Transmission des Nepovirus par les nématodes Longidoridae
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revue Virologie 2007, 11 (4) : 309-21 Transmission des Nepovirus par les nématodes Longidoridae G. Demangeat Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. UMR1131, Santé de la vigne et qualité du vin, Inra, Université Louis Pasteur de Strasbourg. Laboratoire de Virologie et Vection, 28 rue de Herrlisheim, 68021 Colmar <[email protected]> Résumé. La propagation des virus de plante à plante est souvent assurée par des organismes tiers appelés vecteurs. Une classe d’invertébrés souterrains, les nématodes, peut jouer ce rôle. Des nématodes ectoparasites de la famille des Longidoridae sont responsables de la transmission naturelle de virus appartenant au genre Nepovirus selon un mode semi-persistant non circulant et non multipliant. Cette transmission passive des particules virales se déroule au moment des prises alimentaires des nématodes au niveau des racines. Seul un nombre limité de Longidoridae est capable d’acquérir et de transmettre 12 des 32 Nepovirus décrits. Cette particularité reflète une interaction hautement spécifique et solide qui lie le virus et son vecteur au niveau de l’appareil alimentaire du nématode, probablement par l’intermédiaire d’un récepteur. L’étude du modèle grapevine fanleaf virus/xiphinema index a montré que cette spécificité d’interaction est déterminée uniquement par la protéine de capside du virus. Mots clés : Longidoridae, Nepovirus, transmission, spécificité virus-vecteur Abstract. Transmission of plant viruses in nature often involves vectors which are usually plant pests. A class of soil borne invertebrates acts in this way. Ectoparasitic nematodes belonging to the Longidoridae family are responsible for the transmission of viruses from the Nepovirus genus using a semipersistant, non circulative mechanism. This passive transmission occurs during the feeding process of the nematodes on actively growing roots. However, only a few longidorid nematodes are able to acquire and subsequently transmit 12 of the 32 known Nepovirus. This singularity reflects a highly specific and strong association between the virus and the vector likely via a putative receptor on the cuticular lining of the oesophageal tract. Using a reverse genetics approach, investigations on the Grapevine fanleaf virus/Xiphinema index virus-vector association showed that the transmission specificity is solely determined by the coat protein. doi: 10.1684/vir.2007.0102 Key words: Longidoridae, Nepovirus, transmission, virus-vector specificity Les virus de plantes ont en commun, avec tous les parasites, l’obligation de se propager d’hôtes en hôtes pour pouvoir se multiplier. Pour la majorité des virus de plante, cette étape implique l’assistance d’un vecteur mobile qui est souvent un ravageur ou un parasite des plantes. Pour une grande partie des virus de plante, ce vecteur est un arthropode et quelques fois un champignon (pour revue sur la transmission de virus de plante, voir Plumb [1]). Mais pour deux Tirés à part : G. Demangeat Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 genres de virus, les Tobravirus et les Nepovirus, ce vecteur peut être un nématode ectoparasite souterrain. Les virus du genre Nepovirus font partie de la famille des Comoviridae. Ils possèdent un génome bipartite constitué d’ARN simple brin de polarité positive protégé à l’intérieur de particules icosaédriques. Seulement un tiers des népovirus est transmis par les nématodes ectoparasites. Bien qu’il existe pour plusieurs autres népovirus des évidences de transmission via le sol impliquant des nématodes, le mode de transmission naturel des autres népovirus est encore mal 309 revue Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. A B Figure 1. A) Aspect général de Xiphinema index , le vecteur naturel du Grapevine fanleaf virus. La barre représente 1 mm. B) Larve de Xiphinema en train de muer. La flèche rouge indique la larve néonate et la flèche noire indique la cuticule de mue à laquelle l’odontostyle est resté accroché. La barre représente 0,1 mm. connu. Cependant, leur dissémination peut être assurée pour certains par le pollen ou la graine. Trois genres très proches de nématodes Longidorous, Paralongidorus et Xiphinema appartenant à la famille des Longidoridae sont responsables de la transmission naturelle de plante à plante des népovirus. Ils sont transmis selon un mode semi-persistant non circulant et non multipliant. Une principale caractéristique de la transmission des népovirus par nématodes est la spécificité élevée entre l’espèce de nématode vectrice et son virus associé. Cette spécificité est déterminée par la capacité du nématode à retenir le virus au niveau de sites spécifiques (probablement via un récepteur) dans l’appareil alimentaire du nématode. Cette rétention spécifique s’étend sur des périodes très longues. Au cours des dernières années, les contributions scientifiques concernant la biologie des népovirus, et en particulier celle du grapevine fanleaf virus (GFLV), ont été importantes [2-5]. Le développement des techniques moléculaires et la connaissance de la biologie des népovirus ont permis de donner un nouvel élan à l’étude des interactions entre les népovirus et leurs vecteurs naturels, les nématodes. Cet article présente les associations vecteurs-népovirus connues à ce jour et fait le point sur les données récentes acquises en ce qui concerne la biologie de la transmission et les déterminants viraux impliqués dans la transmission des népovirus par les nématodes avec une attention particulière pour le GFLV et son vecteur naturel Xiphinema index. Les nématodes, vecteurs de népovirus 1958, Hewit et al. [6] ouvraient une nouvelle voie de recherche, celle de la transmission de virus de plante par 310 des nématodes ectoparasites. Ils ont montré que le GFLV, principal agent responsable de la virose la plus grave de la vigne, la maladie du court-noué, était transmis de vigne à vigne par un nématode ectoparasite, X. index (figures 1 et 2). Peu après, Jha et Posnette [7] ainsi qu’Harrison et Cadman [8] mettaient également définitivement en évidence le rôle de X. diversicaudatum dans la vection de l’Arabis mosaic virus (ArMV), un autre népovirus très proche du GFLV également responsable de la maladie du court-noué de la vigne. Depuis cette découverte initiale, plus de 40 associations virus-vecteur ont été décrites. Cependant, de nombreuses associations ont été révoquées parce que les informations qui les décrivaient ne 100 nm Figure 2. Cliché de microscopie électronique montrant des particules virales de GFLV après purification. La barre représente 100 nm. Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. revue remplissaient pas les conditions nécessaires permettant d’établir sans ambiguïté une interaction stricte entre le vecteur et le virus [9]. Les trois genres Longidorus, Paralongidorus et Xiphinema vecteurs des népovirus appartiennent à l’ordre des Dorylaimida, sous-ordre des Dorylaimana, et à la famille des Longidoridae [9-11]. Ils regroupent plus de 400 espèces différentes mais un faible nombre parmi ces espèces a été identifié comme vecteur de virus [9]. À ce jour, huit espèces de Longidorus, une espèce de Paralongidorus et neuf espèces de Xiphinema ont été démontrées comme étant les vecteurs naturels de 12 des 32 népovirus connus (tableau 1). Les nématodes de la famille des Longidoridae sont vermiformes à tous les stades de développement. Il n’existe pas de différence morphologique majeure entre les adultes et chacun des stades de développement si ce n’est la taille et quelques détails anatomiques peu apparents. Ce sont des nématodes ectoparasites qui s’alimentent au niveau des racines en croissance. Ils possèdent une gamme d’hôtes très large qui s’étend des plantes annuelles au plantes pérennes. Pour 15 des 18 espèces vectrices de népovirus, la reproduction est parthénogénétique et, dans ce cas, les mâles sont rares [11]. Les Longidoridae évoluent du stade œuf vers le stade adulte en passant par 3 ou 4 stades larvaires. En conditions naturelles, la majorité des espèces ont un cycle de vie très long (plus d’un an) alors que, en serre, en conditions contrôlées, ce cycle de vie peut être réduit à quelques semaines [11]. Une caractéristique de la biologie des nématodes est leur capacité de survie très importante qui peut être supérieure à 5 ans. En effet, si les conditions extérieures sont défavorables, les nématodes entrent dans un cycle de quiescence pendant lequel leurs Tableau 1. Associations spécifiques entre virus et vecteurs Longidorus, Paralongidorus et Xiphinema Genres Longidorus Espèces apulus arthensis attenuatus diadecturus elongatus Népovirus Acronyme fasciatus macrosoma martini Artichoke italian latent virus (isolat italien) Cherry rosette virus Tomato black ring virus (isolat allemand/anglais) Peach rosette mosaic virus Raspberry ringspot virus (isolat écossais) Tomato black ring virus (isolat écossais) Artichoke italian latent virus (isolat grecque) Raspberry ringspot virus (isolat anglais) Mulberry ringspot virus AILV CRV TBRV PRMV RpRSV TBRV AILV RpRSV MLRV Paralongidorus maximus Raspberry ringspot virus (isolat vigne allemand) RpRSV Xiphinema americanum sensu lato Cherry rasp leaf virus Peach rosette mosaic virus Tobacco ringspot virus Tomato ringspot virus Cherry rasp leaf virus Tobacco ringspot virus Tomato ringspot virus Tomato ringspot virus Cherry rasp leaf virus Tobacco ringspot virus Tomato ringspot virus Arabis mosaic virus Strawberry latent ringspot virus * Grapevine fanleaf virus Tobacco ringspot virus Tomato ringspot virus Cherry rasp leaf virus Tobacco ringspot virus Tomato ringspot virus Tobacco ringspot virus Tomato ringspot virus CRLV PRMV TRSV ToRSV CRLV TRSV ToRSV ToRSV CRLV TRSV ToRSV ArMV SLRV GFLV TRSV ToRSV CRLV TRSV ToRSV TRSV ToRSV americanum sensu stricto bricolensis californicum diversicaudatum index intermedium rivesi tarjanense * Le SLRV est maintenant assigné au genre Sadwavirus. Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 311 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. revue fonctions biologiques sont arrêtées. Dès que des conditions favorables sont restaurées, ils terminent alors leur cycle biologique [10-12]. La présence de nématodes dans le sol est corrélée essentiellement à deux paramètres qui sont la porosité et l’hygromètrie du sol [13]. Les Longidorus et les Xiphinema s’accommodent en général d’une assez grande variété de sols. La distribution verticale des nématodes dans le sol dépend avant tout de la disponibilité en racines. Les études les plus complètes concernant la distribution verticale des nématodes vecteurs de virus ont été réalisées dans les vignobles. Les nématodes sont très rarement retrouvés dans la couche superficielle du sol (0 à 30 cm), couche trop perturbée par les travaux agricoles et les variations climatiques. La majorité de la population de nématodes vecteurs de virus se concentre entre 30 et 80 cm de profondeur correspondant aux horizons les plus fortement colonisés par les racines [14]. Cependant, il est tout à fait possible de retrouver les nématodes jusqu’à 1,5 m de profondeur (vignoble de Côted’Or) et même jusqu’à 3,6 m dans un vignoble californien [11, 15]. Les Longidoridae vecteurs de virus sont essentiellement endémiques en Europe et sur le continent nord-américain, à l’exception de Longidorus martini, vecteur du Mulberry ringspot virus, association localisée au Japon (figure 3) [11, 16, 17]. Il est fortement probable que les nématodes et leurs virus associés ont été dispersés depuis l’Europe et le continent nord-américain vers l’Amérique du Sud, l’Afrique du Sud, la Chine, l’Asie, l’Australie et la Nouvelle-Zélande [17]. Certaines associations virus– nématodes ont une distribution géographique très large. Par exemple X. index et le GFLV sont présents dans la quasi totalité des vignobles du monde [4]. Pour X. index, il est communément admis que l’aire d’origine pourrait être le Moyen-Orient, région à partir de laquelle il aurait été disséminé en même temps que la vigne dans l’ensemble du bassin méditerranéen