LICENCE SCIENCES BIOLOGIQUES Module Biologie cellulaire II

advertisement
LICENCE SCIENCES BIOLOGIQUES
Module Biologie cellulaire II
TP CULTURE CELLULAIRE
1ère Partie : MECANISMES D'ADHESION ET DE MIGRATION CELLULAIRE
L'embryologie, science d'abord descriptive, s'est rapidement tournée vers la compréhension
des mécanismes permettant le développement des organismes. Chez la plupart des oiseaux,
animaux ovipares, le développement embryonnaire se réalise essentiellement en dehors de
l'organisme maternel. La fourniture des ressources énergétiques et aqueuses mais aussi la
protection de l'embryon sont permis par les annexes embryonnaires : Vitellus, Amnios et
Allantoïde.
Durant l'embryogénèse, outre les mécanismes de division cellulaire, des systèmes de
reconnaissance, de migration et de différenciation cellulaires permettent la formation des
tissus et organes. De nombreuses molécules ont été mises en évidence depuis une trentaine
d'années :
Molécules de la matrice extracellulaire : collagène, fibronectine, laminine...
Molécules membranaires : cadhérines, intégrines, CAM(s)...
Des mécanismes moléculaires plus ou moins complexes permettent à ces éléments d'établir
des contacts intercellulaires, des migrations et des agrégations nécessaires au développement
de l'embryon.
Les techniques de culture cellulaire permettent, depuis une cinquantaine d'années, de mieux
comprendre les mécanismes biologiques et cellulaires. Que ce soit pour le maintien en survie
des cellules ou pour la multiplication et la croissance cellulaire, les paramètres de culture
doivent être parfaitement établis afin de rendre reproductibles les manipulations. Différents
modes de culture existent, et nous emploierons la culture de cellules adhérentes à un support
(boite de culture plastique).
A. L'EMBRYON ET LES ANNEXES EMBRYONNAIRES (1ère séance)
Matériel : paire de ciseaux, pinces, boîte de Pétri.
But : première approche du matériel employé lors de la mise en culture. Approche « de visu »
d'un embryon d'oiseau.
Par 2 ou 3 binômes, observation d’un oeuf de poule dont l'embryon est à environ 7 jours de
développement. Ouvrir délicatement l’œuf à l'aide des ciseaux, coté "gros bout". Observer la
disposition de l'embryon. Faire glisser l'embryon et les liquides de l’œuf, doucement, dans une
boîte de Pétri grand modèle. Observer l'embryon dont l'allure est déjà très avancée au bout
d'un tiers de développement : observer l'allure de la tête, l'ébauche du bec, les ébauches des
ailes et des pattes, le cœur déjà fonctionnel. S'attarder sur la zone cérébrale afin de bien
repérer : yeux, hémisphères cérébraux et les lobes optiques plus volumineux en arrière.
Faire un schéma grossier de l'embryon mettant en évidence vos observations (attention à
respecter les tailles relatives des différents éléments représentés). Sur ce schéma, faire figurer
aussi les annexes embryonnaires reconnaissables à ce stade de développement. Indiquer
succinctement sur le compte rendu les rôles de ces annexes.
B. MISE EN CULTURE DE CELLULES CEREBRALES EMBRYONNAIRES DE
POULET (1ère séance)
Mise en garde : la culture cellulaire n'est pas une manipulation comme les autres, elle
nécessite de la concentration et le respect des règles d'hygiène et de stérilité qui vous seront
indiquées au cours du TP.
Le matériel utilisé ne sera que celui disposé dans les hottes. Ce matériel (le votre ou celui
fourni par l'enseignant) aura été stérilisé auparavant.
Il va s'agir d'étudier les capacités d'adhésion, de migration et d'agrégation des cellules
cérébrales de l'embryon de poulet selon le milieu sur lequel elles sont mises en culture.
Les boîtes de culture (60 x 15 mm) stériles auront reçu l'un des trois revêtements suivants :
Boîtes PL : la veille de la mise en culture, 2.5 ml d'un tampon borate (0.1 M, poids
moléculaire de l'acide borique : 61.8 ; pH 8.4 ajusté avec de la soude 1 M) contenant en plus
0.001 % de Poly L Lysine (stockage sous forme de poudre) sont déposés au fond des boîtes.
Boîtes BO : idem que précédemment sans la poly L lysine.
Boîtes FB : 1 heure avant la mise en culture, 200 µl d'une solution de fibronectine telle que
l'on dépose 2 µg/cm2 de fibronectine à partir du produit Sigma F1141 (documentation : voir
fiches TP) et d'une solution tamponnée stérile EBSS (Earle balanced salt solution).
