Imagerie moléculaire - Université Paul Sabatier

page 4 Paul Sabatier — Le magazine scientifique — numéro 20
Le bon vieux microscope sur lequel des générations
d’étudiants ont usé leur cornée pour observer des
lames minces de matériel fixé est aujourd’hui voué
à rejoindre les étagères des musées. Depuis une
quinzaine d’années, l’imagerie du vivant connaît un
essor considérable, issu de la synergie des
compétences des biologistes, mathématiciens,
informaticiens, physiciens et chimistes. Sans cesse,
de nouveaux équipements et de nouvelles méthodes
apparaissent, permettant d’imager le vivant en trois
dimensions, en temps réel, en profondeur et en très
haute résolution. Cette diversification des techniques
s’est orientée dans deux directions complémentaires :
imager les molécules et leurs interactions, ou les
analyser au sein d'échantillons complexes, cellules,
embryons et même organismes entiers. Désormais,
on peut voir fonctionner les cellules en direct, sous
l’objectif du microscope, suivre le trafic ou les
interactions de protéines d’intérêt grâce à des
marqueurs fluorescents issus d’animaux marins (ce
qui a donné lieu au Nobel de chimie en 2008 à O.
Shimomura, M. Chalfie et R. Tsien), interagir avec la
cellule à l’échelle nanométrique au moyen de lasers…
Les applications sont très nombreuses, simplement
limitées par l’imagination des chercheurs.
Ces développements spectaculaires de l’imagerie
cellulaire constituent un enjeu majeur pour les
laboratoires de biologie, s’ils veulent rester
compétitifs au plan international. Cependant les
microscopes optiques et électroniques modernes sont
onéreux et nécessitent un personnel hautement
qualifié, éléments difficiles à réunir pour un seul
laboratoire. Pour cette raison, les différents plateaux
techniques de microscopie du site toulousain se sont
très tôt regroupés en une plateforme régionale
d’imagerie cellulaire, Toulouse Réseau Imagerie (TRI),
reconnue au plan national par le GIS IBiSA. La
plateforme a été initialement mise en place au Centre
de biologie du développement, puis à l’IFR 109. Elle
coordonne actuellement les ressources en imagerie
optique, électronique et en cytométrie sur l’ensemble
de la région Midi-Pyrénées : plateaux de la Fédération
de Recherche en biologie de Toulouse , de l’IFR 40
(Agrobiosciences, Interactions et Biodiversité) sur
l’Agrocampus d’Auzeville, de l’IFR 150 (Institut de
biologie médicale de Toulouse), sur les campus des
Centres Hospitaliers Régionaux de Purpan et de
Rangueil, ainsi que du Centre Pierre Potier (ITAV). Six
plateaux techniques, plus de 30 postes de travail et
20 ingénieurs et techniciens sont à la disposition de
la communauté scientifique, et accueillent
annuellement plus de 800 chercheurs, appartenant à
160 équipes.
En dépit de cette dispersion géographique, un
management défini au travers de la démarche qualité
(certification ISO 9001, obtenue en janvier 2010),
permet un fonctionnement efficace. La plateforme
possède un site web (http://tri.genotoul.fr/), guichet
unique pour tous les plateaux quelle que soit leur
localisation, et qui présente les activités, équipements
et services. Elle est membre de la Génopole de
Toulouse (http://genopole-toulouse.prd.fr/), réseau qui
coordonne la plupart des grandes plateformes en
sciences de la vie de la région Midi-Pyrénées. Elle est
ouverte sans restriction à tout acteur de la recherche,
publique comme privée. Ses principales missions
sont :
Fournir aux chercheurs l’expertise et les technologies
de pointe dans le domaine de l’imagerie cellulaire ;
constituer un cadre de réflexion et d’échanges dans
ce domaine en évolution rapide ; former les
chercheurs et étudiants dans toutes les méthodes
liées à la microscopie ; contribuer aux
développements de nouveaux équipements et de
méthodologies.
