The highest temperatures for growth is found among archaeal microorganisms, with Geogemma barossii (also known as strain 121) which can develop at
121 C (Kashefi & Lovley, 2003) or Pyrolobus fumarii growing at 113 C
(Blöchl et al., 1997). Life at high temperatures needs an adaptation of microorganisms to these drastic conditions. Some of the cell components, that are
proteins, nucleic acids, or lipids, can possess particular properties compared
to their mesophilic counterparts. In A. aeolicus, only a few specific indications of thermophily are apparent from the genome (Deckert et al.,
1998). The rRNA operons of this bacterium have a relatively high content
of G þ C (65%), a characteristic of thermophilic bacterial rRNA. The thermostability of DNA is probably increased by the reverse gyrase, a DNA
topoisomerase present only in hyperthermophilic organisms and which is
encoded by two genes in the A. aeolicus genome. This enzyme has the
unique property of introducing positive superturns into a covalently closed,
circular DNA in the presence of ATP that could prevent excess local unwinding of the double helix at high temperature (Forterre, 2002).
In general, primary sequences or three-dimensional structures of proteins
from thermophilic or hyperthermophilic bacteria do not drastically differ
from those of mesophiles (Matsui & Harata, 2007). However, these proteins
usually exhibit an extraordinary stability; the three-dimensional structure of
numerous proteins from A. aeolicus has thus been solved. Several factors responsible for the extreme thermostability of proteins have been proposed
including an increase in the number of ion pairs and hydrogen bonds, core
hydrophobicity, and packing density, as well as an entropic effect due to relatively shorter surface loops and peptide chains (Ferrera & Reysenbach,
2007; Vieille & Zeikus, 2001). The soluble monoheme cytochrome c555
was found to be hyperstable. An extra helix should mainly contribute to
this high stability and is presumed to be a novel strategy of cytochromes c
for adaptation to a hyperthermophilic environment (Obuchi et al., 2009).
Proteins from Aquifex can also be stabilized by the presence of disulfide
bonds. It is the case for the serine protease of A. pyrophilus which contains
eight cysteines (Choi, Bang, Kim, & Yu, 1999), for several ferredoxins
(Infossi P. & Giudici-Orticoni M.T., unpublished results; Meyer et al.,
2002) and for Aq_1599 (renamed RhdB2) identified as a rhodanese
(Giuliani et al., 2010). Protein oligomerization might also be a strategy to
cope with elevated temperatures (Vieille & Zeikus, 2001). As subunits’
association provides extra stabilization, some thermophilic proteins have a
higher degree of oligomerization compared to their homologs in organisms
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
133
growing at lower temperatures. In A. aeolicus, a cytoplasmic rhodanese
enzyme (Aq_477 or SbdP) involved in sulfur transfer exists in equilibrium
between monomers, dimers, and tetramers. The tetrameric form has been
demonstrated to be crucial for thermostability as well as for enzyme activity
(Giuliani et al., 2007). The membrane-bound sulfide-quinone reductase,
described to be a dimeric protein, was proposed to be trimeric in
A. aeolicus (Marcia, Ermler, Peng, & Michel, 2009; Prunetti et al., 2010).
As for other hyperthermophiles, it seems that there is not one single
dominating factor but more a combination of many factors, each
contributing to various extents for stabilization according to the protein.
Regarding the membranes, modifications of the constituting lipids allow
a greater stability for the thermophiles. One important feature is the nature
of the binding between the glycerol and the fatty acid of the phospholipid.
The more stable binding (ether) is found in the phospholipids of the
hyperthermophilic bacteria A. aeolicus and Thermotoga maritima as well as
in the archaeal lipids, while the ester binding is typical of the other bacteria
and eucaryotes. The lipids of Aquifex are mainly composed of alkyl glycerol
di- and monoethers (Ferrera & Reysenbach, 2007; Huber & Stetter, 2001a;
Jahnke et al., 2001).
1.2.4 Physiological characteristics and metabolic properties
A. aeolicus (as A. pyrophilus) grows up to 95 C, the highest growth temperature observed within bacteria (Huber & Stetter, 2001a; Stetter, 2006)
(Table 4.1). The salt concentration optimally required is 3% (w/v) NaCl
consistent with the fact that it is a marine bacterium. The preferred pH
for growth comprises between 6.5 and 7.0.
As an autotroph, A. aeolicus assimilates CO2 from the environment via
the rTCA cycle (Hügler et al., 2007). This cycle is vital as it provides the
substrates for many biosynthetic pathways. Three molecules of CO2 are
fixed forming acetyl coenzyme A and subsequently pyruvate, precursor of
all other central metabolites. The central role of this pathway is emphasized
by the duplication of many of its constituent genes in this bacterium
(Deckert et al., 1998). For example, A. aeolicus has two sets of gene clusters
that encode putative multisubunits enzyme pyruvate:ferredoxin
oxidoreductase (Ikeda et al., 2006). The bacterium must synthesize pentose
and hexose monosaccharides from products of the rTCA cycle (Deckert
et al., 1998). A. aeolicus genome contains genes encoding proteins from
metabolic pathways as glycolysis, gluconeogenesis, pentose-phosphate,
and glycogen synthesis.
134
Marianne Guiral et al.
A. aeolicus grows chemolithotrophically in the presence of hydrogen,
oxygen, and sulfur compounds (thiosulfate or elemental sulfur). Aquifex
means “water-maker,” and as in most Aquificales, this bacterium oxidizes hydrogen with oxygen to produce water according to the “Knallgas” reaction:
2H2 þ O2 ! 2H2O . It is described as a microaerophilic microorganism
(Deckert et al., 1998); however, its actual oxygen requirement is unknown.
In the absence of hydrogen, the majority of Aquificales gain energy from
thiosulfate or elemental sulfur as sole electron donors which are oxidized
to sulfuric acid (in the presence of oxygen). A. aeolicus, as Hydrogenothermus
marinus and Hydrogenobaculum acidophilum, requires thiosulfate or elemental
sulfur in addition to hydrogen and oxygen for growth (Eder & Huber, 2002;
Huber & Stetter, 2001b). Aquifex species, like Thermocrinis, can also produce
hydrogen sulfide when grown with hydrogen, oxygen, and elemental sulfur
(Guiral, Tron, et al., 2005). Unlike A. pyrophilus, A. aeolicus does not
perform nitrate respiration and cannot grow anaerobically on nitrogen.
A. aeolicus does not grow on organic substrates including sugars, amino
acids, yeast, or meat extracts (Deckert et al., 1998) (Table 4.1).
2. HYDROGENASES AND HYDROGEN METABOLISM IN
AQUIFEX AEOLICUS
Molecular hydrogen is an obligate energy substrate for growth for
A. aeolicus. Consistent with this requirement, this bacterium possesses various hydrogenases (Fig. 4.3) playing a key role in hydrogen utilization.
Hydrogenases, isolated from prokaryotes and eukaryotes, catalyze either
the hydrogen uptake or the hydrogen evolution depending on the metabolic
requirements of the parent organism, according to the simple redox reaction
H2 $ 2Hþ þ 2e. Hydrogenases are multisubunit metalloenzymes containing iron–sulfur clusters and a dinuclear metallic center which is a Ni
and a Fe in the [NiFe] hydrogenases and two Fe in the [FeFe] hydrogenases
(Vignais, Billoud, & Meyer, 2001). A. aeolicus houses three distinct [NiFe]
hydrogenases, referred to hydrogenases I, II, and III in keeping with the annotated names mbhSL1, mbhSL2, and mbhSL3 (Brugna-Guiral et al., 2003;
Deckert et al., 1998). These hydrogenases are expressed under standard
growth conditions (in the presence of hydrogen, oxygen, and thiosulfate).
Two are membrane bound in the periplasm and involved in energy
generation, and one is soluble in the cytoplasm and likely involved in the
CO2 fixation (Brugna-Guiral et al., 2003; Guiral, Aubert, & GiudiciOrticoni, 2005). Structural genes of both membrane-bound enzymes are
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
135
Periplasm
Quinone
o
H
CH3
o
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Cytoplasm
Figure 4.3 Representation of an assembly of A. aeolicus hydrogenase I large and small
subunits (depicted in red and black, respectively) and A. aeolicus b-type cytochrome
(depicted in gray) generated with The PyMOL Molecular Graphics System, Version
1.3, Schrödinger, LLC. The model was constructed by using Ralstonia eutropha
membrane-bound hydrogenase as a template (PDB entry: 3RGW). The b-type cytochrome of A. aeolicus linked to hydrogenase by a transmembrane helix was modeled
on the b-type cytochrome of formate dehydrogenase N from E. coli (PDB entry: 1KQF).
included in operons together with accessory genes for maturation and
insertion of metals and ligands, whereas in the operon coding for the
soluble hydrogenase III, only genes coding for the two structural subunits
are found (Fig. 4.4). The operon encoding A. aeolicus hydrogenase
I contains a gene encoding a transmembrane b-type cytochrome (called
136
Marianne Guiral et al.
Hydrogenase I
mbhS1
mbhL1 hoxZ hupEhupD
X
X
hypB
hypF
Hydrogenase II
mbhL2
hdrD aq_963 mbhS2
Hydrogenase III
mbhS3 mbhL3
Figure 4.4 Organization of the hydrogenases genes operons in A. aeolicus. mbhL and
mbhS encode large and small hydrogenase subunits, respectively. For hydrogenase I,
hoxZ gene encodes cytochrome bI, the ones annotated X correspond to aq_668 and
aq_669 encoding putative proteins and other genes encode proteins involved in hydrogenase maturation. For hydrogenase II, aq_963 encodes cytochrome bII and hdrD
encodes an iron–sulfur protein with homology to a subunit of heterodisulfide reductase.
cytochrome bI) in the typical order of genes (small subunit, large subunit,
cytochrome). Hydrogenase II is encoded by an operon describing an
unusual organization. The two genes for the small and large subunits are
separated by two additional genes which likely code for an uncharacterized
iron–sulfur protein and a membrane-integral b-type cytochrome called
cytochrome bII (Baymann, Lebrun, et al., 2003; Brugna-Guiral et al., 2003;
Guiral, Aubert, et al., 2005). This gene organization has also been
described in the mesophilic purple sulfur bacteria Thiocapsa roseopersicina
(Palágyi-Mészáros et al., 2009; Rakhely, Colbeau, Garin, Vignais, &
Kovacs, 1998) in Allochromatium vinosum (Dahl et al., 1999), and in the
hyperthermophilic sulfur-dependent archaeon Acidianus ambivalens (Laska,
Lottspeich, & Kletzin, 2003). The diheme cytochrome bI acts as membrane
anchor for hydrogenase. Cytochrome bII most probably plays an analogous
role although being not evolutionary linked (Baymann, Lebrun, et al.,
2003). Phylogenetic analysis indicates that hydrogenase I and hydrogenase
II clearly fall into group 1 of the [NiFe] hydrogenases as defined by Vignais
et al. (2001). This group contains dimeric membrane-bound enzymes
transferring electrons from hydrogen to cytochrome b with transmembrane
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
137
proton translocation. In contrast, the phylogenetic position of hydrogenase III
is more ambiguous as the phylogram of the small subunit clusters with sensory
and cyanobacterial uptake hydrogenase (group 3) but the large subunit is
separated from all major groups of [NiFe] hydrogenases. Two of the three
A. aeolicus hydrogenases, that is, the membrane-bound hydrogenase I and
the soluble hydrogenase III, were purified to homogeneity and
characterized, whereas hydrogenase II was never isolated but identified in a
complex (see Section 4.1.1) (Brugna-Guiral et al., 2003; Guiral, Aubert,
et al., 2005; Guiral, Tron, et al., 2005).
The understanding of the structural features that drive the enzymatic function under extreme T , but also the ability to obtain biocatalysts for biotechnological devices, has encouraged increasing research in hydrogenase field
during the last years. Indeed, hydrogenases are considered since more than
10 years as potential candidates as biocatalysts for hydrogen production
(Friedrich, Fritsch, & Lenz, 2011) or in H2/O2 biofuel cells (Lojou, 2011).
On one hand, photosynthetic production of hydrogen only from water
and sun light is regarded as a friendly alternative to fossil fuel use. On the other
hand, H2/O2 fuel cells using biocatalysts instead of noble metal catalysts are
another way to produce greenhouse gas-free electricity. The major drawback
that has slowed down the applications, but has also increased the research,
relies on the strong inhibition of most hydrogenases to oxygen (Vincent
et al., 2005). This characteristic a priori precluded the use of these enzymes
in photosynthetic systems for hydrogen production, or as a bioanode in a biofuel cell with oxygen as the oxidant in the cathodic compartment. With this
challenging bottle necks in mind, the characterization and then resistance
properties of hydrogenases I and III against temperature, but also inhibitors
such as oxygen and carbon monoxide, have been extensively studied in the
last few years in the double objective to understand the molecular basis of their
resistances and to evaluate their potentialities as biocatalysts.
2.1. Possible involvement of hydrogenase III in carbon
assimilation pathway
Hydrogenase III was purified from soluble extract and first characterized by
SDS-PAGE (Brugna-Guiral et al., 2003). Two bands at 30 and 50 kDa were
assigned to the small and large subunits, respectively. The structure of hydrogenase III is still unsolved. But by analogy to the “standard” hydrogenases
(the most studied are the oxygen-sensitive [NiFe] hydrogenases from
Desulfovibrio or Allochromatium species (Dementin et al., 2011; Lamle,
Albracht, & Armstrong, 2005), the small subunit harbors FeS clusters,
138
Marianne Guiral et al.
acting as a conductive line to drive the electron from the active site to
the surface of the enzyme, while the [NiFe] active center is buried inside
the large subunit (Fig. 4.3). It was shown by EPR that the [NiFe] center,
the distal, and intermediary FeS clusters were similar to that of other
bacterial [NiFe] hydrogenases. By contrast, two adjacent cysteines were
identified near the proximal FeS cluster. Exact role of this structural
feature has not been elucidated, yet. The enzymatic activity of
hydrogenase III was followed using spectrophotometry. Low redox
potential mediators, such as methyl viologen, were found to be suitable
electron acceptor/donor for hydrogen oxidation and proton reduction by
hydrogenase III. This is in accordance with the finding that hydrogenase
III can reduce two low-potential ferredoxins from A. aeolicus (Infossi &
Giudici-Orticoni, unpublished results). The redox potentials of these
ferredoxins were determined by electrochemistry to be in the range
440/460 mV suggesting that the potentials of the clusters in
hydrogenase III might also be quite negative. Spectrophotometric
measurements with methyl viologen as an electron acceptor yielded an
activity of 100 U mg 1 at 80 C for hydrogen oxidation. Hydrogenase III
was active in a large range of temperature between 20 and 90 C. It was
shown to be thermostable since no loss in activity can be observed during
4 h at 80 C. Electrochemistry was handled to measure the activity of
hydrogenase III. By this method, the enzyme was adsorbed on the surface
of a graphite electrode which played the role of the electron acceptor/
donor. No redox mediator was added since the enzyme could exchange
electrons directly with the electrode. The enzymatic activity of the enzyme
under either hydrogen or N2 was measured as a current, whose intensity is
a measure of the enzymatic efficiency. Electrochemical measurements
confirmed the ability of hydrogenase III to equally oxidize hydrogen or
reduce Hþ on a large range of temperature.
Hydrogenase III was found to exhibit CO and oxygen resistances.
Indeed, CO addition had no effect on the electrochemical signal for hydrogen oxidation by adsorbed hydrogenase III onto a graphite electrode
(Lojou, Giudici-Orticoni, & Bianco, 2005). In strong contrast with the
standard oxygen-sensitive hydrogenases, hydrogenase III was also found
to be active at least during 2 h of exposure to 20% oxygen at 0 C.
EPR studies revealed that oxidized hydrogenase III was entirely in a form
known as Ni-B, which corresponds to a Ni state quickly activated upon
reduction, a feature shared by other hydrogenases which are oxygen resistant, such as hydrogenase from Ralstonia eutropha (Cracknell, Wait, Lenz,
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
139
Friedrich, & Armstrong, 2009). Conversely, oxygen-sensitive hydrogenases exist under both Ni-B and Ni-A states, the latter being hardly
reactivated. The molecular basis for oxygen resistance is still under investigation. However, phylogenetic analysis has allowed putting forward one
potential explanation. Hydrogenase III clusters in the phylogram together
with sensory hydrogenases (although hydrogenase III cannot be considered
as a hydrogen sensor due to its abundance in the cell and activity, see below).
These hydrogenases have been identified in several other microorganisms
(R. eutropha, Rhodobacter capsulatus, etc.) and are proved to be oxygen insensitive compared to the highly active but oxygen-inhibited hydrogenases from
the Desulfovibrio species. It was demonstrated that oxygen resistance could be
understood in these hydrogen sensors by taking into account the presence of
two bulky amino acid residues that narrow the end of the hydrophobic
channel for hydrogen access to the [NiFe] active site (Buhrke, Lenz, Krauß,
& Friedrich, 2005). Identically, these two amino acids (isoleucine and phenyl
alanine instead of the highly conserved leucine and valine in the oxygensensitive hydrogenases) are present in hydrogenase III.
The soluble cytoplasmic hydrogenase III was proposed to be probably
involved in the CO2 fixation pathway in A. aeolicus (Brugna-Guiral et al.,
2003; Infossi & Giudici-Orticoni, unpublished results) which operates via
the rTCA cycle in this bacterium (Hügler et al., 2007). As this cycle is an
endergonic pathway, the key enzyme of this cycle, that is, the pyruvate
ferredoxine oxidoreductase, requires a highly pool of reduced low-potential
ferredoxins to function in reverse (i.e., to produce pyruvate from CO2 and
acetyl CoA). The enzyme that possibly transfers electrons in vivo to ferredoxin is the hydrogenase III as it was shown that it is able to reduce in vitro,
in the presence of hydrogen, low-potential artificial electron acceptors
(Brugna-Guiral et al., 2003) as well as two [4Fe–4S] low-potential ferredoxins purified from A. aeolicus (Infossi P. & Giudici-Orticoni M.T.,
unpublished results). The steady-state rate of ferredoxins reduction follows
Michaelis–Menten kinetics, and the catalytic constant and Km values are almost identical for both proteins (around 30 s 1 and < 4 mM, respectively).
These two highly similar ferredoxins, referred as Fd6 and Fd7, are encoded
by tandemly arranged genes (fdx6 and fdx7) and are considered to serve as
low-potential electron donors (440 and 460 mV at pH 7) for the pyruvate:ferredoxin oxidoreductase (Infossi P. & Giudici-Orticoni M.T.,
unpublished results; Ikeda et al., 2005). Even if these two small proteins
are reduced by hydrogenase III in vitro, whether they are both involved
in the reductive decarboxilation in vivo is not yet known.
140
Marianne Guiral et al.
2.2. Focus on the super-resistant hydrogenase I
2.2.1 Biochemical and physicochemical characterization
Since its identification and purification from the membrane extracts, hydrogenase I has been the subject of increasing studies, especially in the past few years
(Ciaccafava, De Poulpiquet, et al., 2012; Ciaccafava, Infossi, et al., 2012; Lojou,
2011; Pandelia, Infossi, Stein, Giudici-Orticoni, & Lubitz, 2011; Pandelia et al.,
2010). This is clearly because of its outstanding properties that enable both to
improve the understanding of oxygen sensitivity/resistance of hydrogenases
and to consider highly interesting biotechnological applications. Huge work
has been done in order to compare and try to mimic by genetic
engineering, the physicochemical properties of A. aeolicus hydrogenase I, and
others presenting the same phenotypes, that is, R. eutropha or E. coli, and
hydrogenases from anaerobic bacteria, such as Desulfovibrio or Allochromatium,
that are highly oxygen sensitive.
The crystal structure of hydrogenase I is not resolved yet, but high homology with hydrogenase from Desulfovibrio gigas was found (Brugna-Guiral et al.,
2003). Recently, structures at resolution between 1.18 and 1.5 Å of two similar oxygen-resistant hydrogenases have been published: membrane-bound
hydrogenases from the aerobic bacteria R. eutropha, and Hydrogenovibrio marinus (Fritsch et al., 2011; Shomura, Yoon, Nishihara, & Higuchi, 2011). From
these structures and previous biochemical and physicochemical works done
on A. aeolicus hydrogenase I (Brugna-Guiral et al., 2003), key features
concerning hydrogenase I can be drawn. Hydrogenase I is a heterodimer.
The small subunit contains three FeS clusters, and the large subunit harbors
the [NiFe] active center where hydrogen is cleaved into protons and
electrons. The distal [4Fe–4S] and intermediary [3Fe–4S] clusters are
similar to those found in the “standard” hydrogenases. Their redox
potentials have been determined using EPR and found to be 78 and
þ68 mV (Pandelia, Nitschke, et al., 2011). It is noteworthy that these
potential values are 200 mV higher than the potentials measured for the
FeS clusters in oxygen-sensitive hydrogenases. The proximal FeS cluster,
however, was proved to present a unique [4Fe–3S] structure coordinated
by six cysteines residues, contrary to the [4Fe–4S] cubane coordinated by
four cysteines found in standard hydrogenases. As developed below, this
uncommon structure explained both the redox behavior of the distal
cluster and oxygen resistance displayed by hydrogenase I.
Spectrophotometric activity measurements put forward that higher potential redox mediators than for A. aeolicus hydrogenase III or for standard
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
141
hydrogenases were efficient for hydrogen oxidation. The same result was
described for hydrogen oxidation by the hyperthermophilic Hydrogenimonas
thermophila (Nishimura, Kitano, Inoue, Nomura, & Sako, 2010). Accordingly, enzymatic activity measured by electrochemistry using hydrogenase
I adsorbed onto an electrode clearly underlined that methylene blue (redox
potential at þ11 mV) was a much more efficient redox mediator than
methyl viologen (redox potential at 446 mV) for hydrogen oxidation
(Luo, Brugna, Tron-Infossi, Giudici-Orticoni, & Lojou, 2009). This result
agrees with the finding that the clusters in hydrogenase I present higher
redox potentials than those in standard hydrogenases. Actually, when running electrochemical experiments with directly connected hydrogenases on
an electrode (measurement with no redox mediators), hydrogen oxidation
proceeded at a potential around 100 mV higher than in standard hydrogenases, a feature also shared by the membrane-bound hydrogenase from
R. eutropha (Cracknell et al., 2009). As a consequence, hydrogenase I was
shown to be a poor proton reducer with a large bias toward hydrogen
oxidation (Brugna-Guiral et al., 2003; Luo et al., 2009).
Hydrogenase I was shown to be active in a large range of temperature
from 20 to 90 C, with an optimum around 85 C. Furthermore, it was
demonstrated by electrochemistry to be highly thermostable, being active
during several hours with no loss of activity, and bearing temperature
stresses such as temperature sharp repetitive variations from 20 to 75 C
(Luo et al., 2009).
As described for hydrogenase III, EPR studies revealed the presence of
Ni-B state only in the as-prep hydrogenase I, suggesting by comparison with
hydrogenase III and the membrane-bound hydrogenase from R. eutropha,
that hydrogenase I can present oxygen resistance. Actually, electrochemistry
experiments clearly demonstrated that hydrogenase I was oxygen and CO
resistant, in marked contrast with the standard hydrogenases for which oxygen and CO are competitive inhibitors (Fig. 4.5). Kinetics data of the reaction of hydrogenase I with oxygen and CO revealed that both gases
reached the [NiFe] active site. But in the case of oxygen, the Ni-B state
reactivated much more quickly than in standard hydrogenases. In the case
of CO, a very weak Ni–CO bond was formed. Contrary to hydrogenase
III, these resistances cannot be explained by a narrow channel for diffusion
of gases, since the highly conserved leucine and valine residues are found in
hydrogenase I. It is neither due to additional diatomic ligands as on the soluble NADþ-reducing hydrogenase from R. eutropha (Pandelia et al., 2010).
Oxygen and CO resistance displayed by hydrogenase I is more probably
142
Marianne Guiral et al.
380
A. aeolicus
hydrogenase I
+O2
Current mA cm–2
290
240
190
-0.45
CO
H2
90
-0.25
-0.05
100
+0.15
Current mA cm–2
-0.40
-0.20
0
+0.20
70
100
D. f
hydrogenase
+O2
40
60
H2
CO
10
20
-20
-0.60
-40
-0.60
-0.40
-0.20
Potential V versus NHE
0
-20
-0.60
-0.40
-0.20
0
+0.20
Potential V versus NHE
Figure 4.5 Resistance of A. aeolicus hydrogenase I toward O2 and CO. The evolution of
the enzymatic current for H2 oxidation before and after addition of either CO or O2
clearly put forward the inhibition of the mesophilic [NiFe] hydrogenase from
Desulfovibrio fructosovorans, while A. aeolicus hydrogenase I remains active. H2 enzymatic oxidation is followed using electrochemistry with hydrogenases immobilized
onto a pyrolytic graphite electrode. The current–potential curves are recorded under
H2 at 60 C for A. aeolicus hydrogenase I and 25 C for Desulfovibrio fructosovorans
hydrogenase.
related to the uncommon structure of the proximal [4Fe–3S] cluster. Due to
a distorted conformation, this cluster was shown to present one more high
potential redox state (þ232 mV in hydrogenase I) than the classical [4Fe–4S]
clusters, which can be the key point in order to avoid the formation of Ni-A
state (Pandelia, Nitschke, et al., 2011).
2.2.2 Hydrogen electroenzymatic oxidation in a physiological like
environment
Encouraged by the outstanding properties of hydrogenase I, further work
has been performed in order to understand and control the enzymatic pathway with the enzyme placed in strained conditions, close to physiological
environment. These studies furthermore aim to improve the efficiency of
the enzyme when immobilized onto an electrode, which is a key step for
developing biotechnological devices.
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
143
The early purification of hydrogenase I allowed the identification in the
membrane fraction of the complex hydrogenase I–cytochrome bI. Three
bands were revealed by SDS-PAGE at 70, 40, and 25 kDa, characteristic
of the two subunits of hydrogenase I and cytochrome bI, respectively (Guiral
et al., 2003). The complex was active toward hydrogen oxidation mediated
by methylene blue, and displayed a high thermal stability, with a loss of only
15% of activity after 2 h at 80 C. These results already suggested that
hydrogenase I could be more efficient for hydrogen oxidation when involved in the physiological complex.
Cytochrome bI is inserted in the cell membrane. It carries the quinone
reduction site and serves as an anchor for hydrogenase I. The components of
the whole physiological complex were thus studied with the final objective
of reconstitution of the complex in liposomes. The redox potentials of the
diheme cytochrome bI were determined by electrochemistry, spectrophotometric titration, and EPR (Infossi et al., 2010). Two redox potentials,
respectively, at 110 and 20 mV were determined by electrochemistry
for the purified cytochrome bI. Noteworthy, redox titration of the
immobilized cytochrome bI from R. eutropha showed a redox potential,
respectively, around 90 mV for cytochrome bI or hydrogenase
I–cytochrome bI (Sezer et al., 2011). From spectrophotometric titration
realized on the complex hydrogenase I–cytochrome bI, two redox species
were obtained with redox potentials of 60 and þ 130 mV. Discrepancies
in the results might result from the different environments of the hemes
when immobilized on the electrode. A model of cytochrome bI was constructed that showed that the quinone site is located close to the heme near
the cytoplasmic side, while the heme located near the periplasmic surface
binds hydrogenase I, most probably through the distal FeS cluster.
Quinone from A. aeolicus was purified and analyzed by NMR and mass
spectrometry (Infossi et al., 2010). Its redox potential at pH 7 and 25 C
was determined as 9 mV, not very far from the value for the
demethylmenaquinone from Haemophilus parainfluenza (Holländer, 1976).
Accordingly, complete assignment of the experimental data concluded that
the quinone from A. aeolicus was a demethylmenaquinone (DMK7). Both
the nature and the redox potential of this quinone were discussed to be in
agreement with the phylogenetic position of A. aeolicus and its microaerophilic
character. The redox potential of the A. aeolicus DMK7 is lower than the one of
ubiquinones predominantly expressed in facultative or obligate aerobic organisms but more positive than the one of classical menaquinones (Infossi et al.,
2010; Schoepp-Cothenet et al., 2009).
144
Marianne Guiral et al.
Proteoliposomes were reconstituted with A. aeolicus quinone and hydrogenase I–cytochrome bI complex (Infossi et al., 2010). The efficient orientation of the complex into the vesicles was demonstrated using electronic
microscopy and SPR after antibodies labeling. The proteoliposomes were
demonstrated by native blue gels and spectrophotometry to be three times
more active than the free complex. Moreover, it was demonstrated that quinone stabilized the complex. Mediated hydrogen oxidation via hydrogenase
I–cytochrome bI complex inserted into liposomes was then followed by
electrochemistry using a thin layer configuration (Dos Santos et al., 2003;
Lojou & Bianco, 2004). The second-order rate constants were calculated
to be 3 and 15 105 M 1 s 1, respectively, for the free complex or the
proteoliposomes (Fig. 4.6). The difference in the rate constants was
proposed to reflect the higher stability of hydrogenase I–cytochrome bI
complex inserted into the liposomes.
Q
A. aeolicus quinone
A. aeolicus
hydrogenase I–cytb
O
H
CH3
O
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
+
Liposome
+
CH3
Colloidal gold
Antirabbit lgG
14
H2 oxidation
I (mA)
10
Anti-hydrogenase
antibody
6
Proteoliposome
Q
2
-2
-350
-150
50
250
E versus SHE / mV
Figure 4.6 Stabilization of A. aeolicus hydrogenase I in proteoliposomes.
Proteoliposomes are built by insertion in liposomes of A. aeolicus demethylmenaquinone
and the cytb–hydrogenase I complex. Presence of some cytb–hydrogenase I molecules
inserted with hydrogenase I pointing at the exterior of the liposome, thus available for
H2 oxidation, is observed after gold labeling by microscopy. Comparison of current–
potential curves for H2 oxidation mediated by methyl viologen (fine curve in the E–i
graph) using either proteoliposomes or cytb–hydrogenase I complex at the electrode
clearly shows the better efficiency of the proteoliposomes.
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
145
2.2.3 The electrochemical interface: A friendly physiological like partner
The orientation of the enzyme in proteoliposomes was a key step for an
efficient catalytic activity. In this case, the reconstituted complex was very
similar to the physiological membrane so that efficiency toward hydrogen
was expected. Generally speaking, in an electron transfer chain where electrons are exchanged between two physiological partners, molecular recognition before electron transfer implies the formation of transitory complexes
or at least a specific orientation of one partner toward the other. One way to
explore and control the parameters that drive this enzyme orientation is to
replace one partner by an electrode, which plays the role of the last electron
acceptor/donor. The game will be to chemically modify the electrochemical
interface so that it can mimic the physiological partner. Another advantage of
such a procedure is to define a conductive support for stable and efficient enzyme immobilization, thus available for the design of a bioanode. As an example, it was accordingly demonstrated that the soluble [NiFe] hydrogenase
from Desulfovibrio could be specifically orientated simply by modifying the
electrochemical interface by positive charges, mimic of the highly basic cytochrome c3 physiological partner (Lojou et al., 2008; Rüdiger et al., 2010). This
specific orientation opened the route for efficient immobilization of
hydrogenase, hence high-current densities for hydrogen oxidation.
For hydrogen oxidation by A. aeolicus hydrogenase I, electrons are transferred from [NiFe] active site through the three FeS clusters, then exchanged
with the diheme cytochrome bI, via the surface FeS cluster, called the distal
cluster, and finally transferred to the quinone pool (Fig. 4.3). With the aim of
an efficient electron transfer between hydrogenase I and an electrode interface, the electrode was thus modified so that it could fit the environment of
the distal FeS cluster. Self-assembled monolayers on gold electrodes are
commonly used for electrode modification due to the versatility of the thiol
chains. Although the structure of hydrogenase I is unresolved, the similarity
with the resolved structure from Hydrogenovibrio marinus and R. eutropha
membrane-bound hydrogenases (Fritsch et al., 2011; Shomura et al.,
2011) has allowed the construction of a model (Fig. 4.3). No charged
amino acid residues can be found in the close vicinity of the FeS distal
cluster, precluding a specific orientation of hydrogenase I by electrostatic
interaction (Ciaccafava et al., 2011). Accordingly, amino- or carboxylicterminated alkylthiol layers on gold electrodes, that is, positive or
negative layer at pH 7, yielded multiple orientations of hydrogenase I on
the electrode, hence multiple electron transfer rates. The nonspecific
orientation of hydrogenase was clearly revealed by the occurrence of
146
Marianne Guiral et al.
both a direct electron transfer process (with the hydrogenase molecules
oriented with the distal FeS cluster close to the electrode) and a mediated
electrode transfer process (with the hydrogenase oriented with the distal FeS
cluster too far from the electrode so that direct electron transfer is limited by
the tunnel distance). In order to mimic the membrane environment of
hydrogenase I, the gold electrodes were then modified by CH3-terminated
alkylthiol chain. Unexpectedly, it was demonstrated that hydrogenase I was
oriented with the distal FeS cluster opposite to the hydrophobic
electrochemical interface (Ciaccafava, De Poulpiquet, et al., 2012;
Ciaccafava, Infossi, et al., 2012). Actually, it was shown by mass
spectrometry that hydrogenase I purified from the membrane fraction with
the aid of detergent carries the transmembrane helix that serves as an anchor
in the membrane (Luo et al., 2009). This helix is highly hydrophobic,
composed of 45 amino acid residues, and located less than 15 Å from the
distal FeS cluster. It was also underlined using thin layer chromatography that
detergent remains around this transmembrane helix (Ciaccafava, De
Poulpiquet, et al., 2012; Ciaccafava, Infossi, et al., 2012). As a consequence,
it was proposed that the domain around the FeS distal cluster became
hydrophilic and had no affinity for the hydrophobic electrode (Fig. 4.7).
2.2.4 Future use of A. aeolicus hydrogenase I as biocatalysts in H2/O2
biofuel cells
Although still debated, hydrogen offers tremendous potentials as a clean,
renewable energy source, able to free us from the dependence on fossil fuel,
because it delivers the highest energy output relative to the molecular weight
and because its combustion only produces water and heat. One of the means
for generating electricity is to develop H2/O2 fuel cells. An attractive route is
to take profit of the biological conversion of hydrogen by hydrogenases
which emerge as good candidates in replacement of chemical catalysts, thus
designing a future H2/O2 biofuel cell (Fig. 4.8). The advantages of hydrogenases over chemical catalysts (often noble metals) are multiple. This includes high efficiency, high specificity, and low overpotential for
hydrogen oxidation, biodegradability and bioavailability, and operation at
soft pH and temperature conditions. A. aeolicus hydrogenase I appears suitable for such a biotechnological device because it is able to oxidize hydrogen
in the presence of oxygen, because it affords temperatures up to 90 C, and
because it resists to CO, one major drawback of platinum catalysts.
In view of designing such biofuel cells, one key step is to immobilize
hydrogenase I on an electrode while preserving its stability and efficiency.
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
147
Redox
mediator
Redox
mediator
Redox
mediator
e–
e–
Hydrophilic or charged electrode
Mixed DET + MET process
for H2 oxidation
Redox
mediator
e–
e
–
e–
Hydrophobic electrode
MET process
for H2 oxidation
Figure 4.7 The transmembrane helix surrounded by detergent controls the orientation
of A. aeolicus hydrogenase I at gold-modified electrodes, thus the electron transfer process for H2 oxidation. At hydrophilic or charged interface, the absence of charged patch
around the distal FeS cluster allows A. aeolicus hydrogenase I to adopt many orientations. Oxidation of H2 occurs via both direct and mediated electron transfer processes.
At hydrophobic interface, due to the presence of the transmembrane helix close to the
FeS distal cluster and surrounded with neutral detergent, A. aeolicus hydrogenase I flips
upside down, so that H2 oxidation can only occur through a mediated pathway.
The researches just described before are essential for this achievement because they bring forward the parameters that unsure a good electrical connection of the enzyme on the electrode. In addition, power densities higher
than 100 mW cm 2 must be reached in order to power small electrical devices. The power density is the result of the open-circuit voltage (theoretically, the OCV is 1.23 V for a H2/O2 fuel cell) by the current density.
Given immobilization of an oxidase in the cathodic compartment, such as
bilirubin oxidase, able to efficiently reduce oxygen, a large OCV can be
reached close to 1 V (Wait, Parkin, Morley, dos Santos, & Armstrong,
2010). But compared to a chemical catalyst such as platinum, hydrogenases
are huge molecular objects. Their immobilization on a surface is thus limited
in enzyme surface concentration, thus in current densities to be delivered.
The solution is to build electrode that displays large surface areas in which
more than one layer of hydrogenase can be connected.
With this objective in mind, a phenothiazine-based polymer on a graphite electrode was used as a host matrix for A. aeolicus hydrogenase I
148
Marianne Guiral et al.
Oxygen reduction
Hydrogen oxidation
O2
H2
e–
e–
Anode
Cathode
H+
Hydrogenase
Bilirubin Oxidase
H2O
Catalytic current (mA cm–2)
1200
800
400
PG
0
20
40
60
80
Temperature (°C)
Figure 4.8 A. aeolicus hydrogenase I is an attractive biocatalyst to replace platinumbased catalyst in green H2/O2 biofuel cell. Combining immobilization of A. aeolicus hydrogenase I at the anode and O2 reductase, such as bilirubin oxidase, at the cathode, the
biofuel cell is expected to deliver hundreds of mW cm 2, with the advantages of using
H2 from biomass, no membrane between the anodic and cathodic compartment, biodegradability, and bioavailability. Carbon nanotube networks on graphite electrode are
excellent materials for future biofuel cell. They allow a great increase in current densities
for H2 oxidation because they develop large conductive surface areas and offer soft host
matrixes for A. aeolicus hydrogenase I.
(Ciaccafava, Infossi, Giudici-Orticoni, & Lojou, 2010). It was shown that
the polymer was able to act as an efficient anchor platform for hydrogenase,
thus allowing a highly stable and increased current density compared to a
bare electrode. The intrinsic resistance properties of A. aeolicus hydrogenase
I, including high activity at high temperature, resistance to temperature, and
oxygen and CO stresses were conserved upon immobilization. The
electropolymerized film was proposed to play a multifunctional role, including not only anchor for hydrogenase but also anchor for redox mediator and
ROS scavenger. But the most promising mean to increase connected
hydrogenase amount onto electrodes relies on hierarchical porous carbon
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
149
structures. This type of structure can be reached using carbon nanotubes that
present high electrical conductivity, unique chemical and mechanical properties, and develop large surface areas. Furthermore, chemical functions can
be generated on the surface of the carbon nanotubes, thus numerous anchoring sites available for hydrogenase immobilization. A. aeolicus hydrogenase I
was immobilized onto carbon nanotube-modified graphite electrode and
evaluated for hydrogen oxidation capability (Luo et al., 2009). The current
density was demonstrated to be greatly enhanced, reaching a high value of
1 mA cm 2, at least 7 times higher than at the bare electrode but also 20
times higher than the current density value obtained using the mesophilic
hydrogenase from Desulfovibrio on the same carbon nanotube deposit
(Fig. 4.8). Work is now in progress in order to design a complete biofuel
cell with A. aeolicus hydrogenase I as the anode biocatalyst for hydrogen
oxidation (Ciaccafava, De Poulpiquet, Techer, Giudici-Orticoni, Tingry,
Innocent & Lojou, 2012).
