reactivation de l`expression du gene rep de l`adeno

UNIVERSITE DE NANTES
FACULTE DE MEDECINE
REACTIVATION DE L’EXPRESSION DU GENE REP DE
L’ADENO-ASSOCIATED VIRUS PAR LA PROTEINE
ICP0 DE L’HERPES SIMPLEX DE TYPE 1
THESE DE DOCTORAT
Ecole doctorale : Chimie Biologie
Discipline : Médecine
Spécialité : Virologie
présentée
et soutenue publiquement par
Marie-Claude GEOFFROY
Le 24 Octobre 2005, devant le jury ci-dessous
Président du jury : Pr. Berthe-Marie Imbert
Rapporteurs : Dr. Alberto Epstein
Pr. Jean Rommelaere
Examinateur : Dr. Fernando Arenzana-Seisdedos
Directeur de thèse : Dr. Anna Salvetti
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PREAMBULE
Je suis arrivée en septembre 2002, au CHU de Nantes, dans le laboratoire de
thérapie génique (Unité INSERM 649), dirigé par le Dr. Philippe Moullier. Ce
laboratoire s’intéresse tout particulièrement au développement et la production de
vecteurs viraux pour la thérapie génique. Parmi eux, les vecteurs recombinants dérivés de
l’Adeno-Associated Virus (AAVr) constituent actuellement un outil prometteur pour le
transfert de gènes. Ces vecteurs recombinants sont dépourvus des fonctions nécessaires à
leur réplication empêchant ainsi leur propagation dans l’hôte. Ils sont constitués du
transgène d’intérêt et de séquences virales nécessaires à leur production. Cependant, afin
d’améliorer la production de tels vecteurs, il est essentiel de mieux comprendre la
biologie du virus d’origine. Ainsi, ce travail de thèse a été réalisé dans l’équipe du Dr
Anna Salvetti, qui s’intéresse tout particulièrement aux aspects fondamentaux de la
biologie de l’AAV.
L’AAV est un parvovirus non pathogène qui nécessite la présence d’un virus
auxiliaire tel que l’Herpes Simplex de type 1 (HSV-1) ou l’adénovirus pour se répliquer.
De ce fait, les vecteurs AAVr sont produits en présence d’un virus auxiliaire, le plus
souvent constitué par l’adénovirus. Récemment, il a été démontré au laboratoire que
l’HSV-1 était un virus particulièrement efficace pour la production de vecteurs AAVr et
qu’il comportait un certain nombre d’avantages par rapport à l’utilisation d’adénovirus
(510). Cependant, les fonctions auxiliaires apportées par l’HSV-1, nécessaires à la
réplication et l’assemblage de particules AAV restent à préciser. De ce fait, l’objectif de
ce travail de thèse a été d’identifier les protéines de l’HSV-1, conduisant à l’expression
du gène rep de l’AAV-2, étape essentielle pour initier son cycle viral.
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INTRODUCTION............................................................................................................ 6
I. L’Adeno-Associated Virus (AAV)............................................................................... 6
1. L’histoire naturelle de l’AAV .................................................................................... 6
1.1. La découverte de l’AAV-2 .................................................................................. 6
1.2. Les nouveaux sérotypes....................................................................................... 7
2. La particule virale..................................................................................................... 10
2.1. La structure de la capside et ses propriétés physico-chimiques ........................ 10
2.2. Le génome viral................................................................................................. 13
II. Le cycle viral de l’AAV-2.......................................................................................... 16
1. La description générale du cycle viral...................................................................... 16
2. Les étapes précoces du cycle viral............................................................................ 18
2.1. L’internalisation du virus dans la cellule........................................................... 18
2.2. L’endocytose et le traffic intracellulaire............................................................ 20
2.3. L’import nucléaire et la conversion du génome ................................................ 21
3. La phase latente de l’AAV-2.................................................................................... 24
3.1. La persistance du génome viral in vitro ............................................................ 24
¾ L’intégration site-spécifique dans le chromosome 19................................... 24
¾ Le site AAVS1 dans son contexte chromosomique ...................................... 25
¾ Mécanisme d’intégration du génome viral.................................................... 27
3.2. La persistance du génome viral in vivo ............................................................. 31
3.3. Le cas particulier des AAVr .............................................................................. 32
4. La phase productive de l’AAV-2 ............................................................................. 32
4.1. La réplication du génome viral.......................................................................... 33
¾ La synthèse des formes réplicatives .............................................................. 33
¾ Les centres de réplication de l’AAV-2.......................................................... 37
4.2. L’assemblage des particules virales .................................................................. 38
4.3. Les fonctions régulatrices des protéines Rep .................................................... 38
¾ Les activités enzymatiques de Rep78/68 et Rep52/40 .................................. 39
¾ Les effets biologiques des protéines Rep ...................................................... 42
4.4. Le rôle des virus auxiliaires au cours du cycle viral ......................................... 43
¾ Les fonctions auxiliaires apportées par l’adénovirus .................................... 45
¾ Les fonctions auxiliaires apportées par l’HSV-1 .......................................... 46
4.5. La production des vecteurs recombinants dérivés de l’AAV-2......................... 48
III. La régulation de l’expression des gènes de l’AAV-2 ............................................ 49
