Peste équine
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SECTION 2.5. EQUIDAE CHAPITRE 2.5.1. PESTE ÉQUINE RÉSUMÉ La peste équine (PE) est une maladie virale infectieuse mais non contagieuse, frappant toutes les espèces d’équidés, due à un orbivirus de la famille des Reoviridae et caractérisée par une atteinte des fonctions respiratoire et circulatoire. La PE est transmise par au moins deux espèces de Culicoides. Neuf sérotypes différents ont été décrits. Tous les sérotypes de virus de la PE se rencontrent en Afrique de l’Est et du Sud. Seuls les sérotypes 9 et 4 ont été trouvés en Afrique de l’Ouest d’où ils gagnent parfois les pays circumméditerranéens. Les exemples d’épizooties survenues hors d’Afrique sont : Le Moyen-Orient (1959-1963), l’Espagne (sérotype 9, 1966, sérotype 4, 1987-1990), et le Portugal (sérotype 4, 1989). Le diagnostic de laboratoire de la PE est fondamental. Bien que les signes cliniques et les lésions soient très évocateurs, ils peuvent être confondus avec ceux d’autres maladies équines. En tant que maladie virale, le diagnostic de laboratoire peut reposer sur l’identification du virus infectieux, de son acide nucléique, des antigènes viraux ou des anticorps spécifiques. Durant ces dernières années, une grande variété d’épreuves de laboratoire a été adaptée à la détection à la fois du virus (AHSV, African Horse Sickness Virus) et de ses anticorps spécifiques. Identification de l’agent pathogène : il est important d’effectuer l’isolement et le sérotypage du virus chaque fois que des foyers apparaissent hors des régions d’enzootie. Le virus équipestique peut être isolé du sang prélevé durant la phase fébrile initiale. Pour isoler le virus, les autres tissus de choix sont représentés par la rate, le poumon et les nœuds lymphatiques, prélevés lors de l’autopsie. Les préparations peuvent être inoculées en cultures de cellules, telles que celles de rein de jeune hamster (BHK-21), de singe (MS) ou de rein de singe vert africain (Vero), et par voie intra-cérébrale au souriceau nouveau-né. Différentes méthodes immuno-enzymatique (ELISA) ont été mises au point pour la détection rapide d’antigènes viraux dans la rate et le surnageant de cultures de cellules infectées. L’identification de l’ARN viral a aussi été réalisée à l’aide de la technique de transcription inverse couplée à une réaction d’amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR). Les virus isolés peuvent être sérotypés par une réaction sérologique spécifique telle qu’une séroneutralisation virale (SN), par une transcription inverse couplée à une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) et par séquençage. Épreuves sérologiques : les chevaux qui survivent à une infection naturelle développent des anticorps vis-à-vis du sérotype viral infectant, en 8 à 12 jours après l’infection. Ceci peut être démontré par plusieurs méthodes sérologiques telles que la réaction de fixation du complément, l’ELISA, l’immuno-empreinte et la SN. Cette dernière est utilisée pour le sérotypage. D’autres épreuves ont été décrites et proposées comme l’immunodiffusion en gélose et l’inhibition de l’hémagglutination. Manuel terrestre de l’OIE 2008 901 Chapitre 2.5.1. — Peste équine Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : des vaccins vivants atténués (monovalents et polyvalents) destinés au cheval, mulet et âne, sont à l’heure actuelle disponibles dans le commerce. Un vaccin inactivé monovalent a été commercialisé mais n’est plus disponible. De nouveaux vaccins, y compris un vaccin sous-unités, ont été évalués expérimentalement. A. INTRODUCTION La peste équine (PE) (Peste equina africana, African horse sickness [AHS]) est une maladie des équidés non contagieuse, transmise par des arthropodes, due à un orbivirus (ARN double brin) de la famille des Reoviridae. Le genre Orbivirus comprend aussi le virus de la fièvre catarrhale ovine et celui de la maladie hémorragique épizootique qui ont des aspects morphologiques et des propriétés biochimiques voisines alors qu’ils diffèrent par leurs caractéristiques pathogènes et antigéniques