2.3. The hydrogen–oxygen bioenergetic pathway
As mentioned above, A. aeolicus is a “knallgas” bacterium and grows using
hydrogen as electron donor and oxygen as electron acceptor, which is an
uncommon and only scarcely studied metabolic pathway. Hydrogenase I,
linked to the diheme cytochrome bI, belongs to group 1 of [NiFe] hydrogenases containing respiratory enzymes. This enzyme is likely involved in the
oxygen reduction pathway in A. aeolicus. It has been proposed that the first
step of this bioenergetic pathway consists of an electron uptake from hydrogen by hydrogenase I and subsequent reduction of the quinone pool via the
cytochrome b subunit. Electrons from the quinone pool probably pass through
the membrane-attached cytochrome bc1 complex toward a periplasmic cytochrome c and end up reducing molecular oxygen by an oxidase enzyme
(Fig. 4.9A). A hydrogen-dependent reduction of exogenous cytochrome c
was measured at 70 C with detergent-extract membranes of A. aeolicus grown
in the presence of elemental sulfur as the sulfur source. This efficient cytochrome c reduction with hydrogen and the sensitivity of this reaction toward
the inhibitor stigmatellin suggest that the bc1 complex as well as a hydrogenase
participate in this electron transfer (Guiral et al., 2009). Protein components
involved in the proposed energy pathway, that is, small and large subunits
of hydrogenase I (with its partner cytochrome bI), the bc1 complex, the
cytochrome c555 m , and a cytochrome c oxidase, were all detected in the
A. aeolicus membranes using a proteomic approach combining separation of
proteins by blue-native electrophoresis, in-gel detection of enzyme activities,
150
Marianne Guiral et al.
H+
A H2
Periplasm
c
IM
ba3
oxidase
bc
Q
Hydrogenase I
O2
H2O
Periplasm
B
S
H2 S
c
IM Quinol
ox
O2
Q
H2O
Sqr
Q
ba3
oxidase
bc
O2
H2O
Figure 4.9 Models of electron transports in A. aeolicus membranes. Reaction scheme of
electron transfer from molecular hydrogen to oxygen (Brugna-Guiral et al., 2003; Guiral
et al., 2009) (A) and from hydrogen sulfide to oxygen (Guiral et al., 2009; Nübel et al.,
2000) (B) These schematic representations take no account of the stoichiometry of
the various enzymes and complexes. Oxidase is for cytochrome c oxidase, Quinol ox
for bd quinol oxidase, bc for bc1 complex, c for monoheme cytochrome c555, Q for
quinone pool, S for elemental sulfur and IM for inner membrane. Arrows indicate the
possible electron transfer.
and protein identification by mass spectrometry (Guiral et al., 2009). Moreover, the bc1 complex and the cytochrome c oxidase interact to form a supercomplex in the membrane of A. aeolicus, implying that they are involved in the
same electron transfer pathway (Gao et al., 2012; Guiral et al., 2009; Prunetti
et al., 2010).
The bc1 complex of A. aeolicus, reoxidizing quinone pool reduced by the
cytochrome bI, is made of three subunits: the Rieske iron–sulfur protein, the
monoheme cytochrome c1, and the transmembrane diheme cytochrome b,
encoded by genes included in an operon (cyc, petA, petB). This membraneattached complex was biochemically and biophysically characterized. In particular, the redox potentials and the spectral properties of the four redox centers were determined (Schütz et al., 2003). This complex belongs to the
group of low redox potentials Rieske/cytochrome b complexes (redox
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
151
potentials of heme bL, bH, and c1 are 190, 60, and þ160 mV, respectively) oxidizing menaquinone (DMK7 in A. aeolicus as mentioned above).
However, some properties of this complex resemble those of proteobacterial
or mitochondrial bc1 complexes (Schütz et al., 2003).
At the end of the pathway, the reduction of molecular oxygen to water is
catalyzed by complicated membrane-bound multisubunits metalloenzymes
called cytochrome c oxidases or quinol oxidases. The Aquifex genome sequence analysis revealed, in addition to genes for a bd quinol oxidase (CydA
and CydB encoded by aq_1357 and aq_1358, respectively), a gene cluster
containing genes encoding two putative cytochrome c oxidases, namely
cytochrome c oxidase I (putatively encoded by coxA1, coxB, and coxC)
and cytochrome c oxidase II (encoded by coxA2 and coxB2) (Prunetti,
Brugna, Lebrun, Giudici-Orticoni, & Guiral, 2011). Based on sequence
comparison, it was proposed that cytochrome c oxidase I belongs to type
A heme–copper oxidases (or aa3-type) and has all the specific residues of
the D- and K-proton channels, whereas cytochrome c oxidase II is a B-type
enzyme (or ba3-type) with specific residues forming a K-channel homologue
for proton translocation (Pereira, Santana, & Teixeira, 2001; Prunetti et al.,
2011). The proteomics data suggested the presence in the membrane of only
one, the cytochrome c oxidase II, of the two potentially present cytochrome
c oxidases in the conditions used for the growth (i.e., hydrogen, elemental
sulfur, and oxygen). Cytochrome c oxidase I was never detected. As
A. aeolicus, numerous prokaryotes possess both aa3- and ba3-type oxidases
(Brochier-Armanet, Talla, & Gribaldo, 2009; Ducluzeau, 2009; Prunetti
et al., 2011). The production of the B-type oxidase in the A. aeolicus
membrane is consistent with the very low oxygen concentration available
for growth, at least at the end of the culture, in the medium (probably a
few micrograms of molecular oxygen/L). Under low aeration conditions,
it has been shown, in various Bacteria and Archaea, that the preferred
oxygen reduction enzyme is the ba3-type oxidase considered to possess a
higher affinity to oxygen that type A oxidases (Prunetti et al., 2011). This
cytochrome c oxidase II was purified and spectroscopically characterized
as a ba3 enzyme with heme b presenting some unusual spectral
characteristics (Gao et al., 2012; Prunetti et al., 2010). EPR spectra
showed peak at g ¼ 3.00 and 3.4 arising from low spin heme b (Gao
et al., 2012; Prunetti et al., 2010; Schütz et al., 2003). This enzyme was
first described as a two-subunit complex containing the small subunit II
(CoxB2 of 16,700 Da) and the large subunit I (CoxA2 of 59,000 Da).
The presence of an additional small subunit composed of 41 amino acids,
152
Marianne Guiral et al.
called subunit IIa, was recently discovered (Gao et al., 2012; Prunetti et al.,
2011). Prediction indicates that this small protein is a transmembrane helix,
thus implying that this membrane-bound complex strongly structurally
resembles that of the ba3 cytochrome c oxidase of the thermophilic
bacterium Thermus thermophilus (Prunetti et al., 2011; Soulimane, Than,
Dewor, Huber, & Buse, 2000). The enzymatic activity of this enzyme
was determined at various temperatures in vitro. It is not active at room
temperature as most enzymes from thermo/hyperthermophilic organisms
(see paragraph below). Surprisingly, it is able to oxidize both reduced
cytochrome c and ubiquinol when this latter is present in amounts
exceeding the capacity of the cytochrome bc1 complex. There must be a
compelling advantage for this cytochrome oxidase to use quinol, in
particular, because the cytochrome bc1 complex and the cytochrome c
oxidase are constituents of the same supercomplex (Gao et al., 2012;
Prunetti et al., 2011).
Two cytochromes are probable candidates for accepting electrons from
the bc1 complex and transferring them to the terminal oxidase. These two
highly homologous (85% identity) monoheme cytochromes c, a
membrane-tethered c555 m and a soluble cytochrome c555 s , are present in
the periplasm of the bacterium (Aubert et al., 2001; Baymann, Barlow,
et al., 2003; Baymann et al., 2001; Obuchi et al., 2009). The existence of
these two small cytochromes in A. aeolicus is due to gene duplication.
The c555 m is tightly bound to the lipid bilayer probably via a lipid anchor
presumably attached to an N-terminal cysteine residue (Baymann,
Barlow, et al., 2003; Baymann et al., 2001). This protein belongs to the
family of pivoting cytochromes and can adopt multiple orientations with
respect to the membrane. One or both of these cytochromes are possibly
involved in the bioenergetic pathway. However, whether these
homologous proteins have similar or competing function in the cell is not
known. It was speculated that both cytochromes c555 may form dimer to
create an electron transfer couple (Baymann, Barlow, et al., 2003;
Baymann et al., 2001). The cytochrome c555 m was found in the
membrane fraction of the bacterium cultivated in the presence of
hydrogen, oxygen, and elemental sulfur, and one or both of these
cytochromes are present in small amount in the purified supercomplex
containing the bc1 complex and the cytochrome c oxidase II (Guiral et al.,
2009; Prunetti et al., 2010).
Phylogenetic analyses indicated that A. aeolicus bc1 complex and
membrane-bound hydrogenases I and II are closely related to
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
153
proteobacterial counterparts, in disagreement with positioning of the bacterium on small subunit rRNA trees. As stated in Section 1.1, this suggests
lateral transfer for genes encoding these enzymes from a proteobacterial donor (Brugna-Guiral et al., 2003; Schütz et al., 2003).
3. HYDROGEN SULFIDE UTILIZATION PATHWAY
3.1. Sulfide-dependent electron transport
Inorganic reduced compound hydrogen sulfide, a poisonous inflammable
gas highly soluble in water, can serve as electron donor for the electron transfer chain to a variety of Bacteria and some Archaea (Griesbeck, Hauska, &
Schütz, 2000). Both phototrophic and respiratory (chemoautotrophic) organisms possess enzymes that oxidize hydrogen sulfide to feed electrons into
the bioenergetic pathways. These enzymatic systems are the membranebound sulfide:quinone reductase (Sqr) or the soluble periplasmic
flavocytochrome c sulfide dehydrogenase (FCC). FCC is composed of a flavin adenine dinucleotide (FAD) binding subunit and a cytochrome c. It reduces a c-type cytochrome which subsequently donates the electron to a
cytochrome c oxidase in chemotrophic electron transport chain or to a photosynthetic reaction center in phototrophic chain (Griesbeck et al., 2000).
Sqr, which transfers electrons from hydrogen sulfide to the quinone pool,
feeds electrons to a bc complex. It was suggested that Sqr and the sulfidedependent electron transport chain evolved very early in bacterial evolution
(Nübel, Klughammer, Huber, Hauska, & Schütz, 2000).
The complete genome sequence of A. aeolicus indicated the presence of
an open-reading frame that encodes a protein with similarity to the Sqr.
The first studies on sulfide oxidation were developed using intact membrane
of the bacterium grown in the presence of thiosulfate. They showed that
the electron transport from sulfide to oxygen employs the Sqr and the cytochrome bc complex via the quinone pool. A substantial portion of the quinol
might be reoxidized also by the quinol oxidase (Nübel et al., 2000) (Fig. 4.9B).
A sulfide-to-oxygen ratio of approximately 2 was measured indicating that
sulfide was oxidized to the level of zero-valent sulfur (Nübel et al., 2000).
More recently, experiments using detergent-extract membranes of A. aeolicus
support the presence of the H2S/O2 energetic pathway in growth conditions
with elemental sulfur (Guiral et al., 2009). The Sqr specific activity of the enzyme in the intact membrane (3.5 mmol of decyl-ubiquinone reduced/mg
of protein/min at 20 C; Nübel et al., 2000) as well as in the detergentsolubilized membrane (6 mmol of decyl-ubiquinone reduced/mg of
154
Marianne Guiral et al.
protein/min at 20 C; Prunetti & Guiral, unpublished results) was determined
to be one of the highest found so far despite measured at room temperature.
This specific activity increases with increasing temperature. This suggests that
hydrogen sulfide, in addition to hydrogen, constitutes one of the major electron donor for the respiration in A. aeolicus (Griesbeck et al., 2000; Nübel
et al., 2000). A. aeolicus was successfully grown using hydrogen sulfide in
the presence of oxygen and hydrogen (Prunetti et al., 2010). Hydrogen
sulfide, in addition to hydrogen, is a gas naturally present in volcanic gases
and hot springs, including the ones at Vulcano Island where A. aeolicus was
isolated (Stetter, 2001).
3.2. The highly active and thermostable Sqr from A. aeolicus
Sqr is a membrane flavoprotein catalyzing by oxidation of sulfides (H2S, S2 ,
or HS) the two-electron reduction of the quinone pool, via a FAD redox
cofactor according to the reaction: H2S þ Q $ S þ QH2 (where Q is quinone, QH2 quinol, and S zero-valent sulfur). This enzyme belongs to the
disulfide reductase family including glutathione and thioredoxin reductases
and dihydrolipoamide dehydrogenases. Sqr has various important physiological roles. In addition, to be involved in energy metabolism, they can
function in hydrogen sulfide detoxification or homeostasis in mammals.
This enzyme was purified and biochemically characterized from few microorganisms including, in addition to A. aeolicus, the purple bacterium R. capsulatus (Schütz, Maldener, Griesbeck, & Hauska, 1999; Schütz, Shahak,
Padan, & Hauska, 1997), the cyanobacteria Oscillatoria limnetica and
Aphanothece halophytica (Bronstein, Schütz, Hauska, Padan, & Shahak,
2000), the chemolithoautotrophic acidophile Acidithiobacillus ferrooxidans
(Cherney, Zhang, Solomonson, Weiner, & James, 2010; Wakai et al.,
2007), and the acidophilic hyperthermophilic archaeon A. ambivalens
(Brito et al., 2009). Recently, a new classification of Sqr into six groups
was defined. A. aeolicus Sqr belongs to type I together with proteins from
a- and b-proteobacteria and cyanobacteria. They present affinity to
sulfide in micromolar range and are probably expressed constitutively in
cells (Marcia, Ermler, Peng, & Michel, 2010).
3.2.1 Subcellular localization
As a monotopic enzyme, A. aeolicus Sqr faces either the cytoplasmic or the
periplasmic side of the membrane. No characteristic signal peptide or twinarginine motif is detected in the N-terminal part of the amino acid sequence.
Despite no translocation signal is present in the sequence, it was shown in
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
155
R. capsulatus that the Sqr is located in the periplasm and that C-terminal 38
amino acid residues are essential for translocation (Schütz et al., 1999). The
N-terminal sequencing of A. aeolicus Sqr showed that it is not cleaved, as
the one from R. capsulatus (Prunetti et al., 2010). Moreover, electronic and
optical microscopies were used to demonstrate that Sqr in A. aeolicus faces
the periplasm as this enzyme is detected using specific antibodies directly
on spheroplasts (i.e., entire cells that have lost in part the external membrane)
(Prunetti L., Infossi P., & Guiral M., unpublished results). This location still
needs to be conclusively demonstrated for Sqr of A. ferrooxidans (Wakai et al.,
2007) and the one of A. ambivalens which is assumed to be localized at the
cytoplasmic face of the membrane in this archaeon (Brito et al., 2009).
3.2.2 Properties
A. aeolicus Sqr was purified from the native membrane and was biochemically and structurally characterized (Marcia, Langer, et al., 2010; Marcia
et al., 2009; Prunetti et al., 2010). It forms two gel bands (of 47 and
35 kDa) on denaturing gel due to the partial lost of the FAD cofactor
upon denaturation (Marcia, Langer, et al., 2010). The FAD is required
for the enzyme activity. It was reported that the cofactor can be lost
during purification procedures of Sqr from various organisms. Depending
on the purification, optical spectroscopy and fluorescence emission
showed that 25–50% of purified A. aeolicus Sqr possesses their cofactor.
Indeed, typical signal of flavoproteins is observed around 360, 457, and
485 nm for Sqr. On the other hand, fluorescence emission signal of FAD
is quenched by the protein environment when the cofactor is
incorporated in Sqr. For quantification, it has to be extracted from the
enzyme by an acidic treatment (Engels, Kahmann, Ruppel, & Pistorius,
1997; Prunetti & Guiral, unpublished results). Despite covalent binding,
by an unprecedent persulfide linkage to a cysteine residue (Cys-124) to
the A. aeolicus Sqr, the redox cofactor can be removed from the protein,
confirming that this bond is labile as previously proposed (Marcia et al.,
2009). This is different from FAD from A. ambivalens Sqr which is bound
by a stable thioether bond (Brito et al., 2009) or the one from
A. ferrooxidans Sqr noncovalently bound to the protein (Cherney et al., 2010).
Enzymatic specific activity of A. aeolicus Sqr varies between 70 and
400 mmol mg 1 min 1 at 40 C depending on the preparation
(Table 4.2). As only a fraction of Sqr contains the flavin cofactor (see above),
this activity is largely underestimated and can be recalculated twice higher
considering the real concentration of active enzyme. The specific activity
156
Table 4.2 Enzymatic properties of some archaeal and bacterial Sqr
A.
ambivalens
A. aeolicus
A. aeolicus
R. capsulatus
A. ferrooxidans
O. limnetica
Specific
activity
400a (25 C)
800a (40 C)
71 (40 C)
55 (RT)
400–500 (RT)
100–150 (RT)
0.762
(70 C)
Optimal
pH
7
6.5
6.7
nd
nd
6.7
KM Na2S
2.5 (25 C)
5.9
5
2.8
8
2 (50 C)
KM
quinone
1.6 (DB, 25 C)
2.16 (DB)
3 (DB)
22 (DB)
31 (PQ)
nd
References
Prunetti et al. (2010),
Prunetti and Guiral
(unpublished results)
Marcia, Langer, et al. Griesbeck et al.
(2010), Marcia,
(2002)
Ermler, et al. (2010)
Cherney et al.
(2010)
Arieli, Shahak,
Taglicht, Hauska,
and Padan (1994)
Brito et al.
(2009)
a
Specific activity of A. aeolicus Sqr has been corrected considering the real FAD content in the purified enzyme.
Specific activity is given in mmol min 1 mg 1 protein, KM in mM.
DB, decyl-ubiquinone; PQ, plastoquinone; RT, room temperature; nd, not determined; R. capsulatus, Rhodobacter capsulatus; A. ferrooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans;
O. limnetica, Oscillatoria limnetica; A. ambivalens, Acidianus ambivalens.
Marianne Guiral et al.
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
157
increases greatly with the temperature. Thus at 25 C, it is roughly half the
one obtained at 40 C and this increases to double at 60 C. Activity at
80 C, close to the optimum temperature of cells growth, is higher but difficult to measure with accuracy due to the faster chemical reaction at this temperature (i.e., the direct reduction of quinone by hydrogen sulfide) and the
extremely high enzyme turnover (Prunetti & Guiral, unpublished results).
Two features are worthy of notice regarding A. aeolicus Sqr: (i) its specific activity is one of the greatest reported so far for such enzyme and is comparable,
at 25 C, to the one of A. ferrooxidans purified Sqr although this bacterium is a
mesophile (Table 4.2). Similarly, purified A. aeolicus complex I possesses a specific activity that is much higher than that reported for other complex I preparations (Peng et al., 2003). Usually, enzymes from hyperthermophiles have
normally specific activities similar to those from mesophiles (Daniel &
Danson, 2001). (ii) A. aeolicus Sqr is highly active at room temperature, in opposition to the enzyme from the hyperthermophile A. ambivalens almost inactive at room temperature (Brito et al., 2009). Most of redox enzymes
purified from A. aeolicus are not or very little active at room temperature as
measured for bc1 complex, ba3 cytochrome c oxidase, hydrogenase I, or complex I (Brugna-Guiral et al., 2003; Peng et al., 2003; Prunetti et al., 2010). This
is frequently observed for enzymes from hyperthermophiles. Room
temperature activity of A. aeolicus Sqr thus appears as an outstanding property.
The optimal pH as well as the catalytic constants was determined at
25 C for A. aeolicus Sqr. They are in the same range than those reported
for other Sqr (Table 4.2).
3.2.3 Three-dimensional structure
The X-ray structure of A. aeolicus “as-purified” Sqr and quinone- and
inhibitor-bound forms were recently determined (Marcia et al., 2009).
The overall architecture of the monomer is typical of disulfide reductase enzymes. All three 3D structures do not significantly differ. In addition to the
unconventional nature of the covalent bond between the flavin and the protein, they revealed some unexpected features like the oligomeric state (see
below) and the presence of a covalently bound polysulfur chain in the active
site. The insertion of this integral monotopic membrane protein into the
lipid bilayer was estimated to a depth of about 12 Å and is mediated through
a helix-turn-helix motif containing two amphipathic helices in the C-terminal
domain. This topology is favorable to catalyze reaction between hydrophilic
(sulfide) and hydrophobic substrate (quinone) (Marcia, Langer, et al., 2010).
Two substrate-binding sites are spatially separated. The quinone, on the si face
158
Marianne Guiral et al.
of the cofactor FAD, accesses its binding site through a hydrophobic channel
from the membrane attachment domain. On the re face of the FAD, a cavity is
delimited and constitutes the catalytic site. It is accessible for the substrate in
the periplasm from the bulk solvent through a hydrophilic channel. Sulfide
oxidation takes place in this pocket which faces three cysteine residues essential for the activity (Cys-124 binding the FAD, Cys-156 and Cys-347,
A. aeolicus numbering). Two different complicated multicycle mechanisms
of action for sulfur polymerization were suggested. They both propose a final
release of the product in the form of insoluble cyclooctasulfur (S8) (Marcia,
Ermler, et al., 2010; Marcia et al., 2009).
Recently, the complete structure of one other bacterial (from A. ferrooxidans)
and one archaeal (from A. ambivalens) Sqr was solved by X-ray crystallography.
It revealed unexpected differences in the active sites, in FAD binding, and
in channels for sulfide diffusion (Brito et al., 2009; Cherney et al., 2010;
Marcia, Ermler, et al., 2010; Marcia et al., 2009). Both Sqr have different
physiological oligomerization states and different membrane binding motifs
(Marcia, Ermler, et al., 2010). A. aeolicus Sqr structure is more closely related
to A. ferrooxidans Sqr one. One of the major differences occurs in the
domain containing the amphipathic helices penetrating the membrane.
In A. ferrooxidans Sqr, one of these two helices undergoes a major
conformational change depending on the presence or absence of detergent
and changes its orientation (Cherney et al., 2010). In A. ambivalens Sqr, a
high flexibility around the C-terminal part was also suggested (Brito et al., 2009).
3.2.4 Oligomerization state
Oligomerization state of microbial Sqr was little studied in detail (except for
the A. aeolicus one), but it was generally accepted that these enzymes are dimeric, like enzymes belonging to the same superfamily. Although not demonstrated, the active form of Sqr was proposed to be a dimer in R. capsulatus
(Griesbeck et al., 2002). This enzyme is a monomer in solution when purified from A. ambivalens (Brito et al., 2009). The A. ferrooxidans Sqr is
thought to be a dimer, but calculations propose that equilibrium shifts toward monomer at low protein concentration (below 0.01 mM). However,
for both of these last organisms, dimers have been observed in the crystal
form, suggesting a possible dimeric arrangement of the enzyme in the membrane. Cherney and collaborators propose that the association of Sqr that exists in solution (dimers interacting via the C-terminal domain) is different
from the probable biological dimer, which is inserted in the lipid bilayer
(Brito et al., 2009; Cherney et al., 2010).
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
159
A. aeolicus Sqr is the only Sqr proposed to be trimeric. A crystallographic
dimer of trimers was found in the asymmetric unit. It was suggested that this
trimeric organization creates an appropriate surface for binding lipid phosphate groups and that insertion of A.aeolicus Sqr into the membranes stabilizes enzyme oligomerization (Marcia et al., 2009). The oligomeric state of
Sqr extracted from the native membrane by detergent was studied by a variety of approaches. The results are in agreement with the existence of a trimer in solution, however, depending on the technique used. The dimer
(and even other forms) is also found in large amount (Marcia, Langer,
et al., 2010; Prunetti et al., 2010). Multimerization of Sqr does not
probably affect the enzyme activity but it could provide stability to the
protein orientation in the membrane (Cherney et al., 2010). Indeed, it
has been shown that all the oligomers (dimer, trimer, and a higher form
that might correspond to a tetramer) as well as the monomer are
enzymatically active when Sqr specific activity is revealed directly into
native gel (Prunetti L. & Guiral M., unpublished results; Prunetti et al.,
2010). This suggests that there is no correlation between oligomerization
state and activity. Moreover, preliminary data seem to indicate that the
oligomerization does not vary with the enzyme concentration nor the
temperature (Prunetti L. & Guiral M., unpublished results).
3.2.5 Thermostability
The 3D structure of A. aeolicus does not reveal major differences with the
one of A. ferrooxidans despite being a mesophilic bacterium. As mentioned
above, oligomerization of protein could be a strategy for hyperthermophilic
microorganisms to stabilize the protein structure (Vieille & Zeikus, 2001), as
demonstrated for a soluble rhodanese from A. aeolicus (Giuliani et al., 2007).
Another stabilization factor for A. aeolicus Sqr could be the presence of two
disulfide bridges in the C-terminal domain (Marcia et al., 2009). However,
other factors might exist as these two bridges are absent in the hyperthermophilic Sqr from A. ambivalens (Brito et al., 2009).
A. aeolicus Sqr thermostability was determined by incubation of the enzyme at 80 C and measurement of its activity. The stability of the purified
protein is remarkable, with a half-life of 32 h (Marcia, Langer, et al., 2010).
In comparison, A. aeolicus hydrogenase I or complex I has a half-life of 5 and
10 h at 80 C, respectively (Brugna-Guiral et al., 2003; Peng et al., 2003).
Thermostability of A. ambivalens Sqr was not yet analyzed.
Denaturation of A. aeolicus Sqr was followed with circular dichroism,
routinely used to study secondary structure modifications. A variation of
160
Marianne Guiral et al.
temperature from 20 to 90 C followed by a decrease to 20 C, as well as an
incubation at 80 C for 10 h, did not modify the a helice signal of the purified protein at 222 nm indicating a high structural stability, in line with the
stability of activity. Moreover, the action of urea, a denaturing reagent, was
tested on this enzyme (up to 18 h with a concentration of 8 M) which confirms the stability on native gel as well as the absence of dissociation of the
oligomers. Moreover, it could be shown that the Sqr does not lose its FAD
cofactor when treated with urea, although being linked by a rather labile
covalent bonding (Prunetti & Guiral, unpublished results). This extreme stability was not found for the sulfur oxygenase reductase (SOR) oligomeric
enzyme from A. aeolicus, which starts denaturing from 3 M urea
(Pelletier, Leroy, Guiral, Giudici-Orticoni, & Aubert, 2008).
3.3. The new sulfide-oxidase and oxygen-reductase
supercomplex of A. aeolicus
Studies on A. aeolicus membranes have revealed the possible existence of
functional supercomplex(es) involved in pathway for hydrogen sulfide oxidation and O2 reduction. Indeed, possible associations between Sqr, bc1
complex, cytochrome c oxidase, hydrogenase I, and quinol oxidase were
proposed using separation of detergent-extracted complexes by blue-native
electrophoresis (Guiral et al., 2009). The purification, by several chromatographic steps, of a membrane-bound supercomplex containing a cytochrome c oxidase activity confirmed the existence of stable interactions
between redox complexes and enzymes in the membranes of A. aeolicus
(Prunetti et al., 2010). Supercomplexes, resulting from specific associations
between bioenergetic complexes, were extensively described from mitochondria (Acı́n-Pérez, Fernández-Silva, Peleato, Pérez-Martos, & Enriquez,
2008). Besides the existence of substrate channeling, it was proposed that
they have a role in the stability and assembly of the individual complexes
and in preventing excess oxygen radical formation (Lenaz & Genova,
2010). Conversely, in bacteria or archaea, few respiratory supercomplexes
have been found and few were purified to homogeneity.
3.3.1 Composition, spectral, and functional properties
The homogeneity and molecular mass of the 350 kDa supercomplex were
investigated by analytical ultracentrifugation and by size exclusion chromatography with light scattering detection (Prunetti et al., 2010). The precise
protein composition of the edifice was established by mass spectrometry and
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
161
immunodetection. It is composed of three partners, the Sqr, the bc1 complex, and the cytochrome c oxidase II. Although the association between
the two complexes (bc complex and oxidase) was already described in prokaryotes and mitochondria (Gao et al., 2012; Guiral et al., 2009; Lenaz &
Genova, 2010), this is the first time that Sqr is purified in a protein complex.
Optical room temperature spectra confirmed the presence of hemes c
with signals in the reduced state at 424 and 554 nm, hemes b with signals
at 424 and 561 nm, and cytochrome c oxidase with signal at 448 nm (a small
peak is also visible around 600 nm). As already mentioned above, visible
spectroscopy showed that the cytochrome c oxidase II contained in the
supercomplex is a ba3 enzyme. It possesses a positive redox potential heme
b. EPR characterization indicated that the cytochrome c555 m (or less probably
the soluble c555 s exhibiting identical peaks in EPR spectroscopy) is present in
substoichiometric amount in the purified superstructure, and most importantly that the ratio between cytochrome c oxidase and bc1 complex is
1:2. This suggests that the supercomplex contains one cytochrome c
oxidase for one dimeric bc1 complex, consistent with the fact that dimers
of bc1 complexes constitute the minimal and functional unit of this
complex (Cramer, Hasan, & Yamashita, 2011). As the flavin cofactor of
Sqr is not visible by EPR spectroscopy, not detected by optical spectroscopy (because masked by signals arising from cytochromes), and not extractable from Sqr when present in the supercomplex for a precise
quantification by fluorescence (Prunetti & Guiral, unpublished results),
the stoichiometry of the Sqr in the supercomplex was not determined.
However, the presence of one or two molecules of Sqr seems to be consistent with the molecular mass of the protein edifice (Prunetti et al., 2010).
This supercomplex, containing the Sqr, one ba3 cytochrome c oxidase, one
dimeric bc complex, and traces of cytochrome c555, constitutes a novel protein association.
The functional role of the purified supercomplex in the oxidation of
sulfide and reduction of oxygen was shown by determination of enzyme
activities of the three individual enzymes and oxygen consumption measurements. Specific activities of the cytochrome c oxidase, the bc1 complex,
and Sqr engaged in the supercomplex were revealed at 40 C. This is a
strong indication that they are all functional in the purified protein edifice
(Prunetti et al., 2010). Contrary to Sqr, the cytochrome c oxidase and the
bc1 complex are not active at 25 C (Prunetti & Guiral, unpublished results). Enzyme activities of cytochrome c oxidase and Sqr were also visualized on native gel after migration of the supercomplex (Prunetti et al.,
162
Marianne Guiral et al.
2010). The reduction of O2 by the purified supercomplex, using Na2S as
electron donor, was measured at 60 C with a Clark electrode. The protein
association is able to transfer electrons from Na2S to O2, and this reaction is
sensitive to cyanide, an inhibitor of cytochrome c oxidases, as well as to
antimycin A, a quinone analogue. The edifice thus contained all the components required to catalyze the electron transfer. These results are essential because they strongly suggest that (i) the purified complex is an active
H2S oxidase–O2 reductase enzymatic entity; (ii) in addition to the cytochrome c555, quinone molecules, shuttling electron between Sqr and bc
complex, are retained in the supercomplex; and (iii) this novel supercomplex can be considered as a complete respirasome resulting from the
association of consecutive enzymes involved in H2S/O2 pathway
(Prunetti et al., 2010).
3.3.2 Stability
The purified supercomplex was found to be highly stable to the denaturing
agent urea. It is not significantly dissociated even after incubation with a high
urea concentration for several hours (Prunetti & Guiral, unpublished results)
(Fig. 4.10A). Identically, dissociation of the superstructure in its three components was not possible after treatment with detergents at various temperatures.
As investigated by blue-native electrophoresis and in-gel detection of the cytochrome c oxidase activity, Triton X-100, described as a nonionic mild detergent, does not destabilize the interaction between the enzymes inside the
complex, even at a final concentration of 6% (Fig. 4.10B). The majority of
the supercomplex entities are still intact and active (for the oxidase) after incubation with the strong ionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) at a concentration as high as 0.5% or 1% (Fig. 4.10B). In these conditions, a small
fraction of a smaller protein entity of about 200–250 kDa, which contains at
least the cytochrome c oxidase, is released. This was confirmed using twodimensional blue-native/blue-native gels and denaturation of the supercomplex in the gel with SDS after the first dimension (Fig. 4.10C). In addition
to the entire supercomplex, a subcomplex of about 240 kDa containing at least
the cytochrome c oxidase and the bc1 complex (with an unknown stoichiometry) and a nonactive subcomplex of about 140 kDa were dissociated from the
large complex (Prunetti & Guiral, unpublished results). The isolated A. aeolicus
complex I was also found to be rather stable in the presence of SDS (Guiral
et al., 2009; Peng et al., 2003). This suggests that the association between bc1
complex and cytochrome c oxidase constitutes the highly stable “core” of
the A. aeolicus supercomplex (Gao et al., 2012). This is in good agreement
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
A
M
kDa
Urea
0
3
5
163
C
6
1 D = BN
8
480
242
B
M
1046
1
2
3
4
480
246
350
240
2D = BN + SDS
720
142
Figure 4.10 Stability and dissociation of the A. aeolicus sulfide-oxidase/oxygenreductase supercomplex. (A) Migration of the Sqr-bc1 complex-ba3 oxidase purified
supercomplex on a 5–15% blue-native gel after incubation with various amounts of
urea. Incubation was performed at room temperature. 5 mg of proteins were loaded
in each lane, they were stained with Coomassie blue. M indicates Molecular mass
markers. (B) Dissociation of the purified supercomplex after incubation with detergents.
Supercomplex was incubated before migration 1 h at 37 C with no detergent (lane 1),
6% (w/v) Triton X-100 (lane 2), 0.5% (w/v) SDS (lane 3), and 1% (w/v) SDS (lane 4). The
supercomplex was allowed to migrate on a 4–12% blue-native gel, and the in-gel cytochrome c, oxidase activity was revealed. Proteins (20 mg) were loaded in each lane. (C)
Dissociation of the supercomplex using SDS, visualized by two-dimensional blue-native
gel. After separation in the first dimension (5–15% blue-native gel), 150 mg of the supercomplex was dissociated in-gel by a treatment with 1% SDS (1 h at 37 C), and separated by a second dimension identical to the first one. Cytochrome c oxidase was
revealed in-gel. 350 and 240 indicate the approximate molecular mass of the supercomplex and a subcomplex, respectively. BN is for blue-native gel.
with the specific association already described in other bacteria or archaea like
Bacillus PS3, Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium smegmatis, or Sulfolobus
(Iwasaki, Matsuura, & Oshima, 1995; Keefe & Maier, 1993; Megehee, Hosler,
& Lundrigan, 2006; Niebisch & Bott, 2003; Sone, Sekimachi, & Kutoh, 1987)
and in the mitochondrial membrane of a variety of organisms.
The extreme insensibility of A. aeolicus supercomplex to detergents or
other denaturing agents is not a general feature of respiratory membranebound supercomplexes. Indeed, interactions between constituents of supercomplexes from prokaryotes or mitochondria are described to be rather
weak (Niebisch & Bott, 2003; Wittig, Carrozzo, Santorelli, & Schägger,
2006). For example, mitochondrial supercomplexes are dissociated with
164
Marianne Guiral et al.
low amount of dodecyl maltoside without any incubation (detergent only
present in the cathode buffer of blue-native gel is sufficient for
dissociation) (Wittig et al., 2006). This exceptional stability probably
explains why this supercomplex is one of the few that can be purified to
homogeneity with several chromatographic steps.
3.3.3 Influence of physiological partners on Sqr properties
Taking the advantage that Sqr was available in the isolated state and associated to its partners into the supercomplex, some properties of this enzyme in
both states were compared. Indeed, one of the proposed advantages of the
existence of respiratory membrane-bound supercomplexes in the literature
is the structural stability of the individual component when in interaction
compared to the isolated state (Lenaz & Genova, 2010). This was demonstrated for mitochondrial and bacterial complex I (Stroh et al., 2004). However, the thermostability of A. aeolicus Sqr was determined to be the same
whatever it is engaged or not in a complex. It thus seems that interaction
of Sqr with other components of the supercomplex does not stabilize this
enzyme. This is probably due to the high stability of this enzyme to high
temperature when it is free (see above) (Prunetti et al., 2010).
Conversely, Sqr embedded in the multiprotein complex has slightly different
kinetic properties than the pure enzyme, such as a Michaelis constant Km for the
quinone lower when Sqr is in complex, suggesting a higher affinity for this substrate in these conditions. Moreover, it was shown that oligomeric state of the
Sqr is different according to whether it is free or associated with cytochrome c
oxidase and bc1 complex (Prunetti et al., 2010). These findings suggest that interaction of the H2S/O2 pathway constituents into a superstructure modifies at
least the properties of the Sqr and this may have consequences on the regulation
of the entire metabolic pathway. This kind of behavior was already pointed out
for soluble enzymes inserted in multiprotein complexes (Lebreton, Graciet, &
Gontero, 2003). Moreover, this is compatible with the idea of the in vivo existence of two pools of Sqr in A. aeolicus (Prunetti et al., 2010).
3.4. Putative A. aeolicus enzymes involved in sulfide oxidation
Genes encoding putative proteins annotated as sulfide dehydrogenase
are found in the genomic sequence. dhsU (or aq_232, FCC) and fccB0
(or aq_235, sulfide dehydrogenase, flavoprotein subunit) might be included
in a same operon together with the gene soxF (aq_234) putatively coding for
a Rieske-I iron–sulfur protein (Table 4.3). These two FAD containing
Table 4.3 Putative or characterized A. aeolicus proteins involved in energy sulfur metabolism
Gene
Locus tag
Protein name
Function
P/C
References
Sulfur reduction
C
Guiral, Tron, et al.
(2005)
Sulfide quinone
reductase
H2S oxidation
C
aq_455
Sulfur oxygenase
reductase
Disproportionation of S0
C
Pelletier et al. (2008)
aq_477
Sulfur-binding -donating
protein
Rhodanese, sulfur
oxidation, and reduction
C
Giuliani et al. (2007),
Aussignargues et al.
(2012)
aq_1811
Thioredoxin (SoxW)
Thiosulfate/sulfur
oxidation
P
Sulfur reductase
sreAa
aq_1234
Sulfur reductase chain A
sreB
aq_1232
Sulfur reductase chain B
sreC
aq_1231
Sulfur reductase chain C
Sulfide quinone reductase
sqr
aq_2186
Sulfur oxygenase reductase
sor
SbdP
sbdP
Sox
trxA2
Continued
Table 4.3 Putative or characterized A. aeolicus proteins involved in energy sulfur metabolism—cont'd
Gene
Locus tag
Protein name
Function
P/C
aq_1810
aq_1810
SoxY
aq_1809
aq_1809
SoxZ
aq_1807
aq_1807
SoxA
aq_1806
aq_1806
SoxX
soxB
aq_1803
Sulfur oxidation protein
SoxB
aq_1802
aq_1802
Hypothetical protein
aq_1800
aq_1800
Hypothetical protein
rhdA2
aq_1799
Thiosulfate
sulfurtransferase
cphA1
aq_1798
SoxH
aq_389
aq_389
Hypothetical protein
(DsrE/F-like family)
aq_390
aq_390
Hypothetical protein
(DsrE/F-like family)
aq_391
aq_391
Heterodisulfide reductase
subunit C, HdrC
References
HdrABC
Disulfide reduction or
oxidation
P
Quatrini et al. (2009)
aq_392
aq_392
Heterodisulfide reductase
subunit B, HdrB
aq_394
aq_394
Heterodisulfide reductase
subunit B, HdrB
hdrA
aq_395
Heterodisulfide reductase
subunit A, HdrA
aq_397
aq_397
Hypothetical protein
hdrC
aq_398
Heterodisulfide reductase
subunit C, HdrC
hdrB
aq_400
Heterodisulfide reductase
subunit B, HdrB
hdrD
aq_961
Heterodisulfide reductase
aq_963
aq_963
Hypothetical protein,
renamed cyt bII
aq_1081
Bifunctional sulfate
adenylyltransferase/
adenylylsulfate kinase
protein
HdrDE
P
Guiral, Tron, et al.