1. Les mécanismes généraux de la transcription par l’ARN polymérase II ................. 49
1.1. L’initiation de la transcription ........................................................................... 49
¾ Les séquences régulatrices du promoteur...................................................... 50
¾ L’assemblage du complexe de pré-initiation................................................. 53
1.2. L’étape d’élongation.......................................................................................... 54
¾ L’assemblage du complexe d’élongation et ses facteurs régulateurs............ 54
1.3. Les sites de transcription dans le noyau ............................................................ 56
¾ La localisation des transcrits naissants et en cours d’élongation .................. 56
¾ Les domaines nucléaires associés à la transcription...................................... 57
1. 4. Le rôle de la chromatine dans la transcription des gènes ................................. 60
3

¾ Les modifications épigénétiques de la chromatine ....................................... 61
¾ Les enzymes participant au remodelage de la chromatine............................ 62
2. La régulation de la transcription des gènes de l’AAV-2 .......................................... 65
2.1. La transcription des gènes rep et cap................................................................ 65
¾ Les promoteurs de l’AAV-2.......................................................................... 65
¾ L’accumulation temporelle des transcrits issus du p5, p19 et p40................ 65
¾ Les activités promotrices résiduelles des ITR............................................... 67
2.2. La régulation des promoteurs de l’AAV-2 pendant la phase latente................. 68
¾ Le rôle des protéines Rep dans la répression du p5 et du p19....................... 68
¾ La contribution de YY1 dans la répression du p5......................................... 69
2.3. La régulation des promoteurs de l’AAV-2 en présence d’adénovirus .............. 70
¾ Le rôle des protéines E1a dans l’activation du p5......................................... 70
¾ Le rôle des protéines Rep78/68 dans l’activation du p19 et du p40.............. 73
2.4. La régulation des promoteurs de l’AAV-2 en présence d’HSV-1 .................... 74
¾ La description générale du cycle viral de l’HSV-1 et de son génome .......... 75
¾ Les facteurs HSV-1 potentiellement impliqués dans l’activation du p5....... 77
¾ Les fonctions d’ICP0 et ses activités enzymatiques...................................... 80
¾ Les effets biologiques d’ICP0 au cours du cycle viral.................................. 83
IV. Objectifs du travail .................................................................................................. 86
RESULTATS.................................................................................................................. 87
I. Identification des fonctions auxiliaires de HSV-1, conduisant à l’expression du
gène rep de l’AAV-2 : rôle de la protéine ICP0 ........................................................... 87
Article N°1 et résultats complémentaires.................................................................... 87
1.1. Introduction ....................................................................................................... 87
1.2. Résultats et discussion....................................................................................... 89
¾ Réactivation de l’expression du gène rep par ICP0 ...................................... 89
¾ Analyse de l’effet transactivateur d’ICP0 sur le promoteur p5..................... 91
¾ Contribution de USP7 dans l’effet transactivateur de ICP0 sur le p5 ........... 94
1.3. Conclusion......................................................................................................... 94
II. Mécanismes moléculaires impliqués dans la réactivation du gène rep
par ICP0........................................................................................................................ 106
1. Rôle de USP7 dans l’activation du gène rep.......................................................... 106
1.1. Introduction ..................................................................................................... 106
1.2. Matériels et méthodes...................................................................................... 107
1.3. Résultats et discussion..................................................................................... 109
¾ Contribution de USP7 dans l’activation du gène rep par transfection ........ 109
¾ Effet de USP7 sur la stabilité de la protéine ICP0 ...................................... 111
¾ Identification d’un domaine répresseur dans le gène codant ICP0 ............ 115
¾ Rôle de USP7 dans l’activation du gène rep au cours de l’infection virale 118
1.4. Conclusions ..................................................................................................... 118
2. Caractérisation des facteurs cellulaires associés au promoteur p5......................... 121
2.1. Introduction ..................................................................................................... 121
2.2. Matériels et méthodes...................................................................................... 121
2.3. Analyse des facteurs cellulaires associés au p5............................................... 124
2.4. Effet de la trichostatine A sur l’expression du gène rep ................................. 128
2.5. Conclusions ..................................................................................................... 130
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DISCUSSION GENERALE........................................................................................ 132
ANNEXE....................................................................................................................... 140
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES................................................................... 148
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