ainsi que par les espèces affectées. La particule virale d’une taille d’environ 70 nm n’est pas enveloppée. Le génome du virus de la peste équine (AHSV, African Horse Sickness Virus) est formé de 10 segments double brin d’ARN, qui codent 7 protéines structurales (VP 1-7), la plupart de celles-ci ayant été séquencées pour les sérotypes viraux 4, 6 et 9 (29, 36, 39), et 4 protéines non structurales (NS1, NS2, NS3, NS3A) (11, 19). Les protéines VP2 et VP5 forme la partie externe de la capside du virion, et les protéines VP3 et VP7 constituent les constituants majeurs de la couche interne de la capside. Les protéines VP1, VP4 et VP6 sont les constituants mineurs de cette couche interne. Les protéines NS3 sont les secondes protéines virales les plus variables (35) ; les plus variables étant la protéine majeure VP2 de la surface de la capside. Cette protéine VP2 est aussi responsable des sérotypes viraux et, avec VP5, de l’activité de neutralisation du virus (26). Neuf sérotypes distincts de virus de la PE ont été identifiés par neutralisation virale, mais quelques réactions croisées ont été constatées entre les sérotypes 1 et 2, 3 et 7, 5 et 8, ainsi que 6 et 9, mais aucune réaction croisée avec d’autres orbivirus connus n’a été observée. La PE demeure enzootique en Afrique sub-saharienne, bien que des poussées occasionnelles aient été enregistrées en Afrique du Nord (1965, 1989-1990), au Moyen Orient (1959-1961), et en Europe (Espagne, 1966, 1987-1990 et Portugal, 1989). La maladie présente, à la fois une incidence saisonnière (fin de l’été, automne) et cyclique avec des pics épizootiques en Afrique du Sud durant les accès de chaleur (1). La mortalité apparaît en rapport avec les espèces d’équidés affectés et la souche ou le sérotype de virus en cause. Au moins deux vecteurs sont impliqués sur le terrain : Culicoides imicola et C. bolitinos. Parmi les équidés, le cheval est le plus sensible au virus de la PE, avec un taux de mortalité de 50 à 90 %, suivi par le mulet, avec un taux de mortalité voisin de 50 %. Dans les régions d’enzootie africaines ; l’âne est très résistant et ne fait que des infections sub-cliniques. Cependant, en Europe et dans les pays asiatiques, l’âne se révèle moyennement sensible et la mortalité peut atteindre 10 %. Les zèbres sont aussi très résistants, n’extériorisent aucun signe clinique excepté de la fièvre, mais ils peuvent présenter une virémie prolongée (jusqu’à 40 jours) (4). B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC Bien que certains signes cliniques et certaines lésions soient très évocateurs, comme par exemple l’œdème de la fosse temporale souvent présent chez les chevaux atteints de forme subaiguë, ces signes cliniques associés à des commémoratifs historiques et des informations épidémiologiques peuvent être suffisant pour tenter le diagnostic. Cependant, d’autres signes et lésions sont moins spécifiques de la PE, et d’autres maladies telles que l’encéphalose équine, l’anémie infectieuse, la pneumonie à morbilivirus, l’artérite virale équine, la babésiose et le purpura hémorragique, peuvent être confondues avec une forme ou l’autre de la PE et doivent être écartées. C’est pourquoi le diagnostic de laboratoire est essentiel pour confirmer le diagnostic clinique. 1. Les formes cliniques de la PE Il existe 4 formes cliniques classiques de PE : pulmonaire, cardiaque, cardio-pulmonaire ou mixte, et fébrile pure (7). La forme suraiguë ou pulmonaire, qui a une incubation courte (3 à 5 jours), est caractérisée par une dyspnée sévère et une atteinte respiratoire progressive. Une poussée aiguë fébrile, durant 1 à 2 jours et pouvant atteindre 40 à 41 °C, peut être le seul signe. Le plus souvent elle est suivie par divers degrés de détresse respiratoire – la fréquence respiratoire peut augmenter à 60 ou même 75 respirations/min. Le sujet se tient immobile, les antérieurs écartés, la tête tendue sur l’encolure, les naseaux dilatés. Un jetage abondant est fréquent et une toux spasmodique peut être notée en phase terminale avec un jetage mousseux obstruant les naseaux. La mort