Dans son ensemble, la plateforme TRI fournit les
compétences, les équipements et l’assistance
technique pour tout projet nécessitant l’imagerie
cellulaire sous ses diverses formes.. Elle possède des
compétences et des matériels de pointe dont certains
sont uniques en France, voire en Europe : microscopie
confocale et multiphoton, microscopie champ large
avec déconvolution, imagerie en durée de vie de
fluorescence (FLIM), microscopie à feuille de lumière
(SPIM), microscopie à haute résolution (TIRF),
imagerie de molécules uniques, imagerie intra-vitale
et corps entier du petit animal, tomographie et cryo-
méthodes en microscopie électronique.
Dans ce dossier sont présentés un certain nombre de
recherches utilisant cette plateforme d’imagerie
cellulaire…
Contacts : [email protected] et
[e-mail]
IMAGERIE MOLÉCULAIRE
>>> Philippe COCHARD, directeur de recherche
CNRS, au Centre de Biologie du Développement,
(CBD, unité mixte UPS/CNRS) et Alain JAUNEAU,
Ingénieur de recherche CNRS à la Plateforme
Microscopie Imagerie de l’IFR40.
L’imagerie cellulaire
en pleine révolution
>>> Reconstruction tridimensionnelle de cellules
nerveuses et de leurs prolongements marqués par la
protéine fluorescente GFP dans une tranche de cerveau
de rongeur. Image acquise grâce au microscope
bi-photon. © B. Ronsin, A. Le Ru & A. Lorsignol

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Comment les plantes
se protègent des pathogènes
A l'instar du système immunitaire des animaux, les végétaux ont développé au
cours de l'évolution des mécanismes de défense visant à les protéger des virus,
bactéries et champignons. L’utilisation des techniques d’imagerie récentes ont
mis en évidence la complexité des protéines mises en jeu. La compréhension
des mécanismes d'immunité végétale constitue un enjeu majeur pour
envisager la réduction de l’usage de produits phytosanitaires dangereux pour
l'environnement et pour les consommateurs.
Elucider les nouveaux mécanismes de résistance des
plantes est au cœur des préoccupations de notre
équipe. On y étudie comment une plante perçoit, au
niveau cellulaire, la présence de son agresseur et par
quels mécanismes elle parvient à adapter une réponse
de défense spécifiquement adaptée.
Le modèle d'étude choisi : la plante Arabidopsis
thaliana, appelée plus communnement "Arabettes des
dames" et deux bactéries, Xanthomonas campestris
et Ralstonia solanacearum, agents de deux
phytobactérioses responsables chaque année de pertes
agricoles se chiffrant en millions d'euros.
Têtes chercheuses
Comme d'autres bactéries pathogènes, ces deux
espèces sont capables d'injecter des protéines à
l'intérieur même de leurs cellules végétales hôtes.
Ces protéines appelées effecteurs s'apparentent à
de véritables missiles à tête chercheuse qui vont
notamment avoir pour cible des protéines de défense
de l'hôte afin de les neutraliser et court-circuiter
ainsi la mise en place de l’immunité végétale. En
réponse à ces effecteurs, les végétaux ont développé
des systèmes de surveillance faisant intervenir des
protéines « gardiennes » visant à détecter la présence
des effecteurs eux-mêmes ou leurs effets sur les
protéines ciblées de l'hôte. Une fois l’agent pathogène
démasqué, la réponse immunitaire est déclenchée.
Dans le cas contraire, la plante ne parvient pas
à se défendre et l’agresseur prend le dessus.
Le missile et sa cible
L’idée consiste à étudier des couples protéiques issus
respectivement de l’agresseur bactérien et de son
hôte végétal (autrement dit, le missile et sa cible). En
étroite collaboration avec la plateforme Microscopie
et imagerie cellulaire de l'IFR40, on a démontré
l’existence d’interactions physiques entre différents
partenaires protéiques grâce à la technique de FRET-
FLIM. Cette technique est basée sur des mesures de
transfert d’énergie entre molécules fluorescentes
fusionnées aux protéines d’intérêt. Elle présente
l’énorme avantage de pouvoir démontrer des
interactions protéines/protéines en préservant
l’intégrité des structures cellulaires d’intérêt et par
conséquent de pouvoir suivre des mouvements
dynamiques de complexes protéiques au niveau
subcellulaire.