(2005)
P
Yu, Lansdon, Segel, and
Fisher (2007)
ATP sulfurylase
cysD
Sulfite oxidation
Continued
Table 4.3
Gene
Putative or characterized A. aeolicus proteins involved in energy sulfur metabolism—cont'd
Locus tag
Protein name
Function
P/C
References
SoxF
dhsU
aq_232
Flavocytochrome C
sulfide dehydrogenase
(SoxF1)
fccB0
aq_235
Sulfide dehydrogenase,
flavoprotein subunit
(SoxF2)
a
H2S/sulfur oxidation
P
Verté et al. (2002)
Originally, sre genes were annotated dms (Guiral, Tron, et al. (2005)). P indicates putative protein and C indicates characterized protein or complex.
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
169
hypothetical proteins are predicted to be located in the periplasmic space as
they all contain a twin-arginine motif in their N-terminal part. These three
proteins were called SoxF1, PetA2 and SoxF2 (encoded by dhsU, soxF and
fccB 0 , respectively) by Verté et al. (2002). DhsU protein was identified in the
membrane fraction of A. aeolicus growing with hydrogen, oxygen, and elemental sulfur (Guiral et al., 2009). As mentioned above, FCC involved
in sulfide oxidation is composed of a FAD-binding subunit and a cytochrome c. The cytochrome c subunit gene is absent in the operon and
not detected elsewhere in the genomic sequence.
4. ELEMENTAL SULFUR AND OXIDIZED SULFUR
COMPOUNDS ENERGY METABOLISM
Sulfur is an element with a complex chemistry, and inorganic sulfur
compounds are found in nature in a wide range of oxidation states (from
2 to þ 6). They can either be oxidized up to sulfate (SO4 2 ) or reduced
to sulfide (H2S). Consequently, they are used as electron donor or acceptor
by numerous microorganisms (Ghosh & Dam, 2009; Suzuki, 1999).
Microbial metabolisms based on inorganic sulfur compounds are thus
frequently elaborated involving multiple different enzymes. A. aeolicus uses
sulfur compounds for growth, including at least thiosulfate, elemental sulfur
(in the form of flowers of sulfur) as well as sulfide (Deckert et al., 1998;
Guiral, Tron, et al., 2005; Prunetti et al., 2010), and dispose of a pleiad of
enzymes and proteins related to sulfur compounds metabolism.
4.1. Many enzymes. . .
4.1.1 Reductive pathway
The processes by which microorganisms reduce elemental sulfur to hydrogen sulfide are still unclear for most of them, and only few enzymes involved
in this respiration have been purified and characterized. The activity of sulfur
reduction has been found associated to soluble and/or to membraneassociated proteins. If we focus on elemental sulfur reduction with hydrogen
as electron donor, the best characterized system is the hydrogenase/polysulfide reductase (Psr) from the mesophilic bacterium Wolinella succinogenes
(Hedderich et al., 1999; Klimmek, 2005). This pathway couples the
oxidation of hydrogen to polysulfide reduction using quinone as
intermediate which can be directly reduced by the hydrogenase
(Hedderich et al., 1999). Studies performed with extremophilic archaea
A. ambivalens and Pyrodictium abyssi as model organisms demonstrate that
170
Marianne Guiral et al.
hydrogen oxidation with elemental sulfur as electron acceptor requires at
least two enzymes, that is, a hydrogenase and a sulfur or polysulfide
reductase (SR/Psr), both membrane bound as it has been described in
W. succinogenes (Dirmeier, Keller, Frey, Huber, & Stetter, 1998; Laska
et al., 2003). In A. aeolicus, a multiprotein sulfur-reducing membranebound supercomplex, coupling hydrogen oxidation to sulfur reduction in
the presence of quinone, has been purified from cells grown on elemental
sulfur in addition to hydrogen and oxygen (Guiral, Tron, et al., 2005). It
contains at least hydrogenase II and a molybdoenzyme annotated DMSO
reductase in A. aeolicus genome that has been renamed Sre for SR
(Table 4.3). The hydrogenase consists of at least three subunits (large and
small hydrogenase subunits and a probable cytochrome bII, see Section 2).
The SR enzyme is composed of SreA, SreB, and SreC (Guiral, Tron,
et al., 2005.). As in A. aeolicus and in contrast to W. succinogenes, a
copurification of hydrogenase and SR as a supercomplex has been
described in A. ambivalens and P. abyssi with a molecular mass around
520 kDa for the P. abyssi complex (Dirmeier et al., 1998). In P. abyssi,
the complex with hydrogen:sulfur oxidoreductase activity was composed
of nine different subunits containing a [NiFe] hydrogenase, SR, and
hemes b and c. The hydrogenase–SR complex from A. ambivalens
contains at least four proteins but not cytochrome c (Laska et al., 2003).
This hydrogenase–SR supercomplex is one of the rare examples of an
entire electron transport chain present in a single complex.
Investigations on the A. aeolicus SR were hampered because the enzyme
could not be purified without the hydrogenase part. The gene cluster encoding
the A. aeolicus SR consisted of three open-reading frames, sreABC. A sequence
analysis of sreA and sreB showed similarity with the catalytic and the [Fe–S]
cluster subunits of molybdoproteins of the DMSO/FDH/nitrate reductases
family, including the SR/Psr molybdoenzymes (Laska et al., 2003). Like all
members of the DMSO reductase family, SR from A. aeolicus probably possesses a bismolybdopterin-guanine dinucleotide (bis-MGD) cofactor as all
the genes implicated in its synthesis are present in the genome. The residue
ligand to Mo cofactor has not been clearly identified but is probably coordinated by a cysteine residue as it is the case in other SR/Psr (Guiral, Tron, et al.,
2005; Jormakka et al., 2008). All molybdoproteins showing a high degree of
sequence similarity with SreA from A. aeolicus present a cysteine (or seleno
cysteine) as putative Mo ligand as well as an atypical [Fe–S] cluster binding
site (Guiral, Tron, et al., 2005). The catalytic subunits SreA/PsrA are likely
to be located on the outside of the membrane in the case of W. succinogenes
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
171
and A. ambivalens in line with the presence of the typical twin-arginine motif at
the N-terminal part of the subunit. However, the N-terminal amino acid
sequence of A. aeolicus SreA does not contain a twin-arginine motif,
suggesting that the protein is not exported over the membrane by the TAT
pathway. One consequence is that the respiratory chain from hydrogen to
elemental sulfur in A. aeolicus comprises two proteins with their catalytic
site having opposite orientations with respect to the cytoplasmic
membrane. SreB subunit is predicted to coordinate four [4Fe–4S] clusters.
The sreC gene encodes a hydrophobic membrane protein with eight
transmembrane helices, without clear homology with SreC/PsrC from
A. ambivalens or W. succinogenes. It does not contain any redox centers, such
as the heme b molecules found in many other membrane-bound bis-MGD
enzymes. In contrast to A. ambivalens, no sreD gene is detected in the
A. aeolicus operon suggesting a lack of specific chaperon similar to the
maturation protein TorD which is a system-specific chaperone protein
involved in the introduction of the molybdenum cofactor into the protein
(Genest, Méjean, & Iobbi-Nivol, 2009).
The sulfur-reducing quinone-dependent activity is increased by
NADPH, by a factor 3–10 depending on the enzyme preparation. NADPH
does not have any effect on hydrogenase activity. Due to the cytoplasmic
localization of SR from A. aeolicus, we can suppose a direct interaction between NADPH and SR. The potential NADPH-binding motif described in
the molybdoenzyme biotin sulfoxide reductase is present in SreA from
A. aeolicus (Guiral, Tron, et al., 2005). In contrast to P. abyssi, no cytochrome c is involved in this kind of electron transfer in A. aeolicus. This is
also in accordance with the possible role of these cytochromes in the electron transfer chain from bc1 complex to cytochrome oxidase (Prunetti et al.,
2010) and with the cytoplasmic localization of sulfur reduction.
Although not demonstrated in A. aeolicus, the reduction of sulfur compounds using electrons from hydrogen, by the sulfur-reducing supercomplex,
is probably an energy-generating respiratory process. The functioning of the
equivalent supercomplex isolated from the archaeon A. ambivalens allows energy synthesis as the microorganism is able to grow using exclusively hydrogen
as electron donor and elemental sulfur as electron acceptor. The generation of
an electrochemical gradient would require a redox loop mechanism as proposed for the E. coli nitrate reductase/formate dehydrogenase system. Protons
would be taken up by quinone upon reduction on the cytoplasmic side of the
membrane and released to the outside upon reoxidation (Laska et al., 2003).
Similarly, W. succinogenes grows by oxidative phosphorylation with polysulfide
172
Marianne Guiral et al.
as terminal electron acceptor and hydrogen as electron donor, which involves
a membrane-bound hydrogenase and a polysulfide reductase. A mechanism of
polysulfide respiration was proposed leading to the formation of 0.33 mol
ATP per mol hydrogen (Dietrich & Klimmek, 2002). Moreover, the
three-dimensional structure of the polysulfide reductase of the thermophilic
bacterium T. thermophilus suggests that it could be a key energy-conserving
enzyme of the respiratory chain of this bacterium, utilizing polysulfide as
the terminal electron acceptor and pumping protons across the membrane
via quinone (Jormakka et al., 2008).
4.1.2 Oxidative pathways
Sulfide oxidation is mediated, as already stated above, by the sulfideoxidase–oxygen-reductase supercomplex containing the Sqr (Table 4.3)
(Prunetti et al., 2010). In addition, the SOR enzyme catalyzes a disproportionation of elemental sulfur in the presence of oxygen in A. aeolicus (Pelletier et al.,
2008) (Table 4.3). sor genes are not widespread in nature and have been identified only in few microorganisms (Veith, Botelho, Kindinger, Gomes, &
Kletzin, 2012). This large oligomeric (around 600 kDa estimated by bluenative gel) enzyme is present in the cytoplasm of the bacterium and possesses
low-potential mononuclear nonheme iron sites as the putative redox-active
cofactor indispensable for the activity. It was shown that the three
Fe-coordinating residues and a persulfurated cysteine, binding the sulfur substrate, are essential for catalysis (Chen, Jiang, She, Liu, & Zhou, 2005; Urich,
Gomes, Kletzin, & Frazão, 2006). It produces sulfite and sulfide according to
the reaction: 4S0 þ O2 þ 4H2 O ! 2HSO3 þ 2HS þ 4Hþ . A nonenzymic
reaction leading to the formation of thiosulfate is also observed under excess of
elemental sulfur (Pelletier et al., 2008). Sulfite, thiosulfate, and hydrogen
sulfide are formed at various stoichiometries depending on pH and
temperature (Veith et al., 2012). As the enzymes from Acidianus species
(Sun, Chen, He, Zhou, & Liu, 2003; Urich et al., 2004), A. aeolicus SOR is
inactive at 20 C and presents a maximum activity at high temperatures
(Pelletier et al., 2008). Conversely, SOR from the mesophilic bacterium
Halothiobacillus neapolitanus is active in a wide range of temperature
(10–99 C) with an optimum at 80 C. This unexpected spectrum in
activity was proposed to be an apparent adaptative response to substrate
limitation at mesophilic conditions, allowing efficient sulfur-based energy
metabolism (Veith et al., 2012). The X-ray crystallographic threedimensional structure of A. ambivalens (Urich et al., 2006) and Acidianus
tengchongensis SOR (Li et al., 2008) was determined. They showed that
these enzymes are built from 24 subunits, each forming a large (15 nm
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
173
diameter) hollow sphere with the minimal building block being a subunit
dimer. SOR of H. neapolitanus adopts secondary and quaternary structures
similar to those of the 24-subunit enzymes from hyperthermophiles (Veith
et al., 2012).
4.1.3 Rhodaneses
Rhodaneses belong to the sulfurtransferase family of enzymes and are found
in organisms from all three domains of life. Rhodaneses in vitro catalyze the
transfer of a sulfur atom from thiosulfate to cyanide. According to the generally accepted mechanism, the enzyme cycles between two distinct forms
during catalysis, the free enzyme and a covalent enzyme-sulfur intermediate
characterized by a persulfide bond (R
S
SH) at the sulfhydryl group of
the catalytic cysteine residue (Cipollone, Ascenzi, & Visca, 2007):
SSO3 2 þ Rho SH ! SO3 2 þ Rho S SH
Rho S SH þ CN ! Rho SH þ SCN
Rhodaneses act as a carrier for reactive sulfur atoms by forming persulfide
intermediates, and they are known to play a critical role in sulfur traffic by
delivering sulfur in a “safe” chemical species to biosynthetic pathways, using
their labile persulfide group. A. aeolicus presents four genes encoding
rhodaneses: two of them are tandem-domain proteins RhdA1 and RhdA2,
while Aq_477 (renamed SbdP; Aussignargues et al., 2012; Giuliani et al.,
2007) and Aq_1599 (renamed RhdB2, Giuliani et al., 2010) are two singledomain proteins, which were not identified by the annotation of the
genome. Although RhdA1 and RhdA2 have still never been detected in
A. aeolicus cells, the two single-domain rhodaneses were characterized.
These two enzymes were the first single-domain rhodaneses characterized
from a hyperthermophilic bacterium (Giuliani et al., 2010, 2007).
Moreover, they are the only single-domain enzymes presenting an
oligomeric thermoactive and thermostable organization. As described in
Section 4.2.1, a contribution of SbdP in the energy sulfur utilization was
recently proposed as this cytoplasmic rhodanese physically interacts with the
sulfur-reducing complex as well as the SOR from A. aeolicus (Table 4.3)
(Aussignargues et al., 2012). Expression of RhdB2 is associated with a shift
from planktonic lifestyle to an adherent behavior of A. aeolicus cells and
depends on the sulfur source (gene upregulated in cells grown with
elemental sulfur). This periplasmic rhodanese could have a role in this
acclimation process, which remains to be elucidated (Giuliani et al., 2010).
174
Marianne Guiral et al.
4.1.4 Putative enzymes
Besides these biochemically characterized enzymes, several putative sulfuroxidizing or reducing systems are inferred from the genomic sequence
(Deckert et al., 1998).
4.1.4.1 Sox system
A putative thiosulfate oxidizing mutiprotein complex is encoded by a gene
cluster containing at least 10 genes (Table 4.3) (Ghosh, Mallick, &
DasGupta, 2009; Miyake et al., 2007; Sano et al., 2010; Verté et al.,
2002). This Sox multienzyme system, found in numerous phototrophic
and chemotrophic sulfur-oxidizing bacteria, is responsible for the
oxidation of thiosulfate to sulfate or to sulfur species incorporated in
sulfur globules, depending on the presence or not of the soxCD genes
which encode a heterotetrameric molybdoprotein cytochrome c complex
(Bardischewsky et al., 2005). Only the periplasmic core enzymes were
found to be essential for oxidizing activity: SoxAX, a heterodimer
containing c-type hemes; SoxYZ, a heterodimer with a cysteine residue
which covalently binds the sulfur substrate; and SoxB, a monomeric
dimanganese protein. Reconstituted systems are able to perform
thiosulfate-, sulfite-, sulfur-, and hydrogen-sulfide-dependent cytochrome c
reduction (Rother, Henrich, Quentmeier, Bardischewsky, & Friedrich,
2001). It is currently not known whether Sox proteins are operating or not
(and in which growth conditions) in the periplasmic space of A. aeolicus.
Genes for the required SoxAXYZB are present in the gene cluster which
lacks soxCD suggesting an incomplete oxidation by these proteins.
Temperature-dependent thiosulfate oxidizing activity was already
demonstrated in H. thermophilus, an Aquificale belonging to the same family
as A. aeolicus (Sano et al., 2010).
4.1.4.2 Heterodisulfide reductases
A putative operon containing nine genes encodes one (or several)
heterodisulfide reductase (Hdr) complex as well as hypothetical proteins
with DsrE/F-like proteins homology and a putative protein with unknown
function (Table 4.3). Hdr has a key function in the energy metabolism of
Archaea in which they catalyze the reversible reduction of the disulfide substrate called CoM-S-S-CoB (Buan & Metcalf, 2010; Hedderich et al., 1999).
They have also been found in sulfate-reducing microorganisms (Mander,
Pierik, Huber, & Hedderich, 2004). One type of Hdr is a three-subunit
complex (HdrABC) containing iron–sulfur clusters and FAD and forms a
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
175
tight complex with the F420-nonreducing hydrogenase (Buan & Metcalf,
2010; Mander et al., 2004). In A. ferrooxidans and the thermoacidophilic
archeon Metallosphaera sedula, a similar operon with conserved gene
organization as the one in A. aeolicus was detected at the genomic level.
HdrABC and the sulfur metabolism accessory proteins encoded by genes
of this operon (a rhodanese-like protein, absent in A. aeolicus operon, a
SirA-like protein belonging to a sulfur relay system, and a DsrE family
protein possibly involved in sulfur transfer reactions) are predicted to be
involved in reduced inorganic sulfur compounds oxidation in both
microorganisms. Most of these genes for these Hdr-related components
are, indeed, upregulated when Acidithiobacillus or Metallosphaera grow with
elemental sulfur or tetrathionate compared to ferrous iron as electron
donor (Auernik & Kelly, 2008; Mangold, Valdés, Holmes, & Dopson,
2011; Quatrini et al., 2009). Quatrini and coworkers hypothesize that the
cytoplasmic HdrABC complex in A. ferrooxidans and A. aeolicus could
function in reverse, using the proton gradient, to oxidize disulfide
intermediaries to sulfite and deliver the electrons to the quinone pool in
the membrane. They also proposed that the accessory proteins possibly
transfer the sulfur substrate (currently unknown but proposed to be
sulfane sulfur of GSnH with n > 1, GSH being the glutathione) to Hdr
(Quatrini et al., 2009; Rohwerder & Sand, 2003). However, these
suggestions are awaiting experimental evidences. In addition to the
Aquificales Hydrogenobaculum sp. and Hydrogenivirga sp., a similar operon
was also found in the genomic sequence of various species of the sulfur
oxidizer Sulfolobus (Auernik & Kelly, 2008; Quatrini et al., 2009).
A second type of Hdr, called HdrDE, reduces also a disulfide as substrate
in Archaea using electrons from quinol or methanophenazine (Buan &
Metcalf, 2010; Hedderich et al., 1999; Mander et al., 2004). This
membrane-bound enzyme is composed of a small subunit containing two
hemes b and a large subunit with iron–sulfur clusters and produces a
proton-translocating oxidation–reduction loop (Künkel, Vaupel, Heim,
Thauer, & Hedderich, 1997; Simianu, Murakami, Brewer, & Ragsdale,
1998). As mentioned in Section 2, genes encoding proteins resembling
these two Hdr subunits (sometimes referred as isp1 and isp2) were found
between genes coding for the large and small subunits of [NiFe]
hydrogenases in some organisms. These genes exhibit also similarity to
Dsr subunits of the dissimilatory sulfite reductase (Dsr) complex (Dahl
et al., 1999; Grein, Pereira, & Dahl, 2010; Palágyi-Mészáros et al., 2009).
In A. aeolicus, these two genes related to HdrDE (hdrD and aq_963
176
Marianne Guiral et al.
renamed cytbII; Table 4.3 and Fig. 4.4) are located between mbhS2 and
mbhL2 genes for the membrane-bound hydrogenase II (Brugna-Guiral
et al., 2003; Guiral, Tron, et al., 2005). This hydrogenase, as stated
above, was shown to be involved in sulfur reduction, through its
functional interaction with the sulfur reductase enzyme, as is in the case
of A. ambivalens (Laska et al., 2003). Although the cytochrome bII was
proposed to be an anchor for the two-subunit hydrogenase in A. aeolicus
as well as in A. ambivalens, the presence of HdrD (or the corresponding
Isp2) in this sulfur-reducing complex was not demonstrated for these two
organisms (Guiral, Tron, et al., 2005; Laska et al., 2003). The
physiological function of this HdrD/Isp2 subunit is completely unknown.
However, by analogy with the archaeal HdrDE, the hypothesis that
corresponding proteins in the above cited species might be involved in
uncharacterized redox disulfide substrate utilization coupled to hydrogen
metabolism cannot be discarded (Palágyi-Mészáros et al., 2009.
4.2. . . .many possibilities
4.2.1 Internalization of elemental sulfur and oxidation/reduction
pathways
A. aeolicus is able to grow with solid sulfur (flowers of sulfur, mainly composed of S8 sulfur rings) (Guiral, Tron, et al., 2005). A sulfur-dependent bacterial adherence linked to an absence of flagellin was conserved, suggesting a
possible role for sulfur detection by A. aeolicus (Giuliani et al., 2010). Enzymatic utilization of this substrate, as already pointed out earlier for other
sulfur-oxidizing organisms, is likely preceded by an activation reaction step
of the sulfur because of the great insolubility of this hydrophobic species in
water (Frigaard & Dahl, 2009; Ghosh & Dam, 2009; Rohwerder & Sand,
2003; Sakurai, Ogawa, Shiga, & Inoue, 2010). Moreover, a sulfur uptake
is required to be consumed inside the cells. However, transport and
transformation of this sulfur compound are yet unknown in A. aeolicus as
well as in other species. It was postulated in Acidithiobacillus and
Acidiphilium spp. that extracellular S8 sulfur is mobilized and transported
into the periplasm as persulfide sulfane sulfur by thiol groups of outermembrane proteins (Rohwerder & Sand, 2003). This persulfide sulfur
might be subsequently oxidized by periplasmic sulfur dioxygenases in
these species. Another strategy could be the excretion by microorganisms
of reducing substances that can modify external sulfur substrates distant
from the cells (Frigaard & Dahl, 2009). In green sulfur bacteria, the
involvement of SoxW, a periplasmic protein containing a thioredoxin
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
177
motif and a membrane protein annotated as “thiol disulfide interchange
protein DsbD,” was hypothesized to be involved in sulfur species transfer
across the inner membrane from periplasm to cytoplasm (Sakurai et al.,
2010). In A. aeolicus, the mechanism by which sulfur is transferred
through the outer and inner membranes inside the cell might also involve
thiol-containing proteins not yet identified (Fig. 4.11).
Depending on growth conditions (e.g., the available oxygen concentration), sulfur can be reduced by A. aeolicus through the sulfur-reducing supercomplex (Fig. 4.11). Various electron acceptors can be used by this complex
in vitro (Guiral, Tron, et al., 2005). However, it is probable that elemental
sulfur is not the form preferentially reduced by this enzyme in vivo.
Sulfur can also be used as an electron donor. In general terms, biochemical
pathways for elemental sulfur oxidation are poorly understood. In numerous
bacteria, oxidation of intracellular sulfur is mediated by the cytoplasmic Dsr
system encoded by dsr gene cluster (Friedrich, Bardischewsky, Rother,
H2S
S2O3
S0
H2S
OM
?
?
?
Periplasm
S*
S2O3
Sox F1/F2
SOX
H2S
S*
H+
S*
Sqr
Hase II
Complex I
?
NADH?
?HdrD
HdrABC
?
S*
S*
S2O3
O2
?
H2S
Sqr Q
Q
bc
ba3
IM
ox
O2
H2O
SR
H2S
out
H2S
SOR
SbdP
Hase I
S*
S*
S*
H+ S*
Q
–
SO3
H2
H2
2–
APS +P
S2O3
SO3
?
SO4
+ATP
?
ATP sulfurylase
Cytoplasm
Figure 4.11 Model for H2, O2, and sulfur compounds utilization in A. aeolicus. Known and
putative pathways are depicted. S* represents internal activated unknown sulfur species
(see text for details). Hase is for hydrogenase, bc for dimeric bc1 complex, ox for oxidase,
SR for sulfur reductase, Q for quinone, S0 for insoluble elemental sulfur, IM for inner membrane, and OM for outer membrane.
178
Marianne Guiral et al.
Quentmeier, & Fischer, 2005; Frigaard & Dahl, 2009), lacking in A. aeolicus.
In A. aeolicus, the initial sulfur-oxidizing enzyme might be the SOR present in
the cytoplasmic compartment as it is the case in A. ambivalens (Kletzin, Urich,
Müller, Bandeiras, & Gomes, 2004) and Acidithiobacillus species (Mangold
et al., 2011) (Fig. 4.11). S8 can be used in vitro by the purified SOR
(Kletzin et al., 2004; Pelletier et al., 2008); however, linear sulfur substrates
are again probably preferred in vivo, in accordance with cyclooctasulfur
transformation prior to utilization. Indeed, the A. ambivalens SOR
architecture indicates that the disproportionation reaction takes place in a
“reaction chamber” inside the enzyme, separated from the cytoplasmic
space. The substrate probably penetrates in the spherical enzyme using the
chimney-like protrusions, and it was proposed that linear, more soluble
polysulfide Sn 2 , could more easily pass than the sulfur rings, to finally
bind the persulfurated cysteine in the active-site pocket (Urich et al.,
2006). Recent studies have demonstrated that A. aeolicus cytoplasmic
thiosulfate rhodanese SbdP (see Section 4.1.3) is able to interact with
SOR. This rhodanese can bind five sulfur atoms on its catalytic cysteine in
the presence of flowers of sulfur and most probably donates its linear sulfur
chain to the SOR (Aussignargues et al., 2012). It was also shown that this
rhodanese can interact with the sulfur-reducing supercomplex and most
importantly enhance its reducing activity. The proposed physiological
function for this former enzyme is likely to transport and transfer long
sulfur chain to cytoplasmic sulfur-utilizing enzymes like a shuttle carrying
reactive sulfur compounds to enzymes of the energy sulfur metabolism
(Fig. 4.11 and Table 4.3). This function is reminiscent of the polysulfidesulfur transferase Sud from W. succinogenes, the characterization of which
revealed for the first time a direct intervention of a rhodanese-like protein
in energy sulfur metabolism, as this protein is the sulfur donor for the
terminal acceptor of respiratory chain Psr in this bacterium (Klimmek
et al., 1998). Inclusions containing sulfur have been observed in A. aeolicus
cytoplasm when the bacterium grows in the presence of elemental sulfur.
These kinds of sulfur structures are usually present either in the periplasmic
compartment or in the extracellular environment. In any case, the
chemical nature of sulfur in the globules is still a debated question as three
different forms of it have been proposed depending of the considered
microorganism: cyclooctasulfur (S8), polythionates ([(SnSO3)2]2 ), and
sulfur chains (Prange et al., 2002). It could be envisaged that SbdP might
transfer sulfur from these inclusions to the enzymes of sulfur metabolism.
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
179
In A. ambivalens, it was proposed that SOR does not directly contribute
to the gradient of protons across the membrane but most probably produces
sulfur compounds subsequently used by membrane-embedded energetic
enzymes (Brito et al., 2009; Kletzin et al., 2004; Müller et al., 2004).
SOR was described as a soluble cytoplasmic enzyme, but it was proposed
to be membrane associated in A. tengchongensis (Chen et al., 2005). In
A. aeolicus, the majority of this enzyme is soluble in the cytoplasm, while
a fraction is found associated with the membrane (Aussignargues et al.,
2012). This subcellular localization is compatible with a comparable
mechanism in A. aeolicus, with the subsequent consumption of hydrogen
sulfide, produced by SOR, by the periplasmic Sqr leading to oxygen
reduction and protons translocation by the supercomplex (Prunetti et al.,
2010). It can also be considered that the produced sulfide is reoxidized by
free Sqr enzyme (the one not integrated in the supercomplex; Prunetti
et al., 2010) to produce a reduced quinone pool that could in turn
reduce the quinol oxidase (Nübel et al., 2000) or other membrane-bound
enzymes. The Sox system as well as the periplasmic uncharacterized
putative proteins annotated as sulfide dehydrogenase (SoxF mentioned
above) could also participate to sulfide oxidation (Fig. 4.11, Table 4.3).
Sulfite, another toxic product generated by sulfur disproportionation
catalyzed by SOR, is probably oxidized to sulfate by a currently
undiscovered cytoplasmic process in A. aeolicus (see section below).
4.2.2 Other putative oxidative pathways
4.2.2.1 Thiosulfate oxidation
As mentioned in Section 4.1.4.1, thiosulfate is putatively oxidized by the
truncated soluble Sox system in the periplasmic space, releasing sulfur species
products (sulfur or polysulfide) which might be, by an unknown mechanism, integrated into sulfur globules to be further oxidized. Indeed, sulfate
is usually produced by complete Sox system, that is, containing SoxCD, absent in A. aeolicus. However, when cultivated with thiosulfate, oxygen, and
hydrogen, no sulfur globules were detected microscopically (Guiral, Tron,
et al., 2005), suggesting a very transient deposit of sulfur and/or a rapid oxidation of this sulfur compound to sulfate without any sulfur storage. The
absence of the soxCD genes suggests that the oxidation route to sulfate is
different and might be cytoplasmic as hypothesized below. Oxidation of
thiosulfate by Sox components leads to cytochrome c reduction with
2 mol of electron produced per mol of thiosulfate (in the absence of SoxCD;
180
Marianne Guiral et al.
Friedrich et al., 2005), implying that it is linked to oxygen reduction by a
cytochrome c oxidase (Fig. 4.11).
4.2.2.2 Sulfite oxidation
Sulfite, despite being toxic, is known to be the main intermediate in the oxidation of sulfur compounds to sulfate. Two main mechanisms for sulfite oxidation have been described: the indirect one involving the adenylylsulfate
(APS) reductase and the ATP sulfurylase, and the direct one involving a single molybdenum sulfite oxidase (Frigaard & Dahl, 2009; Ghosh & Dam,
2009; Kappler, 2011; Kappler & Dahl, 2001; Kletzin et al., 2004;
Zimmermann, Laska, & Kletzin, 1999). Sulfite was also found to be
oxidized by the membrane-bound aa3 cytochrome c oxidase from
A. ferrooxidans D3-2 (Sugio, Ako, & Takeuchi, 2010). While the indirect
route occurs in the cytoplasm and allows ATP synthesis by substrate level
phosphorylation, the direct pathway can be either cytoplasmic or
periplasmic. As depicted in Fig. 4.11, it is possible that oxidation of
thiosulfate, elemental sulfur, and hydrogen sulfide all end up producing
cytoplasmic sulfite. As already proposed by Quatrini et al. (2009), a novel
sulfite oxidation pathway might operate in A. aeolicus as well as in
A. ferrooxidans. These bacteria lack the APS reductase genes, although they
have a cytoplasmic ATP sulfurylase (Yu et al., 2007). An uncharacterized
enzyme might replace the APS reductase to produce APS from sulfite, or a
sulfite oxidase directly oxidizing sulfite to sulfate in the cytoplasm might be
present. The Sox system is also a likely candidate for sulfite oxidation
in phototrophic sulfur bacteria (Frigaard & Dahl, 2009). Sulfite oxidation in
A. aeolicus constitutes one of the major points to be elucidated.
4.2.2.3 Disulfide substrates oxidation
As said above, a cytoplasmic HdrABC complex could be involved in sulfur
compound utilization in A. aeolicus (Quatrini et al., 2009). By analogy to
known Hdrs, this putative enzyme might oxidize an unknown disulfide substrate that could be low-molecular-weight thiols like GSH (Mangold et al.,
2011; Quatrini et al., 2009; Rohwerder & Sand, 2003) or glutathione
amide (g-Glu-Cys-Gly-NH2) (Frigaard & Dahl, 2009) produced by some
bacteria such as A. vinosum (Fahey, 2001). The so-called accessory proteins
encoded by genes in the Hdr operon could be involved in sulfur
compound transformation and/or transfer to Hdr (Mangold et al., 2011). It
was hypothesized that the disulfide oxidation by this Hdr enzyme might
lead to sulfite production in A. ferrooxidans and that this reaction
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
181
accompanied by the extrusion of electrons (reduction of quinone pool)
utilizes the naturally existing proton gradient (Mangold et al., 2011;
Quatrini et al., 2009). This obviously needs further biochemical
confirmations in A. ferrooxidans as well as in A. aeolicus.
A possibility that cannot be excluded is that the activated sulfur compound is also oxidized in the periplasmic space by the Sox enzymes as proposed for other sulfur oxidizers (Yamamoto, Nakagawa, Shimamura, Takai,
& Horikoshi, 2010).
Based on genomic sequence analysis and biochemical evidences, it seems
that two types of sulfur-related metabolic pathways exist in A. aeolicus: sulfur
reduction (with hydrogen) and sulfur/thiosulfate/sulfide oxidation (with
oxygen). Metabolism of elemental sulfur is greatly complicated by its activation prior to its utilization. As it was proposed for Acidithiobacillus caldus,
the potential use of HdrABC and/or SOR for elemental sulfur oxidation
by A. aeolicus remains to be resolved (Mangold et al., 2011). Some catalytic
steps during thiosulfate or elemental sulfur oxidation must be identical in
particular the final reactions (Fig. 4.11).
5. A MODEL OF INTRICATE BIOENERGETIC PATHWAYS
IN AQUIFEX AEOLICUS
As an obligate chemolithoautotroph, A. aeolicus grows using exclusively inorganic compounds. Hydrogen, oxygen, a sulfur compound, and
carbon dioxide seem to be required for cell proliferation. Three electron
transfer pathways involved in energy conservation were clearly identified
to date in A. aeolicus, at least when cultivated in the presence of elemental
sulfur: the H2/O2 one, the sulfur-reducing H2/S0 one, and the sulfuroxidizing H2S/O2 one. Besides these bioenergetics pathways, putative pathways can be proposed from the genomic sequence analysis: the oxidation of
thiosulfate and elemental sulfur, probably both involving the same sulfur
species intermediates. Genome sequence information needs to be supplemented by biochemical characterization. A global view of the energy metabolism has been drawn (Fig. 4.11). Thiosulfate and elemental sulfur are
available from the environment. Hydrogen sulfide is present in substantial
amounts in hydrothermal volcanic systems, but it is a product of enzymatic
sulfur reduction as well. It was proposed that in A. ambivalens, Sqr oxidizes
sulfide produced by SOR allowing the maximum of energy to be obtained
from sulfur compounds (Brito et al., 2009). An analogous process could exist
in Aquifex with an energetic coupling between the sulfur reduction and
182
Marianne Guiral et al.
oxidation pathways (Prunetti et al., 2010). Sulfur species that might be stored
in inclusions could be used by SOR and the sulfur reductase producing hydrogen sulfide that would in turn be used by Sqr to reduce oxygen and produce ATP by the ATP synthase (Guiral et al., 2009; Peng et al., 2006).
Hydrogen sulfide might simply diffuse across the membrane without
facilitation by membrane channels (Mathai et al., 2009).
In addition to the enzymes and proteins detailed above, A. aeolicus possesses a bd-type two-subunit membrane-bound quinol oxidase (CydA or
Aq_1357 and CydB or Aq_1358) using quinol and oxygen as substrates.
This enzyme was already found to be present in the membrane of the bacterium (Guiral et al., 2009; Scheide, Huber, & Friedrich, 2002). In general,
this oxidase has a high affinity for oxygen and has been proposed to scavenge
O2 and thereby protects oxygen-sensitive enzymes under micro-oxic
growth conditions (Li, Jubelirer, Garcia Costas, Frigaard, & Bryant,
2009). This enzyme could protect cells during oxygen exposure of
A. aeolicus which has been described as a microaerophilic microorganism
(Deckert et al., 1998). It moreover participated in proton motive force
production for ATP synthesis. A. aeolicus has also a NADHdehydrogenase or complex I which was characterized in detail (Guiral
et al., 2009; Peng et al., 2003; Scheide et al., 2002). In mitochondria as
well as in numerous microorganisms, the NADH-dehydrogenase, which
translocates protons across the membrane, is the first enzyme of the
aerobic respiratory chain feeding electrons to quinone pool. The
physiological function of this complex is most frequently different in
chemolithoautotrophs, where it can function in reverse using some of the
proton motive force, to produce NADH from NADþ (Willey,
Sherwood, & Woolverton, 2008). As an autotroph, A. aeolicus needs
NADH and ATP to reduce CO2 via the rTCA cycle. The Sqr, present
in large quantities in the membrane of the cells, could, as a quinone
reducer, be linked to NADH-dehydrogenase and/or quinol oxidase
(Fig. 4.9B) in A. aeolicus. The fact that Sqr might be free and associated
with the bc1 complex and the ba3 cytochrome c oxidase (Prunetti et al.,
2010) allows hypothesizing its involvement in reducing power (NADH)
production or even in detoxification of hydrogen sulfide, in addition to
energy conservation. Electrons coming from the oxidation of hydrogen
by the membrane-bound hydrogenases could also end up reducing
NADH-dehydrogenase or quinol oxidase.
It is probable that all the putative or characterized energy pathways do
not function simultaneously in the A. aeolius cell but more likely run under
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
183
some specific environmental conditions. In particular, the reduction of sulfur using hydrogen might work at very low oxygen concentrations. It remains completely obscure how the various enzymes involved in energy
conservation are regulated, which substrates induce or repress gene expression, or whether they are constitutive. A. aeolicus is the sole organism in
which both the sulfur reduction and the sulfur oxidation pathways were
demonstrated to be organized in supramolecular protein structures called
supercomplexes (see above) (Guiral, Aubert, et al., 2005; Guiral et al.,
2009; Guiral, Tron, et al., 2005; Prunetti et al., 2010). This might be
related to the extremophilic nature of the bacterium. In addition, the
stable association between respiratory complexes might be a way to
regulate or guide the electron flow toward a specific pathway.
6. CONCLUDING REMARKS
A. aeolicus, an extreme chemolithotroph isolated from a marine hydrothermal environment, possesses outstanding properties. It has a special phylogenetic position and grows at the highest temperature known for a
bacterium. Some of the proteins isolated from this microorganism are thus
extraordinarily stable, that is, able to function under harsh conditions of temperature. The molecular basis for adaptation of these proteins to such extreme conditions has met an enhanced knowledge in the last few years.
These findings have also attracting issues toward biotechnological devices,
which are currently envisaging for health or environmental applications.
In particular, hydrogenases from A. aeolicus present high efficiency toward
hydrogen oxidation in addition to resistance to oxygen and CO. Consequently, they are viewed as excellent catalysts for H2/O2 biofuel cells, in replacement of platinum catalysts. Nowadays, the research faces great
improvements in enzyme connection to electrode interfaces that promise
development of biofuel cells able to power hundreds of mW cm 2 devices
in a very close future.
All the A. aeolicus energy-generating mechanisms are not elucidated;
however, it seems clear that A. aeolicus presents a versatile metabolism. It
can use, through a flexible respiratory system, reduced and oxidized sulfur
species, in addition to hydrogen and oxygen as energy substrates. This probably allows the bacterium to adapt to fluctuations of nutrients available in its
native habitats. Its potential to gain energy from various substrates and the
use of the energy-efficient rTCA cycle for carbon assimilation (low energy
demand compared to the Calvin–Benson–Bassham cycle) are probably an
184
Marianne Guiral et al.
advantage over other microorganisms (Hügler, Gärtner, & Imhoff, 2010).