survient en général quelques heures après le début des manifestations cliniques, l’animal se noyant littéralement 902 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.1. — Peste équine dans son propre fluide séreux. La forme pulmonaire est habituellement observée chez les animaux très sensibles, infectés par une souche hautement virulente, ou sur des animaux qui ont été soumis à un effort physique durant la phase fébrile. La guérison de cette forme est exceptionnelle, survenant dans moins de 5 % des cas. Cette forme est aussi celle qui est observée en général chez les chiens. L’incubation de la forme subaiguë, œdémateuse ou cardiaque, varie de 7 à 14 jours, et l’apparition des signes cliniques est marquée par une réaction fébrile (39 à 41 °C) qui dure 3 à 6 jours. Peu après le déclin de la fièvre, des tuméfactions œdémateuses peuvent apparaître. Elles débutent dans la fosse temporale ou supra-orbitaire et sur les paupières, puis, plus tard atteignent les lèvres, les joues, la langue, l’espace inter-mandibulaire et la région laryngée. Les œdèmes sous-cutanés peuvent s’étendre à distance du cou vers la poitrine et, dans les cas sévères, peuvent envahir la cage thoracique et les épaules, mais en général pas les membres postérieurs. En phase terminale, des pétéchies peuvent être constatées dans la conjonctive et sous la face ventrale de la langue. Finalement, l’animal devient agité et peut montrer des signes de coliques avant de mourir d’un arrêt cardiaque. Une difficulté de déglutition en rapport avec une paralysie de l’œsophage est aussi rencontrée. Le taux de mortalité est d’environ 50 % et la mort survient généralement en 4 à 8 jours après l’apparition de la réaction fébrile. Lors de guérison, les œdèmes se résorbent progressivement en 3 à 8 jours. Cette forme clinique est habituellement associée à une infection par une souche virale de basse virulence ou se rencontre sur des sujets immunisés par des souches virales hétérologues, ou apparaît en rapport avec des variations biologiques chez l’animal infecté. La forme aiguë ou mixte associe à la fois la forme pulmonaire et la forme cardiaque et elle est souvent la forme la plus fréquente chez le cheval et le mulet. La mort survient en 3 à 6 jours après le début de l’hyperthermie, et le taux de mortalité est d’environ 70 %. La maladie peut se manifester de la façon suivante : ! Des signes pulmonaires initiaux relativement modérés sont suivis par l’apparition de tuméfactions œdémateuses importantes de la tête et de l’encolure, la mort résultant d’un arrêt cardiaque. ! Des tuméfactions œdémateuses, typiques de la forme subaiguë, sont suivies par l’apparition soudaine d’une dyspnée et des autres signes cliniques caractéristiques de la forme suraiguë pulmonaire. La forme fébrile pure est la forme la plus discrète et passe souvent inaperçue dans les foyers. L’incubation varie de 5 à 14 jours débouchant sur une réaction fébrile (39 à 40 °C) de type rémittent, avec une rémission le matin et une exacerbation le soir, durant 5 à 8 jours. Mis à part la réaction fébrile, les autres manifestations sont rares. Les conjonctives peuvent être légèrement congestionnées, le pouls accéléré, et un certain degré d’anorexie et d’abattement peut être noté ainsi qu’un œdème des fosses supra-orbitales. Il n’y a pas de mortalité. Cette forme de maladie est habituellement observée chez les animaux bénéficiant déjà d’une immunité partielle et sur les espèces résistantes, telles que les ânes et les zèbres. Il n’existe aucune donnée plaidant pour la possibilité d’infection de l’homme par une souche de terrain de virus de la PE, soit à la suite d’un contact avec des animaux infectés naturellement ou expérimentalement, soit au cours de manipulation du virus au laboratoire. Cependant certaines souches vaccinales neurotropes peuvent entraîner des encéphalites et des rétinites chez l’homme, suite à une contamination trans-nasale (28). La transmission expérimentale et naturelle du virus au chien a été rapportée, suite à l’ingestion de viande de cheval infecté (3). Néanmoins, on ne dispose que de peu d’éléments quant à la possibilité d’infection du chien par piqûre d’insecte (34). 