Nous sommes loin d’être au bout de nos surprises.
Outre la caractérisation de véritables complexes
protéiques, ces travaux sont en passe de mettre en
lumière des mécanismes moléculaires d’une grande
complexité. Ces avancées sont déterminantes pour la
compréhension des événements de perception plantes-
agent pathogènes qui conditionnent l'activation de la
réponse immunitaire végétale.
Pour en savoir plus : Froidure et al (2010) Proc.
Natl. Acad. Sci. 107, 15281-15286; Tasset et al
(2010) Plos Pathog. (sous presse).
Contacts : [email protected] et
[email protected]
Imagerie
moléculaire
>>> Laurent DESLANDES, chargé de
Recherches CNRS et Susana RIVAS, chargée
de Recherches CNRS au Laboratoire des
interactions plantes micro-organismes
(unité mixte CNRS/INRA).
>>> Observation en microscopie confocale d’un noyau de
cellule de Nicotiana benthamiana exprimant transitoire-
ment une protéine effectrice bactérienne et sa cible végé-
tale, respectivement fusionnées à des fluorophores CFP
(Cyan Fluorescent Protein) et YFP (Yellow Fluorescent
Protein). La technique de FLIM permet de détecter des
transferts d’énergie entre les 2 fluorophores lorsque
ceux-ci sont fusionnés à 2 molécules qui interagissent
entre elles.

dOSSIER
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La morphogenèse
en temps réel
Si la génomique découvre l’ensemble des macromolécules du vivant, un enjeu
majeur est de comprendre comment elles s’assemblent pour former des
structures tridimensionnelles organisées. Les avancées de l’imagerie
permettent maintenant d’analyser en temps réel les changements de forme
des cellules vivantes pour élucider les mécanismes impliqués.
Devenir adulte pour des cellules ou des tissus, consiste à
acquérir une forme spécifique nécessaire à leurs
fonctions dans l’organisme. Les cellules présentent ainsi
une grande diversité d’organisation tridimensionnelle.
L’altération de leur forme provoque même des maladies
génétiques (surdités, déficiences visuelles et neurales).
Les mécanismes responsables de la morphogenèse
restent cependant très mal connus aujourd’hui. En effet
les techniques d’observation nécessitaient jusqu’à
récemment de travailler sur des tissus fixés, ne
permettant pas d’analyser la dynamique de la
morphogenèse. La combinaison d’avancées scientifiques
et techniques ouvre aujourd’hui la porte de l’analyse
fonctionnelle des cellules vivantes par imagerie
fluorescente à haute résolution spatiale et
temporelle (5D).
La meduse
La fin du 20ème siècle a révolutionné la conception des
microscopes. Plus que l’illumination (lasers), les caméras
numériques et leur pilotage par ordinateur, c’est bien
la découverte d’une protéine fluorescente chez la méduse
(Green Fluorescent Protein ou GFP) qui a levé le verrou
de l’analyse de cellules vivantes. Grâce à la génétique
moléculaire, il est devenu possible de fusionner une
protéine d’intérêt avec des dérivés de la GFP pour suivre
sa distribution dynamique dans les cellules vivantes et
ainsi d’explorer sa fonction.
Division cellulaire
On peut par exemple suivre ainsi la division des cellules,
via une série stéréotypée de changements de leur forme
pour la séparation des cellules filles. Mais le mode de
contrôle de cette réorganisation tridimensionnelle restait
inconnu. En analysant la dynamique du « squelette »
des cellules vivantes normales, ou en absence de
différents facteurs, notre équipe du Centre de Biologie
du Développement a découvert l’importance des
protéines Ezrin, Radixin, Moesin (ERM) pour contrôler
la forme des cellules et la répartition des chromosomes
au cours de leur division. La fonction des ERM nécessite
un contrôle localisé de leur activité et l’équipe développe
des approches à large échelle dans les cellules vivantes
pour identifier ces régulateurs et leur fonction.