The challenge in studying the energy metabolism of A. aeolicus comes from
the fact that the bacterium requires the three energy compounds, hydrogen,
oxygen, and sulfur, at the same time for growth, at least in batch cultures,
greatly restricting the possibility of metabolic conditions and electron donor/electron acceptor combinations to be studied. Moreover, this leads
to energy conservation pathways with many interconnections that require
considering the energy metabolism as a whole. No genetics tools are available for this microorganism preventing deletions and in vivo studies, and objectives are thus to develop alternative approaches to describe this complex
energy metabolism. Further works are in progress to clarify the physiology of
this hyperthermophilic bacterium, particularly the requirement in oxygen
supply which may be a key parameter in regulation and functioning of
the various respiratory chains. The interconnection between all the electron
transfer routes is the next step to understand.
ACKNOWLEDGMENTS
We gratefully acknowledge the contribution of Marielle Bauzan (Fermentation Plant Unit,
IMM, CNRS, Marseilles, France) for growing the bacteria, Alain Bernadac (IMM, CNRS,
Marseilles, France) for the transmission electron microscopy, Sabrina Lignon, Régine Lebrun
and Rémy Puppo (CNRS, Plate-forme Protéomique IMM, Marseilles, France) for
proteomic analysis. The Proteomic Analysis Center of IFR88 is part of MaP (Marseille
Protéomique, IBiSA). This work was supported by research grants from CNRS, Région
PACA and ANR.
REFERENCES
Acı́n-Pérez, R., Fernández-Silva, P., Peleato, M. L., Pérez-Martos, A., & Enriquez, J. A.
(2008). Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell, 32, 529–539.
Aguiar, P., Beveridge, T. J., & Reysenbach, A. L. (2004). Sulfurihydrogenibium azorense, sp.
nov., a thermophilic hydrogen-oxidizing microaerophile from terrestrial hot springs
in the Azores. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 333–339.
Arieli, B., Shahak, Y., Taglicht, D., Hauska, G., & Padan, E. (1994). Purification and characterization of sulfide-quinone reductase, a novel enzyme driving anoxygenic photosynthesis in Oscillatoria limnetica. The Journal of Biological Chemistry, 269, 5705–5711.
Aubert, C., Guerlesquin, F., Bianco, P., Leroy, G., Tron, P., Stetter, K. O., et al. (2001).
Cytochromes c555 from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. 2. Heterologous production of soluble cytochrome c555s and investigation of the role of methionine
residues. Biochemistry, 40, 13690–13698.
Auernik, K. S., & Kelly, R. M. (2008). Identification of components of electron transport
chains in the extremely thermoacidophilic crenarchaeon Metallosphaera sedula through
iron and sulfur compound oxidation transcriptomes. Applied and Environmental Microbiology, 74, 7723–7732.
Aussignargues, C., Giuliani, M. C., Infossi, P., Lojou, E., Guiral, M.,
Giudici-Orticoni, M. T., et al. (2012). A rhodanese functions as sulfur supplier for
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
185
key enzymes in sulfur energy metabolism. The Journal of Biological Chemistry, 287,
19936–19948.
Bardischewsky, F., Quentmeier, A., Rother, D., Hellwig, P., Kostka, S., & Friedrich, C. G.
(2005). Sulfur dehydrogenase of Paracoccus pantotrophus: The heme-2 domain of the molybdoprotein cytochrome c complex is dispensable for catalytic activity. Biochemistry, 44,
7024–7034.
Baymann, F., Barlow, N. L., Aubert, C., Schoepp-Cothenet, B., Leroy, G., & Armstrong, F. A.
(2003). Voltammetry of a “protein on a rope” FEBS Letters, 539, 91–94.
Baymann, F., Lebrun, E., Brugna, M., Schoepp-Cothenet, B., Giudici-Orticoni, M. T., &
Nitschke, W. (2003). The redox protein construction kit: Pre-last universal common
ancestor evolution of energy-conserving enzymes. Philosophical Transactions of the Royal
Society of London. Series B, Biological Sciences, 358, 267–274.
Baymann, F., Tron, P., Schoepp-Cothenet, B., Aubert, C., Bianco, P., Stetter, K. O., et al.
(2001). Cytochromes c555 from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus (VF5).
1. Characterization of two highly homologous, soluble and membranous, cytochromes
c555. Biochemistry, 40, 13681–13689.
Behammer, W., Shao, Z., Mages, W., Rachel, R., Stetter, K. O., & Schmitt, R. (1995).
Flagellar structure and hyperthermophily: Analysis of a single flagellin gene and its product in Aquifex pyrophilus. Journal of Bacteriology, 177, 6630–6637.
Blöchl, E., Rachel, R., Burggraf, S., Hafenbradl, D., Jannasch, H. W., & Stetter, K. O.
(1997). Pyrolobus fumarii, gen. and sp. nov., represents a novel group of archaea,
extending the upper temperature limit for life to 113 degrees C. Extremophiles, 1,
14–21.
Bonch-Osmolovskaya, E. (2008). Aquificales. Encyclopedia of Life Sciences.
Boussau, B., Guéguen, L., & Gouy, M. (2008). Accounting for horizontal gene transfers explains conflicting hypotheses regarding the position of aquificales in the phylogeny of
Bacteria. BMC Evolutionary Biology, 8, 272.
Brito, J. A., Sousa, F. L., Stelter, M., Bandeiras, T. M., Vonrhein, C., Teixeira, M., et al.
(2009). Structural and functional insights into sulfide:quinone oxidoreductase. Biochemistry, 48, 5613–5622.
Brochier-Armanet, C., Talla, E., & Gribaldo, S. (2009). The multiple evolutionary histories
of dioxygen reductases: Implications for the origin and evolution of aerobic respiration.
Molecular Biology and Evolution, 26, 285–297.
Bronstein, M., Schütz, M., Hauska, G., Padan, E., & Shahak, Y. (2000). Cyanobacterial
sulfide-quinone reductase: Cloning and heterologous expression. Journal of Bacteriology,
182, 3336–3344.
Brugna-Guiral, M., Tron, P., Nitschke, W., Stetter, K. O., Burlat, B., Guigliarelli, B., et al.
(2003). [NiFe] hydrogenases from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus:
Properties, function, and phylogenetics. Extremophiles, 7, 145–157.
Buan, N. R., & Metcalf, W. W. (2010). Methanogenesis by Methanosarcina acetivorans involves two structurally and functionally distinct classes of heterodisulfide reductase.
Molecular Microbiology, 75, 843–853.
Buhrke, T., Lenz, O., Krauß, N., & Friedrich, B. (2005). Oxygen tolerance of the
H2-sensing [NiFe] hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 is based on limited access
of oxygen to the active site. The Journal of Biological Chemistry, 280, 23791–23796.
Burggraf, S., Olsen, G. J., Stetter, K. O., & Woese, C. R. (1992). A phylogenetic analysis of
Aquifex pyrophilus. Systematic and Applied Microbiology, 15, 352–356.
Chen, Z. W., Jiang, C. Y., She, Q., Liu, S. J., & Zhou, P. J. (2005). Key role of cysteine
residues in catalysis and subcellular localization of sulfur oxygenase-reductase of Acidianus
tengchongensis. Applied and Environmental Microbiology, 71, 621–628.
Cherney, M. M., Zhang, Y., Solomonson, M., Weiner, J. H., & James, M. N. (2010). Crystal
structure of sulfide:quinone oxidoreductase from Acidithiobacillus ferrooxidans: Insights
186
Marianne Guiral et al.
into sulfidotrophic respiration and detoxification. Journal of Molecular Biology, 398,
292–305.
Choi, I. G., Bang, W. G., Kim, S. H., & Yu, Y. G. (1999). Extremely thermostable serinetype protease from Aquifex pyrophilus. Molecular cloning, expression, and characterization. The Journal of Biological Chemistry, 274, 881–888.
Ciaccafava, A., Alberola, M., Hameury, S., Infossi, P., Giudici-Orticoni, M. T., & Lojou, E.
(2011). Hydrogen bioelectroxidation in ionic liquids: From cytochrome c3 redox behavior to hydrogenase activity. Electrochimica Acta, 56, 3359–3368.
Ciaccafava, A., De Poulpiquet, A., Infossi, P., Robert, S., Gadiou, R., Giudici-Orticoni, M. T.,
et al. (2012). A friendly detergent for H2 oxidation by Aquifex aeolicus membrane-bound
hydrogenase immobilized on graphite and SAM-modified gold electrodes. Electrochimica
Acta., 82, 115–125.
Ciaccafava, A., Infossi, P., Giudici-Orticoni, M. T., & Lojou, E. (2010). Stabilization
role of a phenothiazine derivative on the electrocatalytic oxidation of hydrogen via
Aquifex aeolicus hydrogenase at graphite membrane electrodes. Langmuir, 26,
18534–18541.
Ciaccafava, A., Infossi, P., Ilbert, M., Guiral, M., Lecomte, S., Giudici-Orticoni, M. T., et al.
(2012). Electrochemistry, AFM and PM-IRRAS spectroscopy of immobilized hydrogenase: Role of a trans-membrane helix on enzyme orientation for efficient H2 oxidation.
Angewandte Chemie International Edition, 51, 953–956.
Ciaccafava, A., De Poulpiquet, A., Techer, V., Giudici-Orticoni, M. T., Tingry, S.,
Innocent, C., & Lojou, E. (2012). An outstanding bioanode for an innovative powerful
and mediatorless H2/O2 biofuel cell. Electrochemistry communications, 23, 25–28.
Cipollone, R., Ascenzi, P., & Visca, P. (2007). Common themes and variations in the
rhodanese superfamily. IUBMB Life, 59, 51–59.
Coenye, T., & Vandamme, P. (2004). A genomic perspective on the relationship between
the Aquificales and the epsilon-Proteobacteria. Systematic and Applied Microbiology, 27,
313–322.
Cracknell, J., Wait, A., Lenz, O., Friedrich, B., & Armstrong, F. A. (2009). A kinetic and
thermodynamic understanding of O2 tolerance in [NiFe]-hydrogenases. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, 106, 20681–20686.
Cramer, W. A., Hasan, S. S., & Yamashita, E. (2011). The Q cycle of cytochrome bc complexes: A structure perspective. Biochimica et Biophysica Acta, 1807, 788–802.
Dahl, C., Rákhely, G., Pott-Sperling, A. S., Fodor, B., Takács, M., Tóth, A., et al. (1999).
Genes involved in hydrogen and sulfur metabolism in phototrophic sulfur bacteria.
FEMS Microbiology Letters, 180, 317–324.
Daniel, R. M., & Danson, M. J. (2001). Assaying activity and assessing thermostability of
hyperthermophilic enzymes. Methods in Enzymology, 334, 283–293.
Deckert, G., Warren, P. V., Gaasterland, T., Young, W. G., Lenox, A. L., Graham, D. E.,
et al. (1998). The complete genome of the hyperthermophilic bacterium Aquifex
aeolicus. Nature, 392, 353–358.
Dementin, S., Burlat, B., Fourmond, V., Leroux, F., Liebgott, P. P., Abou Hamdan, A., et al.
(2011). Rates of intra- and intermolecular electron transfers in hydrogenase deduced
from steady-state activity measurements. Journal of the American Chemical Society, 133,
10211–10221.
Dietrich, W., & Klimmek, O. (2002). The function of methyl-menaquinone-6 and polysulfide reductase membrane anchor (PsrC) in polysulfide respiration of Wolinella
succinogenes. European Journal of Biochemistry, 269, 1086–1095.
Dirmeier, R., Keller, M., Frey, G., Huber, H., & Stetter, K. O. (1998). Purification and
properties of an extremely thermostable membrane-bound sulfur-reducing complex
from the hyperthermophilic Pyrodictium abyssi. European Journal of Biochemistry, 15,
486–491.
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
187
Dos Santos, M., De Sousa, P., Goncalves, M., Krippahl, L., Moura, J., Lojou, E., et al. (2003).
Electrochemical studies on small electron transfer proteins using membrane electrodes.
Journal of Electroanalytical Chemistry, 541, 153–162.
Ducluzeau, A. L. (2009). Origine enzymatique de la respiration aérobie. PhD thesis,
Université de Provence, Marseille, France.
Eder, W., & Huber, R. (2002). New isolates and physiological properties of the Aquificales
and description of Thermocrinis albus sp. nov. Extremophiles, 6, 309–318.
Engels, A., Kahmann, U., Ruppel, H. G., & Pistorius, E. K. (1997). Isolation, partial characterization and localization of a dihydrolipoamide dehydrogenase from the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. Biochimica et Biophysica Acta, 1340, 33–44.
Fahey, R. C. (2001). Novel thiols of prokaryotes. Annual Review of Microbiology, 55, 333–356.
Ferrera, I., & Reysenbach, A.-L, (2007). Thermophiles. Encyclopedia of Life Sciences.
Forterre, P. (2002). A hot story from comparative genomics: Reverse gyrase is the only
hyperthermophile-specific protein. Trends in Genetics, 18, 236–237.
Friedrich, C. G., Bardischewsky, F., Rother, D., Quentmeier, A., & Fischer, J. (2005).
Prokaryotic sulfur oxidation. Current Opinion in Microbiology, 8, 253–259.
Friedrich, B., Fritsch, J., & Lenz, O. (2011). Oxygen-tolerant hydrogenases in hydrogenbased technologies. Current Opinion in Biotechnology, 22, 358–364.
Frigaard, N. U., & Dahl, C. (2009). Sulfur metabolism in phototrophic sulfur bacteria.
Advances in Microbial Physiology, 54, 103–200.
Fritsch, J., Scheerer, P., Frielingsdorf, S., Kroschinsky, S., Friedrich, B., Lenz, O., et al.
(2011). The crystal structure of and oxygen-tolerant hydrogenase uncovers a novel
iron-sulphur centre. Nature, 479, 249–252.
Gao, Y., Meyer, B., Sokolova, L., Zwicker, K., Karas, M., Brutschy, B., et al. (2012). Hemecopper terminal oxidase using both cytochrome c and ubiquinol as electron donors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 28, 3275–3280.
Genest, O., Méjean, V., & Iobbi-Nivol, C. (2009). Multiple roles of TorD-like chaperones
in the biogenesis of molybdoenzymes. FEMS Microbiology Letters, 297, 1–9.
Ghosh, W., & Dam, B. (2009). Biochemistry and molecular biology of lithotrophic sulfur
oxidation by taxonomically and ecologically diverse bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews, 33, 999–1043.
Ghosh, W., Mallick, S., & DasGupta, S. K. (2009). Origin of the Sox multienzyme complex
system in ancient thermophilic bacteria and coevolution of its constituent proteins.
Research in Microbiology, 160, 409–420.
Giuliani, M. C., Jourlin-Castelli, C., Leroy, G., Hachani, A., & Giudici-Orticoni, M. T.
(2010). Characterization of a new periplasmic single-domain rhodanese encoded by a
sulfur-regulated gene in a hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Biochimie, 92,
388–397.
Giuliani, M. C., Tron, P., Leroy, G., Aubert, C., Tauc, P., & Giudici-Orticoni, M. T.
(2007). A new sulfurtransferase from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus.
Being single is not so simple when temperature gets high. FEBS Journal, 274, 4572–4587.
Götz, D., Banta, A., Beveridge, T. J., Rushdi, A. I., Simoneit, B. R., & Reysenbach, A. L.
(2002). Persephonella marina gen. nov., sp. nov. and Persephonella guaymasensis sp. nov.,
two novel, thermophilic, hydrogen-oxidizing microaerophiles from deep-sea hydrothermal vents. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52,
1349–1359.
Grein, F., Pereira, I. A., & Dahl, C. (2010). Biochemical characterization of individual components of the Allochromatium vinosum DsrMKJOP transmembrane complex aids understanding of complex function in vivo. Journal of Bacteriology, 192, 6369–6377.
Griesbeck, C., Hauska, G., & Schütz, M. (2000). Biological sulfide-oxidation: Sulfide quinone reductase (SQR), the primary reaction. In S. G. Pandalai (Ed.), Recent research
developments in microbiology, Vol. 4, (pp. 179–203). Trivadrum, India: Research Signpost.
188
Marianne Guiral et al.
Griesbeck, C., Schütz, M., Schödl, T., Bathe, S., Nausch, L., Mederer, N., et al. (2002).
Mechanism of sulfide-quinone reductase investigated using site-directed mutagenesis
and sulfur analysis. Biochemistry, 41, 11552–11565.
Griffiths, E., & Gupta, R. S. (2004). Signature sequences in diverse proteins provide evidence
for the late divergence of the Order Aquificales. International Microbiology, 7, 41–52.
Guiral, M., Aubert, C., & Giudici-Orticoni, M. T. (2005). Hydrogen metabolism in the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Biochemical Society Transactions, 33, 22–24.
Guiral, M., Prunetti, L., Lignon, S., Lebrun, R., Moinier, D., & Giudici-Orticoni, M. T.
(2009). New insights into the respiratory chains of the chemolithoautotrophic and hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Journal of Proteome Research, 8, 1717–1730.
Guiral, M., Tron, P., Aubert, C., Gloter, A., Iobbi-Nivol, C., & Giudici-Orticoni, M. T.
(2005). A membrane-bound multienzyme, hydrogen-oxidizing, and sulfur-reducing
complex from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. The Journal of Biological
Chemistry, 280, 42004–42015.
Hedderich, R., Klimmek, O., Kroëger, A., Dirmeier, R., Keller, M., & Stetter, K. O.
(1999). Anaerobic respiration with elemental sulfur and with disulfides. FEMS Microbiology Reviews, 22, 353–381.
Holländer, R. (1976). Correlation of the function of demethylmenaquinone in bacterial electron transport with its redox potential. FEBS Letters, 72, 98–100.
Huber, H., Diller, S., Horn, C., & Rachel, R. (2002). Thermovibrio ruber gen. nov., sp. nov.,
an extremely thermophilic, chemolithoautotrophic, nitrate-reducing bacterium that
forms a deep branch within the phylum Aquificae. International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology, 52, 1859–1865.
Huber, R., & Eder, W. (2006). Aquificales. In M. Dworkin, S. Falcow, E. Rosenberg, K. H.
Schleifer & E. Stackebrandt (Eds.), The prokaryotes. Proteobacteria: Delta, epsilon subclass,
Vol. 7, (pp. 925–938). New-York: Springer-Verlag.
Huber, R., Eder, W., Heldwein, S., Wanner, G., Huber, H., Rachel, R., et al. (1998).
Thermocrinis ruber gen. nov., sp. nov., a pink-filament-forming hyperthermophilic bacterium isolated from yellowstone national park. Applied and Environmental Microbiology,
64, 3576–3583.
Huber, R., & Stetter, K. O. (2001a). Aquificales. Encyclopedia of life sciences.
Huber, R., & Stetter, K. O. (2001b). Genus Aquifex. In D. R. Boone, R. W. Castenholz &
G. M. Garrity (Eds.), Bergey’s manual of systematic bacteriology. (2nd ed.). The archaea and the
deeply branching and phototrophic bacteria, Vol.1, (pp. 359–367). New York: Springer.
Huber, R., Wilharm, T., Huber, D., Trincone, A., Burggraf, S., König, H., et al. (1992).
Aquifex pyrophilus gen.nov. sp.nov., represents a novel group of marine hyperthermophilic hydrogen-oxidizing bacteria. Systematic and Applied Microbiology, 15, 340–351.
Hügler, M., Gärtner, A., & Imhoff, J. F. (2010). Functional genes as markers for sulfur cycling
and CO2 fixation in microbial communities of hydrothermal vents of the Logatchev
field. FEMS Microbiology Ecology, 73, 526–537.
Hügler, M., Huber, H., Molyneaux, S. J., Vetriani, C., & Sievert, S. M. (2007). Autotrophic CO2
fixation via the reductive tricarboxylic acid cycle in different lineages within the phylum
Aquificae: Evidence for two ways of citrate cleavage. Environmental Microbiology, 9, 81–92.
Ikeda, T., Ochiai, T., Morita, S., Nishiyama, A., Yamada, E., Arai, H., et al. (2006). Anabolic
five subunit-type pyruvate:ferredoxin oxidoreductase from Hydrogenobacter thermophilus
TK-6. Biochemical and Biophysical Research Communications, 340, 76–82.
Ikeda, T., Yamamoto, M., Arai, H., Ohmori, D., Ishii, M., & Igarashi, Y. (2005). Two tandemly arranged ferredoxin genes in the Hydrogenobacter thermophilus genome: Comparative characterization of the recombinant [4Fe-4S] ferredoxins. Bioscience,
Biotechnology, and Biochemistry, 69, 1172–1177.
Infossi, P., Lojou, E., Chauvin, J. P., Herbette, G., Brugna, M., & Giudici-Orticoni, M. T.
(2010). Aquifex aeolicus membrane hydrogenase for hydrogen bioxidation: Role of lipids
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
189
and physiological partners in enzyme stability and activity. International Journal of Hydrogen
Energy, 35, 10778–10789.
Iwasaki, T., Matsuura, K., & Oshima, T. (1995). Resolution of the aerobic respiratory system
of the thermoacidophilic archaeon, Sulfolobus sp. strain 7. I. The archaeal terminal oxidase supercomplex is a functional fusion of respiratory complexes III and IV with no
c-type cytochromes. The Journal of Biological Chemistry, 270, 30881–30892.
Jahnke, L. L., Eder, W., Huber, R., Hope, J. M., Hinrichs, K. U., Hayes, J. M., et al. (2001).
Signature lipids and stable carbon isotope analyses of Octopus Spring hyperthermophilic
communities compared with those of Aquificales representatives. Applied and Environmental Microbiology, 67, 5179–5189.
Jormakka, M., Yokoyama, K., Yano, T., Tamakoshi, M., Akimoto, S., Shimamura, T., et al.
(2008). Molecular mechanism of energy conservation in polysulfide respiration. Nature
Structural & Molecular Biology, 15, 730–737.
Kappler, U. (2011). Bacterial sulfite-oxidizing enzymes. Biochimica et Biophysica Acta, 180, 1–10.
Kappler, U., & Dahl, C. (2001). Enzymology and molecular biology of prokaryotic sulfite
oxidation. FEMS Microbiology Letters, 11, 1–9.
Kashefi, K., & Lovley, D. R. (2003). Extending the upper temperature limit for life. Science,
301, 934.
Kawasumi, T., Igarashi, Y., Kodama, T., & Minoda, Y. (1984). Hydrogenobacter thermophilus
gen. nov., sp. nov., an extremely thermophilic, aerobic, hydrogen-oxidizing bacterium.
International Journal of Systematic Bacteriology, 34, 5–10.
Keefe, R. G., & Maier, R. J. (1993). Purification and characterization of an O2-utilizing
cytochrome-c oxidase complex from Bradyrhizobium japonicum bacteroid membranes.
Biochimica et Biophysica Acta, 1183, 91–104.
Kletzin, A., Urich, T., Müller, F., Bandeiras, T. M., & Gomes, C. M. (2004). Dissimilatory
oxidation and reduction of elemental sulfur in thermophilic archaea. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 36, 77–91.
Klimmek, O. (2005). The biological cycle of sulfur. Metal Ions in Biological Systems, 43,
105–130.
Klimmek, O., Kreis, V., Klein, C., Simon, J., Wittershagen, A., & Kröger, A. (1998). The
function of the periplasmic Sud protein in polysulfide respiration of Wolinella succinogenes.
European Journal of Biochemistry, 253, 263–269.
Künkel, A., Vaupel, M., Heim, S., Thauer, R. K., & Hedderich, R. (1997). Heterodisulfide
reductase from methanol-grown cells of Methanosarcina barkeri is not a flavoenzyme.
European Journal of Biochemistry, 244, 226–234.
Lamle, S., Albracht, S., & Armstrong, F. A. (2005). The mechanism of activation of [NiFe]hydrogenase by electrons, hydrogen, and carbon monoxide. Journal of the American Chemical Society, 127, 6595–6604.
Laska, S., Lottspeich, F., & Kletzin, A. (2003). Membrane-bound hydrogenase and sulfur
reductase of the hyperthermophilic and acidophilic archaeon Acidianus ambivalens. Microbiology, 149, 2357–2371.
Lebreton, S., Graciet, E., & Gontero, B. (2003). Modulation, via protein-protein interactions, of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity through redox phosphoribulokinase regulation. The Journal of Biological Chemistry, 278, 12078–12084.
Lenaz, G., & Genova, M. L. (2010). Structure and organization of mitochondrial respiratory
complexes: A new understanding of an old subject. Antioxidants & Redox Signaling, 15,
961–1008.
L’Haridon, S., Reysenbach, A. L., Tindall, B. J., Schönheit, P., Banta, A., Johnsen, U., et al.
(2006). Desulfurobacterium atlanticum sp. nov., Desulfurobacterium pacificum sp. nov. and
Thermovibrio guaymasensis sp. nov., three thermophilic members of the Desulfurobacteriaceae fam. nov., a deep branching lineage within the Bacteria. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56, 2843–2852.
190
Marianne Guiral et al.
Li, M., Chen, Z., Zhang, P., Pan, X., Jiang, C., An, X., et al. (2008). Crystal structure studies
on sulfur oxygenase reductase from Acidianus tengchongensis. Biochemical and Biophysical
Research Communications, 9, 919–923.
Li, H., Jubelirer, S., Garcia Costas, A. M., Frigaard, N. U., & Bryant, D. A. (2009). Multiple
antioxidant proteins protect Chlorobaculum tepidum against oxygen and reactive oxygen
species. Archives of Microbiology, 191, 853–867.
Lojou, E. (2011). Hydrogenases as catalysts for fuel cells: Strategies for efficient immobilization at electrode interfaces. Electrochimica Acta, 56, 10385–10397.
Lojou, E., & Bianco, P. (2004). Membrane electrodes for protein and enzyme electrochemistry. Electroanalysis, 16, 1113–1121.
Lojou, E., Giudici-Orticoni, M. T., & Bianco, P. (2005). Hydrogenases from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus: Electrocatalysis of the hydrogen production/consumption reactions at carbon electrodes. Journal of Electroanalytical Chemistry, 577, 79–86.
Lojou, E., Luo, X. J., Brugna, M., Candoni, N., Dementin, S., & Giudici-Orticoni, M. T.
(2008). Biocatalysts for fuel cells: Efficient hydrogenase orientation for H2 oxidation at
electrodes modified with carbon nanotubes. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 13,
1157–1167.
Luo, X. J., Brugna, M., Tron-Infossi, P., Giudici-Orticoni, M. T., & Lojou, E. (2009).
Immobilization of the hyperthermophilic hydrogenase from Aquifex aeolicus bacterium
onto gold and carbon nanotube electrodes for efficient H2 oxidation. Journal of Biological
Inorganic Chemistry, 14, 1275–1288.
Mamat, U., Schmidt, H., Munoz, E., Lindner, B., Fukase, K., Hanuszkiewicz, A., et al.
(2009). WaaA of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus is a monofunctional
3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid transferase involved in lipopolysaccharide biosynthesis. The Journal of Biological Chemistry, 284, 22248–22262.
Mander, G. J., Pierik, A. J., Huber, H., & Hedderich, R. (2004). Two distinct heterodisulfide
reductase-like enzymes in the sulfate-reducing archaeon Archaeoglobus profundus. European Journal of Biochemistry, 271, 1106–1116.
Mangold, S., Valdés, J., Holmes, D. S., & Dopson, M. (2011). Sulfur metabolism in the
extreme acidophile Acidithiobacillus caldus. Frontiers in Microbiology, 2, 17.
Marcia, M., Ermler, U., Peng, G., & Michel, H. (2009). The structure of Aquifex aeolicus sulfide:quinone oxidoreductase, a basis to understand sulfide detoxification and respiration.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106, 9625–9630.
Marcia, M., Ermler, U., Peng, G., & Michel, H. (2010). A new structure-based classification
of sulfide:quinone oxidoreductases. Proteins, 78, 1073–1083.
Marcia, M., Langer, J. D., Parcej, D., Vogel, V., Peng, G., & Michel, H. (2010). Characterizing a monotopic membrane enzyme. Biochemical, enzymatic and crystallization studies on Aquifex aeolicus sulfide:quinone oxidoreductase. Biochimica et Biophysica Acta,
1798, 2114–2123.
Mathai, J. C., Missner, A., Kügler, P., Saparov, S. M., Zeidel, M. L., Lee, J. K., et al. (2009).
No facilitator required for membrane transport of hydrogen sulfide. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 106, 16633–16638.
Matsui, I., & Harata, K. (2007). Implication for buried polar contacts and ion pairs in hyperthermostable enzymes. The FEBS Journal, 274, 4012–4022.
Megehee, J. A., Hosler, J. P., & Lundrigan, M. D. (2006). Evidence for a cytochrome bcc-aa3
interaction in the respiratory chain of Mycobacterium smegmatis. Microbiology, 152,
823–829.
Meyer, J., Clay, M. D., Johnson, M. K., Stubna, A., Munck, E., Higgins, C., et al. (2002).
A hyperthermophilic plant-type [2Fe-2S] ferredoxin from Aquifex aeolicus is stabilized by
a disulfide bond. Biochemistry, 41, 3096–3108.
Miroshnichenko, M. L., & Bonch-Osmolovskaya, E. A. (2006). Recent developments in the
thermophilic microbiology of deep-sea hydrothermal vents. Extremophiles, 10, 85–96.
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
191
Miyake, D., Ichiki, S., Tanabe, M., Oda, T., Kuroda, H., Nishihara, H., et al. (2007). Thiosulfate oxidation by a moderately thermophilic hydrogen-oxidizing bacterium,
Hydrogenophilus thermoluteolus. Archives of Microbiology, 188, 199–204.
Müller, F. H., Bandeiras, T. M., Urich, T., Teixeira, M., Gomes, C. M., & Kletzin, A.
(2004). Coupling of the pathway of sulphur oxidation to dioxygen reduction: characterization of a novel membrane-bound thiosulphate:quinone oxidoreductase. Molecular
Microbiology, 53, 1147–1160.
Nakagawa, S., Nakamura, S., Inagaki, F., Takai, K., Shirai, N., & Sako, Y. (2004). Hydrogenivirga caldilitoris gen. nov., sp. nov., a novel extremely thermophilic, hydrogen- and
sulfur-oxidizing bacterium from a coastal hydrothermal field. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 2079–2084.
Niebisch, A., & Bott, M. (2003). Purification of a cytochrome bc-aa3 supercomplex with
quinol oxidase activity from Corynebacterium glutamicum. Identification of a fourth subunit
of cytochrome aa3 oxidase and mutational analysis of diheme cytochrome c1. The Journal
of Biological Chemistry, 278, 4339–4346.
Nishimura, H., Kitano, Y., Inoue, T., Nomura, K., & Sako, Y. (2010). Purification and
characterization of membrane-associated hydrogenase from the deep-sea
epsilonproteobacterium Hydrogenimonas thermophila. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 74, 1624–1630.
Nübel, T., Klughammer, C., Huber, R., Hauska, G., & Schütz, M. (2000). Sulfide:quinone
oxidoreductase in membranes of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus (VF5).
Archives of Microbiology, 173, 233–244.
Obuchi, M., Kawahara, K., Motooka, D., Nakamura, S., Yamanaka, M., Takeda, T., et al.
(2009). Hyperstability and crystal structure of cytochrome c(555) from hyperthermophilic
Aquifex aeolicus. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 65, 804–813.
Palágyi-Mészáros, L. S., Maróti, J., Latinovics, D., Balogh, T., Klement, E.,
Medzihradszky, K. F., et al. (2009). Electron-transfer subunits of the NiFe hydrogenases
in Thiocapsa roseopersicina BBS. The FEBS Journal, 276, 164–174.
Pandelia, M., Fourmond, V., Tron-Infossi, P., Lojou, E., Bertrand, P., Leger, C., et al.
(2010). Membrane-bound hydrogenase I from the hyperthermophilic bacterium Aquifex
aeolicus: Enzyme activation, redox intermediates and oxygen tolerance. Journal of the
American Chemical Society, 132, 6991–7004.
Pandelia, M., Infossi, P., Stein, M., Giudici-Orticoni, M. T., & Lubitz, W. (2011). Spectroscopic characterization of the key catalytic intermediate Ni-C in the O2-tolerant [NiFe]
hydrogenase I from Aquifex aeolicus: Evidence of a weakly bound hydride. Chemical Communications, 48, 823–825.
Pandelia, M., Nitschke, W., Infossi, P., Giudici-Orticoni, M. T., Bill, E., & Lubitz, W.
(2011). Characterization of a unique [FeS] cluster in the electron transfer chain of the
oxygen tolerant [NiFe] hydrogenase from Aquifex aeolicus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108, 6097–6102.
Pelletier, N., Leroy, G., Guiral, M., Giudici-Orticoni, M. T., & Aubert, C. (2008). First
characterisation of the active oligomer form of sulfur oxygenase reductase from the bacterium Aquifex aeolicus. Extremophiles, 12, 205–215.
Peng, G., Bostina, M., Radermacher, M., Rais, I., Karas, M., & Michel, H. (2006).
Biochemical and electron microscopic characterization of the F1F0 ATP synthase from
the hyperthermophilic eubacterium Aquifex aeolicus. FEBS Letters, 580, 5934–5940.
Peng, G., Fritzsch, G., Zickermann, V., Schägger, H., Mentele, R., Lottspeich, F., et al.
(2003). Isolation, characterization and electron microscopic single particle analysis of
the NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from the hyperthermophilic eubacterium Aquifex aeolicus. Biochemistry, 42, 3032–3039.
Pereira, M. M., Santana, M., & Teixeira, M. (2001). A novel scenario for the evolution of
haem-copper oxygen reductases. Biochimica et Biophysica Acta, 1505, 185–208.
192
Marianne Guiral et al.
Pitulle, C., Yang, Y., Marchiani, M., Moore, E. R., Siefert, J. L., Aragno, M., et al. (1994).
Phylogenetic position of the genus Hydrogenobacter. International Journal of Systematic
Bacteriology, 44, 620–626.
Plötz, B. M., Lindner, B., Stetter, K. O., & Holst, O. (2000). Characterization of a novel lipid
A containing D-galacturonic acid that replaces phosphate residues. The structure of the
lipid a of the lipopolysaccharide from the hyperthermophilic bacterium Aquifex pyrophilus. The Journal of Biological Chemistry, 275, 11222–11228.
Prange, A., Chauvistré, R., Modrow, H., Hormes, J., Trüper, H. G., & Dahl, C. (2002).
Quantitative speciation of sulfur in bacterial sulfur globules: X-ray absorption spectroscopy reveals at least three different species of sulfur. Microbiology, 148, 267–276.
Prunetti, L., Brugna, M., Lebrun, R., Giudici-Orticoni, M. T., & Guiral, M. (2011). The
elusive third subunit IIa of the bacterial B-type oxidases: The enzyme from the hyperthermophile Aquifex aeolicus. PLoS One, 6, e21616.
Prunetti, L., Infossi, P., Brugna, M., Ebel, C., Giudici-Orticoni, M. T., & Guiral, M. (2010).
New functional sulfide oxidase-oxygen reductase supercomplex in the membrane of the
hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. The Journal of Biological Chemistry, 285,
41815–41826.
Quatrini, R., Appia-Ayme, C., Denis, Y., Jedlicki, E., Holmes, D. S., & Bonnefoy, V.
(2009). Extending the models for iron and sulfur oxidation in the extreme acidophile
Acidithiobacillus ferrooxidans. BMC Genomics, 10, 394.
Rakhely, G., Colbeau, A., Garin, J., Vignais, P. M., & Kovacs, K. L. (1998). Unusual organization of the genes coding for HydSL, the stable [NiFe] hydrogenase in the photosynthetic bacterium Thiocapsa roseopersicina BBS. Journal of Bacteriology, 180, 1460–1465.
Reysenbach, A. L. (2001). Order I. Aquificales ord. nov. In D. R. Boone, R. W. Castenholz
& G. M. Garrity (Eds.), Bergey’s manual of systematic bacteriology. (2nd ed.). The Archaea and
the deeply branching and phototrophic bacteria, Vol. 1, (pp. 359–367). New York: Springer.
Reysenbach, A. L., Banta, A., Civello, S., Daly, J., Mitchel, K., & Lalonde, S. (2005).
Aquificales in Yellowstone National Park. In W. Inskeep & T. McDermott (Eds.). Geothermal biology and geochemistry in Yellowstone National Park: Workshop proceedings from the
thermal biology Institute’s Yellowstone National Park Conference, October 2003 (pp. 129–142).
Bozeman, M.T., Montana State University.
Reysenbach, A. L., Hamamura, N., Podar, M., Griffiths, E., Ferreira, S., Hochstein, R., et al.
(2009). Complete and draft genome sequences of six members of the Aquificales. Journal
of Bacteriology, 191, 1992–1993.
Reysenbach, A. L., Wickham, G. S., & Pace, N. R. (1994). Phylogenetic analysis of the hyperthermophilic pink filament community in Octopus Spring, Yellowstone National
Park. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2113–2119.
Rohwerder, T., & Sand, W. (2003). The sulfane sulfur of persulfides is the actual substrate of
the sulfur-oxidizing enzymes from Acidithiobacillus and Acidiphilium spp. Microbiology,
149, 1699–1710.
Rother, D., Henrich, H. J., Quentmeier, A., Bardischewsky, F., & Friedrich, C. G. (2001).
Novel genes of the sox gene cluster, mutagenesis of the flavoprotein SoxF, and evidence
for a general sulfur-oxidizing system in Paracoccus pantotrophus GB17. Journal of Bacteriology, 183, 4499–4508.
Rüdiger, O., Gutierrez-Sanchez, C., Olea, D., Pereira, I., Velez, M., Fernandez, V., et al.
(2010). Enzymatic anodes for hydrogen fuel cells based on covalent attachment of NiFe
hydrogenases and direct electron transfer to SAM-modified gold electrodes. Electroanalysis, 22, 776–783.
Sakurai, H., Ogawa, T., Shiga, M., & Inoue, K. (2010). Inorganic sulfur oxidizing system in
green sulfur bacteria. Photosynthesis Research, 104, 163–176.
Sano, R., Kameya, M., Wakai, S., Arai, H., Igarashi, Y., Ishii, M., et al. (2010). Thiosulfate
oxidation by a thermo-neutrophilic hydrogen-oxidizing bacterium, Hydrogenobacter
thermophilus. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 74, 892–894.
Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus
193
Scheide, D., Huber, R., & Friedrich, T. (2002). The proton-pumping NADH:ubiquinone
oxidoreductase (complex I) of Aquifex aeolicus. FEBS Letters, 13, 80–84.
Schoepp-Cothenet, B., Lieutaud, C., Baymann, F., Verméglio, A., Friedrich, T.,
Kramer, D. M., et al. (2009). Menaquinone as pool quinone in a purple bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106, 8549–8554.
Schütz, M., Maldener, I., Griesbeck, C., & Hauska, G. (1999). Sulfide-quinone reductase
from Rhodobacter capsulatus: Requirement for growth, periplasmic localization, and extension of gene sequence analysis. Journal of Bacteriology, 181, 6516–6523.
Schütz, M., Schoepp-Cothenet, B., Lojou, E., Woodstra, M., Lexa, D., Tron, P., et al.
(2003). The naphthoquinol oxidizing cytochrome bc1 complex of the hyperthermophilic knallgasbacterium Aquifex aeolicus: Properties and phylogenetic relationships.