par les Phéniciens, les Grecs et enfin les Romains. X. diversicaudatum, vecteur de l’ArMV, est présent en Europe, en Asie, en Inde, au Canada et dans les pays de l’ex-Union soviétique [11, 17, 18]. Les népovirus nord-américains et leurs nématodes associés sont disséminés sur la totalité du continent nord-américain uniquement Ex-Union soviétique + Moyen Orient Europe Xiphinema Longidorus Xiphinema index diversicaudatum Longidorus attenuatus elongatus macrosoma index diversicaudatum apulus arthensis attenuatus elongatus fasciatus macrosoma Paralongidorus maximus Amérique du Nord Xiphinema index americanum sensu lato americanum sensu stricto bricolensis californicum intermedium rivesi tarjanense Asie Afrique Xiphinema index Longidorus diadecturus Amérique du Sud Xiphinema index diversicaudatum Longidorus martini Xiphinema index californicum Figure 3. Distribution mondiale des nématodes Longidoridae, vecteurs de virus. Xiphinema index, vecteur du grapevine fanleaf virus, est indiqué en rouge pour souligner sa répartition mondiale. D’après Brown et MacFarlane [17]. 312 Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. revue [17]. En revanche, pour une grande partie des associations virus-vecteur présentes en Europe, cette distribution géographique est plutôt restreinte à un pays, voire une région. Ainsi L. apulus et L. faciatus, tous deux vecteurs de deux sérotypes d’Artichoke italian latent virus (AILV), ont été recensés en Italie et en Grèce respectivement [19, 20]. De même L. arthensis et son virus associé, le Cherry rosette virus (CRV), ont été mis en évidence localement dans la région de la Arth, en Suisse [21]. X. italiae a également été proposé comme étant un vecteur du GFLV [22]. Cependant, cette association n’a jamais été confirmée par d’autres travaux [11, 16]. Il est donc fort peu probable qu’il puisse être un vecteur spécifique du GFLV ; par conséquent, X. index est considéré comme étant le seul vecteur naturel du GFLV [11, 16]. Les Nepovirus transmis par nématodes Les virus appartenant au genre Nepovirus appartiennent à la famille des Comoviridae qui comprend également les genres Comovirus et Fabavirus [23]. Les népovirus ont une gamme d’hôtes naturels très large. Cette gamme d’hôtes s’étend des plantes sauvages aux plantes cultivées annuelles ou pérennes. Elle est étroitement liée à celle de leurs vecteurs associés. En effet, le seul hôte naturel connu du GFLV est la vigne qui est également le seul hôte naturel de X. index. En revanche, l’ArMV, transmis spécifiquement par X. diversicaudatum, a une gamme d’hôtes beaucoup plus large (arbres fruitiers, plantes à petits fruits, arbres et arbustes ornementaux, cultures légumières, adventices) parce que le nématode vecteur est beaucoup plus polyphage que X. index. Les népovirus sont également inoculables mécaniquement à de nombreuses plantes herbacées [2, 23]. Les symptômes induits par les népovirus sont très variés. La multiplication du virus se manifeste par l’apparition au niveau des feuilles d’anneaux chlorotiques, de panachures réticulées, de jaunissements des nervures ou du limbe, de mosaïques, de panachures. On peut également observer un rabougrissement de la plante, une déformation des limbes, une réduction de la vigueur [24]. Dans les cas extrêmes, la multiplication du virus conduit à la mort des plantes infectées (figure 4). La quantité et la qualité des récoltes sont également affectées. Les pertes économiques engendrées par ces virus peuvent être importantes et atteindre 80 % pour la vigne. [4]. Cette grande variabilité des réponses à l’infection dépend de la nature du virus ou de l’isolat viral, de l’hôte, de l’âge de la plante et des conditions pédoclimatiques de la culture. Au champ, les plantes naturellement infectées par les népovirus sont souvent réparties sous forme de foyers. L’extension d’un foyer se fait en général très lentement parce que la mobilité naturelle des nématodes n’est que de quelques centimètres par an [9, 10]. Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 Figure 4. Parcelle de Chardonnay montrant des symptômes caractéristiques de la maladie du court-noué. La multiplication du virus induit une dégénérescence progressive des ceps de vigne qui conduit, dans certains cas, à la mort des pieds de vigne, comme illustré sur cette photo par les ceps de vigne manquants au sein d’un foyer de court-noué. Les chutes de rendement peuvent atteindre 80 %. Les particules virales sont non enveloppées, d’un diamètre variant de 28 à 30 nm et de forme icosaédrique (figure 2). La capside des népovirus est typiquement composée de 60 sous-unités d’un seul polypeptide variant de 52 à 60 kDa [23]. Une structure cristallographique a été obtenue pour le membre type des népovirus, le tobacco ringspot virus (TRSV) [25]. La résolution du cristal de TRSV suggère que la sous-unité de la capside des népovirus est repliée en trois domaines identiques adoptant un repliement communément appelé jelly-roll. Les 60 sous-unités sont associées entre elles pour former une capside selon une organisation pseudo T = 3 [25]. Les particules virales protègent le génome viral qui est constitué de deux ARN, ARN1 et 2, simple brin de polarité positive. L’extrémité 5’ de chaque ARN est liée de manière covalente à une protéine virale, la Vpg, et l’extrémité 3’ est polyadenylée. Certains isolats de népovirus possèdent un ARN supplémentaire que l’on appelle ARN satellite [26], qui est encapsidé dans les mêmes particules virales que les ARN génomiques. Les deux ARN génomiques sont nécessaires pour déclencher une infection mais l’ARN1 seul est capable de se répliquer dans les protoplastes de plantes [5]. Chaque ARN est traduit en une polyprotéine qui est clivée en protéines fonctionnelles grâce à une protéase codée par l’ARN1. Ce processus de maturation des polyprotéines a été étudié entre autres pour l’ArMV, le tomato black ring virus (TBRV), le GFLV et le tomato ringspot virus (ToRSV), principalement in vitro [2, 4, 5]. En plus de la sous-unité de la capside, identifiée dans les plantes pour la plupart des