Migration des cellules dans l’organisme
La morphogenèse embryonnaire nécessite aussi la
migration de certaines cellules, qui se déplacent sur les
autres tissus attirées par des gradients moléculaires.
Comprendre ces mécanismes nécessite donc leur analyse
directement au sein de l’embryon. Là encore, la
combinaison de protéines fluorescentes, d’imagerie
confocale vitale et de la génétique nous a permis
d’identifier la Fascin comme un régulateur clé de la
forme des cellules en migration dans l’embryon. Cette
protéine relie entre eux des filaments d’actine, pour
former de véritables câbles qui soutiennent
l’organisation polarisée des cellules en migration. En
absence de Fascin, les cellules perdent leur forme
spécifique et sont incapables de migrer.
Les protéines ERM et Fascin sont dérégulées dans de
nombreux cancers où elles favorisent la formation et
l’agressivité des métastases. Comprendre leur
dynamique chez des organismes modèles aidera à mieux
cerner leur impact pathologique. L’évolution constante
des approches d’imagerie vitale à l’Université Paul
Sabatier permettra encore de nouvelles avancées
fondamentales en lien direct avec la santé.
Pour en savoir plus : Carreno et al, 2008, Journal of
Cell Biology, 2009 Aug; 136(15):2557-65; Zanet et al,
2009, Development, 2008 Feb 25;180(4):739-46.
Contacts : [email protected] et [email protected]
>>> Macrophages vivants en cours de migration dans
l’embryon de drosophile. Les filaments d’actine sont
observés par une fusion GFP, révélant l’impact de
l’absence de la Fascin (à droite) sur l’organisation
polarisée des cellules. © J. Zanet
>>> Equipe morphogenèse et signalisation
cellulaires, au Centre de Biologie du
Développement (CBD, unité mixte UPS/CNRS).
De gauche à droite au premier plan : Serge
PLAZA, Hélène CHANUT, Delphine MENORET,
François PAYRE, au deuxième plan : Pierre
FERRER, Yvan LATAPIE, Philippe VALENTI,
Ahmad ALSAWADI, Emilie BENRABAH.
Imagerie
moléculaire

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Imagerie de Fluorescence
du Petit Animal
L'Imagerie de fluorescence du petit animal permet d'observer le
comportement cellulaire à l'intérieur d'un animal vivant. Très instructif, et
particulièrement éthique...
Cette technologie a l’avantage de permettre de
respecter la règle des 3 R (Réduction, Raffinement,
Remplacement), règle édictée pour limiter l’usage des
animaux de laboratoire. En effet, le suivi dans le
temps (sur plusieurs mois) peut être effectué sur un
même animal sans le sacrifier. La réduction du
nombre d’animaux nécessaire pour des données
statistiques fiables est un élément économiquement et
sociétalement positif.
L'imagerie optique par fluorescence consiste à
visualiser ce que l'on cherche à observer grâce à des
molécules injectées à l'animal simplement anesthésié.
Ces molécules sont couplées à un marqueur
fluorescent qui va se lier aux cibles et émettre de la
lumière. La principale difficulté à surmonter pour
pouvoir observer à l'intérieur des organismes sans les
ouvrir est la propagation de la lumière dans les
tissus. Ce sont en effet des milieux inhomogènes et
turbides, qui dévient les faisceaux incidents et
transmis et altérent la détection du signal lumineux
émis. Pour surmonter cette difficulté, il faut
introduire des corrections pour tenir compte de
l’absorption, la diffusion, la réflexion et la réfraction
des photons. Pour tenir compte de ces différents
paramètres, la fenêtre optique optimale se situe dans
le proche infra-rouge, entre 600 et 1000 nm.
Corps entier
La plateforme intègre donc des avancées technologiques
(illuminateurs puissants -lasers, LED-, caméras ultra-
sensibles –EmCCD-) pour augmenter considérablement la
sensibilité de détection et la résolution spatio-temporelle.