PRECHAUFFAGE DU MILIEU
Dès le début de la séance, sous la hotte, les liquides contenant les revêtements des différents
types de boite seront retirés. Puis chaque boite sera lavée une fois avec du milieu DMEMbase (voir documentation fiche TP), puis recevra 2.5 ml de milieu de culture complet. Les
boites sont placées à 37°C dans l'incubateur à CO2.
MISE EN CULTURE
Chaque binôme réalise la manipulation suivante :
ETAPE 1: la dissection (effectuée par un des membres du binôme)
Se nettoyer les mains à l'alcool. Prendre un oeuf de poule dont l'embryon est à 7-8 jours de
développement. Nettoyer l’œuf avec un coton imbibé d'alcool.
Sous la hotte, à l'aide des ciseaux faire une ouverture coté "gros bout" et sortir l'embryon à
l'aide de la grosse paire de pinces. Attention à l'amnios qui tend à retenir l'embryon dans
l’œuf. Placer l'embryon dans une boîte de Pétri contenant un peu de milieu DMEM-base.
Couper la tête de l'embryon et la placer dans une seconde boîte remplie elle aussi d'un peu de
milieu DMEM-base.
En tenant la tête avec les pinces, dégager aux pinces fines ou aux ciseaux les hémisphères
cérébraux. Attention à ne pas confondre les lobes optiques placés en arrière des hémisphères
et qui sont plus volumineux à ce stade.
Dans un flacon à bouchon rouge contenant 5 ml de milieu de culture complet, placer les deux
hémisphères cérébraux que l'on aura au préalable débarrassés des méninges les entourant par
agitation dans la boîte de Pétri à l'aide d'une pince.
ETAPE 2: la mise en culture (effectuée par l'autre membre du binôme)
Avant d'entrer les mains sous la hotte, les nettoyer à l'alcool. Le premier travail aura été
d'aider dans ses manipulations son voisin en lui fournissant les instruments et le matériel
nécessaire s'il le souhaite.
Puis, il aura fallu préparer le flacon à bouchon rouge que l'on remplit de 5 ml de milieu de
culture complet. Quand on reçoit les deux hémisphères dans ce flacon, homogénéiser le tissu
en le faisant passer plusieurs fois dans une seringue équipée d'un trocart.
Quand la solution est homogène, ajouter 5 ml de milieu de culture complet (on obtient
approximativement 5.105 cellules/ml). Bien mélanger et déposer avec une pipette stérile
neuve 2.5 ml du mélange dans chaque boîte de Pétri contenant déjà 2.5 ml de milieu complet
préchauffé.
Refermer la boîte de Pétri. Indiquer sur chaque boite par une abréviation lisible un repère
permettant l'identification plus tard.
Observer au microscope inversé l'allure des cellules en suspension. Au bout d'une demi-heure
environ, observer de nouveau votre boîte. Noter l'évolution observée.
ETAPE 3: l'entretien des cultures
Vos boîtes verront leur milieu de culture changé le lendemain. Elles seront observées et
photographiées régulièrement (voir organisation avec l'enseignant).
Une semaine plus tard, les photos vous seront montrées et vous observerez par vous même
l'état de vos différentes cultures.
A l'aide des documents techniques fournis dans les fiches à votre disposition dans la salle de
TP, donner le protocole permettant d'obtenir les différentes solutions utilisées* (tampon
borate, poly Lysine, fibronectine). Attention, le gaspillage est l'ennemi des laboratoires,
montrez vous économe dans votre protocole. (* pour 10 boites par revêtement)
En résumant au maximum, indiquez les différentes étapes de la mise en culture que vous
aurez réalisée.
ETAPE 4: l'observation des cultures (2ème séance)
Si possible au cours de la semaine séparant votre mise en culture et l'observation finale, vous
pourrez venir observer vos boites. (Organisation à définir avec l'enseignant).
Au bout d’une semaine lors de la seconde séance de TP, observation et prise de photos sont à
réaliser ainsi que la préparation de votre rapport de compte rendu.
ATTENTION LE COMPTE RENDU EST A RENDRE A LA FIN DE LA TROISIEME
SEANCE DE TP.
Les questions qui se posent sont :
Quelles sont les cellules cérébrales qui ont adhéré et poussé ?
Indiquez l'évolution au cours de la culture de ces cellules selon le revêtement qui leur a été
fourni. Interprétez ces développements
LES FICHES DE TP (1ère et 2ème séance)
A votre disposition au cours des séances, ces fiches rassemblées dans un classeur présentent
des images du développement embryonnaire de l'oiseau vu sous l'aspect descriptif et
moléculaire, des informations sur la culture et des applications expérimentales des recherches
effectuées dans ce domaine. Des indications sur les produits employés sont également
fournies vous permettant de plus facilement rédiger la partie Matériel et Méthodes. Une
bibliographie vous est également fournie. A vous de tirer partie de ces informations pour la
rédaction du compte rendu.