népovirus, certains des produits de maturation ont été mis en évidence in vivo [2, 4, 5, 27]. Le GFLV, avec le ToRSV, est l’un des népovirus pour lequel les connaissances sur la structure et l’expression du génome sont les 313 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. revue plus avancées [4, 5, 23]. La polyprotéine P1 codée par l’ARN1 du GFLV est clivée en cinq protéines : 1A (46 kDa), 1BHel (88 kDa), 1CVPg (3 kDa), 1DPro (24 kDa) et 1EPol (92 kDa) (figure 5). Ces protéines sont libérées par un clivage en cis au niveau de sites peptiques identifiés par l’action de la protéine 1DPro. Les comparaisons de séquences avec des virus très proches du GFLV suggèrent que la protéine 1A soit un cofacteur de la protéase. La protéine 1BHel, qui possède un domaine de fixation des nucléotides, est supposée être une hélicase alors que la présence d’un motif GDD permet de proposer une fonction polymérase pour la protéine 1EPol. L’étude de l’expression du génome du GFLV a montré que la protéine 1CVPg est liée de manière covalente à l’ARN viral. La maturation des polyprotéines a été attribuée à la protéine 1DPro [4]. Le clivage de la polyprotéine P2 codée par l’ARN2 est réalisée en trans par la protéase 1DPro. Il conduit à la formation de trois protéines matures : 2AHP (28 kDa) impliquée dans la réplication de l’ARN2, 2BMP (38 kDa) nécessaire au mouvement du virus de cellule à cellule et 2CCP qui correspond à la sous-unité de la capside du virus [4]. Il est important de préciser, à ce niveau, que le strawberry latent virus (SLRV), transmis spécifiquement par X. diversicaudatum, a été considéré comme un membre atypique du genre Nepovirus. Ce virus, qui possède une capside constituée de deux sous-unités de tailles différentes et des homologies de séquences avec les virus du genre Cheravirus et ceux des familles Sequiviridae, Comoviridae, Picornaviridae, est maintenant assigné au genre Sadwavirus. Ce genre, tout comme les Cheravirus, n’est pour le moment rattaché à aucune famille ou ordre [23]. Morphologies, alimentation et transmission Les Longidorus, Paralongidorus et Xiphinema sont des nématodes de grande dimension car ils mesurent de 2 à 12 mm de long au stade adulte. Ils sont vermiformes à tous les stades de leur développement. Pour l’ensemble des Longidoridae, la morphologie de leur appareil alimentaire est semblable (figure 6). Ils ont un long stylet creux de 60 à 250 lm au stade adulte qui permet d’atteindre les zones vasculaires des jeunes racines. Dans sa partie antérieure, le stylet est formé de l’odontostyle, partie la plus rigide du stylet, qui est élaboré par une cellule située dans la paroi de l’œsophage. Les larves en possèdent deux : le premier fonctionnel et le second situé plus bas dans la paroi de l’œsophage (figure 6). Ce dernier devient fonctionnel lors de la mue, lorsque le nématode perd son odontostyle en même temps que sa cuticule (figures 1 et 6). La partie postérieure du stylet est l’odontophore dont la partie basale est reliée aux muscles protracteurs qui permettent de faire sortir entièrement l’odontostyle. L’acquisition et la transmission de particules virales sont deux étapes directement liées au comportement alimentaire des nématodes. Chez les Longidoridae, les nématodes explorent la surface des cellules de racines avec leurs lèvres, afin d’identifier une région propice à la prise alimentaire. La cellule est ensuite pénétrée par une poussée rapide de l’odontostyle. Le stylet est entièrement sorti et la racine est pénétrée sur une épaisseur de plusieurs cellules. Après la perforation des cellules, le contenu des glandes salivaires, associées au bulbe œsophagien, est déversé dans la cellule. ARN1 (7342 nt) / P1 : 253 kDa 1CVpg 1BHEL 1A C/A 1DPro C/S G/E 1EPol (A)n R/G/E ARN2 (3774 nt) / P2 : 112 kDa 2AHP 2BMP C/A 2CCP (A)n R/G Figure 5. Organisation génomique et expression des ARN1 et 2 du grapevine fanleaf virus (GFLV) isolat F3. Les deux ARN comportent une longue phase de lecture ouverte représentée par les rectangles ombrés. Les séquences non codantes sont représentées par les rectangles fins rouges aux extrémités de chaque phase codante. La Vpg est représentée par un cercle noir. Les sites de clivage au niveau des deux polyprotéines et leurs séquences correspondantes sont indiqués par les triangles pleins et les lettres respectivement. Le nom des protéines est indiqué à l’intérieur de chaque protéine produite. 314 Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 revue Site de rétention Xiphinema Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. in bl gs oe osr Site de rétention Longidorus mr od mp mg os Figure 6. Partie antérieure des Longidoridae (stade larvaire). in : intestin ; bl : bulbe musculoglandulaire ; gs : glandes salivaires ; oe : œsophage ; osr : odontostyle de remplacement ; mr : muscle rétracteur ; od : odontophore ; mp : muscle protracteur ; mg : membrane guide ; Os : odontostyle. L’accolade noire indique la localisation des particules virales chez les Longidorus et l’accolade rouge celle chez les Xiphinema au niveau de l’appareil alimentaire du nématode. Ces sécrétions permettent de liquéfier le cytoplasme cellulaire de façon à permettre l’ingestion, les organites cellulaires ne pouvant pas être assimilés directement [28]. L’ingestion, qui peut durer plusieurs heures, s’effectue par des contractions du bulbe œsophagien entrecoupées de périodes d’arrêt de quelques minutes, pendant lesquelles le processus de salivation est repris. L’odontostyle est finalement retiré et la prise alimentaire s’achève par quelques contractions du bulbe œsophagien. Un nématode peut vider le contenu d’une quarantaine de cellules par heure. C’est au cours de ces étapes d’alimentation, pendant lesquelles des échanges entre la plante et le nématode sont réalisés, que se déroule la transmission des particules virales. Parmi les différentes étapes du processus alimentaire, trois sont proprement liées à la transmission des virus [29]. Les particules virales sont ingérées par le nématode avec la nourriture, puis retenues spécifiquement au niveau