L’imagerie spectrale a été choisie pour éliminer
l’autofluorescence. Les études ont lieu sur un
« macroscope » Leica ou des dispositifs corps entier.
Il est alors possible de repérer les zones d’expression
(par exemple lors de la progression métastatique) de
tumeurs fluorescentes sur l’animal. Il est espéré ainsi
dans le futur le ciblage visuel des zones tumorales
lors de l’acte chirurgical.
La peau constitue une limite dans la résolution spatiale.
Un saut technologique est de travailler en mode
intravital où une légère chirurgie permet d’avoir une
vision directe de l’organe cible ou d’implanter une fenêtre
à la place de la peau. La détection se fait sur l’animal
anesthésié placé sous sur la platine du macroscope
(champ large), du microscope biphotonique ou d’un
microscope dédié avec enregistrement vidéo. L’avantage
majeur est que la peau n’est plus présente dans le trajet
optique d’où l’absence des phénomènes d’absorption, de
réflexion et d’autofluorescence. La résolution à l’échelle
cellulaire est accessible grâce à l’imagerie multiphotonique
qui permet de résoudre spatialement des signaux
lumineux émis plus en profondeur car elle utilise des
longueurs d’onde d’excitation dans le proche IR qui
pénètrent davantage les tissus L’excitation se trouve
limitée à un volume restreint, où se focalise le faisceau.
Cette technique permet d’atteindre une profondeur de
200 à 600 µm. Des images tridimensionnelles de très
haute résolution sont acquises. Il en résulte l’élimination
de la fluorescence hors du plan focal, une zone
d’excitation diminuée, moins de photo-dégradation et de
photo-toxicité.
Plateforme ONIPA
La plateforme d’imagerie baptisée ONIPA (imagerie
optique non invasive du petit animal) est au service
de toute la communauté scientifique. De nombreux
projets collaboratifs sont en cours, tels l’imagerie de
la progression métastatique du cancer de la prostate
avec Olivier Cuvillier et Bernard Malavaud. La
microscopie biphotonique permet d’observer
l’organisation des cellules cancéreuses exprimant
constitutivement la GFP (une protéine fluorescente
verte) et celle des vaisseaux tumoraux. Il est possible
de détecter les vaisseaux suite à l’injection d’un
dextran rhodamine (fluorescence rouge) dans
l’animal. Les images numériques peuvent alors être
analysées par traitement numérique pour déterminer
la perméabilité (via Labview) et la densité vasculaire.
Leur évolution temporelle fournit l’information sur la
dynamique des processus impliqués. On peut par
exemple observer la modification des flux sanguins
(vascular lock) induite par un traitement physique
des tumeurs (électro chimiothérapie). L’imagerie
permet un suivi quantitatif de l’évolution de la
perméabilité membranaire des vaisseaux et de
confirmer le piégeage des principes actifs injectés,
support de la haute efficacité du traitement.
Contacts : mur[email protected] et
[email protected]
>>> Aurélie PAGANIN-GIOANNI, chercheur
post doctorant, Elisabeth BELLARD,
Ingénieur d’études CNRS, Muriel GOLZIO,
chargée de recherche CNRS et
Justin TEISSIÉ, directeur de recherche
CNRS, chercheurs à l’Institut de
Pharmacologie et de Biologie Structurale
(IPBS, unité mixte UPS/CNRS).
>>> Organisation des vaisseaux tumoraux de
mélanomes B16 : visualisation par « macroscopie
intravitale ». L’injection d’une molécule fluorescente
rouge (dextran rhodamine) permet la visualisation
directe de l’organisation complexe des vaisseaux
dans le contexte tumoral.
Imagerie
moléculaire

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Le principe de la microscopie à feuille de lumière
consiste à réaliser des coupes optiques d’un
échantillon en l’illuminant par le côté avec une feuille
de lumière. Le SPIM (Selective Plane Illumination
Microscope), est un microscope inventé à l’EMBL
(Heidelberg) par Ernst Stelzer et son équipe dans
lequel la feuille de lumière est obtenue par la mise en
forme d’un faisceau laser avec une lentille cylindrique.