2ème Partie : MARQUAGES SUBCELLULAIRES DE CULTURES PRIMAIRES DE
FIBROBLASTES
1ère séance : Culture primaire de fibroblastes de poulet
1) Matériels et milieux utilisés
-Embryons de 8 jours
-Outils de dissection
-Milieu de culture CEF :
DMEM
4,5g/l glucose
Sérum poulet
SVF
Antibiotiques+antifongiques X10
-Boites de Pétri de 60mm
: 500ml
: 0,6ml
: 2,5ml
: 5ml
2) Manipulation
-Préchauffer le milieu CEF
-Laver l'œuf à l'éthanol, l'ouvrir, prélever l'embryon et le placer dans une boite de Pétri
contenant 5ml de milieu
-Enlever la tête, les membres et les viscères à l'aide de pinces, transférer le "corps" dans une
boite de 60mm content 5ml de milieu CEF. Le hacher finement. Homogénéiser la suspension
en passant la suspension à travers une aiguille fine (maintes fois). Transférer dans un tube et
laisser décanter les agrégats. Récupérer le surnageant et ensemencer avec 0,5 ml de
suspension cellulaire dans une boite de Pétri. Compléter à 5ml de milieu CEF et placer à
l'étuve (37°C, 5%CO2).
2ème séance : Entretien de cultures cellulaires
1) Matériels et milieux utilisés
-Milieu CEF
-Trypsine/EDTA, PBS
-Boites à 4 trous et boites de Pétri de 30mm
-Cellules fibroblastes primaires
2) Manipulation
-Observer les cellules au microscope inversé (les cellules doivent être confluentes)
-Eliminer le milieu et faire un rinçage avec 2ml de PBS
-Ajouter 1,5ml de trypsine/EDTA. Attendre quelques minutes et suivre le décollement au
microscope. Ajouter aussitôt 0,2ml de SVF. Transférer dans un tube. Centrifuger 3min à
1500rpm
-Eliminer le surnageant et re-suspendre le culot dans 3ml de milieu CEF
-Compter les cellules sur lames de Malassez après coloration au bleu trypan (5
+5
-Ensemencer 1,2 103 cellules /lamelle dans 1 ml de milieu CEF et 5. 104 cellules dans 2 ml
de milieu CEF (boite de diamètre 30mm)
3ème séance : Cytologie : Marquages subcellulaires
I-Coloration des organiques cellulaires de façon aspécifique:
-Fixation des cellules :
-Vider le milieu de culture. Ajouter le fixateur (formaldéhyde 10% dans du PBS pH 7,4).
-Coloration :
-Sans rincer, ajouter 1ml de colorant Giemsa puis 4ml d'eau bi-distillée. Bien homogénéiser.
Laisser 10 min puis observer.
II-Marquage de l'ADN par l'acridine orange
1) Matériels et milieux utilisés
-Culture de cellules sur lamelles (24x60)
-Acridine orange. Solution stock à 1% dans H2O (aliquotée et conservée à l'obscurité à 4°C)
-Acide citrique 0,1M
-Na2HPO4-7H2O 0,3M
-Solution colorante : 10 ml solution stock d'acridine orange + 40ml acide citrique 0,1M +
2,5ml de Na2HPO4-7H2O 0,3M. Le pH final doit être de 2,5 (le cas échéant, ajuster avec de
l'acide citrique)
-Solution de fixation : Solution de Carnoy (à préparer extemporanément) 3 volumes de
méthanol+1 volume d'acide acétique glacial
-PBS filtré
-PBS/glycérol 50%
2) Manipulation
-Observer les lamelles. Placer votre lamelle dans une boite de diamètre 30mm (attention à leur
fragilité)
-Rincer délicatement les lames dans du PBS FILTRE (2 fois)
-Fixation dans la solution de Carnoy pendant 1 h
-Rincer délicatement les lames dans du PBS FILTRE (2 fois). Sécher
-Placer dans la solution colorante pendant 5 min
-Rincer délicatement les lames dans du PBS FILTRE (3 fois)
-Recouvrir la lame de PBS/glycérol 50%. Placer une lamelle et luter
-Observer au microscope (longueur d'onde d’excitation : 490nm, longueur d’onde
d’émission : 530nm)
Le compte rendu de cette deuxième partie sera à rendre 1 semaine après la 3ème séance de TP
Téléchargement