de l’appareil alimentaire et, enfin, relâchées lors du flux des sécrétions produites par les glandes salivaires. L’efficacité de ces trois étapes, et en particularité celle de l’étape d’adsorption et de relargage des particules virales, détermine la capacité du nématode à être un vecteur efficace ou non des virus [29]. Site de rétention des particules virales Dans les nématodes vecteurs, les particules virales sont adsorbées en des sites précis probablement en association avec un récepteur présent au niveau de la cuticule interne de l’appareil alimentaire. L’observation de coupes ultra-fines réalisées à partir de nématodes virulifères ont permis de montrer que, chez les Longidorus et sans doute les Paralongidorus, les particules virales sont présentes exclusivement entre l’odontostyle et la membrane «guide» (figure 6) [30]. Chez les Xiphinema, les particules virales se répartissent sur un segment de l’appareil alimentaire beaucoup plus long que chez les Longidorus (figure 6). Elles sont adsorVirologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 bées en une monocouche tapissant la cuticule de l’odontophore, de l’œsophage et du bulbe œsophagien [11, 30, 31] mais surtout la partie antérieure de l’odontophore [16]. Les Longidorus et les Xiphinema diffèrent par leurs sites de rétention des particules virales. Cette différence de localisation et de surface de rétention explique probablement la différence du temps de conservation des particules virales entre les deux genres de nématodes. En effet, le temps de rétention des particules virales est beaucoup plus important chez les Xiphinema comparé au Longidorus (cf. infra). À chaque mue, les particules virales sont éliminées parce que la cuticule qui recouvre le tractus alimentaire et l’odontophore est éliminée en même temps que l’odontotostyle (figure 1). Les nématodes ne sont plus virulifères après la mue et doivent se réalimenter sur une plante virosée pour devenir à nouveau porteurs du virus [11]. L’adsorption des virus est un phénomène sélectif et spécifique. L’incapacité des autres nématodes à transmettre des particules virales reflète probablement l’absence ou une nature différente des sites de rétention des particules virales. Ainsi, l’ArMV transmis par X. diversicaudatum n’est pas retrouvé au niveau de l’appareil alimentaire de L. elongatus, bien qu’il soit détectable dans son intestin [13]. Par ailleurs, X. index ne transmet pas l’ArMV parce que l’ArMV n’est pas retenu par X. index [32]. L’indication de l’existence d’un récepteur spécifique a été apportée par une expérimentation de génétique classique. Le croisement d’une population écossaise de X. diversicaudatum qui transmet efficacement l’ArMV avec une population italienne qui transmet faiblement l’ArMV génère des individus F1 dont l’efficacité de transmission est intermédiaire. Cette efficacité de la transmission de l’ArMV augmente avec la génération F2 mais n’atteint pas celle des parents écossais de départ [33]. Le récepteur présent au niveau de la cuticule interne de l’appareil alimentaire du nématode n’est pas connu. Néan315 revue Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. moins, chez X. index et X. diversicaudatum, la cuticule de l’odontophore et de l’œsophage peut être colorée à l’acide périodique. Cette coloration indique que ces zones sont tapissées de carbohydrates [34]. Sachant que les particules virales ne sont immobilisées que dans ces zones, il a été proposé que ces carbohydrates pourraient interagir avec des structures à la surface des particules virales. Cependant, ce type de coloration n’a pas pu être mis en évidence chez les nématodes du genre Longidorus, ce qui suggère un autre mécanisme de rétention des particules virales pour ce genre. Nepovirus-nématodes : une interaction solide Une des caractéristiques de l’association virus-vecteur est sa persistance dans le temps qui se traduit au champ par une contamination des nouvelles plantations quasi perpétuelle, même après de très longues périodes de jachère. Cette longévité de l’association est étroitement liée à la biologie des nématodes qui ont des cycles de vie très longs, un faible taux de reproduction et des possibilités de survie dans des biotopes où les conditions biotiques et abiotiques sont fluctuantes. Ils peuvent également persister dans des sols en exploitation où la nature des cultures se succède parce que la plupart des Longidoridae sont très polyphages. Deux exemples peuvent illustrer cette persistance. Une cartographie fine de la distribution des nématodes a été reconduite 30 ans après arrachage d’une parcelle de framboisiers fortement infectée par l’ArMV et son vecteur associé, X. diversicaudatum. Cette nouvelle analyse montre une présence et une distribution identique du vecteur et de son virus associé à celle qui existait 30 ans auparavant malgré la succession de périodes de jachères et de différentes cultures qui, dans certains cas, n’étaient pas des hôtes connus du vecteur et/ou du virus [35]. L’association GFLV-X. index est également un autre exemple de longévité de l’association virus-vecteur. Après une période de 6 ans de repos du sol (sans aucune plante) dans une parcelle de vigne totalement contaminée par X. index et le GFLV, 6 % des nouvelles plantes de vigne sont réinfectées par le GFLV [36]. De même, 5 ans de jachère n’ont pas réussi à éliminer X. index et GFLV dans une parcelle naturellement infectée [15]. Pour espérer une éradication de la totalité de la population des X. index virulifères d’une parcelle de vigne, il est recommandé de laisser le sol en jachère totale pendant une période de 7 ans minimum [37, 38]. Ces données de persistance observées sur le terrain sont corroborées par des données expérimentales obtenues en conditions contrôlées. Ainsi, X. americanum et X. diversicaudatum sont tous deux capables de transmettre leur virus associé, le TRSV et l’ArMV respectivement après 9 mois de conservation en conditions contrôlées [39, 316 40]. Après deux ans de conservation en conditions contrôlées en l’absence de plante hôte, X. rivesi reste