Biochemistry, 42, 10800–10808.
Schütz, M., Shahak, Y., Padan, E., & Hauska, G. (1997). Sulfide-quinone reductase from
Rhodobacter capsulatus. Purification, cloning, and expression. The Journal of Biological
Chemistry, 272, 9890–9894.
Sezer, M., Frielingsdorf, S., Millo, D., Heidary, N., Utesch, T., Mroginski, M., et al. (2011).
Role of HoxZ subunit in the electron transfer pathway of the membrane-bound [NiFe]hydrogenase from Ralstonia eutropha immobilized on electrodes. The Journal of Physical
Chemistry. B, 115, 10368–10374.
Shomura, Y., Yoon, K., Nishihara, H., & Higuchi, Y. (2011). Structural basis for a [4Fe-3S] cluster in the oxygen-tolerant membrane-bound [NiFe]-hydrogenase. Nature, 479, 253–256.
Simianu, M., Murakami, E., Brewer, J. M., & Ragsdale, S. W. (1998). Purification and properties of the heme- and iron-sulfur-containing heterodisulfide reductase from
Methanosarcina thermophila. Biochemistry, 37, 10027–10039.
Smith, E., & Morowitz, H. J. (2004). Universality in intermediary metabolism. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 13168–13173.
Sone, N., Sekimachi, M., & Kutoh, E. (1987). Identification and properties of a quinol oxidase super-complex composed of a bc1 complex and cytochrome oxidase in the thermophilic bacterium PS3. The Journal of Biological Chemistry, 262, 15386–15391.
Soulimane, T., Than, M. E., Dewor, M., Huber, R., & Buse, G. (2000). Primary structure of
a novel subunit in ba3-cytochrome oxidase from Thermus thermophilus. Protein Science, 9,
2068–2073.
Stetter, K. O (2001). Micro-organisms in High-temperature sulfur environments. Encyclopedia of life sciences.
Stetter, K. O. (2006). History of discovery of the first hyperthermophiles. Extremophiles, 10,
357–362.
Stohr, R., Waberski, A., Völker, H., Tindall, B. J., & Thomm, M. (2001). Hydrogenothermus
marinus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic hydrogen-oxidizing bacterium, recognition of Calderobacterium hydrogenophilum as a member of the genus Hydrogenobacter and
proposal of the reclassification of Hydrogenobacter acidophilus as Hydrogenobaculum
acidophilum gen. nov., comb. nov., in the phylum ‘Hydrogenobacter/Aquifex’. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 1853–1862.
Stroh, A., Anderka, O., Pfeiffer, K., Yagi, T., Finel, M., Ludwig, B., et al. (2004). Assembly
of respiratory complexes I, III, and IV into NADH oxidase supercomplex stabilizes complex I in Paracoccus denitrificans. The Journal of Biological Chemistry, 279, 5000–5007.
Sugio, T., Ako, A., & Takeuchi, F. (2010). Sulfite oxidation catalyzed by aa3-type cytochrome c oxidase in Acidithiobacillus ferrooxidans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry,
74, 2242–2247.
Sun, C. W., Chen, Z. W., He, Z. G., Zhou, P. J., & Liu, S. J. (2003). Purification and properties of the sulfur oxygenase/reductase from the acidothermophilic archaeon, Acidianus
strain S5. Extremophiles, 7, 131–134.
Suzuki, I. (1999). Oxidation of inorganic sulfur compounds: Chemical and enzymatic reactions. Canadian Journal of Microbiology, 145, 97–105.
194
Marianne Guiral et al.
Swanson, R. V. (2001). Genome of Aquifex aeolicus. Methods in Enzymology, 330, 158–169.
Takai, K., Nakagawa, S., Sako, Y., & Horikoshi, K. (2003). Balnearium lithotrophicum gen. nov.,
sp. nov., a novel thermophilic, strictly anaerobic, hydrogen-oxidizing chemolithoautotroph
isolated from a black smoker chimney in the Suiyo Seamount hydrothermal system. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53, 1947–1954.
Urich, T., Bandeiras, T. M., Leal, S. S., Rachel, R., Albrecht, T., Zimmermann, P., et al.
(2004). The sulphur oxygenase reductase from Acidianus ambivalens is a multimeric
protein containing a low-potential mononuclear non-haem iron centre. The Biochemical
Journal, 381, 137–146.
Urich, T., Gomes, C. M., Kletzin, A., & Frazão, C. (2006). X-ray structure of a selfcompartmentalizing sulfur cycle metalloenzyme. Science, 311, 996–1000.
Veith, A., Botelho, H. M., Kindinger, F., Gomes, C. M., & Kletzin, A. (2012). The sulfur
oxygenase reductase from the mesophilic bacterium Halothiobacillus neapolitanus is a
highly active thermozyme. Journal of Bacteriology, 194, 677–685.
Verté, F., Kostanjevecki, V., De Smet, L., Meyer, T. E., Cusanovich, M. A., &
Van Beeumen, J. J. (2002). Identification of a thiosulfate utilization gene cluster from
the green phototrophic bacterium Chlorobium limicola. Biochemistry, 41, 2932–2945.
Vieille, C., & Zeikus, G. J. (2001). Hyperthermophilic enzymes: Sources, uses, and molecular
mechanisms for thermostability. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 65, 1–43.
Vignais, P. M., Billoud, B., & Meyer, J. (2001). Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiology Reviews, 25, 455–501.
Vincent, K., Parkin, A., Lenz, O., Albracht, S., Fontecilla-Camps, J., Cammack, R., et al.
(2005). Electrochemical definitions of O2 sensitivity and oxidative inactivation in hydrogenases. Journal of the American Chemical Society, 127, 18179–18189.
Wait, A., Parkin, A., Morley, G., dos Santos, L., & Armstrong, F. (2010). Characteristics of
enzyme-based hydrogen fuel cells using an oxygen-tolerant hydrogenase as the anodic
catalyst. Journal of Physical Chemistry C, 114, 12003–12009.
Wakai, S., Tsujita, M., Kikumoto, M., Manchur, M. A., Kanao, T., & Kamimura, K. (2007).
Purification and characterization of sulfide:quinone oxidoreductase from an acidophilic
iron-oxidizing bacterium, Acidithiobacillus ferrooxidans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, 2735–2742.
Wedemeyer, U., Peng, G., Michel, H., & Hartung, K. (2007). Protein AQ_1862 from the
hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus is a porin and contains two conductance
pathways of different selectivity. Biophysical Journal, 93, 2667–2677.
Willey, J., Sherwood, L., & Woolverton, C. (2008). Prescott/Harley/Klein’s microbiology
(7th ed.). McGraw-Hill Science.
Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., & Schägger, H. (2006). Supercomplexes and subcomplexes of mitochondrial oxidative phosphorylation. Biochimica et Biophysica Acta,
1757, 1066–1072.
Yamamoto, M., Nakagawa, S., Shimamura, S., Takai, K., & Horikoshi, K. (2010). Molecular
characterization of inorganic sulfur-compound metabolism in the deep-sea
epsilonproteobacterium Sulfurovum sp. NBC37-1. Environmental Microbiology, 12, 1144–1153.
Yu, Z., Lansdon, E. B., Segel, I. H., & Fisher, A. J. (2007). Crystal structure of the bifunctional ATP sulfurylase-APS kinase from the chemolithotrophic thermophile Aquifex
aeolicus. Journal of Molecular Biology, 19, 732–743.
Zimmermann, P., Laska, S., & Kletzin, A. (1999). Two modes of sulfite oxidation in the
extremely thermophilic and acidophilic archaeon Acidianus ambivalens. Archives of Microbiology, 172, 76–82.
Résultats et discussion
Chapitre II
Recherche d’un niveau
d’organisation supérieure dans
l’architecture des voies respiratoires
chez Aquifex aeolicus
155
Résultats et discussion
156
Résultats et discussion
Recherche d’un niveau d’organisation
supérieure dans l’architecture des voies
respiratoires chez Aquifex aeolicus
I) Introduction : Organisation des complexes protéiques
membranaires
S‘il est depuis longtemps admis que les enzymes des chaînes respiratoires sont des systèmes
redox complexes souvent formés de multiples sous-unités, l‘acceptation de la notion
d‘organisation des enzymes de ces chaînes respiratoires en super édifice fonctionnel appelé
supercomplexe est, elle, assez récente et a connu une naissance difficile. Proposée pour la
première fois à la fin des années 60 lorsque des associations stables des complexes I et III
(complexe bc1), ou II (succinate déshydrogénase) et III des mitochondries avaient été
observées (Hatefi and Rieske, 1967; Tisdale, 1967), elle avait été, à l‘époque, rejetée et
classée comme artéfact expérimental, puisqu‘en effet, l‘extraction membranaire de ces
complexes était alors réalisée à l‘aide de sels biliaires, connus pour promouvoir l‘agrégation
des protéines. Le modèle « canonique » de l‘organisation des chaînes respiratoires reposait
alors sur le modèle du « fluid state » (Hackenbrock et al., 1986) (Figure 77A), selon lequel les
différents complexes diffuseraient de manière libre et indépendante au sein de la membrane.
157
Résultats et discussion
A
B
Figure 77. Représentation schématique de la chaîne respiratoire mitochondriale dans le modèle en « fluid
state » (A) et en « solid state » (B). CI : complexe I ; CII : complexe II ; CIII : complexe III ; CIV : complexe
IV ; CV : complexe V ; CoQ : quinone ; cyt c : cytochromes c. (Acin-Perez et al., 2008)
Il avait pourtant été découvert chez Paracoccus denitrificans (Berry and Trumpower, 1985),
Bacillus PS3 (Sone et al., 1987), ou encore Sulfolobus (Iwasaki et al., 1995) une association
stable des complexes III et IV (cytochrome c oxydase) qui n‘avait rien d‘artéfactuel. Ces
structures supramoléculaires avaient cependant été considérées comme des exceptions du
monde procaryote qui n‘entamaient pas le dogme du modèle « fluid state » de la
mitochondrie.
Il a fallu attendre les années 2000, et plus particulièrement le travail de Schägger et
Pfeiffer (Schagger and Pfeiffer, 2000) pour apporter une preuve solide quant à l‘association
stable et fonctionnelle des complexes respiratoires de la mitochondrie de levure en un
véritable supercomplexe. Au cours des années suivantes, les techniques de microscopie
électronique, de cinétique enzymatique ainsi que la solubilisation de ces supercomplexes
associée à l‘emploi des gels bleus natifs (gels BN) ont permis de valider définitivement cette
organisation en édifices supramoléculaires. Ainsi, un nouveau modèle intégrant ces résultats a
pu être développé, et est aujourd‘hui connu sous le nom de modèle du « solid state » (Figure
1B). Cependant, toutes ces études ont également révélé que l‘organisation des
supercomplexes respiratoires mitochondriaux présentait des variations selon les organismes,
les tissus ou l‘état physiologique de la cellule, en termes de composition et de stœchiométrie
(Boekema and Braun, 2007). De plus, des complexes isolés étaient encore visibles. Un
nouveau modèle, synthétisant les modèles en « fluid state » et « solid state », a donc été
développé pour prendre en compte ces données. Nommé « plasticity model », il propose la
coexistence de complexes isolés et des supercomplexes décrits dans la littérature, avec un
158
Résultats et discussion
processus dynamique, probablement dépendant de l‘état physiologique de la cellule, qui serait
à l‘origine de la dissociation et de la formation des super-édifices (Acin-Perez et al., 2008).
Si les preuves de l‘existence des supercomplexes sont aujourd‘hui abondantes, la
signification fonctionnelle de ces structures est beaucoup moins claire. Différents avantages et
effets de cette architecture ont cependant pu être proposés. Parmi ceux-ci, on retrouve la
notion de stabilisation des complexes respiratoires au sein du supercomplexe, la résistance
aux espèces réactives de l‘oxygène (pouvant endommager l‘ADN, les protéines et les lipides
des cellules) ainsi que la diminution de la formation de ces espèces par les chaînes
respiratoires. Ce dernier point est possible grâce à la canalisation du transfert des électrons
depuis le donneur primaire jusqu‘à l‘accepteur terminal, qui permettrait également
d‘augmenter le flux métabolique, et donc l‘efficacité du système.
Plus récemment, en plus de cette organisation des complexes énergétiques en
supercomplexes, un degré supérieur d‘architecture a été proposé, principalement sur la base
d‘observations des membranes mitochondriales par cryo-fracture (Bultema et al., 2009; Wittig
et al., 2006). Nommés mégacomplexes, ces structures seraient un assemblage spécifique,
ordonné linéairement, des supercomplexes respiratoires (Figure 78). Ce type d‘association a
également été proposé pour les supercomplexes photosynthétiques des thylakoïdes des plantes
(Kouril et al., 2012). Cette notion étant très récente, aucune preuve biochimique de l‘existence
de ces mégacomplexes n‘a pour l‘instant été apportée, mis à part la visualisation très récente
sur gels bleus natifs modifiés de mégacomplexes respiratoires multimériques de poids
moléculaire d‘environ 35 à 45 MDa (Strecker et al., 2010). Il a ainsi été suggéré que les
supercomplexes soient des sortes de briques de base des mégacomplexes mitochondriaux. En
revanche, aucune observation de ce genre d‘organisation chez les procaryotes n‘a pour
l‘instant été rapportée.
159
Résultats et discussion
Figure 78. Modèle des supercomplexes inclus dans des mégacomplexes respiratoires. L‘unité de base est
constituée par deux copies du complexe I (en bleu), une copie du dimère du complexe III (en rouge) et deux
copies du complexe IV (en jaune) (Bultema et al., 2009).
Enfin, en parallèle de ce type d‘organisation en super- et mégacomplexes, une nouvelle notion
de compartimentalisation des complexes énergétiques dans la membrane a été introduite très
récemment dans la littérature : en effet, au lieu d‘une distribution aléatoire et homogène des
protéines, il y aurait des zones (« patchs ») spécialement dédiées à une fonction bien précise,
telle que la respiration. Appelées « respirazones », ces sous-compartiments membranaires
spécialisés d‘environ 100 nm seraient fortement enrichis en complexes respiratoires et font
suite à l‘observation par microscopie à fluorescence de la distribution hétérogène « en zones »
de l‘oxydase terminale d‘Escherichia coli dans sa membrane interne (Lenn et al., 2008)
(Figure 79). De plus, le même type de technique couplée à des études biochimiques a
également montré la présence de « domaines bioénergétiques » chez la cyanobactérie
Gloeobacter violaceus (Rexroth et al., 2011), ainsi que des résultats similaires dans la
membrane mitochondriale, avec une distribution hétérogène, en patchs, des complexes
respiratoires (Muster et al., 2010; Vogel et al., 2006).
160
Résultats et discussion
Figure 79. Notion de respirazone chez Escherichia coli. (a) Les respirazones sont des sous-compartiments
membranaires (en gris), (b) dans lesquels les composants respiratoires sont hautement concentrés par rapport à la
membrane adjacente, (c) ce qui entraîne une optimisation locale du rendement énergétique (Lenn et al., 2008).
De ces travaux ressort la conclusion que les complexes énergétiques des eucaryotes
(mitochondries et chloroplastes) et des procaryotes sont organisés de manière bien plus
complexe que l‘idée que l‘on s‘en fait habituellement. Il existe ainsi une hiérarchie
d‘architecture dans la membrane : les enzymes respiratoires possèdent déjà un certain degré
de complexité, puisque ce sont des complexes redox formés par plusieurs sous-unités, comme
le complexe I de la mitochondrie, par exemple, qui en contient 45 (Carroll et al., 2006). Ces
complexes vont s‘assembler pour former des supercomplexes (par exemple composé des
complexes I, III et IV), lesquels peuvent à leur tour former des mégacomplexes (structure
linéaire composée d‘un enchainement de supercomplexes) (Figure 80).
161
Résultats et discussion
Figure 80. Les différents niveaux d’organisation des complexes énergétiques. A, les complexes énergétiques
isolés peuvent s‘associer en B, un supercomplexe, lui-même unité de base des mégacomplexes, C (d‘après
(Acin-Perez et al., 2008) et (Bultema et al., 2009)).
A un degré encore supérieur, des sous-compartiments enrichis en complexes
respiratoires peuvent être trouvés dans les membranes. De plus, ces états ne semblent pas
figés, mais bien au contraire dynamiques, avec une inter-conversion des complexes et des
supercomplexes, et donc probablement dissociation/formation de mégacomplexes et/ou de
respirazones, l‘état physiologique de la cellule jouant probablement le rôle de modulateur.
Ces dernières notions étant encore très récentes, les preuves biochimiques ne sont pas
particulièrement abondantes, les modèles étant essentiellement fondés sur de la
cryomicroscopie électronique et de la microscopie à fluorescence. De plus amples études
doivent être menées afin de confirmer ce qui tient aujourd‘hui plus du modèle que de la
certitude établie.
Comparativement aux eucaryotes, il existe finalement peu de supercomplexes décrits
chez les procaryotes. Dans le cas d‘Aquifex aeolicus, la présence de deux supercomplexes
membranaires fonctionnels, caractérisés et purifiés par l‘équipe, est tout à fait exceptionnelle.
Le premier associe une hydrogénase (orientée vers le périplasme) à une soufre réductase
(orientée vers le cytoplasme) (Guiral et al., 2005b) ; le second est composé d‘une sulfure
quinone oxydoréductase (SQR), d‘un dimère de complexe bc1 (complexe III) et d‘une
cytochrome c oxydase (complexe IV) (Prunetti et al., 2010). Ces supercomplexes
respiratoires, représentant respectivement une voie hydrogène/soufre et une voie
soufre/oxygène, sont très stables grâce aux interactions fortes entre les protéines dues au
caractère hyperthermophile de la bactérie, ce qui a permis une purification de ces
supercomplexes en l‘état. Ils représentent donc un modèle de choix pour l‘étude de
l‘organisation architecturale des complexes respiratoires bactériens. En nous basant sur les
récentes données de la littérature, nous avons voulu savoir si les voies énergétiques d‘Aquifex
162
Résultats et discussion
aeolicus pouvaient présenter des degrés encore plus élevés d‘organisation. De plus, là où la
littérature ne propose que l‘existence de ce que nous pouvons appeler des « homomégacomplexes », constitués de la répétition d‘un même supercomplexe (l‘hypothèse des
mégacomplexes n‘a été proposée que chez les mitochondries et les chloroplastes pour
lesquelles il n‘existe qu‘une seule chaîne de transfert d‘électron), nous nous interrogeons sur
l‘existence « d‘hétéro-mégacomplexes ». En effet, il faut noter que le complexe hydrogénase /
soufre réductase consomme entre autre des chaînes de soufre pour donner du sulfure
d‘hydrogène H2S. Ce même H2S est substrat de la SQR du second supercomplexe, laquelle va
produire à son tour des chaînes de soufre (Figure 76). Il n‘est pas illogique de penser à un
éventuel couplage entre les deux voies. L‘H2S réagissant facilement avec l‘oxygène
(nécessaire à la bactérie), un moyen de canaliser efficacement ce substrat pourrait être une
association des deux supercomplexes en un hétéro-mégacomplexe. La présence d‘autres
enzymes et complexes respiratoires (comme le complexe I et l‘ATPsynthase) dans les
membranes de la bactérie pose également la question de leur incorporation dans d‘éventuelles
structures supra-moléculaires.
Nous avons choisi une stratégie combinant plusieurs approches pour tenter de
répondre à ces questions. Au sein de ce projet, mon travail a porté sur la recherche de
structures protéiques de très haut poids moléculaire, en combinant des approches de
solubilisation de membranes, migration et activités enzymatiques sur gels bleus natifs, à des
analyses par spectrométrie de masse. Des verrous techniques étaient à lever, comme le
développement de gels bleus natifs à larges pores, pour mettre en évidence des
mégacomplexes.
II) Développement et optimisation de gels natifs pour la
visualisation de mégacomplexes
De manière concrète, l‘une des méthodes les plus directes pour identifier des
mégacomplexes membranaires consiste à les visualiser sur gel bleu natif (voir section
163
Résultats et discussion
Matériel et Méthodes). En effet, ce type de gels permet de conserver l‘état natif des protéines,
et donc l‘intégrité des complexes protéiques, tout en déterminant avec une certaine précision
leur masse moléculaire. Cette technique est bien maitrisée au laboratoire et a notamment
permis la mise en évidence et la caractérisation des supercomplexes d‘Aquifex aeolicus.
Cependant, les gels classiquement utilisés (gradient de 4 à 15% d‘acrylamide) jusqu‘à présent
étaient optimisés pour une gamme de masses moléculaires allant de 30 à 800 kDa environ
(Figure 81C). Notre objectif a donc été dans un premier temps de développer une approche
permettant de visualiser des mégacomplexes de masse moléculaire supérieure à 1 MDa.
En toute première approche, nous avons simplement modifié le gradient d‘acrylamide,
pour travailler avec des gels 3-13%. Ceci a permis d‘obtenir des gels capables de séparer
efficacement des complexes plus lourds, légèrement supérieurs au MDa (Figure 81A), cette
amélioration étant déjà suffisante pour débuter l‘étude de l‘organisation des complexes
énergétiques de la bactérie.
Figure 81. Comparaison de la migration des marqueurs de masses moléculaires sur gels bleus natifs 313% à base d’acrylamide commercial (A) ou de mélange AB3 (B). Un gel BN « classique » 4-15%
d’acrylamide est représenté à titre de contrôle (C). Les masses sont données en kDa à gauche de chaque gel.
Cependant, la diminution de la concentration d‘acrylamide (passage d‘un gradient 415% à un gradient 3-13%) s‘est faite au détriment de la solidité du gel, celui-ci devenant plus
164
Résultats et discussion
fragile et difficile à manipuler. Cependant, le protocole de référence des gels bleus natifs
(Wittig et al., 2006) parle de séparation de protéines entre 100 kDa et 10 MDa pour un gel 313%, résolution que nous ne sommes pas parvenus à obtenir. Il existe de légères différences
entre ce protocole et celui que nous avons utilisé au laboratoire, notamment en ce qui
concerne le mélange d‘acrylamide employé. En effet, le protocole mentionne l‘emploi d‘un
stock (nommé AB3) 49,5% T, 3% C, où, selon la nomenclature classique (Hjerten, 1962), T
représente la concentration totale des monomères d‘acrylamide et de bisacrylamide (agent
réticulant permettant la formation du gel) et C le pourcentage de bisacrylamide par rapport au
total des deux espèces. Ce stock est donc préparé en mélangeant 48 g d‘acrylamide et 1,5 g de
bisacrylamide dans 100 ml d‘eau. Le stock commercial que nous utilisons est à environ 2,6%
C. Si cette différence semble minime, elle pourrait tout de même avoir un impact sur la
solidité des gels qui seraient alors plus facilement manipulables que ceux que nous obtenions
de manière classique. Nous avons donc préparé notre propre stock 3% C à l‘aide d‘acrylamide
et bisacrylamide en poudre pour préparer de nouveaux gels (notés AB3, Table 6). S‘il n‘y a
pas de différence majeure dans le profil de migration comparé aux gels classiques utilisant
l‘acrylamide commercial (2,6% C) (Figure 81 A et B), leur rigidité a été accrue, et leur
manipulation en est devenue plus aisée, autorisant par là-même leur emploi pour des tests
enzymatiques sur gel.
Type de gel
%T
%C
Gamme de Poids Moléculaire
Classique
4-15
2,6
30 à 800 kDa
AB3
3-13
3
100 à 10MDa
BNPL
3-9
20-6
100 à 25MkDa
Table 6 : Caractéristiques des différents types de gels bleus natifs utilisés. %T représente le pourcentage en
acrylamide et bisacrylamide et %C le pourcentage en bisacrylamide par rapport au total des deux. La gamme de
poids moléculaire correspond au pouvoir résolutif des gels estimé dans la littérature.
165
Résultats et discussion
III) Préparation et optimisation des échantillons pour la
détection de mégacomplexes
Les gels ayant été optimisés, la question de la préparation des échantillons a pu être
abordée. Des études antérieures avaient montré l‘influence de la nature et de la concentration
du détergent utilisé pour la solubilisation des protéines membranaires sur la conservation de
l‘intégrité des complexes énergétiques (Guiral et al., 2009). La mise en évidence des
mégacomplexes nécessitant de conserver au mieux les interactions protéines-protéines, nous
avons choisi, au cours d‘un premier crible, d‘utiliser des détergents non-ioniques (le DDM, le
Tween 20 et le Triton X-100), connus pour être particulièrement peu dénaturants envers les
complexes membranaires. Nous avons également utilisé un détergent anionique (le Sarkosyl
NL) ne solubilisant que les protéines de la membrane interne. Les concentrations protéiques
ont été ajustées à 10 mg.ml-1 avant de réaliser les solubilisations avec du Triton X-100 (2%),
du Sarkosyl NL (2%), du Tween 20 (2%) et du DDM (0,5%) (condition très « douce »). Les
résultats présentés Figure 82A, obtenus après coloration des protéines au bleu de Coomassie,
ne montrent pas de différences majeures dans la migration des complexes solubilisés dans les
différentes conditions. Il peut cependant être noté la présence d‘une bande protéique de plus
d‘un MDa (montrée par une flèche) visible dans toutes les conditions, mais principalement
après solubilisation au DDM et au Triton X-100. Des activités cytochrome c oxydase
(complexe IV), NADH déshydrogénase (complexe I), SQR et hydrogénase ont été réalisées
sur ces échantillons directement sur gel (Figure 82 B-E). On constate cette fois-ci des
différences
entre
les
conditions
de
solubilisation.
Concernant
l‘activité
NADH
déshydrogénase, une bande présente dans toutes les conditions à environ 350 kDa (flèche 1)
correspond probablement à un sous-complexe actif du complexe I déjà observé auparavant
(Guiral et al., 2009). Des bandes supplémentaires ont été détectées dans les fractions DDM et
Sarkosyl NL à des tailles plus élevées (environ 750 et 900 kDa pour le DDM, flèches 2 et 3
respectivement, et 650 et 800 kDa pour le Sarkosyl NL, flèches 4 et 5 respectivement) et
pourraient correspondre au complexe I entier, celui-ci ayant déjà été détecté à une taille
d‘environ 650 kDa (Guiral et al., 2009). Les bandes plus hautes pourraient être liées à
l‘association du détergent avec les protéines modifiant les propriétés de migration, ou à
166
Résultats et discussion
l‘association du complexe I avec d‘autres protéines. L‘analyse de ces différentes bandes par
spectrométrie de masse de type trappe à ions n‘a malheureusement pas pu nous permettre
d‘identifier de nouveaux partenaires potentiels, puisqu‘aucune protéine n‘a pu être identifiée
en raison d‘une trop faible quantité de matériel à analyser. L‘activité hydrogénase montre
également des bandes de différentes tailles dont certaines (flèches 6 et 7) pourraient
correspondre à des multimères d‘hydrogénase (chaque monomère du complexe hydrogénase
ayant une masse moléculaire d‘environ 130 kDa) ou à leur association avec d‘autres
protéines. Le profil obtenu après solubilisation par du Sarkosyl est similaire bien qu‘il
apparaisse que les différentes bandes protéiques portant une activité hydrogénase soient
déplacées vers le haut du gel. L‘activité SQR montre une bande d‘activité qui co-localise avec
l‘activité cytochrome c oxydase du complexe IV (panel D et E, piste 1, flèche 8), et qui
pourrait être due au supercomplexe SQR-bc-oxydase déjà caractérisé (Prunetti et al., 2010) ;
les autres bandes actives correspondent probablement aux différents multimères
(SQR
monomérique = 48 kDa) de la SQR libre. Enfin, dans le cas de l‘activité cytochrome c
oxydase, on observe clairement des bandes de très haut poids moléculaire dans chaque
condition de solubilisation, mis à part le sarkosyl NL (flèches 9). Les bandes actives
observées plus haut correspondent à des agrégats qui sont à peine rentrés dans le gel et ne
peuvent donc pas être prises en compte. L‘analyse par spectrométrie de masse de type trappe
à ions de la bande issue de la solubilisation au DDM (piste 1, flèche 9) a permis
l‘identification de plusieurs protéines, dont deux sous-unités de l‘ATPsynthase (complexe V),
une protéine hypothétique Aq_1760, une cytochrome c peroxydase ainsi que le cytochrome c
et la protéine de Rieske du complexe bc1 (Table 7). De manière étonnante, on ne retrouve
aucune protéine de la cytochrome c oxydase justifiant l‘activité observée sur le gel ;
cependant, la présence de protéines du complexe bc1, que l‘on retrouve toujours associé à la
cytochrome c oxydase dans les membranes d‘Aquifex aeolicus, laisse penser que le complexe
IV est effectivement présent bien que non identifié par spectrométrie de masse.
L‘ensemble de ces résultats sont en accord avec ceux précédemment obtenus au
laboratoire sur l‘existence de complexes et supercomplexes actifs (Guiral et al., 2009; Prunetti
et al., 2010). De plus, l‘utilisation de ce nouveau type de gel a permis l‘identification d‘un
complexe de haut poids moléculaire présentant une activité cytochrome c oxydase, qui semble
parfaitement répondre à la notion de mégacomplexe.
167
Résultats et discussion
Figure 82. Séparation des protéines membranaires solubilisées par gels BN AB3. 50 µg de membranes
solubilisées au DDM 0,5% (piste 1), Sarkosyl NL 2% (piste 2), Tween 20 2% (piste 3), Triton X-100 2% (piste
4), sont chargés sur gel bleu natif, et sont colorées au bleu de coomassie (A) ou révélées par activité NADH
déshydrogénase (B), hydrogénase (C), SQR (D) et cytochrome c oxydase (E). Les masses sont données en kDa à
gauche de chaque gel.
168
Résultats et discussion
Nom de la protéine
Gène
Numéro d’identification NCBI
Nb de
Peptides
Totaux
Nb de
Peptides
Uniques
F1 ATP synthase alpha, central domain
atpA
3913127
15
9
Hypothetical protein Aq_1760
aq_1760
15606825
15
5
F1 ATP synthase beta subunit
atpD
3913128
9
4
Cytochrome c
cyc
15605643
7
3
Cytochrome c peroxidase
cpx
15605716
9
3
Hypothetical protein Aq_1558
aq_1558
15606693
4
2
Rieske-I iron sulfur protein
petA
15605645
4
2
Table 7 : Résultats d’analyses de Spectrométrie de masse de type trappe à ions. Analyse réalisée sur la
bande protéique (flèche 9) révélée au bleu de Coomassie du gel de la figure 6E.
IV) Développement des gels natifs à larges pores pour la
visualisation des mégacomplexes
Les premiers résultats sont prometteurs, toutefois, le problème principal réside encore dans le
pouvoir résolutif du gel : en effet, l‘activité cytochrome c oxydase « lourde » se trouve très
haut dans le gel, juste après le gel de concentration, et se présente comme un signal plutôt
diffus sous lequel pourraient se trouver plusieurs bandes distinctes. Nous avons donc décidé
de poursuivre ces travaux en développant des gels permettant une meilleure résolution des
complexes de haut poids moléculaire.
Récemment, un nouveau type de gel BN modifié, capable de séparer des complexes
protéiques de taille supérieure à 10 MDa, a été développé (Strecker et al., 2010). Cette
innovation repose sur des travaux bien plus anciens qui avaient étudié l‘effet de la proportion
de l‘agent réticulant, le bisacrylamide, sur la porosité des gels de polyacrylamide (Righetti et
al., 1981; Ruchel et al., 1978). Il avait été ainsi démontré que diminuer la concentration en
acrylamide d‘un gel en augmentait la porosité, mais aussi que d‘une manière assez
169
Résultats et discussion
paradoxale, l‘augmentation de la proportion de bisacrylamide par rapport au total des deux
monomères (le pourcentage de C) au-delà d‘une certaine valeur augmentait cette porosité de
manière non négligeable (Figure 83). Ce principe a été mis en application dans le protocole
proposé par Strecker et collaborateurs (Strecker et al., 2010) (Strecker et al 2010) et a donné
naissance à des gels dont le pourcentage de C varie le long du gel, permettant ainsi la
migration de gros complexes protéiques (jusqu‘à 45 MDa) tout en leur conservant un
caractère manipulable.
Figure 83. Différents gels de polyacrylamide observés en microscopie électronique en transmission. Les
valeurs sont montrées en tant que %T/%C. La concentration d‘acrylamide + bisacrylamide (T) augmente de
gauche à droite, avec la concentration de bisacrylamide par rapport au total des deux monomères (C) constante,
diminuant ainsi la prorosité du gel. A l‘inverse, quand T est constant et C augmente (représentation verticale), la
taille des pores du gel augmente. D‘après Rüchel et al, 1978.
Nous avons donc mis en place cette nouvelle technique, désignée ci-après comme gels
BNPL (pour gels bleus natifs à pores larges, Table 6), en réalisant un gradient de [3% T,
20%C] à [9% T, 6%C] destiné à séparer des protéines jusqu‘à 25 MDa. Les résultats Figure
84 montrent qu‘une meilleure résolution des hauts poids moléculaires est atteinte de manière
satisfaisante.
170
Résultats et discussion
Figure 84. Migration de marqueurs de masses moléculaires sur gel bleu natif à pores larges (A).Un gel BN
« classique » 4-15% d’acrylamide est représenté à titre de contrôle (B). Les masses sont données en kDa à
gauche du gel.
Nous avons également souhaité élargir notre gamme de conditions de solubilisation,
afin de trouver celles où des superstuctures protéiques seraient conservées. Nous avons donc
de nouveau utilisé le DDM, le Tween 20, et le Triton X100, ainsi que le Nonidet P40 (non
ionique) et la Digitonine (couramment employée pour isoler les complexes et supercomplexes
mitochondriaux). De plus, la concentration du détergent ayant une influence directe sur la
conservation de l‘intégrité des complexes énergétiques (Guiral et al., 2009), nous avons testé
deux concentrations différentes de chaque détergent (0,5 et 3%) pour solubiliser les protéines
membranaires. Enfin, les mégacomplexes étant des structures très « lourdes », ils peuvent être
perdus à la suite d‘une ultracentrifugation trop longue et trop rapide des membranes
solubilisées (voir section Matériel et Méthodes). Le protocole de récupération des protéines
solubilisées a donc été modifié en conséquence en diminuant la durée et la vitesse
d‘ultracentrifugation (Wittig et al., 2006). Les résultats Figure 85 sont intéressants à plusieurs
niveaux : en premier lieu, une bande d‘environ 2 MDa (flèche 1) est présente dans toutes les
conditions testées. Ensuite, dans certaines conditions, une bande supplémentaire d‘1 MDa
environ est détectée (flèche 2).
171
Résultats et discussion
Figure 85. Séparation des protéines membranaires solubilisées par gels BN à pores larges. 75 µg de
membranes solubilisées dans différentes conditions sont chargés sur le gel. Les protéines sont colorées au bleu
de coomassie. Les masses sont données en kDa à gauche de chaque gel. 1, DDM 0,5% ; 2, DDM 3% ; 3, Tween
20 0,5% ; 4 Tween 20 3% ; 5, Triton X-100 0,5% ; 6, Triton X-100 3% ; 7, Nonidet P40 0,5% ; 8, Nonidet P40
3% ; 9, digitonine 0,5% ; 10, digitonine 3%.
Nous avons testé sur certains de ces échantillons trois activités enzymatiques sur gel (Figure
86). L‘activité NADH déshydrogénase a donné un résultat attendu, avec une activité
correspondant au sous-complexe (350 kDa, panel A, flèche 1) et au complexe entier (650
kDa, panel A, flèche 2) pour les deux conditions testées ; en revanche les activités
hydrogénase et cytochrome c oxydase ont dévoilé des profils très intéressants, puisque deux
bandes d‘environ 1 MDa sont révélées en activité hydrogénase lorsque la solubilisation a été
effectuée avec du Nonidet P40 (panel B, piste 2, flèche 3), ainsi que des bandes d‘environ 800
kDa, 1 MDa (flèches 4 et 5) et de manière plus faible 2 MDa (flèche 6) en activité cytochrome
c oxydase pour les deux conditions testées. Il faut également noter que le supercomplexe
SQR-bc-oxydase (taille observée sur gel : environ 450 kDa, Figure 82 panel D piste 1) n‘est
pas révélé par cette dernière activité ce qui peut suggérer qu‘il n‘ait pas été solubilisé dans les
conditions testées, ou un état d‘oligomérisation ou d‘association avec d‘autres protéines,
pouvant donner les hauts poids moléculaires observés. Enfin, le résultat fourni par l‘activité
hydrogénase doit être modéré, puisque le même test répété quelques jours plus tard sur le
même échantillon ne révèlera pas les bandes de 1 MDa : sa présence initiale peut être
artéfactuelle (artéfact de migration par exemple), on peut aussi supposer que le complexe dont
172
Résultats et discussion
l‘hydrogénase fait partie aurait tendance à se décomposer en ses éléments de base au cours du
temps.
Figure 86. Recherche de mégacomplexes sur gel bleu natif à pores larges. 75 µg de membranes solubilisées
sont chargés sur gel bleu natif à pores larges, et les protéines sont révélées par activité NADH déshydrogénase
(A) hydrogénase (B) et cytochrome c oxydase (C). Les masses sont données en kDa à gauche du gel 75 µg de
membranes solubilisées sont chargés sur le gel. Les masses sont données en kDa à gauche du gel. 1, Tween 20
3% ; 2, Nonidet P40 3%.
Les trois bandes (2 MDa, 1 MDa et 800 kDa) issues de la solubilisation au Nonidet
P40 ont été découpées du gel coloré au bleu de Coomassie, et analysées par spectrométrie de
masse de type trappe à ions. Les résultats n‘ont malheureusement pas été concluants, aucune
protéine n‘ayant été identifiée. Les protéines membranaires, à cause de leurs zones
hydrophobes et de la difficulté de les ioniser, sont connues pour répondre assez mal aux
analyses de spectrométrie de masse. De plus, la masse moléculaire importante de ces
complexes rajoute encore un niveau de complexité. Il a donc fallu employer une technique
plus sensible et précise que la trappe à ions pour obtenir des résultats fiables, et une nouvelle
analyse par spectrométrie de masse de type orbitrap a été menée. Grâce à cette stratégie, de
nombreuses protéines ont pu être identifiées. Concernant la bande de 800 kDa, les protéines
majoritaires sont des contaminants souvent retrouvés dans les préparations de membranes
solubilisées d‘Aquifex aeolicus, puisque l‘on retrouve essentiellement des protéines
ribosomales, ainsi que des protéines du flagelle (Table 7A). Cette constatation est également
173
Résultats et discussion
valable pour la bande de 1 MDa (Table 7B). Mais dans les deux cas, on retrouve une
cytochrome c peroxydase qui pourrait expliquer la forte activité cytochrome c oxydase
observée sur le gel. L‘activité cytochrome c peroxydase (réduction de l‘H2O2 grâce aux
électrons d‘un cytochrome c) pourrait être révélée de manière aspécifique par le test utilisé
pour la cytochrome c oxydase (réduction de l‘O2 grâce aux électrons d‘un cytochrome c). La
bande de 2 MDa (Table 7C) contient quelques protéines ribosomales, une protéine de
membrane externe et la même cytochrome c peroxydase précédemment identifiée, mais
surtout des protéines du flagelle et la protéine hypothétique Aq_1760. Cette dernière fera
l‘objet d‘une étude plus approfondie, exposée dans la partie III des résultats de cette thèse.