La feuille de lumière est positionnée dans le plan
focal de la lentille d’un objectif de détection placé
perpendiculairement au trajet d’excitation. Du fait
de la dissociation des trajets optiques d’excitation et
d’émission (ou d’imagerie), l’ensemble du plan
optique est éclairé, mais pas les autres plans du
spécimen. Il n’y a donc pas d’émission de lumière hors
du plan focal et l’image de ce plan est acquise dans sa
globalité, et non pas après un balayage progressif, ce
qui permet, d’une part, d’obtenir des images avec une
excellente résolution axiale et, d’autre part, de
diminuer grandement le temps d’exposition à la
lumière, réduisant du même coup les risques de
phototoxicité au sein de l’échantillon. Une autre
caractéristique spécifique du SPIM est que
l’échantillon peut être tourné sur lui-même de 360°
permettant ainsi des acquisitions sous plusieurs
angles de vues. La fusion de ces différentes vues
permet une visualisation en 3D de l’échantillon avec
une résolution quasi isotrope.
Echantillons épais
Il n’existe pas à l’heure actuelle de microscope SPIM
commercial. Face à la nécessité d’une stratégie
d’imagerie adaptée à des échantillons épais, nous
avons développé un prototype SPIM aujourd'hui
à la disposition de la communauté scientifique.
Ce développement s’est appuyé sur des compétences
multidisciplinaires associant en particulier des
biologistes cellulaires spécialistes d'imagerie
(ITAV/LBCMCP, Bernard Ducommun), des
mathématiciens de l'IMT (Jérôme Fahrenbach,
Pierre Weiss) et des informaticiens de l’IRIT (Denis
Kouamé). Au niveau international, une communauté
scientifique s’est développée autour de la microscopie
à feuille de lumière dans le but de partager les
avancées de chacun et de promouvoir cette
microscopie émergente.
Microscopie émergente
Cette microscopie émergente fait aujourd'hui l'objet
d'un intérêt majeur car elle représente une solution
originale parmi l’ensemble des techniques d’imagerie
existantes, permettant de répondre à des questions
jusque-là inexplorables du fait de l’absence de
technologies adaptées. Le SPIM est particulièrement
adapté pour l’imagerie en profondeur d’échantillons
de quelques dizaines de micromètres à quelques
millimètres, fixés ou vivants. Des domaines aussi
variés que la biologie cellulaire (figure a), la biologie
du développement (figure e-f), la biologie marine, la
biologie végétale (figure b ; d), et l’ingénierie tissulaire
sont concernés, comme le montre la galerie d'images
originales acquises avec le prototype SPIM accessible
sur la plate-forme d’imagerie de l’ITAV.
Contacts : [e-mail] et
[e-mail]
L’imagerie à feuille de lumière pour
accéder à la troisième dimension
>>> Images de différents organismes modèles acquises sur le
SPIM. Objectif d’illumination 10X NA 0.25, objectif de détection
10X physiologique NA 0.3, Ïex 532 nm, Ïem 560 nm. (a)
Sphéroïdes Capan2-DsRed, (b) Racine d’Arabidopsis thaliana,
(c) Neurofilaments embryon de souris, (d) Méristème
d’Arabidopsis thaliana, (e-f) embryon de Zebrafish.
Echelle 100 µm.
>>> Valérie LOBJOIS, Chercheuse et Corinne
LORENZO, Ingénieure, travaillant à l’UMS3039-
ITAV, unité mixte de service UPS/CNRS/INSA).
Un des challenges de l’imagerie optique en biologie est de visualiser en trois
dimensions des structures biologiques et des organismes sans perturber leur
développement. Un nouvel instrument, le SPIM, basé sur la microscopie à
feuille de lumière, la fluorescence et des possibilités d'acquisition en vues
multiples ouvre de nouvelles perspectives.
Imagerie
moléculaire