capable de transmettre le ToRSV à des plantes pièges [41]. Des expérimentations contrôlées ont également permis de montrer la persistance de l’association X. index-GFLV. Des échantillons de sol provenant d’une parcelle de vigne naturellement contaminée ont été conservés à 20 et 7 °C pendant 4 ans en l’absence de plante hôte. Pendant ces 4 années de conservation, la population initiale de X. index diminue significativement mais des individus vivants (adultes et larves) peuvent être isolés pour les deux conditions de stockage [37]. Dans ces nématodes vivants, isolés après 4 ans de stockage, la présence du GFLV a été clairement mise en évidence [37]. Cette capacité de survie en l’absence de plante hôte ou lors de conditions défavorables correspondrait à un arrêt de l’ensemble du métabolisme du nématode conduisant à un blocage du développement des nématodes [12]. Des nématodes appartenant aux genres Paralongidorus maximus et Xiphinema pachtaicum ont été observés fortement enroulés sur eux-mêmes dans du sol en état de dessication. Des comportements similaires ont été observés dans notre laboratoire à partir d’élevages de X. index laissés en serre sans arrosage pendant de longues périodes (observations non publiées). Un rétablissement partiel de l’hygrométrie a restauré une activité de ces nématodes. Bien que les nématodes du genre Longidorus possèdent les mêmes capacités de survie que les Xiphinema, ils retiennent les particules virales pendant des périodes bien moins importantes puisque cette période n’est que de quelques semaines [11, 13]. Cette différence de temps de persistance des particules virales est probablement liée à la différence de localisation des particules virales entre les deux genres de nématode. Identification et caractérisation moléculaire des vecteurs et des virus Les nématodes font partie des espèces animales les plus difficiles à identifier. La caractérisation de leurs différentes espèces est classiquement fondée sur des mesures très précises des individus et sur des critères morphologiques. Cependant, leurs populations ne sont pas toujours homogènes. Elles sont souvent constituées par des individus à différents stades de développement ou correspondent à des mélanges d’espèces/genres différents, ce qui est le cas le plus général sur le terrain. De plus, elles partagent entre elles beaucoup de caractéristiques morphologiques communes. L’ensemble de ces caractéristiques fait que le travail d’identification des nématodes reste très difficile et réservé à des experts. La difficulté de l’identification des Longidoridae est encore accrue par le fait que ces nématodes sont souvent présents en faible effectif à plusieurs Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. revue stades de développement. La caractérisation des virus dans les nématodes est un défi supplémentaire. L’essor de la biologie moléculaire et la connaissance du génome des nématodes ont permis de proposer des approches moléculaires pour identifier certaines espèces de Longidoridae qu’elles soient vectrices ou non de virus. Fondés sur la connaissance des séquences correspondant aux ITS (internal transcribed spacer), des protocoles d’amplification de fragments d’ADN par PCR (polymerase chain reaction) multiplex utilisant des amorces spécifiques ont été développés. Ils permettent de différencier spécifiquement 9 espèces de Xiphinema et 8 espèces de Longidorus qui sont très proches morphologiquement les unes des autres [42-45]. Ces procédures multiplex sont suffisamment sensibles pour permettre l’identification d’un seul individu, quel que soit son stade de développement (larves ou adulte) [42-44]. Elles permettent également l’identification d’un individu dans un mélange de plusieurs espèces et/ou genres. Elles sont particulièrement intéressantes parce que l’identification classique des espèces (mesures et caractéristiques morphologiques) est établie principalement à partir des adultes qui ne sont pas toujours présents en nombres suffisants dans les échantillons. Elles sont reproductibles, très sensibles (1 nématode cible détecté en mélange parmi 800 autres) et faciles à mettre en œuvre [44]. Tout comme l’identification des nématodes, la caractérisation de la présence de virus dans les populations de Longidoridae nématodes est une étape délicate. Cette étape est souvent nécessaire pour connaître le potentiel infectieux des nématodes prélevés sur les terrains ou dans le cadre d’études plus fondamentales afin d’étudier la nature des interactions virus-vecteur. Pendant longtemps, la présence de virus dans les nématodes était évaluée de manière indirecte en mettant les nématodes isolés en contact avec un hôte sensible au nématode et au virus [11]. Cette procédure est longue, fastidieuse et nécessite des structures importantes. L’utilisation de l’immunomicroscopie directe ou indirecte par fluorescence permet de mettre en évidence la présence du virus dans un seul nématode [30, 46]. Cependant, elle demande des équipements coûteux et une expertise en microscopie. Le test Elisa (enzyme linked immunosorbent assay) a été utilisé avec succès pour détecter les particules virales, principalement pour rechercher le GFLV dans des populations de X. index [47-49]. Bien que très facile d’utilisation, il nécessite un nombre important de nématodes pour permettre une détection efficace du virus [48, 49]. Cette condition n’est pas toujours compatible avec les effectifs isolés à partir des échantillons de sol. En parallèle au développement des méthodes moléculaires permettant de caractériser les espèces de Longidoridae, des protocoles sensibles et reproductibles amplifiant une partie du génome du virus hébergé par les nématodes ont été mis Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 en œuvre. À partir des ARN totaux extraits de nématodes, des expérimentations RT-PCR (reverse transcriptionpolymerase chain reaction) amplifiant spécifiquement une partie du génome du virus (le plus souvent le gène codant pour la sous-unité de la capside) ont été développées [18, 50-52]. Ces techniques permettent de