D‘autre part la présence de la cytochrome c peroxidase était intrigante : il a récemment été
montré que ce type de protéine pouvait jouer un rôle non conventionnel d‘accepteur terminal
d‘électrons dans les chaînes respiratoires (Strazdina et al., 2012), nous nous étions donc
interrogés dans un premier temps sur la possibilité d‘une association de cette protéine avec
des enzymes des voies respiratoires, et donc de son implication dans le métabolisme
énergétique d‘Aquifex aeolicus. La non-reproductibilité dans la détection avec un seuil
convenable des enzymes du métabolisme énergétique et une première analyse in silico de
cette cytochrome c peroxydase révèlant qu‘elle serait soluble, laissent cette hypothèse en
suspend.
V) Impact des conditions de culture sur la présence des
superédifices
Il a été proposé que l‘état physiologique de la cellule influe sur l‘organisation supramoléculaire des chaînes respiratoires de la mitochondrie ; de même, la notion de
« respirazone » implique également une optimisation du métabolisme énergétique. Il n‘est
donc pas illogique de penser qu‘une bactérie en phase exponentielle de croissance, et donc
ayant des besoins en énergie très importants, soit plus susceptible de présenter des degrés
supérieurs d‘architecture de ses complexes énergétiques. Nous avons testé cette hypothèse en
parallèle de nos autres expériences. Pour cela, nous avons utilisé des cellules d‘Aquifex
174
Résultats et discussion
aeolicus qui ont été cultivées dans des conditions de croissance particulières grâce à une
collaboration avec l‘équipe de Y. Combet-Blanc et R. Auria (Institut Méditerranéen
d‘Océanologie, Marseille). Les bactéries ont été cultivées en fermenteur, en présence de
thiosulfate (la fleur de soufre insoluble posant des problèmes d‘ordre technique), et d‘un flux
d‘oxygène étroitement contrôlé pour en rendre la concentration constante et optimale pour la
croissance de la bactérie. En milieu de phase exponentielle de croissance, la culture a été
arrêtée, les cellules récoltées et congelées à -80°C. Nous avons alors appliqué le même
protocole de solubilisation des membranes, à l‘aide de Tween 20 et de Nonidet P40 3%, ces
deux détergents ayant été ceux pour lesquels les résultats avaient été les plus probants au
cours du développement du mode opératoire. La migration sur gel de ces fractions ainsi que
les activités enzymatiques sont présentées Figure 87. Ainsi, les profils obtenus par coloration
des protéines ou par activités ne semblent pas vraiment différents de ce qui avait été
précédemment obtenu, ne nous permettant pas d‘identifier des complexes uniquement
présents en phase exponentielle de croissance de la bactérie, ou dans les conditions de
croissance particulières utilisées ici.
Figure 87. Recherche de mégacomplexes dans des cellules d’Aquifex aeolicus récoltées en milieu de phase
exponentielle de croissance. 75 µg de membranes solubilisées sont chargés sur gel bleu natif à pores larges, et
les protéines sont colorées au bleu de coomassie (A) ou révélées par activité hydrogénase (B), NADH
déshydrogénase (C) et cytochrome c oxydase (D). Les masses sont données en kDa à gauche du gel. 1, Tween 20
3% ; 2, Nonidet P40 3%.
175
A
Nom de la protéine
Gène
Numéro d’identification
NCBI
Cytochrome c peroxidase
50S ribosomal protein L3
50S ribosomal protein L1
50S ribosomal protein L4
50S ribosomal protein L2
Hypothetical protein Aq_1862
50S ribosomal protein L18
50S ribosomal protein L10
50S ribosomal protein L9
FOF1 ATP synthase subunit beta
50S ribosomal protein L7/L12
50S ribosomal protein L6
50S ribosomal protein L21
Hypothetical protein Aq_1345
FOF1 ATP synthase subunit alpha
50S ribosomal protein L14
Dihydrodipicolinate reductase
50S ribosomal protein L5
Flagellin
cpx
rplC
rplA
rplD
rplB
aq_1862
rplR
rplJ
rplI
atpD
rplL
rplF
rplU
aq_1345
atpA
rplN
dapB
rplE
fliC
15605716
15605616
15606946
15605617
15605619
15606901
15606750
15606947
15607017
15607015
15606948
15606751
15606746
15606901
15606090
15606756
15606245
15606754
15606990
Nom de la protéine
Gène
Numéro d’identification
NCBI
50S ribosomal protein L3
50S ribosomal protein L1
flagellin
Cytochrome c peroxidase
Hypothetical protein Aq_1862
50S ribosomal protein L7/L12
ATP-dependant Clp protease
3-dehydroquinate synthase
ribosomal protein S01
50S ribosomal protein L10
50S ribosomal protein L24
50S ribosomal protein L2
DNA gyrase A subunit
Flagellar hook protein FlgE
DNA-directed RNA polymerase beta
prime subunit
RNA polymerase beta prime subunit
50S ribosomal protein L18
Hypothetical protein Aq_1760
FOF1 ATP synthase subunit alpha
rplC
rplA
fliC
cpx
aq_1862
rplL
clpC
aq_1922
rpsA
rplJ
rplD
rplB
gyrA
flgE
rpoB
Nb de
Peptides
Totaux
115
109
69
61
59
56
54
49
49
43
42
38
36
33
32
31
29
29
21
Nb de
Peptides
Uniques
44
26
29
24
29
28
10
25
22
28
15
20
12
20
23
11
21
15
20
15605616
15606946
15606990
15605716
15606901
15606948
15606509
15606938
15606647
15606947
15605617
15605619
15606292
15606898
15606949
Nb de
Peptides
Totaux
103
102
100
90
89
89
86
86
69
65
59
56
52
51
50
Nb de
Peptides
Uniques
29
30
26
44
32
17
54
32
51
29
23
28
41
30
41
rpoC
rplR
aq_1760
atpA
15606950
15606750
15606825
15606090
48
46
35
33
6
8
22
25
Nom de la protéine
Gène
Numéro d’identification
NCBI
Hypothetical protein Aq_1760
flagellin
50S ribosomal protein L2
Hypothetical protein Aq_331
Outer membrane protein C
50S ribosomal protein L1
FOF1 ATP synthase subunit alpha
Cytochrome c peroxidase
Hypothetical protein Aq_1345
aq_1760
fliC
rplB
aq_331
ompC
rplA
atpA
cpx
aq_1345
15606825
15606990
15605619
15605849
15605995
15606946
15606090
15605716
15606901
Nb
dePeptides
Totaux
16
13
10
5
4
4
4
3
3
Nb de
Peptides
Uniques
14
9
7
3
3
3
2
2
1
B
C
Table 7 : Résultats d’analyses de Spectrométrie de masse de type OrbiTrap. Analyse réalisée sur les bandes protéiques
révélées au bleu de Coomassie à 0,8 MDa (A) ; 1MDa (B) et 2 MDa (C) du gel de la figure 85. Moins d’échantillons avaient
été analysés dans le cas de la bande à 2MDa expliquant le plus faible nombre de peptides obtenus.
Résultats et discussion
VI) Discussion
Les notions de mégacomplexes et de respirazones sont encore très récentes, et leur
mise en évidence par des preuves biochimiques est loin d‘être triviale. Le travail exposé ici
représente la première étape d‘un projet visant à étudier l‘organisation architecturale des
complexes énergétiques en prenant une bactérie pour modèle. Notre positionnement présente
plusieurs originalités par rapport à la littérature : en premier lieu, le choix du modèle d‘étude,
une bactérie hyperthermophile présentant un métabolisme énergétique non conventionnel par
rapport aux mitochondries et aux chloroplastes couramment étudiés, et dont l‘organisation en
supercomplexes est bien établie ; le choix des techniques ensuite : en effet, les gels bleus
natifs à pores larges sont une évolution très récente des gels bleus natifs classiquement utilisés
dans l‘étude des protéines membranaires. A ce jour en effet, une seule publication portant sur
l‘assemblage supramoléculaire d‘aquaporines humaines mentionne l‘emploi de tels gels (Jin
et al., 2011), mais leur pouvoir résolutif pourrait constituer un outil de choix pour toutes les
équipes travaillant sur des complexes protéiques de haut poids moléculaire. L‘emploi de la
spectrométrie de masse de type orbitrap pour l‘identification de protéines membranaires et de
structures « lourdes », bien plus précise et sensible que la trappe à ions, est également une
nouveauté à notre échelle, et représente une évolution de nos techniques d‘analyse en lien
avec les nouveaux besoins découlant de la thématique abordée. Nous pensons donc que le
choix et la mise au point de ces techniques et de ce mode opératoire représentent une étape clé
pour les futures expériences qui seront menées au laboratoire.
Plusieurs verrous ont également été dévoilés par ce travail. L‘un des points principaux
concerne la préparation de l‘échantillon proprement dit : si nous avons bien obtenu des
associations protéiques de haut voire très haut poids moléculaire, un certain nombre sont
composées de protéines solubles. En effet, ces résultats pointent le fait que lors de la
préparation d‘un échantillon de membranes, on retrouve des ribosomes, des RNA
polymérases… En conséquence, les résultats de spectrométrie de masse font apparaitre la
présence de protéines du cytoplasme et du périplasme qui, présentes en grande quantité,
peuvent « masquer » la détection des protéines membranaires présentes peut-être en plus
faible quantité et surtout dont l‘identification par spectrométrie de masse est plus difficile.
Ainsi, certains résultats suggéraient la présence de protéines respiratoires (plusieurs sous176
Résultats et discussion
unités du complexe I et de l‘ATPsynthase, protéines du supercomplexe SQR-bc1-oxydase…)
dans les bandes analysées, mais si l‘on se réfère aux critères d‘acceptabilité de la
spectrométrie de masse (nombre de peptides…) il est impossible de conclure à la présence ou
à l‘absence de ces protéines du métabolisme énergétique dans les bandes analysées. Mais si
l‘on parvenait à résoudre ce problème de contamination, l‘analyse des profils sur gels serait
beaucoup plus aisée et souffrirait de moins d‘ambiguïtés. Le lavage au NaBr des membranes
avant
leur
solubilisation,
étape permettant
d‘éliminer
les
protéines
interagissant
transitoirement avec la membrane, mais également les éventuels contaminants, a été testé au
cours de cette étude. Cependant, ce traitement est connu pour dissocier des interactions faibles
entre protéines, et nous pensons qu‘il pourrait avoir un effet délétère sur les mégacomplexes.
De fait, cette stratégie n‘a apporté aucun élément nouveau. Un traitement plus doux, comme
le dépôt des membranes non-solubilisées sur un coussin de sucrose par exemple permettrait
probablement d‘éliminer la plus grande part des contaminants solubles en respectant
l‘intégrité de l‘organisation de la membrane. Les futures recherches doivent également porter
sur les conditions de solubilisation. En revanche, le temps de solubilisation ne semble pas
avoir d‘effet majeur, des temps de 5 ou 30 minutes ayant donné des profils strictement
similaires. Enfin, il faut se rappeler que certains résultats obtenus par les tests d‘activité
hydrogénase notamment, semblaient suggérer sa présence au sein de complexes plus lourds
que ceux habituellement observés. Cette piste plus prometteuse doit également être explorée.
En dernier lieu, ce travail est à remettre dans le contexte plus général du projet mené
dans l‘équipe, puisque d‘autres expériences, utilisant d‘autres techniques et d‘autres
approches sont actuellement menées en parallèle. Les premiers résultats de l‘une d‘entre elles
semblent suggérer un possible enrichissement de zones membranaires restreintes en SQR et
en hydrogénase, ce qui pourrait aller dans le même sens que les « respirazones » proposés
chez Escherichia coli.
177
Résultats et discussion
Chapitre III
Mise en évidence d’un
nanocompartiment protéique et de sa
ferritine atypique chez la bactérie
hyperthermophile Aquifex aeolicus
(Article en préparation)
178
Résultats et discussion
179
Résultats et discussion
Mise en évidence d’un nanocompartiment protéique et de sa ferritine
atypique chez la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus
Clément AUSSIGNARGUES, Marianne ILBERT, Marianne GUIRAL, Elisabeth LOJOU,
Pascale INFOSSI et Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI
Introduction
Dans la nature, les exemples de protéines capables de s‘auto-assembler en nano- ou
microcompartiments ne sont pas rares. Ces protéines peuvent être à vocation structurales
(comme les capsides des virus) ou enzymatiques. Dans ce dernier cas, les ferritines sont l‘un
des systèmes les mieux documentés. Elles constituent une immense famille représentée dans
les trois domaines de la vie et ont pour rôle d‘oxyder le fer ferreux en fer ferrique au niveau
d‘un centre ferroxydase binucléaire, afin de le stocker à l‘intérieur de la sphère qu‘elles
forment en s‘assemblant en homomultimères. Ce stockage peut intervenir dans différents
contextes suivant les organismes et les conditions de croissance. Ainsi, les ferritines peuvent
être impliquées dans la réponse à une surabondance ou une carence en fer, un moyen de
protection contre le stress oxydant ou encore de manière plus générale une réserve de fer biodisponible pour l‘organisme hôte, qui pourra l‘utiliser par exemple dans les voies de
biosynthèses des protéines nécessitant ce métal (Smith, 2004). En effet, à pH physiologique et
en présence d‘oxygène, le fer se retrouve sous la forme majoritaire de fer (III) ferrique, très
peu soluble et donc peu bio-disponible (Carrondo, 2003). En revanche, sous forme de fer (II)
ferreux, il peut réagir avec le peroxyde d‘hydrogène produit par le métabolisme pour donner
des espèces réactives de l‘oxygène très dommageables pour la cellule (réaction de Fenton)
(Andrews, 1998). Les ferritines permettent donc à la fois de conserver une source de fer non
dangereuse à l‘intérieur de la cellule, mais aussi de lutter contre le stress oxydatif (Yamamoto
et al., 2004). Chez les bactéries, trois types de ferritines sont principalement retrouvés : les
ferritines bactériennes, les bactérioferritines et les DPS (DNA binding protein from starved
cells). Les deux premiers types s‘associent en une sphère creuse de 24 sous-unités mais
diffèrent par la fixation d‘un hème b (de fonction inconnue) entre deux sous-unités chez les
bactérioferritines. Leur cavité centrale peut contenir respectivement 2500 et 1800 atomes de
180
Résultats et discussion
fer (Smith, 2004). Les DPS, en plus de leur rôle de stockage du fer, peuvent, suivant les
organismes, se fixer à l‘ADN afin de le protéger physiquement contre les nucléases ou les
espèces réactives de l‘oxygène. Elles ne sont en revanche constituées que de 12 sous-unités et
stockent environ 500 atomes de fer (Zhao et al., 2002).
Parmi les autres protéines de structure pouvant s‘auto assembler, un exemple
intéressant est l‘encapsuline présente chez de nombreux micro-organismes. La résolution de
la structure cristallographique en 2008 de celle de Thermotoga maritima (Sutter et al., 2008) a
permis d‘en apprendre beaucoup sur une protéine qui avait été à l‘origine classifiée comme
protéase chez d‘autres organismes (Valdes-Stauber and Scherer, 1994). Il s‘agit d‘une
protéine d‘environ 30 kDa qui s‘associe en 60-mers pour donner une sphère creuse
(ressemblant à la capside de certains virus) de 24 nm de diamètre et de haut poids moléculaire
dépourvue de toute activité protéase (Figure 1).
Figure 1. Encapsuline de Thermotoga maritima (code PDB 3DKT) sous forme complète (60-mers) à
gauche, ou monomérique, à droite. D‘après (Sutter et al., 2008).
181
Résultats et discussion
Le plus surprenant a été de découvrir la présence d‘autres enzymes comme des péroxydases
de type DyP (dye-decolorizing peroxidase), ou encore des protéines de types ferritines, à
l‘intérieur de cette structure. La nature de la protéine « cargaison » présente au sein de ce
nanocompartiment varie suivant l‘organisme considéré., Bien qu‘il n‘existe qu‘une seule
étude, essentiellement structurale, réalisée sur l‘encapsuline de Thermotoga maritima et dans
une moindre mesure, sur celle de Brevibacterium linens (Sutter et al., 2008) les auteurs
proposent que l‘encapsulation de ces protéines permette de les protéger et de les stabiliser tout
en augmentant leur efficacité ; dans le cas des ferritines, l‘encapsuline offrirait également un
espace de stockage du fer plus important que pour une ferritine seule (Sutter et al., 2008). Le
rôle physiologique de ces protéines est donc encore très spéculatif, et de nombreux travaux
restent nécessaires à la compréhension de ces systèmes.
La bactérie chimiolitoautotrophe et microaérophile Aquifex aeolicus est une des
bactéries les plus hyperthermophiles connues à ce jour et représente l‘une des branches les
plus basses de l‘arbre phylogénétique (Stetter, 2006). Beaucoup d‘enzymes de cet organisme
ont été caractérisées et certaines ont été montrées pour s‘autoassembler en nanocompartiments
enzymatiques. C‘est le cas par exemple de la soufre oxygénase réductase (SOR), formée de
24 sous-unités de 38 kDa et impliquée dans la dismutation du soufre élémentaire (Urich et al.,
2006);(Pelletier et al., 2008) et de la lumazine synthase (60 sous-unités de 16,7 kDa) (Zhang
et al., 2001). La recherche de nouvelles structures de haut poids moléculaire chez Aquifex
aeolicus a révélé la présence d‘unédifice
multimérique de 2 MDa. L‘identification des
composants de cette structurea permis de montrer l‘existence à la fois d‘une protéine de
compartimentalisation appartenant à la famille des encapsulines ainsi qu‘une nouvelle sousfamille de ferritines atypiques.
Matériel et Méthodes
Obtention du matériel biologique :
Aquifex aeolicus VF5 est cultivé à 85°C en bouteilles de 2 litres contenant 400 mL de
milieu SME modifié en présence de fleurs de soufre (7,5 g/L) comme décrit précédemment
(Guiral et al., 2005b). Les cellules sont récoltées en phase exponentielle de croissance et
congelées à -80°C.
182
Résultats et discussion
La fraction contenant les protéines solubles de très haut poids moléculaire est obtenue
comme suit : des cellules d‘Aquifex aeolicus (3 g) sont cassées au désintégrateur de cellules
par deux passages à 1,6 kbar, puis centrifugées à 10000 g pendant 10 min pour éliminer les
débris et les cellules intactes. Le surnageant est ensuite ultracentrifugé à 250000 g pendant 1 h
30 pour culoter les membranes ainsi que les protéines solubles très lourdes. Le culot est lavé
dans du Bis-Tris 50 mM pH 7, puis repris dans le même tampon et centrifugé à 20000g
pendant 30 min pour éliminer les membranes. Le surnageant contient les protéines d‘intérêt.
Electrophorèse et activité sur gel :
Les gels de polyacrylamide utilisés sont des gels natifs basés sur une précédente
publication (Strecker et al., 2010) avec quelques modifications. La teneur en bisacrylamide
(% C, c‘est-à-dire le pourcentage de bisacrylamide par rapport au total des deux monomères
acrylamide et bisacryalamide) de ces gels est supérieure à ce qui est couramment employé
(environ 3% C), permettant ainsi d‘obtenir une porosité plus importante et donc la possibilité
de faire migrer des protéines et complexes de très haut poids moléculaire. Le gel de
concentration est à 2,5% (25% C) et le gel de séparation est un gradient de 3% (20% C) à 9%
(6% C). Le tampon utilisé pour la préparation du gel est un tampon Imidazole-HCl 25 mM pH
7, ACA 0,5 M, et la migration s‘effectue à 10 mA constant à température ambiante, dans un
tampon Imidazole-HCl 25 mM, pH 7 pour l‘anode et un tampon Imidazole 7,5 mM, Tricine
50 mM sans bleu cathode G250 pour la cathode, et le tampon de charge ne contient que du
glycérol et du bleu de bromophénol pour alourdir et colorer l‘échantillon. Après migration, le
gel est coloré au bleu de Coomassie ou soumis à une activité ferroxydase , c'est-à-dire au suivi
de l‘oxydation du fer (II) en fer (III). Afin de détecter cette activité sur gel, celui-ci est incubé
15 min dans du tampon acétate de sodium 100 mM pH 6, transféré dans le même tampon
additionné de 0,2 mM de sulfate de fer et d‘ammonium et incubé à 37°C pendant 2 h sous
agitation douce (Lang et al., 2012). Après un rinçage rapide, le gel est incubé dans une
solution de ferrocyanure de potassium (1% poids/volume dans HCl 0,1 N) pour révéler le fer
(III). La ferritine de rate de cheval (450 kDa) est utilisée comme contrôle positif.
Spectrométrie de masse :
Les analyses protéomiques sont réalisées sur un spectromètre de masse LTQ Velos
Orbitrap (Trappe ionique linéaire avec une cellule C-trap et une Orbitrap) équipé d‘une source
d‘ions nanospray et couplé à une nanochromatographie Ultimate NCS 3500. Après digestion
de l‘échantillon par la trypsine, les solutions de peptides sont dessalées sur une pré-colonne
183
Résultats et discussion
de type C18 et les peptides sont élués sur une colonne C18 par un gradient de 4% à 55% de
tampon B (20% eau/ 80% acetonitrile/0.1% d‘acide formique) dans 0.1% d‘acide formique
dans l‘eau pendant 30 min, puis jusqu‘à 95% B en 5 min. Les peptides sont détectés en mode
positif par un événement « full MS » dans l‘Orbitrap, à la résolution 30 000, suivi par un
événement de Dissociation Induite par Collisions (CID) des 10 ions-parents les plus intenses
(Top 10) (analyses des fragments MS/MS dans l‘Orbitrap, à la résolution 7500, dans une
gamme de masses de 150-1700). Le traitement des spectres est sur le logiciel de Proteome
Discoverer (Thermofisher Scientific) et la recherche des protéines par MASCOT (licence in
situ) en utilisant les paramètres de recherche suivants : database : NCBI_nr et taxonomie
Aquifex
aeolicus;
enzyme :
trypsine;
modifications
variables des
acides
aminés :
carbamidométhylation (cysteine) et oxydation (methionine); les valeurs monoisotopiques sont
considérées ; tolérance de masse ± 8 ppm ; tolérance de masse sur les fragments : ± 0.8Da ; 1
site manqué par la Trypsine admis ; les protéines ne sont considérées comme présentes qu‘à
partir de 2 peptides uniques avec une probabilité p<0.05.
Analyse in silico :
La prédiction de la structure secondaire des protéines a été obtenue grâce au serveur
JPRED (Cole et al., 2008). Les alignements de séquence ont été générés en utilisant clustalW
sur le serveur du Pole Bioinformatique Lyonnais (Combet et al., 2000). La recherche de
protéines homologues a été réalisée en utilisant l‘algorithme DELTA-BlastP (Boratyn et al.,
2012). La modélisation de Aq_1760 a été faite en utilisant le serveur SWISS-MODEL
(Arnold et al., 2006) et le logiciel PyMOL a été utilisé pour générer les figures finales.
Résultats
La protéine Aq_1760 est identifiée comme étant une encapsuline
Afin de trouver de nouvelles structures de très haut poids moléculaire chez Aquifex
aeolicus, une fraction correspondant à des protéines solubles et « lourdes » a été déposée sur
un gel natif de polyacrylamide à pores larges. Ces gels possèdent un pourcentage de bisacrylamide bien supérieur à celui des gels plus classiques, conduisant ainsi à un maillage
beaucoup plus lâche. Ils ont initialement été développés en tant que gels bleu natif permettant
de visualiser des complexes protéiques de plusieurs MDa (Strecker et al., 2010). Après
migration et coloration des protéines au bleu de Coomassie, une bande d‘environ 2 MDa a été
184
Résultats et discussion
obtenue (Figure 2A, gel). Cette même bande a été découpée et analysée par spectrométrie de
masse afin d‘en déterminer la composition protéique (Figure 2B, tableau de masse).
Figure 2. A. Migration de la fraction contenant les protéines « lourdes » (75 µg) sur gel natif à larges
pores. Les marqueurs de poids moléculaires sont représentés à gauche. B. Identification des protéines de la
bande découpée sur le gel (encadrée) par spectrométrie de masse de type Orbitrap. Seuls les 10 premiers résultats
sont présentés ici.
Les résultats indiquent la présence d‘une protéine hypothétique majoritaire désignée
sous le nom d‘Aq_1760. Une recherche par similarité de séquence (BlastP) indique des
homologies avec la famille de protéines « linocin M18 » et notamment avec l‘encapsuline de
la bactérie Thermotoga maritima, seule représentante de cette famille caractérisée et
cristallisée à ce jour (Sutter et al., 2008). La protéine Aq_1760 d‘Aquifex aeolicus présente 25%
d‘identité avec cette dernière de plus un alignement de séquences montre que la structure
secondaire prédite d‘Aq_1760 est sensiblement similaire à celle de l‘encapsuline de
Thermotoga maritima (Figure 3).
Par analogie avec la structure quaternaire déjà décrite, une association en 60-mers
d‘Aq_1760 donnerait un complexe d‘une masse moléculaire d‘environ 1,9 MDa, cohérente
avec la masse apparente sur gel d‘environ 2 MDa.
185
Résultats et discussion
A. aeolicus
T. maritima
A. aeolicus
T. maritima
A. aeolicus
T. maritima
A. aeolicus
T. maritima
A. aeolicus
T. maritima
10
20
30
40
50
60
|
|
|
|
|
|
MEFLQRDQAPLTAEEWEQIDKTAYEVFKSTVVCRKFMPVVGPFGAGHQVVSYDVLYGVEP
MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHP--------L
****:*. **** ::*::**: * *:**: : ***: * **:* : . .
70
80
90
100
110
120
|
|
|
|
|
|
GVCEVKPGQEYKVCEPVRTGERKHVPVPTLYKDFVISWRDLEHWRQFNLPVDTTGVAAAA
GEVEVLSDE----NEVVKWGLRKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETV
* ** ..:
* *: * ** :*: *
*.:. :*:: .: : ** :.: :.
130
140
150
160
170
180
|
|
|
|
|
|
SSLAVAEDKLILFGNQEMGIEGFLTAKGTLREELSDWEKVGNAFQDVVKGISRLVEKGFY
RKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFE--E-RKIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIE
.:* **::*: * :: *::*:*: :
.::. .. : :: :*:.:* : :.*:
190
200
210
220
230
240
|
|
|
|
|
|
TNYYLIVNPKRYFLLNRIHDNTGLLELEQ-IKKVVKEVYQTPIIPEDIVLLVSASPANFD
GPYTLVINTDR--WINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFK
* *::*..*
:* :::::*
**: ::: ::
.
: .*:**
.:*.
250
260
270
280
|
|
|
|
LAIALDVNVAFVETSNMNHTFRVMEMVVPRIKRPEAILIFSS
LILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF
* :. *:.:.: : .:
: : * .. :: .***::::.
Figure 3. Alignement des séquences d’encapsulines de Thermotoga maritima et Aquifex aeolicus et
représentation de leur structure secondaire, à partir des données cristallographiques pour Thermotoga
maritima, et prédite grâce au serveur JPRED (Cole et al., 2008) pour Aquifex aeolicus. Les hélices alpha sont
représentées en bleu et les brins beta en vert. *, acide aminé strictement conservé ; :, conservation forte ; .,
conservation faible.
Nous avons également modélisé la structure tridimensionnelle d‘Aq_1760 à partir de
celle de l‘encapsuline de Thermotoga maritima, et par analogie nous en avons reconstitué la
forme complète (60-mers). Ces modélisations montrent une similarité architecturale entre les
deux protéines, renforçant ainsi l‘idée de l‘appartenance de Aq_1760 à la famille des
encapsulines (Figure 4).
Nous avons donc identifié une nouvelle protéine d‘Aquifex aeolicus, Aq_1760, dont
l‘homologie structurale et de séquence la place dans la famille des encaspulines. Par
homologie avec la structure formée par l‘encapsuline de Thermotoga maritima, Aq_1760
serait le nomomère de base d‘une structure protéique de haut poids moléculaire qui
s‘associerait pour former une nanocagede 60 sous-unités identiques .
186
Résultats et discussion
Figure 4. A. Alignement des structures de l’encapsuline de Thermotoga maritima (en vert) et de la
modélisation de Aq_1760 (en bleu). B et C, représentation de la forme 60-mers de l’encapsuline Aq_1760
d’Aquifex aeolicus, entière (A) et en coupe (B).
Identification de la protéine cargaison d’Aq_1760
Il a été montré que les encapsulines sont des protéines de structures permettant de
compartimentaliser des enzymes appartenant à la famille des peroxydases ou à celle des
ferritines, et que le gène codant pour la protéine « cargaison » est généralement situé dans le
même opéron que celui codant pour l‘encapsuline (Sutter et al., 2008). L‘analyse du contexte
génétique d‘aq_1760 ne permet pas de définir la nature de la protéine cargaison : en effet, les
gènes aq_1758 et aq_1761 coderaient respectivement pour une pseudouridine synthase et une
protéine du primosome impliqué dans la réplication, réparation et recombinaison de l‘ADN.
La présence dans les protéines identifiées par spectrométrie de masse d‘une
cytochrome c peroxydase (Figure 2B) est intéressante. Cette enzyme est identifiée comme
étant une protéine de la famille MauG impliquée dans la biosynthèse du cofacteur tryptophane
tryptophylquinone (Wilmot and Davidson, 2009). Cependant, cette famille de protéines est
parfaitement distincte de la famille des peroxydases DyP que l‘on retrouve habituellement
187
Résultats et discussion
dans les encapsulines. De plus, les protéines cargaisons sont généralement identifiables grâce
à la présence d‘une extension C-terminale caractéristique et conservée permettant leur ancrage
à l‘intérieur de l‘encapsuline (Sutter et al., 2008). Or, la cytochrome c peroxydase identifiée ne
possède pas cette extension C-terminale. L‘ancrage de cette protéine à l‘intérieur de
l‘encapsuline semble donc peu probable. Sa présence dans cette bande de haut poids
moléculaire reste à être expliquée.
Nous nous sommes tournés vers une autre protéine identifiée par un grand nombre de
peptides lors de l‘analyse par spectrométrie de masse, Aq_331. La comparaison de sa
séquence avec celle d‘autres protéines encapsulées (ferritines et cytochrome c peroxydase)
montre la présence d‘un site conservé correspondant à l‘extension C-terminale d‘ancrage
(Figure 5).
G. diazotrophicus
B. xenovorans
Rhodococcus sp
B. parapertussis
B. linens
M. tuberculosis
S. cellulosum
F. alni
R. rubrum
T. maritima
A. aeolicus
10
20
30
40
|
|
|
|
-APAAGCAADGSGAGG-SAPPSPSAYGSLGIGSLKEKV--------QASAAAADGGQQPDT-SSSAEPQEGGSLNIGSLKGISQYE------GDEPAGAESAPEDPVEPAAAGPYDLSLKIGGLKGVSQ-------AERDPQDTDGSRLDP-APAARAPHDGSLNIGSLKGNPQQ-------SASARVEETDPPNPASADDPAPADDSLGIGSLRRRDQ-------FSPTIDFLDHPPPLP-QAATPTLAAGSLSIGSLKGSPR--------TEVEAAEEAAKLGATAKTGAMAPSGALGIGSLKGA----------ETMDRGGSGDPDAVTERQAAGPGDGSLGIGSLKGVGE-------IEAADTAGEGSGGDA-AKGATAQGDGSLGIGSLKGEAALARPPRL
--LRTYLFTDKPITEIEEETSGGSENTGGDLGIRKL------------LFKWFEKQEDYHAQRLKELFRKMNRFTIGGLGEES--------
Figure 5. Alignement de séquences des extensions C-terminale des peroxydases de type DyP (six premières
séquences) et des protéines de type ferritine (quatre dernières séquences) permettant leur ancrage dans
l‘encapsuline. La conservation des acides aminés est indiquée par le code couleur (rouge pour une identité et
jaune pour une substitution homologue. La séquence soulignée (T. maritima) correspond au peptide ancré dans
l‘encapsuline, visualisé dans la structure cristallographique (Sutter et al., 2008). G. diazotrophicus,
Gluconacetobacter diazotrophicus ;B. xenovorans, Burkholderia xenovorans ; B. parapertussis, Bordetella
parapertussis ; B. linens, Brevibacterium linens M18 ; M. tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis ; S.
cellulosum, Sorangium cellulosum ; F. alni, Frankia alni ; R. rubrum, Rhodospirillum rubrum ; T. maritima,
Thermotoga maritima ; A. aeolicus, Aquifex aeolicus.
Cette homologie associée à la co-migration de cette protéine avec l‘encapsuline
suggère fortement qu‘Aq_331 est la protéine de cargaison. Une analyse plus globale de la
séquence de Aq_331 montre qu‘il s‘agit d‘ une protéine de 293 acides aminés pour une masse
moléculaire prédite de 34,6 kDa avec une homologie de séquence avec la grande famille des
188
Résultats et discussion
protéines à domaine ferritine, ou « ferritin-like proteins» (Flp) pour reprendre le terme anglosaxon. Ce rattachement à la superfamille des ferritines appuie notre hypothèse.
Ainsi, le système cargo/cargaison d‘Aquifex aeolicus semblerait assez similaire à celui
de Thermotoga maritima, avec une protéine de la famille des ferritines encapsulée par une
nanocage protéique de grandes dimensions. Une différence notable toutefois entre ces deux
systèmes réside dans leurorganisation génétique : en effet, si les deux gènes codant pour les
protéines partenaires sont retrouvés dans le même opéron chez Thermotoga maritima, ils se
trouvent dans des loci tout à fait différents chez Aquifex aeolicus. Cette caractéristique n‘est
pas rare chez Aquifex aeolicus pour laquelle certains gènes, présents dans un même opéron à
l‘organisation très conservée chez les autres organismes, se retrouvent séparés et parfois très
éloignés les uns des autres dans le génome de la bactérie. Le cas le plus flagrant étant
probablement celui du complexe I.
Etude in silico et biochimique de la protéine Aq_331
Nous avons cherché à en apprendre plus sur cette protéine cargaison, en commençant
par une analyse de sa séquence. Les protéines de cette famille sont d‘une taille assez modeste,
entre 18 et 20 kDa environ, et présentent un repliement classique de quatre hélices α
regroupées en fagot et coiffées ou non par une hélice plus courte (Figure 6) (Haikarainen and
Papageorgiou, 2010; Smith, 2004).
Figure 6. Structure de la bactérioferritine de Desulfovibrio desulfuricans (code PDB 1NF4). Le centre actif
ferroxydase est visible au centre de la protéine : les deux atomes de fer sont représentés par des sphères rouges,
et les acides aminés qui les lient sont représentés par des bâtonnets bleus.
189
Résultats et discussion
Aq_331 est une protéine de 34,6 kDa, soit presque le double des autres représentants
de cette famille. L‘analyse de la séquence prédit la présence de deux domaines de type
ferritine. De plus, la prédiction de la structure secondaire d‘Aq_331 révèle l‘existence de huit
hélices alpha (Figure7).
Domaine_1
Domaine_2
Domaine_1
Domaine_2
Domaine_1
Domaine_2
10
20
30
40
50
60
|
|
|
|
|
|
MNKKELIDILLYDVALEHSAIIQYLYNVFLIGDPEITNEIESIARQEMRHLKWFAQKVVE
GIDSEIFNILNKLLQKEYRLILDYLYHFFHSKTWQEKDTSLDIAIESMFHMGELGEKIGE
..*:::**
: *: *::***:.*
: .:
.** :.* *: :.:*: *
70
80
90
100
110
120
|
|
|
|
|
|
LGGKVTLNRIEEAIKVGQSWEEMLKNDVDAEEEAIKIYSQQLEIVKDDSVKKLLDRVIND
LGGYPDLSLPKAKHFKGFTPEEVIE-DIKEEETASRMYEENAKKVTREDLVKLFKWFEKQ
***
*. :
* : **::: *:. ** * ::*.:: : *. :.: **:. . ::
130
140
|
|
EMRHRDEFSEMLEELKNKKIEEAKQEA
EDYHAQRLKELFRKMNRFTIGGLGEES
* * :.:.*::.:::. .*
:*:
Figure 7. Alignement des séquences correspondant aux deux domaines de la ferritine Aq_331 d‘Aquifex
aeolicus. Le domaine 1 correspond aux résidus 1 à 147, le domaine 2 aux résidus 148 à 293 de la protéine
entière. Les hélices alpha (prédites grâce au serveur JPRED) sont représentées en bleu, et les résidus des centres
ferroxydases putatifs sont en blanc.
Ces deux éléments suggèrent une duplication du domaine ferritine sur une même
chaîne peptidique. La séquence protéique d‘Aq_331 a donc été coupée en deux parties égales
qui ont été analysées comme s‘il s‘agissait de deux protéines indépendantes. Les deux
domaines ont environ 65% de similarité de séquence, mais surtout, l‘architecture globale est
conservée, avec la présence typique de quatre hélices alpha par domaine (Figure 7), montrant
ainsi qu‘Aq_331 serait une protéine à domaines en tandem atypique de la famille des
ferritines. A notre connaissance, c‘est la première fois qu‘une telle organisation est démontrée
pour une protéine de cette famille.
Les ferritines se caractérisent également par la présence d‘un site catalytique
ferroxydase responsable de l‘oxydation du fer (II) en fer (III). Ce centre à fer binucléaire est
assez conservé au sein de la superfamille des ferritines, chaque atome de fer étant coordiné
par deux résidus acides et une histidine au sein d‘un site de type [D/E]-X(n)-[D/E]XXH. Il est
190
Résultats et discussion
également à noter que le site catalytique se trouve au cœur du faisceau formé par les quatre
hélices alpha des ferritines, chacune d‘entre elles portant un ou plusieurs des résidus
impliqués dans la liaison des atomes de fer (Smith, 2004) (Figure 6). Cette organisation est
également retrouvée dans la protéine Aq_331, chacun des domaines portant un centre
ferroxydase complet (Figure 7). La substitution d‘un glutamate par une sérine (position 47 du
domaine 2) est retrouvée chez d‘autres membres de cette famille ; de plus, un glutamate
(position 46) est présent juste avant cette sérine, ce résidu peut donc lier le fer etdonner un site
de fixation fonctionnel. Nous avons donc testé expérimentalement la capacité d‘Aq_331 à
oxyder le fer (II) à l‘aide d‘un test ferroxydase sur gel Les résultats présentés Figure 8
montrent d‘une part que cette protéine est effectivement capable de convertir le fer ferreux en
fer ferrique et d‘autre part que le système fonctionne même si Aq_331 est enfermée au sein
de l‘encapsuline.
Figure 8. Activité ferroxydase sur gel natif à pores larges. Piste 1 : fraction contenant l‘encapsuline et la
ferritine (75 µg) ; piste 2 : contrôle positif (ferritine de rate de cheval, 1 µg). Après migration, le gel est incubé
dans du sulfate de fer et d‘ammonium pendant 2 h à 37°C, puis le fer (III) correspondant à l‘activité ferroxydase
est révélé. Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués en kDa à gauche du gel. Les flèches pointent vers
les bandes révélées par l‘activité ferroxydase.
Aq_331 est donc une protéine atypique de la famille des ferritines, capable d‘oxyder le
fer, et possédant deux domaines comportant chacun un site ferroxydase complet.