détecter efficacement le virus hébergé par un seul nématode [50, 51]. Tout comme la caractérisation moléculaire des nématodes, la mise en évidence des virus dans les nématodes est reproductible et sensible. Il est potentiellement envisageable d’identifier un X. index virulifère parmi 3000 nématodes avirulifères [50]. De plus, dans le cas du couple X. index-GFLV, le ou les isolats de virus hébergés par un nématode peuvent être caractérisés par RFLP [50] ou par PCR en temps réel [51]. Nepovirus-nématodes : une interaction spécifique déterminée par la protéine de capside du virus Tous les nématodes phytophages qui s’alimentent au niveau de plantes infectées ont la possibilité d’acquérir et de transmettre des particules virales. Cependant, sur environ 3500 espèces de nématodes phytophages, 18 appartenant au genre Longidorus ; Paralongidorus et Xiphinema sont les vecteurs de 12 des 32 népovirus décrits (tableau 1). Cette situation soulève deux questions : pourquoi si peu de nématodes sont-ils capables de transmettre des virus et pourquoi un nombre limité d’espèces virales du genre Nepovirus ont-elles comme vecteurs naturels les nématodes ? L’une des raisons réside probablement dans le fait qu’il existe une interaction très spécifique entre le vecteur et son virus associé. Spécificité d’association Cette spécificité concerne principalement les Longidoridae, vecteurs présents en Europe. On ne retrouve pas, du moins à un même niveau, cette spécificité pour le groupe des népovirus nord-américains et leurs vecteurs associés. Elle est relativement complexe et se situe à différents niveaux (tableau 1). En effet, l’analyse des associations virusvecteur a mis en évidence que certains népovirus sont associés à une espèce définie de nématode. C’est le cas de L. apulus qui transmet l’AILV, isolat italien. Cependant, une espèce de nématode peut transmettre plus d’un virus. Ainsi, X. diversicaudatum peut transmettre l’ArMV et le SLRV alors que L. elongatus est le vecteur du raspberry ringspot virus (RpRSV) et du TBRV. Les observations de terrain ont également montré que deux népovirus proches 317 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. revue mais sérologiquement distincts peuvent être transmis par deux nématodes différents appartenant au même genre. Ainsi, le GFLV et l’ArMV, deux népovirus très proches, sont transmis spécifiquement par X. index et par X. diversicaudatum respectivement. Il en est de même des isolats écossais et anglais du RpRSV qui sont transmis spécifiquement par L. elongatus et L. marcosoma respectivement bien qu’ils possèdent des propriétés antigéniques communes. Cependant, quand deux variants d’un même virus ne présentent que de très faibles différences sérologiques entre eux, ils sont généralement transmis par le même vecteur. Ainsi, L. elongatus transmet efficacement la souche écossaisse du RpRSV ainsi que deux autres variants de ce même virus. L’isolement géographique de certaines associations conduit quelques fois à un très fort niveau de spécificité. Ainsi, un isolat italien du SLRV ne peut être transmis que par une population locale de X. diversicaudatum [11, 33]. Sur le continent nord-américain, la principale espèce vectrice de virus est le groupe des X. americanum (tableau 1) dont la classification dans ce groupe reste encore très controversée. En effet, l’avis général actuel porte à plus de 40 le nombre d’espèces appartenant à ce groupe. La totalité du complexe d’espèces est inclus dans le groupe X. americanum sensu lato dans lequel des différences morphologiques entre les espèces sont mineures et peu de taxonomistes sont capables de les différentier. L’une des espèces de ce groupe est X. americanum sensu stricto pour laquelle il y a une identification claire. Plusieurs espèces de X. americanum transmettent indifféremment deux, trois ou quatre virus différents. Même s’il existe des spécificités de transmission entre certains virus et certaines populations, cela concerne des populations et des isolats très localisés. Il semble donc que la spécificité d’association entre les népovirus américains et leurs vecteurs soit plus complexe que celle observée pour les vecteurs de virus européens. Pour qualifier la nature des associations entre virus et vecteur, Brown et Weischer [29] ont proposé le concept d’association « exclusive » et « complémentaire ». D’après ce concept, l’exclusivité correspond aux situations où une espèce de nématode transmet un virus ou une souche virale sérologiquement caractérisée. Réciproquement, ce virus ou cette souche virale n’est transmisse que par un seul vecteur. L’exclusivité concerne sept associations virus-vecteurs. La complémentarité, qui concerne le reste des associations, est définie pour les situations où une espèce de nématode peut transmettre plusieurs virus ou souches de virus sérologiquement distinctes. Déterminants viraux impliqués dans la spécificité de la transmission des népovirus L’analyse des associations virus-vecteurs suggère un rôle potentiel de la capside dans la spécificité de trans318 mission puisque celle-ci est étroitement liée aux propriétés antigéniques des particules virales. Ce rôle potentiel de la capside du virus a été renforcé par le travail effectué en utilisant des isolats pseudo-recombinants obtenus avec deux souches différentes du RpRSV. En effet, la souche S (écossaise) du RpRSV est transmisse par L. elongatus alors que la souche E (anglaise) est transmise par L. macrosoma. Différentes combinaisons de pseudorecombinants ont été réalisées à partir de ces deux souches et leur transmissibilité par L. elongatus a été évaluée. Ces travaux ont permis de montrer que les pseudorecombinants contenant l’ARN2 de la souche S sont plus fréquemment transmis que ceux contenant l’ARN2 de la souche E [53]. Des travaux identiques ont été menés avec deux souches de TBRV : beet ringspot (transmise par L. elongatus) et potato bouquet (transmise par L. attenuatus). L’étude de la transmissibilité par L. elongatus des isolats pseudo-recombinant a montré que le pseudo-recombinants contenant l’ARN1 du sérotype