191
Résultats et discussion
La ferritine Aq_331 est le représentant d’une nouvelle famille de ferritines à domaines
en tandem
Nous avons cherché à savoir si d‘autres protéines présentent le même type
d‘organisation qu‘Aq_331, ou si elle est un cas particulier limité à Aquifex aeolicus. Les
résultats obtenus grâce à une recherche par DELTA-BlastP montrent que la duplication du
domaine ferritine se retrouve chez d‘autres organismes. En effet, huit séquences protéiques
chez les Aquificales (en comptant Aquifex aeolicus), cinq chez les Dehaloccocoides et une
chez une bactérie de type Sulfobacillus se révèlent être des ferritines à deux domaines en
tandem. De plus, toutes les protéines des Aquificales ainsi que celle de la bactérie thermophile
modérée Sulfobacillus acidophilus (Li et al., 2011) présentent l‘extension C-terminale
caractéristique permettant l‘ancrage à l‘intérieur de l‘encapsuline. Et en effet, chacun de ces
organismes présente dans son génome un gène codant pour une encapsuline putative, alors
que les Dehalococcoides ne possèdent ni le gène codant pour l‘encapsuline, ni le domaine
d‘ancrage en C-terminal des ferritines (Table 1). Sur la base des données actuelles, ce système
encapsuline/ferritine à domaines en tandem semble donc être une spécificité des organismes
thermophiles et hyperthermophiles.
Ainsi, l‘utilisation de ferritine à deux domaines en tandem est une stratégie rare mais
non unique, mise en place par plusieurs organismes appartenant à des groupes
phylogénétiques distincts. Elle peut également être combinée à l‘encapsulation de la protéine
comme c‘est le cas chez les Aquificales ou chez Sulfobacillus.
192
Organisme
Numéro d'identification Présence de l'extension Numéro d'identification
NCBI de la Flp
C-terminale
NCBI de l'encapsuline
Aquifex aeolicus
15605849
oui
15606825
Sulfurihydrogenibium sp. YO3AOP1
188997051
oui
188996068
Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1
163782617
oui
163783093
Hydrogenobacter thermophilus TK-6
288817407
oui
288818122
Thermocrinis albus DSM 14484
289549002
oui
289548655
Sulfurihydrogenibium azorense Az-Fu1
225849438
oui
225848871
Sulfurihydrogenibium yellowstonense SS-5
237755920
oui
237756679
Hydrogenobaculum sp. Y04AAS1
195953688
oui
195953689
Sulfobacillus acidophilus TPY
339626687
oui
339626688
Dehalococcoides sp. VS
270308226
non
abs
Dehalococcoides sp. GT
289432749
non
abs
Dehalococcoides ethenogenes 195
57234241
non
abs
Dehalococcoides sp. CBDB1
73748723
non
abs
Dehalococcoides sp. BAV1
147669482
non
abs
Table 1. Vue d’ensemble de la sous famille des Flp à deux domaines en tandem et
combinaison avec l’encapsuline. Abs = absente.
Résultats et discussion
Discussion
Notre étude a révélé plusieurs points. En premier lieu, Aquifex aeolicus possède une
protéine, Aq_1760, que nous avons démontrée être une encapsuline, c‘est-à-dire une protéine
capable de s‘assembler en homomultimères, formant ainsi une nanocage d‘un poids
moléculaire d‘environ 2 MDa dans laquelle une autre protéine, Aq_331, peut venir s‘ancrer.
Nous avons également montré que cette dernière appartient à la grande famille des ferritines.
Cette situation a été très récemment mise en évidence (Sutter et al., 2008) chez la bactérie
Thermotoga maritima, avec cependant une différence dans l‘organisation génétique du
système, à savoir une structure opéronique pour les deux gènes chez Thermotoga maritima, ce
qui n‘est pas le cas chez Aquifex aeolicus. Une seule étude ayant été réalisée à ce jour sur le
système encapsuline / ferritine, ceci est probablement à mettre en lien avec le fait que ces
mégastructures ne sont pas « évidentes » à pointer par la simple analyse du génome et
nécessitent pour être mises en évidence des approches adaptées. Les auteurs avaient proposé
que l‘encapsulation de la ferritine permette sa protection et sa stabilisation mais aussi un
stockage plus important du fer sous forme ferrique, le volume du compartiment formé par
l‘encapsuline étant bien supérieur à celui de la ferritine (diamètre interne de l‘encapsuline, 22
nm, contre 8 nm pour les ferritines). Le système étant analogue chez Aquifex aeolicus, nous
pouvons donc faire la même supposition. De plus, la transformation du fer (II) en fer (III)
réalisée par la ferritine permet de lutter contre le stress oxydant en évitant la réaction de
Fenton productrice d‘espèces réactives de l‘oxygène (Imlay et al., 1988). L‘encapsuline
pourrait donc être un moyen indirect mais efficace de lutter contre la toxicité de ces espèces.
La mise en évidence récente, par l‘équipe, de la capacité d‘Aquifex aeolicus à supporter et se
développer en présence de concentration en oxygène très élevée, suppose l‘existence de
mécanismes de protection dont ce système peut faire partie.
La nouveauté de ces travaux tient à la nature même de la protéine cargaison, puisqu‘en
effet, Aq_331 est un nouveau type de Flp à deux domaines en tandem portant chacun un
centre actif ferroxydase. Le fait que cette architecture particulière soit retrouvée chez d‘autres
Aquificales, chez des Dehalococcoides ainsi que chez Sulfobacillus acidophilus nous conduit
à proposer l‘existence d‘une nouvelle sous famille de protéines de type ferritine dont Aq_331
serait le prototype. Ceci est parfaitement cohérent avec la diversité des protéines composant
cette superfamille puisque l‘on y retrouve les ferritines bactériennes, les bactérioferritines et
les DPS mais également les rubrérythrines et des protéines possédant un domaine ferritine et
un centre binucléaire de fixation du fer impliquées dans l‘oxygénation du méthane ou la
193
Résultats et discussion
réduction des ribonucléotides par exemple. Cette famille s‘enrichit constamment, comme par
exemple avec la découverte récente d‘une nouvelle sous famille représentée par
l‘archaeoferritine de Pyrococcus furiosus (Ebrahimi et al., 2012) qui possède un mécanisme
de stockage du fer différent de celui habituellement retrouvée chez les autre ferritines. La
compréhension et la caractérisation des protéines de cette famille est actuellement un axe de
recherche très important apportant régulièrement de nouvelles découvertes. L‘étude présentée
ici s‘inscrit directement dans cette tendance.
La duplication du domaine ferritine rappelle le cas d‘une autre superfamille de
protéines, les rhodanèses. En effet, ces dernières ont des rôles très divers et peuvent exister
sous des formes à un seul domaine (Ray et al., 2000);(Giuliani et al., 2007), à deux domaines
(Bordo et al., 2000) ou à un domaine associé à un autre domaine protéique (Palenchar et al.,
2000). Dans le cas d‘une rhodanèse à deux domaines, le cas général implique un premier
domaine actif, catalytique et un second domaine non-catalytique ayant probablement un rôle
dans la stabilisation de la protéine, même si un cas de rhodanèse à deux domaines actifs a
récemment été rapporté (Prat et al., 2012). Ainsi, la duplication du domaine ferritine de
Aq_331 pourrait également avoir un rôle dans la stabilité de la protéine. Ceci est également à
mettre en rapport avec une autre protéine d‘Aquifex aeolicus, Aq_328, qui serait une protéine
du type histone bactérienne, et qui présente une fusion de deux domaines histones distincts sur
une même chaîne peptidique (Qiu et al., 2006). Les auteurs ont proposé que cette
caractéristique permette une meilleure thermostabilité de la protéine grâce à l‘augmentation
du nombre de ponts salins, stratégie déjà évoquée pour d‘autres protéines d‘organismes
thermophiles et hyperthermophiles (Shin et al., 2002). Cette hypothèse pourrait expliquer
pourquoi les Aquificales (hyperthermophiles) et Sulfobacillus acidophilus (thermophile
modérée) présentent une duplication du domaine ferritine ; en revanche, elle n‘explique pas
une telle organisation chez les Dehalococcoides mésophiles. Il faut toutefois mentionner le
fait que ces organismes ont la particularité de se développer dans des environnements
contaminés en utilisant des composés organiques halogénés pour leur croissance, ce qui peut
également être considéré comme un facteur de stress au même titre que la température. Une
seconde explication viendrait de la structure quaternaire des ferritines : en effet, leur forme
active est un 24-mers (ou un 12-mers dans le cas des DPS) dont la sous-unité de base est un
dimère. Ceci est très visible dans le cas des bactérioferritines dont l‘hème b est fixé par deux
monomères (Macedo et al., 2003), et également pour certaines DPS dont le site actif se trouve
à l‘interface entre deux monomères (Haikarainen and Papageorgiou, 2010). Le dimère de
194
Résultats et discussion
ferritine semblant être la brique de base de l‘ensemble, il apparait donc que certains
microroganismes aient favorisé l‘existence d‘un seul gène codant pour une protéine portant
les deux domaines alors que pour d‘autres, l‘association entre les deux protéines portant
chacune un des domaines, reste la première étape de la constitution de l‘édifice.
Un autre point intéressant concerne la régulation de ce système. Les ferritines sont
connues pour être l‘objet de régulations très complexes mettant en jeu différents éléments et
qui correspondent à leur rôle au sein de l‘organisme dont elles font partie. Par exemple, le
régulateur Fur (Ferric Uptake Regulator) a été montré pour agir sur l‘expression de la ferritine
de plusieurs bactéries (Delany et al., 2001; Morrissey et al., 2004), de même que PerR et
OxyR (senseurs de stress oxydant) (Rocha and Smith, 2004; Tu et al., 2012), ou encore FNR
(senseur de l‘oxygène) (Fink et al., 2007). La phase de croissance de la bactérie peut
également influer sur la l‘expression des ferritines. Il serait donc intéressant de déterminer
dans quelles conditions la protéine Aq_331 est produite afin d‘en apprendre plus sur son rôle
exact au sein de la bactérie. Ceci est d‘autant plus vrai que le gène aq_331 se trouve en
opéron avec aq_328 codant pour une protéine de type histone. Or, il a été montré chez
Escherichia coli que des histones bactériennes régulaient de façon négative l‘expression de la
ferritine FtnA, mais qu‘en présence de fer, Fur en devenait un activateur (Nandal et al., 2010).
Le fait qu‘une boîte de régulation Fur soit prédite dans le promoteur de l‘opéron ainsi que
dans un promoteur intragénique putatif d‘aq_331 laisse penser qu‘une régulation de la
ferritine par le fer peut avoir lieu.
195
Conclusions et perspectives
CONCLUSIONS
ET
PERPECTIVES
197
Conclusions et perspectives
198
Conclusions et perspectives
Conclusions et perspectives
Le soufre est un élément absolument capital, tant au niveau des cycles géochimiques
que dans l‘utilisation qui en est faite par les êtres vivants. Sa chimie toute particulière lui
permet d‘adopter des états d‘oxydation variés, allant de -2 à +6, et donne donc lieu à de
multiples composés que l‘on retrouve sous forme gazeux, soluble ou même solide. Les microorganismes ont su s‘adapter à l‘abondance de ces différentes formes du soufre et ont ainsi
développé de nombreuses enzymes et voies métaboliques impliquées dans l‘oxydation et/ou la
réduction de ces composés. Si la plupart ne sont capables que de l‘une ou l‘autre de ces
possibilités, certains possèdent l‘équipement enzymatique nécessaire à la mise en œuvre de
ces deux voies.
Les organismes capables d‘oxyder le soufre n‘utilisent généralement pas un seul mais
plusieurs composés du soufre, plus ou moins réduits, en tant que substrat. Cette plasticité se
retrouve au niveau de leur métabolisme énergétique, comprenant de multiples enzymes et de
multiples voies, lesquelles sont toutes interconnectées. On peut finalement interpréter cette
complexité des métabolismes énergétiques du soufre comme la nécessité absolue pour les
micro-organismes qui les déploient de s‘adapter à leur environnement et aux brusques
variations qu‘ils peuvent subir.
On comprend donc que les organismes capables de déployer un véritable arsenal
enzymatique face aux composés du soufre acquièrent par là-même un véritable avantage
quant à leur aptitude à survivre et à se développer dans leur environnement. Mais on peut
également considérer les choses d‘une autre manière : être capable d‘utiliser chaque type de
composé du soufre, du plus réduit au plus oxydé, permet à ces micro-organismes de contrôler
et de gagner de l‘énergie à chaque étape de son oxydation au travers de ses voies
métaboliques.
De plus, chez certains organismes, il existe un véritable cycle de recyclage du soufre,
en associant réduction et oxydation du soufre, avec deux enzymes (ou plus) qui se permettent
199
Conclusions et perspectives
l‘une à l‘autre de fonctionner en s‘échangeant substrats et produits, l‘une utilisant ce que
l‘autre produit. Il faut cependant noter que dans une telle situation, la réduction du soufre par
l‘un des partenaires fait forcément intervenir un nouveau donneur d‘électrons.
Toutes ces stratégies n‘ont finalement qu‘une seule finalité : il s‘agit de tirer profit au
maximum du soufre en tant que composé énergétique en lui consacrant un métabolisme
optimisé, extrêmement structuré et organisé.
Notre étude portant sur la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus s‘inscrit en
droite ligne de cette vision intégrée du métabolisme énergétique du soufre. Sur la base
d‘études biochimiques décrivant un supercomplexe hydrogénase / soufre réductase, la SOR et
un supercomplexe SQR / cytochrome bc1 / cytochrome c oxydase, une optimisation via in
recyclage du soufre pouvait être proposé. De plus, certaines questions comme le devenir du
sulfite, ou l‘utilisation du thiosulfate n‘étaient pas résolues. Nous avons ainsi proposé un
nouveau modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus en croisant les
voies, les enzymes et les modèles décrits dans la littérature ces dernières années avec les
données génomiques que nous avons pu rassembler sur notre système modèle. Ainsi, la
présence dans le génome de deux voies différentes (voie de l‘APS et la sulfite oxydase
Aq_979) permettant l‘utilisation du sulfite, produit par la SOR, pourrait permettre de
comprendre comment celui-ci est utilisé par la bactérie. De plus, Aq_979 appartient à un
groupe encore non caractérisé des sulfite oxydases, son étude au niveau biochimique
permettrait donc une meilleure compréhension de cette grande famille de protéines. La
présence du système Sox, système multi-enzymatique complexe dédié à l‘oxydation du
thiosulfate, est l‘une des pistes les plus intéressantes à explorer, puisqu‘il s‘agit très
probablement de la voie principale d‘utilisation de ce composé. Enfin, deux nouvelles sulfure
déshydrogénases putatives, DhsU et FccB‘ ont également été identifiées dans le génome, et
pourraient faire partie du système Sox, ou agir indépendamment dans l‘oxydation de l‘H 2S,
peut-être en synergie avec la SQR. Tenter d‘isoler et de caractériser ces nouvelles protéines et
voies métaboliques est donc évidemment un sujet de recherches capital pour la
compréhension des stratégies énergétiques mises en place par Aquifex aeolicus. La notion de
régulation et d‗expression de ces voies en fonction des conditions de croissance n‘a
jusqu‘alors été que peu étudiée : en effet, nous ignorons pour l‘instant si la bactérie utilise ces
systèmes de manière simultanée, ou si comme chez d‘autres organismes, il existe une
200
Conclusions et perspectives
régulation de l‘expression de ces voies par les substrats. Cet aspect prometteur mérite un
investissement futur. Des études transcriptomiques sont une approche de choix pour tenter de
répondre à ces questions.
Un autre point que nous avons abordé, et qui a constitué l‘essentiel de ma thèse,
concerne la rhodanèse Aq_477, depuis rebaptisée SbdP. Nous sommes parvenus à dévoiler la
fonction physiologique de cette protéine, et avons ainsi montré un aspect du métabolisme
énergétique du soufre encore peu étudié dans la littérature. En effet, SbdP a un rôle de navette
et de transfert de substrats entre une source de soufre et l‘enzyme qui va l‘utiliser, en
l‘occurrence la SOR et la soufre réductase qui utilisent toutes deux des chaînes de soufre.
Cette découverte est importante puisqu‘elle permet d‘envisager les substrats dans ce type de
métabolisme non plus comme des composés libres dans la cellule, rencontrant les protéines
qui vont les utiliser au hasard de leurs mouvements, mais comme des éléments pris en charge
de manière spécifique et transportés là où ils doivent être métabolisés. Cette canalisation du
substrat peut tout d‘abord permettre de parer à la toxicité inhérente à certains de ces
composés : en effet, le polysulfure est comme l‘H2S hautement réactif, notamment vis-à-vis
de l‘oxygène essentiel à la bactérie. On comprend donc la nécessité d‘imposer une sorte de
contrôle des mouvements de ce type de composé. Ceci peut également être compris comme
un moyen de réguler l‘activité de ces protéines. Mais l‘avantage principal apporté par cette
fonction est une véritable optimisation de l‘efficacité du métabolisme énergétique du soufre.
Cette faculté de SbdP à prendre en charge et à orienter le substrat vers le site actif de ses
protéines partenaires permettrait une réelle augmentation de l‘efficacité de tels systèmes, et
donc par là-même contribuerait à rendre le métabolisme énergétique d‘Aquifex aeolicus plus
performant.
Finalement, l‘ensemble des découvertes, à la fois sur le rôle de SbdP et sur
l‘identification de nouvelles protéines du métabolisme énergétique du soufre fait apparaitre la
notion d‘un véritable réseau du soufre chez Aquifex aeolicus, étroitement contrôlé et organisé,
permettant d‘obtenir un métabolisme efficace et performant.
La canalisation des substrats, permettant une diminution de la toxicité de certains
composés ainsi qu‘une augmentation de l‘efficacité métabolique, est un concept bien ancré
qui avait été d‘abord proposé pour l‘organisation en supercomplexes du cycle de Krebbs
201
Conclusions et perspectives
notamment, puis plus récemment pour celle des chaînes respiratoires.. La notion nouvelle de
mégacomplexes, des structures de très haut poids moléculaire rassemblant plusieurs de ces
supercomplexes, permet d‘ajouter un degré supplémentaire d‘organisation de ces chaînes
respiratoires et conduirait une façon de compartimentaliser une fonction dans un espace
cellulaire dépourvu d‘organelles. Nous avons tenté de mettre en évidence de telles structures
chez Aquifex aeolicus, et nous avons pour cela développé de nouvelles techniques et outils
adaptés à notre bactérie modèle. Certains verrous technologiques ont ainsi pu être levés, et
nous avons mis en évidence des limitations quant à la façon de préparer les échantillons. Il
semble donc que la majeure partie du travail qui doit être effectué à présent concerne
l‘amélioration de la pureté de la fraction membranaire étudiée en évitant les contaminations
en provenance de la fraction soluble, ainsi que la recherche de conditions de solubilisation
optimale à la conservation de ces hypothétiques mégastructures.
Enfin, en cherchant une forme de compartimentalisation, nous en avons trouvé une
autre : Aq_1760 appartient à la famille des encapsulines, des protéines capables de s‘organiser
en un nanocompartiment de 24 nm de diamètre constituant une sorte de cage dans laquelle
vient s‘ancrer une protéine cargaison. Nous avons identifié chez Aquifex aeolicus, la protéine
Aq_331 comme la cargaison d‘Aq_1760. Nous avons également montré qu‘Aq_331 est une
ferritine particulière puisque composée de deux domaines similaires portant chacun les
résidus nécessaires à l‘activité d‘oxydation et de stockage du fer propre à ce type de protéines.
Cette organisation architecturale, qui découlerait d‘un évènement de duplication/fusion du
gène ancestral, est également présente chez d‘autres organismes, parmi lesquels certains
possèdent également une encapsuline. Bien que le rôle de celle-ci ne soit pas clairement
établi, on peut supposer qu‘elle propose un important espace de stockage au fer insoluble
produit par la ferritine. Nous ne savons pas non plus quel est le rôle précis d‘Aq_331. La
constitution d‘une réserve de fer bio-disponible est bien entendu l‘hypothèse la plus probable,
mais une perspective de recherche serait de déterminer dans quelles conditions de croissance
de la bactérie (abondance ou carence de fer par exemple) ce stockage a lieu, et si elle est un
moyen de se prémunir face au stress oxydatif notamment provoqué par le fer, comme il a été
proposé chez d‘autres organismes. Ces hypothèses restent à être testées.
202
Références bibliographiques
REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
203
Références bibliographiques
204
Références bibliographiques
Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M.L., Perez-Martos, A., and Enriquez, J.A. (2008).
Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell 32, 529-539.
Andrews, S.C. (1998). Iron storage in bacteria. Adv Microb Physiol 40, 281-351.
Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J., and Schwede, T. (2006). The SWISS-MODEL workspace: a webbased environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics 22, 195-201.
Avvakumov, G.V., Walker, J.R., Xue, S., Finerty, P.J., Jr., Mackenzie, F., Newman, E.M., and DhePaganon, S. (2006). Amino-terminal dimerization, NRDP1-rhodanese interaction, and inhibited
catalytic domain conformation of the ubiquitin-specific protease 8 (USP8). J Biol Chem 281, 3806138070.
Bagchi, A. (2011). Structural modeling of SoxF protein from Chlorobium tepidum: An approach to
understand the molecular basis of thiosulfate oxidation. Biochemical and Biophysical Research
Communications 414, 409-411.
Bagchi, A. (2012). Structural insight into the mode of interactions of SoxL from Allochromatium
vinosum in the global sulfur oxidation cycle. Molecular Biology Reports, 1-6.
Bardischewsky, F., Fischer, J., Holler, B., and Friedrich, C.G. (2006a). SoxV transfers electrons to the
periplasm of Paracoccus pantotrophus - an essential reaction for chemotrophic sulfur oxidation.
Microbiology 152, 465-472.
Bardischewsky, F., Quentmeier, A., and Friedrich, C.G. (2006b). The flavoprotein SoxF functions in
chemotrophic thiosulfate oxidation of Paracoccus pantotrophus in vivo and in vitro. FEMS Microbiol
Lett 258, 121-126.
Barton, L.L., and Fauque, G.D. (2009). Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfatereducing bacteria. Adv Appl Microbiol 68, 41-98.
Beh, M., Strauss, G., Huber, R., Stetter, K.-O., and Fuchs, G. (1993). Enzymes of the reductive citric
acid cycle in the autotrophic eubacterium <i>Aquifex pyrophilus</i> and in the
archaebacterium <i>Thermoproteus neutrophilus</i&gt. Archives of Microbiology 160, 306311.
Behammer, W., Shao, Z., Mages, W., Rachel, R., Stetter, K.O., and Schmitt, R. (1995). Flagellar
structure and hyperthermophily: analysis of a single flagellin gene and its product in Aquifex
pyrophilus. J Bacteriol 177, 6630-6637.
Berry, E.A., and Trumpower, B.L. (1985). Isolation of ubiquinol oxidase from Paracoccus
denitrificans and resolution into cytochrome bc1 and cytochrome c-aa3 complexes. Journal of
Biological Chemistry 260, 2458-2467.
Beynon, J.D., MacRae, I.J., Huston, S.L., Nelson, D.C., Segel, I.H., and Fisher, A.J. (2001). Crystal
structure of ATP sulfurylase from the bacterial symbiont of the hydrothermal vent tubeworm Riftia
pachyptila. Biochemistry 40, 14509-14517.
Boekema, E.J., and Braun, H.P. (2007). Supramolecular structure of the mitochondrial oxidative
phosphorylation system. J Biol Chem 282, 1-4.
Boratyn, G.M., Schaffer, A.A., Agarwala, R., Altschul, S.F., Lipman, D.J., and Madden, T.L. (2012).
Domain enhanced lookup time accelerated BLAST. Biol Direct 7, 12.
Bordo, D., and Bork, P. (2002). The rhodanese/Cdc25 phosphatase superfamily. Sequence-structurefunction relations. EMBO Rep 3, 741-746.
Bordo, D., Deriu, D., Colnaghi, R., Carpen, A., Pagani, S., and Bolognesi, M. (2000). The crystal
structure of a sulfurtransferase from Azotobacter vinelandii highlights the evolutionary relationship
between the rhodanese and phosphatase enzyme families. J Mol Biol 298, 691-704.
Brito, J.A., Sousa, F.L., Stelter, M., Bandeiras, T.M., Vonrhein, C., Teixeira, M., Pereira, M.M., and
Archer, M. (2009). Structural and functional insights into sulfide:quinone oxidoreductase.
Biochemistry 48, 5613-5622.
205
Références bibliographiques
Brüser, T., Selmer, T., and Dahl, C. (2000). "ADP sulfurylase" from Thiobacillus denitrificans is an
adenylylsulfate:phosphate adenylyltransferase and belongs to a new family of nucleotidyltransferases.
J Biol Chem 275, 1691-1698.
Brune, D. (1995a). Sulfur Compounds as Photosynthetic Electron Donors
Anoxygenic Photosynthetic Bacteria. In, R. Blankenship, M. Madigan, and C. Bauer, eds. (Springer
Netherlands), pp. 847-870.
Brune, D.C. (1995b). Isolation and characterization of sulfur globule proteins from Chromatium
vinosum and Thiocapsa roseopersicina. Arch Microbiol 163, 391-399.
Bultema, J.B., Braun, H.P., Boekema, E.J., and Kouril, R. (2009). Megacomplex organization of the
oxidative phosphorylation system by structural analysis of respiratory supercomplexes from potato.
Biochim Biophys Acta 1787, 60-67.
Campbell, B.J., Smith, J.L., Hanson, T.E., Klotz, M.G., Stein, L.Y., Lee, C.K., Wu, D., Robinson,
J.M., Khouri, H.M., Eisen, J.A., et al. (2009). Adaptations to submarine hydrothermal environments
exemplified by the genome of Nautilia profundicola. PLoS Genet 5, e1000362.
Carroll, J., Fearnley, I.M., Skehel, J.M., Shannon, R.J., Hirst, J., and Walker, J.E. (2006). Bovine
complex I is a complex of 45 different subunits. J Biol Chem 281, 32724-32727.
Carrondo, M.A. (2003). Ferritins, iron uptake and storage from the bacterioferritin viewpoint. EMBO
J 22, 1959-1968.
Cereda, A., Carpen, A., Picariello, G., Iriti, M., Faoro, F., Ferranti, P., and Pagani, S. (2007). Effects
of the deficiency of the rhodanese-like protein RhdA in Azotobacter vinelandii. FEBS Lett 581, 16251630.
Cereda, A., Carpen, A., Picariello, G., Tedeschi, G., and Pagani, S. (2009). The lack of rhodanese
RhdA affects the sensitivity of Azotobacter vinelandii to oxidative events. Biochem J 418, 135-143.
Chen, Z.W., Jiang, C.Y., She, Q., Liu, S.J., and Zhou, P.J. (2005). Key role of cysteine residues in
catalysis and subcellular localization of sulfur oxygenase-reductase of Acidianus tengchongensis.
Appl Environ Microbiol 71, 621-628.
Chen, Z.W., Koh, M., Van Driessche, G., Van Beeumen, J.J., Bartsch, R.G., Meyer, T.E., Cusanovich,
M.A., and Mathews, F.S. (1994). The structure of flavocytochrome c sulfide dehydrogenase from a
purple phototrophic bacterium. Science 266, 430-432.
Cheng, H., Donahue, J.L., Battle, S.E., Ray, W.K., and Larson, T.J. (2008). Biochemical and Genetic
Characterization of PspE and GlpE, Two Single-domain Sulfurtransferases of Escherichia coli. Open
Microbiol J 2, 18-28.
Cherney, M.M., Zhang, Y., Solomonson, M., Weiner, J.H., and James, M.N.G. (2010). Crystal
Structure of Sulfide:Quinone Oxidoreductase from Acidithiobacillus ferrooxidans: Insights into
Sulfidotrophic Respiration and Detoxification. Journal of Molecular Biology 398, 292-305.
Chng, S.S., Dutton, R.J., Denoncin, K., Vertommen, D., Collet, J.F., Kadokura, H., and Beckwith, J.
(2012). Overexpression of the rhodanese PspE, a single cysteine-containing protein, restores
disulphide bond formation to an Escherichia coli strain lacking DsbA. Mol Microbiol 85, 996-1006.
Cipollone, R., Ascenzi, P., and Visca, P. (2007a). Common themes and variations in the rhodanese
superfamily. IUBMB Life 59, 51-59.
Cipollone, R., Bigotti, M.G., Frangipani, E., Ascenzi, P., and Visca, P. (2004). Characterization of a
rhodanese from the cyanogenic bacterium Pseudomonas aeruginosa. Biochem Biophys Res Commun
325, 85-90.
Cipollone, R., Frangipani, E., Tiburzi, F., Imperi, F., Ascenzi, P., and Visca, P. (2007b). Involvement
of Pseudomonas aeruginosa rhodanese in protection from cyanide toxicity. Appl Environ Microbiol
73, 390-398.
Cole, C., Barber, J.D., and Barton, G.J. (2008). The Jpred 3 secondary structure prediction server.
Nucleic Acids Res 36, W197-201.
206
Références bibliographiques
Combet, C., Blanchet, C., Geourjon, C., and Deleage, G. (2000). NPS@: network protein sequence
analysis. Trends Biochem Sci 25, 147-150.
Cortese, M.S., Caplan, A.B., and Crawford, R.L. (2002). Structural, functional, and evolutionary
analysis of moeZ, a gene encoding an enzyme required for the synthesis of the Pseudomonas
metabolite, pyridine-2,6-bis(thiocarboxylic acid). BMC Evol Biol 2, 8.
Crutzen, P. (2006). Albedo Enhancement by Stratospheric Sulfur Injections: A Contribution to
Resolve a Policy Dilemma? Climatic Change 77, 211-220.
Dahl, C., Engels, S., Pott-Sperling, A.S., Schulte, A., Sander, J., Lubbe, Y., Deuster, O., and Brune,
D.C. (2005). Novel genes of the dsr gene cluster and evidence for close interaction of Dsr proteins
during sulfur oxidation in the phototrophic sulfur bacterium Allochromatium vinosum. J Bacteriol
187, 1392-1404.
Dahl, C., and Prange, A. (2006). Bacterial sulfur globules: occurrence, structure and metabolism. In
Inclusions in Prokaryotes, J.M. Shively, ed. (Berlin, Heidelberg, Springer), pp. 21-51.
Dahl, C., Schulte, A., Stockdreher, Y., Hong, C., Grimm, F., Sander, J., Kim, R., Kim, S.H., and Shin,
D.H. (2008). Structural and molecular genetic insight into a widespread sulfur oxidation pathway. J
Mol Biol 384, 1287-1300.
Dahl, J.U., Urban, A., Bolte, A., Sriyabhaya, P., Donahue, J.L., Nimtz, M., Larson, T.J., and
Leimkuhler, S. (2011). The identification of a novel protein involved in molybdenum cofactor
biosynthesis in Escherichia coli. J Biol Chem 286, 35801-35812.
Dayhoff, M.O., Barker, W.C., and Hunt, L.T. (1983). Establishing homologies in protein sequences.
Methods Enzymol 91, 524-545.
Deckert, G., Warren, P.V., Gaasterland, T., Young, W.G., Lenox, A.L., Graham, D.E., Overbeek, R.,
Snead, M.A., Keller, M., Aujay, M., et al. (1998). The complete genome of the hyperthermophilic
bacterium Aquifex aeolicus. Nature 392, 353-358.
Delany, I., Spohn, G., Rappuoli, R., and Scarlato, V. (2001). The Fur repressor controls transcription
of iron-activated and -repressed genes in Helicobacter pylori. Mol Microbiol 42, 1297-1309.
Denger, K., Weinitschke, S., Smits, T.H., Schleheck, D., and Cook, A.M. (2008). Bacterial sulfite
dehydrogenases in organotrophic metabolism: separation and identification in Cupriavidus necator
H16 and in Delftia acidovorans SPH-1. Microbiology 154, 256-263.
Denkmann, K., Grein, F., Zigann, R., Siemen, A., Bergmann, J., van Helmont, S., Nicolai, A., Pereira,
I.A., and Dahl, C. (2012). Thiosulfate dehydrogenase: a widespread unusual acidophilic c-type
cytochrome. Environ Microbiol.
Dietrich, W., and Klimmek, O. (2002). The function of methyl-menaquinone-6 and polysulfide
reductase membrane anchor (PsrC) in polysulfide respiration of Wolinella succinogenes. Eur J
Biochem 269, 1086-1095.
Dirmeier, R., Keller, M., Frey, G., Huber, H., and Stetter, K.O. (1998). Purification and properties of
an extremely thermostable membrane-bound sulfur-reducing complex from the hyperthermophilic
Pyrodictium abyssi. Eur J Biochem 252, 486-491.
Dörr, M., Käßbohrer, J., Grunert, R., Kreisel, G., Brand, W.A., Werner, R.A., Geilmann, H., Apfel, C.,
Robl, C., and Weigand, W. (2003). A Possible Prebiotic Formation of Ammonia from Dinitrogen on
Iron Sulfide Surfaces. Angewandte Chemie International Edition 42, 1540-1543.
Ebrahimi, K.H., Hagedoorn, P.L., van der Weel, L., Verhaert, P.D., and Hagen, W.R. (2012). A novel
mechanism of iron-core formation by Pyrococcus furiosus archaeoferritin, a member of an
uncharacterized branch of the ferritin-like superfamily. J Biol Inorg Chem 17, 975-985.
Eder, W., and Huber, R. (2002). New isolates and physiological properties of the Aquificales and
description of Thermocrinis albus sp. nov. Extremophiles 6, 309-318.
207
Références bibliographiques
Epel, B., Schafer, K.O., Quentmeier, A., Friedrich, C., and Lubitz, W. (2005). Multifrequency EPR
analysis of the dimanganese cluster of the putative sulfate thiohydrolase SoxB of Paracoccus
pantotrophus. J Biol Inorg Chem 10, 636-642.
Fink, R.C., Evans, M.R., Porwollik, S., Vazquez-Torres, A., Jones-Carson, J., Troxell, B., Libby, S.J.,
McClelland, M., and Hassan, H.M. (2007). FNR is a global regulator of virulence and anaerobic
metabolism in Salmonella enterica serovar Typhimurium (ATCC 14028s). J Bacteriol 189, 2262-2273.
Forlani, F., Cereda, A., Freuer, A., Nimtz, M., Leimkuhler, S., and Pagani, S. (2005). The cysteinedesulfurase IscS promotes the production of the rhodanese RhdA in the persulfurated form. FEBS Lett
579, 6786-6790.
Franz, B., Gehrke, T., Lichtenberg, H., Hormes, J., Dahl, C., and Prange, A. (2009). Unexpected
extracellular and intracellular sulfur species during growth of Allochromatium vinosum with reduced
sulfur compounds. Microbiology 155, 2766-2774.
Franz, B., Lichtenberg, H., Hormes, J., Modrow, H., Dahl, C., and Prange, A. (2007). Utilization of
solid "elemental" sulfur by the phototrophic purple sulfur bacterium Allochromatium vinosum: a
sulfur K-edge X-ray absorption spectroscopy study. Microbiology 153, 1268-1274.
Friedrich, C.G., Rother, D., Bardischewsky, F., Quentmeier, A., and Fischer, J. (2001). Oxidation of
reduced inorganic sulfur compounds by bacteria: emergence of a common mechanism? Appl Environ
Microbiol 67, 2873-2882.
Friedrich, T., and Bottcher, B. (2004). The gross structure of the respiratory complex I: a Lego
System. Biochim Biophys Acta 1608, 1-9.
Frigaard, N.-U., and Dahl, C. (2008). Sulfur Metabolism in Phototrophic Sulfur Bacteria. In Advances
in Microbial Physiology, K.P. Robert, ed. (Academic Press), pp. 103-200.
Fritz, G., Buchert, T., Huber, H., Stetter, K.O., and Kroneck, P.M. (2000). Adenylylsulfate reductases
from archaea and bacteria are 1:1 alphabeta-heterodimeric iron-sulfur flavoenzymes--high similarity
of molecular properties emphasizes their central role in sulfur metabolism. FEBS Lett 473, 63-66.
Fuchs, T., Huber, H., Burggraf, S., and Stetter, K.O. (1996). 16S rDNA-based Phylogeny of the
Archaeal Order Sulfolobales and Reclassification of Desulfurolobus ambivalens as Acidianus
ambivalens comb. nov. Systematic and Applied Microbiology 19, 56-60.
Giuliani, M.C., Jourlin-Castelli, C., Leroy, G., Hachani, A., and Giudici-Orticoni, M.T. (2010).
Characterization of a new periplasmic single-domain rhodanese encoded by a sulfur-regulated gene in
a hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Biochimie 92, 388-397.
Giuliani, M.C., Tron, P., Leroy, G., Aubert, C., Tauc, P., and Giudici-Orticoni, M.T. (2007). A new
sulfurtransferase from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Being single is not so
simple when temperature gets high. Febs J 274, 4572-4587.
Gregersen, L.H., Bryant, D.A., and Frigaard, N.U. (2011). Mechanisms and evolution of oxidative
sulfur metabolism in green sulfur bacteria. Front Microbiol 2, 116.
Grein, F., Pereira, I.A., and Dahl, C. (2010a). Biochemical characterization of individual components
of the Allochromatium vinosum DsrMKJOP transmembrane complex aids understanding of complex
function in vivo. J Bacteriol 192, 6369-6377.
Grein, F., Venceslau, S.S., Schneider, L., Hildebrandt, P., Todorovic, S., Pereira, I.A., and Dahl, C.
(2010b). DsrJ, an essential part of the DsrMKJOP transmembrane complex in the purple sulfur
bacterium Allochromatium vinosum, is an unusual triheme cytochrome c. Biochemistry 49, 82908299.
Griesbeck, C., Schutz, M., Schodl, T., Bathe, S., Nausch, L., Mederer, N., Vielreicher, M., and
Hauska, G. (2002). Mechanism of sulfide-quinone reductase investigated using site-directed
mutagenesis and sulfur analysis. Biochemistry 41, 11552-11565.
208
Références bibliographiques
Grimm, F., Cort, J.R., and Dahl, C. (2010). DsrR, a novel IscA-like protein lacking iron- and Fe-Sbinding functions, involved in the regulation of sulfur oxidation in Allochromatium vinosum. J
Bacteriol 192, 1652-1661.
Grimm, F., Franz, B., and Dahl, C. (2011). Regulation of dissimilatory sulfur oxidation in the purple
sulfur bacterium Allochromatium vinosum. Frontiers in Microbiology 2.
Guiral, M., Aubert, C., and Giudici-Orticoni, M.T. (2005a). Hydrogen metabolism in the
hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Biochem Soc Trans 33, 22-24.
Guiral, M., Prunetti, L., Lignon, S., Lebrun, R., Moinier, D., and Giudici-Orticonit, M.T. (2009). New
insights into the respiratory chains of the chemolithoautotrophic and hyperthermophilic bacterium
Aquifex aeolicus. J Proteome Res 8, 1717-1730.
Guiral, M., Tron, P., Aubert, C., Gloter, A., Iobbi-Nivol, C., and Giudici-Orticoni, M.T. (2005b). A
membrane-bound multienzyme, hydrogen-oxidizing, and sulfur-reducing complex from the
hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. J Biol Chem 280, 42004-42015.
Hackenbrock, C.R., Chazotte, B., and Gupte, S.S. (1986). The random collision model and a critical
assessment of diffusion and collision in mitochondrial electron transport. J Bioenerg Biomembr 18,
331-368.
Haikarainen, T., and Papageorgiou, A.C. (2010). Dps-like proteins: structural and functional insights
into a versatile protein family. Cell Mol Life Sci 67, 341-351.
Han, S., Tang, R., Anderson, L.K., Woerner, T.E., and Pei, Z.M. (2003). A cell surface receptor
mediates extracellular Ca(2+) sensing in guard cells. Nature 425, 196-200.
Hanna, E., MacRae, I.J., Medina, D.C., Fisher, A.J., and Segel, I.H. (2002). ATP sulfurylase from the
hyperthermophilic chemolithotroph Aquifex aeolicus. Arch Biochem Biophys 406, 275-288.
Hanzelmann, P., Dahl, J.U., Kuper, J., Urban, A., Muller-Theissen, U., Leimkuhler, S., and
Schindelin, H. (2009). Crystal structure of YnjE from Escherichia coli, a sulfurtransferase with three
rhodanese domains. Protein Sci 18, 2480-2491.
Hardy, E., and Castellanos-Serra, L.R. (2004). "Reverse-staining" of biomolecules in electrophoresis
gels: analytical and micropreparative applications. Anal Biochem 328, 1-13.
Hatefi, Y., and Rieske, J.S. (1967). The preparation and properties of DPNH—cytochrome c reductase
(complex I–III of the respiratory chain). In Methods in Enzymology, M.E.P. Ronald W. Estabrook, ed.
(Academic Press), pp. 225-231.
He, H., Zhang, C.G., Xia, J.L., Peng, A.A., Yang, Y., Jiang, H.C., Zheng, L., Ma, C.Y., Zhao, Y.D.,
Nie, Z.Y., et al. (2009). Investigation of elemental sulfur speciation transformation mediated by
Acidithiobacillus ferrooxidans. Curr Microbiol 58, 300-307.
Hensen, D., Sperling, D., Trüper, H.G., Brune, D.C., and Dahl, C. (2006). Thiosulphate oxidation in
the phototrophic sulphur bacterium Allochromatium vinosum. Molecular Microbiology 62, 794-810.
Hildebrandt, T.M., and Grieshaber, M.K. (2008). Three enzymatic activities catalyze the oxidation of
sulfide to thiosulfate in mammalian and invertebrate mitochondria. FEBS J 275, 3352-3361.
Hipp, W.M., Pott, A.S., Thum-Schmitz, N., Faath, I., Dahl, C., and Truper, H.G. (1997). Towards the
phylogeny of APS reductases and sirohaem sulfite reductases in sulfate-reducing and sulfur-oxidizing
prokaryotes. Microbiology 143 ( Pt 9), 2891-2902.
Hirano, Y., Kimura, Y., Suzuki, H., Miki, K., and Wang, Z.Y. (2012). Structure Analysis and
Comparative Characterization of the Cytochrome c' and Flavocytochrome c from Thermophilic Purple
Photosynthetic Bacterium Thermochromatium tepidum. Biochemistry 51, 6556-6567.
Hjerten, S. (1962). "Molecular sieve" chromatography on polyacrylamide gels, prepared according to
a simplified method. Arch Biochem Biophys Suppl 1, 147-151.
Holkenbrink, C., Barbas, S.O., Mellerup, A., Otaki, H., and Frigaard, N.U. (2011). Sulfur globule
oxidation in green sulfur bacteria is dependent on the dissimilatory sulfite reductase system.
Microbiology 157, 1229-1239.
209
Références bibliographiques
Huber, R., Stetter, K.O. (2002). Aquificales. . Encyclopedia of Life Sciences eLS.
Huber, R., Wilharm, T., Huber, D., Trincone, A., Burggraf, S., Konig, H., Rachel, R., Rockinger, I.,
Fricke, H., Stetter, K.O. (1992). Aquifex pyrophilus gen. nov. sp. nov., represents a novel group of
marine hyperthermophile hydrogen-oxidizing bacteria. System Appl Microbiol 15, 340-351.
Hugler, M., Huber, H., Molyneaux, S.J., Vetriani, C., and Sievert, S.M. (2007). Autotrophic CO2
fixation via the reductive tricarboxylic acid cycle in different lineages within the phylum Aquificae:
evidence for two ways of citrate cleavage. Environ Microbiol 9, 81-92.
Imlay, J.A., Chin, S.M., and Linn, S. (1988). Toxic DNA damage by hydrogen peroxide through the
Fenton reaction in vivo and in vitro. Science 240, 640-642.
Iwasaki, T., Matsuura, K., and Oshima, T. (1995). Resolution of the Aerobic Respiratory System of
the Thermoacidophilic Archaeon, Sulfolobus sp. Strain 7. Journal of Biological Chemistry 270,
30881-30892.
Jin, B.J., Rossi, A., and Verkman, A.S. (2011). Model of aquaporin-4 supramolecular assembly in
orthogonal arrays based on heterotetrameric association of M1-M23 isoforms. Biophys J 100, 29362945.
Jormakka, M., Yokoyama, K., Yano, T., Tamakoshi, M., Akimoto, S., Shimamura, T., Curmi, P., and
Iwata, S. (2008). Molecular mechanism of energy conservation in polysulfide respiration. Nat Struct
Mol Biol 15, 730-737.
Kamyshny, A. (2009). Solubility of cyclooctasulfur in pure water and sea water at different
temperatures. Geochim Cosmochim Acta 73, 6022-6028.
Kappler, U. (2011). Bacterial sulfite-oxidizing enzymes. Biochim Biophys Acta 1807, 1-10.
Kappler, U., and Bailey, S. (2005). Molecular basis of intramolecular electron transfer in sulfiteoxidizing enzymes is revealed by high resolution structure of a heterodimeric complex of the catalytic
molybdopterin subunit and a c-type cytochrome subunit. J Biol Chem 280, 24999-25007.
Kappler, U., Bennett, B., Rethmeier, J., Schwarz, G., Deutzmann, R., McEwan, A.G., and Dahl, C.
(2000). Sulfite:Cytochrome c oxidoreductase from Thiobacillus novellus. Purification,
characterization, and molecular biology of a heterodimeric member of the sulfite oxidase family. J
Biol Chem 275, 13202-13212.
Kappler, U., Bernhardt, P.V., Kilmartin, J., Riley, M.J., Teschner, J., McKenzie, K.J., and Hanson,
G.R. (2008). SoxAX cytochromes, a new type of heme copper protein involved in bacterial energy
generation from sulfur compounds. J Biol Chem 283, 22206-22214.
Kappler, U., and Dahl, C. (2001). Enzymology and molecular biology of prokaryotic sulfite oxidation.
FEMS Microbiol Lett 203, 1-9.
Kappler, U., and Maher, M. (2012). The bacterial SoxAX cytochromes. Cellular and Molecular Life
Sciences, 1-16.
Kletzin, A. (1989). Coupled enzymatic production of sulfite, thiosulfate, and hydrogen sulfide from
sulfur: purification and properties of a sulfur oxygenase reductase from the facultatively anaerobic
archaebacterium Desulfurolobus ambivalens. J Bacteriol 171, 1638-1643.
Kletzin, A., Urich, T., Muller, F., Bandeiras, T.M., and Gomes, C.M. (2004). Dissimilatory oxidation
and reduction of elemental sulfur in thermophilic archaea. J Bioenerg Biomembr 36, 77-91.
Klimmek, O., Kreis, V., Klein, C., Simon, J., Wittershagen, A., and Kroger, A. (1998). The function of
the periplasmic Sud protein in polysulfide respiration of Wolinella succinogenes. Eur J Biochem 253,
263-269.
Klimmek, O., Stein, T., Pisa, R., Simon, J., and Kroger, A. (1999). The single cysteine residue of the
Sud protein is required for its function as a polysulfide-sulfur transferase in Wolinella succinogenes.
Eur J Biochem 263, 79-84.
210
Références bibliographiques
Kostanjevecki, V., Brige, A., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A., Guisez, Y., and van Beeumen, J.
(2000). A membrane-bound flavocytochrome c-sulfide dehydrogenase from the purple phototrophic
sulfur bacterium Ectothiorhodospira vacuolata. J Bacteriol 182, 3097-3103.
Kouril, R., Dekker, J.P., and Boekema, E.J. (2012). Supramolecular organization of photosystem II in
green plants. Biochim Biophys Acta 1817, 2-12.
Kreis-Kleinschmidt, V., Fahrenholz, F., Kojro, E., and Kroger, A. (1995). Periplasmic sulphide
dehydrogenase (Sud) from Wolinella succinogenes: isolation, nucleotide sequence of the sud gene and
its expression in Escherichia coli. Eur J Biochem 227, 137-142.
L'Haridon, S., Reysenbach, A.L., Tindall, B.J., Schonheit, P., Banta, A., Johnsen, U., Schumann, P.,
Gambacorta, A., Stackebrandt, E., and Jeanthon, C. (2006). Desulfurobacterium atlanticum sp. nov.,
Desulfurobacterium pacificum sp. nov. and Thermovibrio guaymasensis sp. nov., three thermophilic
members of the Desulfurobacteriaceae fam. nov., a deep branching lineage within the Bacteria. Int J
Syst Evol Microbiol 56, 2843-2852.
Lang, K. (1933). Die rhodanbildung in tierkorper. Biochem Z 259, 243 – 256.
Lang, M., Kanost, M.R., and Gorman, M.J. (2012). Multicopper oxidase-3 is a laccase associated with
the peritrophic matrix of Anopheles gambiae. PLoS One 7, e33985.
Laska, S., Lottspeich, F., and Kletzin, A. (2003). Membrane-bound hydrogenase and sulfur reductase
of the hyperthermophilic and acidophilic archaeon Acidianus ambivalens. Microbiology 149, 23572371.
Lenn, T., Leake, M.C., and Mullineaux, C.W. (2008). Are Escherichia coli OXPHOS complexes
concentrated in specialized zones within the plasma membrane? Biochem Soc Trans 36, 1032-1036.
Li, B., Chen, Y., Liu, Q., Hu, S., and Chen, X. (2011). Complete genome analysis of Sulfobacillus
acidophilus strain TPY, isolated from a hydrothermal vent in the Pacific Ocean. J Bacteriol 193, 55555556.
Li, H., Yang, F., Kang, X., Xia, B., and Jin, C. (2008a). Solution structures and backbone dynamics of
Escherichia coli rhodanese PspE in its sulfur-free and persulfide-intermediate forms: implications for
the catalytic mechanism of rhodanese. Biochemistry 47, 4377-4385.
Li, M., Chen, Z., Zhang, P., Pan, X., Jiang, C., An, X., Liu, S., and Chang, W. (2008b). Crystal
structure studies on sulfur oxygenase reductase from Acidianus tengchongensis. Biochem Biophys Res
Commun 369, 919-923.
Lin, Y.J., Dancea, F., Lohr, F., Klimmek, O., Pfeiffer-Marek, S., Nilges, M., Wienk, H., Kroger, A.,
and Ruterjans, H. (2004). Solution structure of the 30 kDa polysulfide-sulfur transferase homodimer
from Wolinella succinogenes. Biochemistry 43, 1418-1424.
Liu, Y., Zhu, X., Nakamura, A., Orlando, R., Soll, D., and Whitman, W.B. (2012). Biosynthesis of 4thiouridine in tRNA in the methanogenic archaeon Methanococcus maripaludis. J Biol Chem.
Lu, W.-P., Swoboda, B.E.P., and Kelly, D.P. (1985). Properties of the thiosulphate-oxidizing multienzyme system from Thiobacillus versutus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure
and Molecular Enzymology 828, 116-122.
Lubbe, Y.J., Youn, H.S., Timkovich, R., and Dahl, C. (2006). Siro(haem)amide in Allochromatium
vinosum and relevance of DsrL and DsrN, a homolog of cobyrinic acid a,c-diamide synthase, for
sulphur oxidation. FEMS Microbiol Lett 261, 194-202.
Luo, G.X., and Horowitz, P.M. (1994). The sulfurtransferase activity and structure of rhodanese are
affected by site-directed replacement of Arg-186 or Lys-249. J Biol Chem 269, 8220-8225.
Ma, K., Schicho, R.N., Kelly, R.M., and Adams, M.W. (1993). Hydrogenase of the hyperthermophile
Pyrococcus furiosus is an elemental sulfur reductase or sulfhydrogenase: evidence for a sulfurreducing hydrogenase ancestor. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 5341-5344.
211
Références bibliographiques
Ma, K., Weiss, R., and Adams, M.W. (2000). Characterization of hydrogenase II from the
hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus and assessment of its role in sulfur reduction. J
Bacteriol 182, 1864-1871.
Macedo, S., Romao, C.V., Mitchell, E., Matias, P.M., Liu, M.Y., Xavier, A.V., LeGall, J., Teixeira,
M., Lindley, P., and Carrondo, M.A. (2003). The nature of the di-iron site in the bacterioferritin from
Desulfovibrio desulfuricans. Nat Struct Biol 10, 285-290.
Mangold, S., Valdes, J., Holmes, D.S., and Dopson, M. (2011). Sulfur metabolism in the extreme
acidophile acidithiobacillus caldus. Front Microbiol 2, 17.
Marcia, M., Ermler, U., Peng, G., and Michel, H. (2009). The structure of Aquifex aeolicus
sulfide:quinone oxidoreductase, a basis to understand sulfide detoxification and respiration. Proc Natl
Acad Sci U S A 106, 9625-9630.
Marcia, M., Langer, J.D., Parcej, D., Vogel, V., Peng, G., and Michel, H. (2010). Characterizing a
monotopic membrane enzyme. Biochemical, enzymatic and crystallization studies on Aquifex aeolicus
sulfide:quinone oxidoreductase. Biochim Biophys Acta 1798, 2114-2123.
Marelja, Z., Stocklein, W., Nimtz, M., and Leimkuhler, S. (2008). A novel role for human Nfs1 in the
cytoplasm: Nfs1 acts as a sulfur donor for MOCS3, a protein involved in molybdenum cofactor
biosynthesis. J Biol Chem 283, 25178-25185.
Markwell, M.A., Haas, S.M., Bieber, L.L., and Tolbert, N.E. (1978). A modification of the Lowry
procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. Anal Biochem 87,
206-210.
Matias, P.M., Pereira, I.A., Soares, C.M., and Carrondo, M.A. (2005). Sulphate respiration from
hydrogen in Desulfovibrio bacteria: a structural biology overview. Prog Biophys Mol Biol 89, 292329.
Matthies, A., Nimtz, M., and Leimkuhler, S. (2005). Molybdenum cofactor biosynthesis in humans:
identification of a persulfide group in the rhodanese-like domain of MOCS3 by mass spectrometry.
Biochemistry 44, 7912-7920.
Matthies, A., Rajagopalan, K.V., Mendel, R.R., and Leimkuhler, S. (2004). Evidence for the
physiological role of a rhodanese-like protein for the biosynthesis of the molybdenum cofactor in
humans. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 5946-5951.
Morrissey, J.A., Cockayne, A., Brummell, K., and Williams, P. (2004). The staphylococcal ferritins
are differentially regulated in response to iron and manganese and via PerR and Fur. Infect Immun 72,
972-979.
Müller, F.H., Bandeiras, T.M., Urich, T., Teixeira, M., Gomes, C.M., and Kletzin, A. (2004).
Coupling of the pathway of sulphur oxidation to dioxygen reduction: characterization of a novel
membrane-bound thiosulphate:quinone oxidoreductase. Mol Microbiol 53, 1147-1160.
Muster, B., Kohl, W., Wittig, I., Strecker, V., Joos, F., Haase, W., Bereiter-Hahn, J., and Busch, K.
(2010). Respiratory chain complexes in dynamic mitochondria display a patchy distribution in life
cells. PLoS One 5, e11910.
Muyzer, G., and Stams, A.J. (2008). The ecology and biotechnology of sulphate-reducing bacteria.
Nat Rev Microbiol 6, 441-454.
Myers, J.D., and Kelly, D.J. (2005). A sulphite respiration system in the chemoheterotrophic human
pathogen Campylobacter jejuni. Microbiology 151, 233-242.
Nakamura, K., Nakamura, M., Yoshikawa, H., and Amano, Y. (2001). Purification and properties of
thiosulfate dehydrogenase from Acidithiobacillus thiooxidans JCM7814. Biosci Biotechnol Biochem
65, 102-108.
Nandal, A., Huggins, C.C., Woodhall, M.R., McHugh, J., Rodriguez-Quinones, F., Quail, M.A.,
Guest, J.R., and Andrews, S.C. (2010). Induction of the ferritin gene (ftnA) of Escherichia coli by
212
Références bibliographiques
Fe(2+)-Fur is mediated by reversal of H-NS silencing and is RyhB independent. Mol Microbiol 75,
637-657.
Nandigama, R.K., and Edmondson, D.E. (2000). Influence of FAD structure on its binding and
activity with the C406A mutant of recombinant human liver monoamine oxidase A. J Biol Chem 275,
20527-20532.
Newton, I.L., Woyke, T., Auchtung, T.A., Dilly, G.F., Dutton, R.J., Fisher, M.C., Fontanez, K.M.,
Lau, E., Stewart, F.J., Richardson, P.M., et al. (2007). The Calyptogena magnifica chemoautotrophic
symbiont genome. Science 315, 998-1000.
Nübel, T., Klughammer, C., Huber, R., Hauska, G., and Schutz, M. (2000). Sulfide:quinone
oxidoreductase in membranes of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus (VF5). Arch
Microbiol 173, 233-244.
Ogawa, T., Furusawa, T., Nomura, R., Seo, D., Hosoya-Matsuda, N., Sakurai, H., and Inoue, K.
(2008). SoxAX binding protein, a novel component of the thiosulfate-oxidizing multienzyme system
in the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum. J Bacteriol 190, 6097-6110.
Ogawa, T., Furusawa, T., Shiga, M., Seo, D., Sakurai, H., and Inoue, K. (2010). Biochemical studies
of a soxF-encoded monomeric flavoprotein purified from the green sulfur bacterium Chlorobaculum
tepidum that stimulates in vitro thiosulfate oxidation. Biosci Biotechnol Biochem 74, 771-780.
Pagani, S., Sessa, G., Sessa, F., and Colnaghi, R. (1993). Properties of Azotobacter vinelandii
rhodanese. Biochem Mol Biol Int 29, 595-604.
Palenchar, P.M., Buck, C.J., Cheng, H., Larson, T.J., and Mueller, E.G. (2000). Evidence that ThiI, an
enzyme shared between thiamin and 4-thiouridine biosynthesis, may be a sulfurtransferase that
proceeds through a persulfide intermediate. J Biol Chem 275, 8283-8286.
Pattaragulwanit, K., Brune, D.C., Truper, H.G., and Dahl, C. (1998). Molecular genetic evidence for
extracytoplasmic localization of sulfur globules in Chromatium vinosum. Arch Microbiol 169, 434444.
Pelletier, N., Leroy, G., Guiral, M., Giudici-Orticoni, M.T., and Aubert, C. (2008). First
characterisation of the active oligomer form of sulfur oxygenase reductase from the bacterium Aquifex
aeolicus. Extremophiles 12, 205-215.
Peng, G., Bostina, M., Radermacher, M., Rais, I., Karas, M., and Michel, H. (2006). Biochemical and
electron microscopic characterization of the F1F0 ATP synthase from the hyperthermophilic
eubacterium Aquifex aeolicus. FEBS Lett 580, 5934-5940.
Peng, G., Fritzsch, G., Zickermann, V., Schagger, H., Mentele, R., Lottspeich, F., Bostina, M.,
Radermacher, M., Huber, R., Stetter, K.O., et al. (2003). Isolation, characterization and electron
microscopic single particle analysis of the NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from the
hyperthermophilic eubacterium Aquifex aeolicus. Biochemistry 42, 3032-3039.
Philippot, P., Van Zuilen, M., Lepot, K., Thomazo, C., Farquhar, J., and Van Kranendonk, M.J.
(2007). Early Archaean microorganisms preferred elemental sulfur, not sulfate. Science 317, 15341537.
Pires, R.H., Lourenco, A.I., Morais, F., Teixeira, M., Xavier, A.V., Saraiva, L.M., and Pereira, I.A.
(2003). A novel membrane-bound respiratory complex from Desulfovibrio desulfuricans ATCC
27774. Biochim Biophys Acta 1605, 67-82.
Ploegman, J.H., Drent, G., Kalk, K.H., and Hol, W.G. (1978). Structure of bovine liver rhodanese. I.
Structure determination at 2.5 A resolution and a comparison of the conformation and sequence of its
two domains. J Mol Biol 123, 557-594.
Pott, A.S., and Dahl, C. (1998). Sirohaem sulfite reductase and other proteins encoded by genes at the
dsr locus of Chromatium vinosum are involved in the oxidation of intracellular sulfur. Microbiology
144 ( Pt 7), 1881-1894.
213
Références bibliographiques
Prange, A., Chauvistre, R., Modrow, H., Hormes, J., Truper, H.G., and Dahl, C. (2002). Quantitative
speciation of sulfur in bacterial sulfur globules: X-ray absorption spectroscopy reveals at least three
different species of sulfur. Microbiology 148, 267-276.
Prange, A., Engelhardt, H., Truper, H.G., and Dahl, C. (2004). The role of the sulfur globule proteins
of Allochromatium vinosum: mutagenesis of the sulfur globule protein genes and expression studies
by real-time RT-PCR. Arch Microbiol 182, 165-174.
Prat, L., Maillard, J., Rohrbach-Brandt, E., and Holliger, C. (2012). An unusual tandem-domain
rhodanese harbouring two active sites identified in Desulfitobacterium hafniense. FEBS J 279, 27542767.
Protze, J., Muller, F., Lauber, K., Nass, B., Mentele, R., Lottspeich, F., and Kletzin, A. (2011). An
Extracellular Tetrathionate Hydrolase from the Thermoacidophilic Archaeon Acidianus Ambivalens
with an Activity Optimum at pH 1. Front Microbiol 2, 68.
Prunetti, L., Infossi, P., Brugna, M., Ebel, C., Giudici-Orticoni, M.T., and Guiral, M. (2010). New
functional sulfide oxidase-oxygen reductase supercomplex in the membrane of the hyperthermophilic
bacterium Aquifex aeolicus. J Biol Chem 285, 41815-41826.
Purschke, W.G., Schmidt, C.L., Petersen, A., and Schafer, G. (1997). The terminal quinol oxidase of
the hyperthermophilic archaeon Acidianus ambivalens exhibits a novel subunit structure and gene
organization. J Bacteriol 179, 1344-1353.
Qiu, Y., Tereshko, V., Kim, Y., Zhang, R., Collart, F., Yousef, M., Kossiakoff, A., and Joachimiak, A.
(2006). The crystal structure of Aq_328 from the hyperthermophilic bacteria Aquifex aeolicus shows
an ancestral histone fold. Proteins 62, 8-16.
Quatrini, R., Appia-Ayme, C., Denis, Y., Jedlicki, E., Holmes, D.S., and Bonnefoy, V. (2009).
Extending the models for iron and sulfur oxidation in the extreme acidophile Acidithiobacillus
ferrooxidans. BMC Genomics 10, 394.
Quentmeier, A., and Friedrich, C.G. (2001). The cysteine residue of the SoxY protein as the active site
of protein-bound sulfur oxidation of Paracoccus pantotrophus GB17. FEBS Lett 503, 168-172.
Quentmeier, A., Hellwig, P., Bardischewsky, F., Wichmann, R., and Friedrich, C.G. (2004). Sulfide
dehydrogenase activity of the monomeric flavoprotein SoxF of Paracoccus pantotrophus.
Biochemistry 43, 14696-14703.
Quentmeier, A., Kraft, R., Kostka, S., Klockenkamper, R., and Friedrich, C.G. (2000).
Characterization of a new type of sulfite dehydrogenase from Paracoccus pantotrophus GB17. Arch
Microbiol 173, 117-125.
Ravot, G., Casalot, L., Ollivier, B., Loison, G., and Magot, M. (2005). rdlA, a new gene encoding a
rhodanese-like protein in Halanaerobium congolense and other thiosulfate-reducing anaerobes. Res
Microbiol 156, 1031-1038.
Ray, W.K., Zeng, G., Potters, M.B., Mansuri, A.M., and Larson, T.J. (2000). Characterization of a 12kilodalton rhodanese encoded by glpE of Escherichia coli and its interaction with thioredoxin. J
Bacteriol 182, 2277-2284.
Reijerse, E.J., Sommerhalter, M., Hellwig, P., Quentmeier, A., Rother, D., Laurich, C., Bothe, E.,
Lubitz, W., and Friedrich, C.G. (2007). The unusal redox centers of SoxXA, a novel c-type hemeenzyme essential for chemotrophic sulfur-oxidation of Paracoccus pantotrophus. Biochemistry 46,
7804-7810.
Reinartz, M., Tschape, J., Bruser, T., Truper, H.G., and Dahl, C. (1998). Sulfide oxidation in the
phototrophic sulfur bacterium Chromatium vinosum. Arch Microbiol 170, 59-68.
Rexroth, S., Mullineaux, C.W., Ellinger, D., Sendtko, E., Rogner, M., and Koenig, F. (2011). The
plasma membrane of the cyanobacterium Gloeobacter violaceus contains segregated bioenergetic
domains. Plant Cell 23, 2379-2390.
214
Références bibliographiques
Reysenbach, A.-L. (2001). Phylum BI. Aquificae phy. nov. In Bergey‘s Manual® of Systematic
Bacteriology, D. Boone, and R. Castenholz, eds. (Springer New York), pp. 359-367.
Righetti, P.G., Brost, B.C., and Snyder, R.S. (1981). On the limiting pore size of hydrophilic gels for
electrophoresis and isoelectric focusing. J Biochem Biophys Methods 4, 347-363.
Robin, S., Arese, M., Forte, E., Sarti, P., Giuffre, A., and Soulimane, T. (2011). A sulfite respiration
pathway from Thermus thermophilus and the key role of newly identified cytochrome c(5)(5)(0). J
Bacteriol 193, 3988-3997.
Rocha, E.R., and Smith, C.J. (2004). Transcriptional regulation of the Bacteroides fragilis ferritin gene
(ftnA) by redox stress. Microbiology 150, 2125-2134.
Rodriguez, J., Hiras, J., and Hanson, T.E. (2011). Sulfite oxidation in chlorobaculum tepidum. Front
Microbiol 2, 112.
Rother, D., Henrich, H.J., Quentmeier, A., Bardischewsky, F., and Friedrich, C.G. (2001). Novel
genes of the sox gene cluster, mutagenesis of the flavoprotein SoxF, and evidence for a general sulfuroxidizing system in Paracoccus pantotrophus GB17. J Bacteriol 183, 4499-4508.
Rother, D., Orawski, G., Bardischewsky, F., and Friedrich, C.G. (2005). SoxRS-mediated regulation
of chemotrophic sulfur oxidation in Paracoccus pantotrophus. Microbiology 151, 1707-1716.
Ruchel, R., Retief, A.E., and Richter-Landsberg, C. (1978). Charge-dependent staining of proteins
after electrophoretic separation in polyacrylamide gels. Anal Biochem 90, 451-464.
Sabar, M., Balk, J., and Leaver, C.J. (2005). Histochemical staining and quantification of plant
mitochondrial respiratory chain complexes using blue-native polyacrylamide gel electrophoresis. Plant
J 44, 893-901.
Sakurai, H., Ogawa, T., Shiga, M., and Inoue, K. (2010). Inorganic sulfur oxidizing system in green
sulfur bacteria. Photosynth Res 104, 163-176.
Sander, J., Engels-Schwarzlose, S., and Dahl, C. (2006). Importance of the DsrMKJOP complex for
sulfur oxidation in Allochromatium vinosum and phylogenetic analysis of related complexes in other
prokaryotes. Arch Microbiol 186, 357-366.
Sauvé, V., Bruno, S., Berks, B.C., and Hemmings, A.M. (2007). The SoxYZ complex carries sulfur
cycle intermediates on a peptide swinging arm. J Biol Chem 282, 23194-23204.
Schäfer, G., Purschke, W.G., Gleissner, M., and Schmidt, C.L. (1996). Respiratory chains of archaea
and extremophiles. Biochim Biophys Acta 1275, 16-20.
Schagger, H., and Pfeiffer, K. (2000). Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and
mammalian mitochondria. EMBO J 19, 1777-1783.
Schagger, H., and von Jagow, G. (1991). Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein
complexes in enzymatically active form. Anal Biochem 199, 223-231.
Scheide, D., Huber, R., and Friedrich, T. (2002). The proton-pumping NADH:ubiquinone
oxidoreductase (complex I) of Aquifex aeolicus. FEBS Lett 512, 80-84.
Schutz, M., Maldener, I., Griesbeck, C., and Hauska, G. (1999). Sulfide-quinone reductase from
Rhodobacter capsulatus: requirement for growth, periplasmic localization, and extension of gene
sequence analysis. J Bacteriol 181, 6516-6523.
Schutz, M., Shahak, Y., Padan, E., and Hauska, G. (1997). Sulfide-quinone reductase from
Rhodobacter capsulatus. Purification, cloning, and expression. J Biol Chem 272, 9890-9894.
Shahak, Y., Arieli, B., Padan, E., and Hauska, G. (1992). Sulfide quinone reductase (SQR) activity in
Chlorobium. FEBS Lett 299, 127-130.
Shahak, Y., and Hauska, G. (2008). Sulfide Oxidation from Cyanobacteria to Humans: Sulfide–
Quinone Oxidoreductase (SQR)
Sulfur Metabolism in Phototrophic Organisms. In, R. Hell, C. Dahl, D. Knaff, and T. Leustek, eds.
(Springer Netherlands), pp. 319-335.
215
Références bibliographiques
Shin, D.H., Yokota, H., Kim, R., and Kim, S.H. (2002). Crystal structure of conserved hypothetical
protein Aq1575 from Aquifex aeolicus. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 7980-7985.
Smith, J.L. (2004). The physiological role of ferritin-like compounds in bacteria. Crit Rev Microbiol
30, 173-185.
Sone, N., Sekimachi, M., and Kutoh, E. (1987). Identification and properties of a quinol oxidase
super-complex composed of a bc1 complex and cytochrome oxidase in the thermophilic bacterium
PS3. Journal of Biological Chemistry 262, 15386-15391.
Sorokin, D.Y., Teske, A., Robertson, L.A., and Kuenen, J.G. (1999). Anaerobic oxidation of
thiosulfate to tetrathionate by obligately heterotrophic bacteria, belonging to the Pseudomonas stutzeri
group. FEMS Microbiol Ecol 30, 113-123.
Spallarossa, A., Donahue, J.L., Larson, T.J., Bolognesi, M., and Bordo, D. (2001). Escherichia coli
GlpE is a prototype sulfurtransferase for the single-domain rhodanese homology superfamily.
Structure 9, 1117-1125.
Speich, N., Dahl, C., Heisig, P., Klein, A., Lottspeich, F., Stetter, K.O., and Truper, H.G. (1994).
Adenylylsulphate reductase from the sulphate-reducing archaeon Archaeoglobus fulgidus: cloning and
characterization of the genes and comparison of the enzyme with other iron-sulphur flavoproteins.
Microbiology 140 ( Pt 6), 1273-1284.
Stetter, K.O. (2006). History of discovery of the first hyperthermophiles. Extremophiles 10, 357-362.
Stockdreher, Y., Venceslau, S.S., Josten, M., Sahl, H.G., Pereira, I.A., and Dahl, C. (2012).
Cytoplasmic Sulfurtransferases in the Purple Sulfur Bacterium Allochromatium vinosum: Evidence
for Sulfur Transfer from DsrEFH to DsrC. PLoS One 7, e40785.
Strazdina, I., Kravale, Z., Galinina, N., Rutkis, R., Poole, R.K., and Kalnenieks, U. (2012). Electron
transport and oxidative stress in Zymomonas mobilis respiratory mutants. Arch Microbiol 194, 461471.
Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., and Schagger, H. (2010). Large pore gels to separate mega
protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: isolation of putative respiratory
strings or patches. Proteomics 10, 3379-3387.
Sugio, T., Ako, A., and Takeuchi, F. (2010). Sulfite oxidation catalyzed by aa(3)-type cytochrome c
oxidase in Acidithiobacillus ferrooxidans. Biosci Biotechnol Biochem 74, 2242-2247.
Sutter, M., Boehringer, D., Gutmann, S., Gunther, S., Prangishvili, D., Loessner, M.J., Stetter, K.O.,
Weber-Ban, E., and Ban, N. (2008). Structural basis of enzyme encapsulation into a bacterial
nanocompartment. Nat Struct Mol Biol 15, 939-947.
Sylvester, M., and Sander, C. (1990). Immunohistochemical localization of rhodanese. Histochem J
22, 197-200.
Tisdale, H.D. (1967). Preparation and properties of succinic—cytochrome c reductase (complex II–
III). In Methods in Enzymology, M.E.P. Ronald W. Estabrook, ed. (Academic Press), pp. 213-215.
Tu, W.Y., Pohl, S., Gizynski, K., and Harwood, C.R. (2012). The iron-binding protein Dps2 confers
peroxide stress resistance on Bacillus anthracis. J Bacteriol 194, 925-931.
Urich, T., Bandeiras, T.M., Leal, S.S., Rachel, R., Albrecht, T., Zimmermann, P., Scholz, C., Teixeira,
M., Gomes, C.M., and Kletzin, A. (2004). The sulphur oxygenase reductase from Acidianus
ambivalens is a multimeric protein containing a low-potential mononuclear non-haem iron centre.
Biochem J 381, 137-146.
Urich, T., Gomes, C.M., Kletzin, A., and Frazao, C. (2006). X-ray Structure of a selfcompartmentalizing sulfur cycle metalloenzyme. Science 311, 996-1000.
Urich, T., Kroke, A., Bauer, C., Seyfarth, K., Reuff, M., and Kletzin, A. (2005). Identification of core
active site residues of the sulfur oxygenase reductase from Acidianus ambivalens by site-directed
mutagenesis. FEMS Microbiol Lett 248, 171-176.
216
Références bibliographiques
Valdes-Stauber, N., and Scherer, S. (1994). Isolation and characterization of Linocin M18, a
bacteriocin produced by Brevibacterium linens. Appl Environ Microbiol 60, 3809-3814.
Vande Weghe, J.G., and Ow, D.W. (2001). Accumulation of metal-binding peptides in fission yeast
requires hmt2+. Mol Microbiol 42, 29-36.
Veith, A., Botelho, H.M., Kindinger, F., Gomes, C.M., and Kletzin, A. (2012). The sulfur oxygenase
reductase from the mesophilic bacterium Halothiobacillus neapolitanus is a highly active thermozyme.
J Bacteriol 194, 677-685.
Veith, A., Urich, T., Seyfarth, K., Protze, J., Frazao, C., and Kletzin, A. (2011). Substrate pathways
and mechanisms of inhibition in the sulfur oxygenase reductase of acidianus ambivalens. Front
Microbiol 2, 37.
Verté, F., Kostanjevecki, V., De Smet, L., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A., and Van Beeumen, J.J.
(2002). Identification of a thiosulfate utilization gene cluster from the green phototrophic bacterium
Chlorobium limicola. Biochemistry 41, 2932-2945.
Visser, J.M., de Jong, G.A., Robertson, L.A., and Kuenen, J.G. (1996). Purification and
characterization of a periplasmic Thiosulfate dehydrogenase from the obligately autotrophic
Thiobacillus sp. W5. Arch Microbiol 166, 372-378.
Vogel, F., Bornhovd, C., Neupert, W., and Reichert, A.S. (2006). Dynamic subcompartmentalization
of the mitochondrial inner membrane. J Cell Biol 175, 237-247.
Wachtershauser, G. (2000). Origin of life. Life as we don't know it. Science 289, 1307-1308.
Wang, R. (2002). Two's company, three's a crowd: can H2S be the third endogenous gaseous
transmitter? FASEB J 16, 1792-1798.
Wang, S.F., and Volini, M. (1973). The interdependence of substrate and protein transformations in
rhodanese catalysis. I. Enzyme interactions with substrate, product, and inhibitor anions. J Biol Chem
248, 7376-7385.
Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., and Preis, D. (1991). The respiratory-chain NADH
dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem 197, 563-576.
Welte, C., Hafner, S., Kratzer, C., Quentmeier, A., Friedrich, C.G., and Dahl, C. (2009). Interaction
between Sox proteins of two physiologically distinct bacteria and a new protein involved in thiosulfate
oxidation. FEBS Lett 583, 1281-1286.
Wilmot, C.M., and Davidson, V.L. (2009). Uncovering novel biochemistry in the mechanism of
tryptophan tryptophylquinone cofactor biosynthesis. Curr Opin Chem Biol 13, 469-474.
Wittig, I., Braun, H.P., and Schagger, H. (2006). Blue native PAGE. Nat Protoc 1, 418-428.
Xu, Y., Schoonen, M.A.A., Nordstrom, D.K., Cunningham, K.M., and Ball, J.W. (1998). Sulfur
geochemistry of hydrothermal waters in Yellowstone National Park: I. the origin of thiosulfate in hot
spring waters - Catalysis of synthetic sphalerite doped with transition metals. Geochimica et
Cosmochimica Acta 62, 3729-3743.
Xu, Y., Schoonen, M.A.A., Nordstrom, D.K., Cunningham, K.M., and Ball, J.W. (2000). Sulfur
geochemistry of hydrothermal waters in Yellowstone National Park, Wyoming, USA. II. Formation
and decomposition of thiosulfate and polythionate in Cinder Pool. Journal of Volcanology and
Geothermal Research 97, 407-423.
Yamamoto, M., Nakagawa, S., Shimamura, S., Takai, K., and Horikoshi, K. (2010). Molecular
characterization of inorganic sulfur-compound metabolism in the deep-sea epsilonproteobacterium
Sulfurovum sp. NBC37-1. Environ Microbiol 12, 1144-1153.
Yamamoto, Y., Fukui, K., Koujin, N., Ohya, H., Kimura, K., and Kamio, Y. (2004). Regulation of the
intracellular free iron pool by Dpr provides oxygen tolerance to Streptococcus mutans. J Bacteriol 186,
5997-6002.
Yong, R., and Searcy, D.G. (2001). Sulfide oxidation coupled to ATP synthesis in chicken liver
mitochondria. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 129, 129-137.
217
Références bibliographiques
Yu, Z., Lansdon, E.B., Segel, I.H., and Fisher, A.J. (2007). Crystal structure of the bifunctional ATP
sulfurylase-APS kinase from the chemolithotrophic thermophile Aquifex aeolicus. J Mol Biol 365,
732-743.
Zhang, X., Meining, W., Fischer, M., Bacher, A., and Ladenstein, R. (2001). X-ray structure analysis
and crystallographic refinement of lumazine synthase from the hyperthermophile Aquifex aeolicus at
1.6 A resolution: determinants of thermostability revealed from structural comparisons. J Mol Biol
306, 1099-1114.
Zhao, G., Ceci, P., Ilari, A., Giangiacomo, L., Laue, T.M., Chiancone, E., and Chasteen, N.D. (2002).
Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A
ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J Biol Chem 277, 27689-27696.
Zimmermann, P., Laska, S., and Kletzin, A. (1999). Two modes of sulfite oxidation in the extremely
thermophilic and acidophilic archaeon acidianus ambivalens. Arch Microbiol 172, 76-82.
218