potato bouquet et l’ARN2 du sérotype beet ringspot est transmis par le nématode L. elongatus. L’analyse de la transmissibilité des isolats pseudo-recombinants construits à partir des souches de RpRSV et du TBRV indique clairement que les déterminants viraux impliqués dans la transmission sont codés par l’ARN2 [54]. Ces expérimentations ne permettent pas d’attribuer la spécificité à l’un ou à l’autre des trois gènes codés par l’ARN2, mais elles renforcent le rôle de la capside du virus qui est codée par l’ARN2. La production de transcrits infectieux du GFLV [4] a permis de poursuivre ce travail sur l’identification des déterminants viraux dans la spécificité de transmission des népovirus. Sur l’idée des travaux effectués avec les pseudorecombinants, des ARN2 chimériques ont été développés en remplaçant les séquences codantes du GFLV par les séquences codantes correspondantes de l’ArMV, un népovirus très proche du GFLV qui est transmis spécifiquement par X. diversicaudatum mais pas par X. index (figure 7). Après étude des propriétés biologiques des ARN chimériques, la transmissibilité de virus recombinants par X. index a été étudiée. Les virus chimériques, qui possèdent une capside de nature GFLV, sont transmis par X. index aussi efficacement que le GFLV. En revanche, les virus chimériques, qui possèdent une capside de nature ArMV, ne sont plus transmis par X. index tout comme l’ArMV (figure 7). L’utilisation des ARN2 chimériques a permis d’exclure de la spécificité de transmission les protéines 2AHP et 2BMP et indique clairement que la 2CCP porte les déterminants viraux de la spécificité de transmission du GFLV par X. index [32, 55]. Cela constitue la première preuve moléculaire de l’implication de la capside dans le mécanisme de la transmission. Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 revue Transmissibilité X. index + GFLV ARN2 2AHP 2BMP + + 2CCP 0 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017. ArMV ARN2 0 Figure 7. Construction des ARN2 chimériques réalisés à partir des ADNc correspondant à l’ARN2 du grapevine fanleaf virus (GFLV) (rectangles rouges) et de l’ArMV (rectangles gris). Les gènes 2AHP, 2BMP et 2CCP du GFLV ont été échangés par leurs équivalents ArMV. La transmissibilité des virus chimériques par X. index a été évaluée et comparée à celle des virus sauvages GFLV et ArMV. Conclusion Depuis la mise en évidence de l’implication de nématodes ectoparasites souterrains dans la transmission de virus de plantes, des connaissances significatives ont été acquises dans la compréhension des relations qui relient les trois partenaires du pathosystème plante-népovirus-nématode. L’accès à la connaissance du génome des népovirus, et maintenant de celui des nématodes, aidé par des outils moléculaires très performants, ont largement permis de faire évoluer cette discipline de la description des paramètres de la biologie de la transmission vers l’élucidation des mécanismes moléculaires de la transmission. Une caractéristique importante de ce pathosystème est la spécificité élevée qui lie le vecteur et le virus. Chaque népovirus est transmis par un ou plusieurs nématodes bien identifiés. Les expériences antérieures suggéraient fortement le rôle de la capside du virus dans cette spécificité de transmission. La possibilité d’introduire des mutations dans le génome du GFLV a permis d’apporter la preuve moléculaire de l’implication de la capside dans la spécificité de transmission du GFLV par son vecteur X. index. Cette approche moléculaire devrait permettre également de caractériser le ou les domaines de la capside du virus en interaction avec la cuticule de l’appareil alimentaire du nématode. L’ensemble de ces acquis pourrait permettre, par la suite, l’identification du récepteur. Une caractéristique remarquable de ces associations virusvecteurs est la longévité de l’interaction entre les nématodes du genre Xiphinema et leurs virus associés. X. index est capable de survivre et de conserver le GFLV en conditions contrôlées pendant au moins 4 ans en l’absence de toute plante hôte. Cette longévité des interactions XiphinemaNepovirus contraste avec celle existante chez les Longidorus qui n’est que de quelques semaines. À la lumière d’une localisation différente des particules virales entre les deux genres, cette différence suggère un mécanisme différent de la transmission des népovirus par les Longidorus. Des efforts importants ont également été apportés dans le développement d’outils moléculaires sensibles et reproVirologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007 ductibles permettant de différencier les principales espèces de nématode vecteur de virus parmi des populations non vectrices de virus. Des outils similaires ont également été développés pour caractériser la présence de particules virales retenues par les nématodes. Ces outils trouvent toute leur application dans les investigations permettant d’élucider les mécanismes moléculaires de la transmission et offrent la possibilité de définir le potentiel infectieux des sols entre deux cultures. L’ensemble des caractéristiques biologiques des associations nématodes-Nepovirus, et plus particulièrement la longue survie des Xiphinema porteurs de virus en l’absence de toute plante hôte, peut expliquer l’inefficacité des méthodes de lutte actuelles contre les principales maladies à virus transmises par nématodes. Nos travaux avec le modèle X. index-GFLV indiquent que des efforts de recherche doivent porter sur de nouvelles stratégies de lutte comme le développement de plantes résistantes au virus et/ou aux nématodes. Il semble que seule une approche génétique puisse apporter une solution efficace et durable contre les maladies à virus transmises par les nématodes. Remerciements. L’auteur remercie Catherine Reinbold pour la réalisation du cliché de microscopie électronique. Références 1. Plumb RT. Plant virus vector interactions. In : Plumb RT, ed. Advances in botanical research. New York : Academic Press, 2002. 2. Mayo MA, Robinson DJ. 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