2. Isolement et identification de l’agent pathogène Plusieurs techniques sont déjà disponibles pour l’identification du virus de la PE, allant de l’épreuve immuno-enzymatique de capture (ELISA sandwich indirect) qui est une technique rapide et utilisant des anticorps soit polyclonaux (AcP) soit monoclonaux (AcM), à la réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) qui inclue une nouvelle technique de transcription inverse couplée à une PCR (RT-PCR) pour discriminer les 9 sérotypes du virus (31) et en passant par la culture sur cellule et l’inoculation à un souriceau nouveau-né. Si possible, plus d’une épreuve doit être réalisée pour diagnostiquer un foyer de PE, spécialement pour préciser le taux d’atteinte. L’épreuve initiale peut être une épreuve rapide telle que l’ELISA ou la PCR, complétée par l’isolement du virus en culture de cellules. La séroneutralisation virale (SN) permettant l’identification du sérotype, doit être effectuée aussitôt que possible lors d’épizootie afin de pouvoir choisir le vaccin adapté. Par la suite, l’ELISA sera très utile pour le diagnostic de laboratoire. Aujourd’hui, il n’existe aucune souche virale de référence au niveau international, ni de réactifs de diagnostic de référence, et ni aucune méthodologie normalisée pour l’identification du virus de la PE. Néanmoins un panel de virus a été évalué et des études comparatives entre différentes tests ELISA pour l’identification antigénique ont été conduites dans différents laboratoires. Les résultats ont démontré un haut niveau de corrélation, pour la détection antigénique (30) lorsque l’on utilise la méthode ELISA sandwich indirecte (13, 18). Manuel terrestre de l’OIE 2008 903 Chapitre 2.5.1. — Peste équine Un élément très important du diagnostic est le choix des prélèvements et les conditions de leur transport au laboratoire. a) Prélèvements pour isolement du virus Du sang récolté sur anti-coagulant durant le début de la phase fébrile de la maladie, ainsi que des fragments (2 à 4 g) de rate, poumon et nœuds lymphatiques prélevés sur un animal venant de mourir, constituent les prélèvements de choix du diagnostic. Ils doivent être placés à 4 °C durant le transport et au laboratoire. b) Culture de cellules L’isolement direct du virus a été réalisé avec succès sur lignées de cellules de mammifères : cellules de rein de jeunes hamsters (BHK-21), de singe (MS), de rein de singe vert africain (Vero), ainsi que sur des lignées de cellules de moustiques et de Culicoides. Les prélèvements de sang recueillis sur un anticoagulant approprié peuvent être utilisés non dilués comme inoculum. Après 15 à 60 min d’adsorption à température ambiante ou à 37 °C, les cellules en culture sont lavées et le milieu d’entretien est ajouté. Il est aussi possible et plus courant de laver le sang, de le lyser et le diluer au 1/10. Cette modalité élimine les anticorps indésirables qui peuvent neutraliser le virus et favorise la libération des virus associés aux membranes cellulaires des globules rouges. Quand des prélèvements tissulaires (rate, poumon, etc.) sont utilisés, une suspension tissulaire à 10 % est préparée dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) ou dans du milieu de culture de cellules, contenant des antibiotiques. Un effet cytopathogène (ECP) peut apparaître entre 2 et 10 jours en post-infection avec les cellules de mammifère. Trois passages aveugles doivent être réalisés avant de considérer les prélèvements comme négatifs. Sur cellules d’insecte, aucun ECP n’est observé, mais la présence du virus peut être détectée 7 à 10 jours après que les cellules d’insecte infectées soient passées sur cellules de mammifère. c) Souriceau nouveau-né Cette méthode d’isolement de l’AHSV nécessite une inoculation intra-cérébrale de deux familles de souriceaux âgés de 1 à 3 jours. Lors de résultats positifs, les animaux présentent des signes nerveux entre 3 et 15 jours après l’inoculation. Les cerveaux des animaux malades peuvent être récoltés, homogénéisés et ré-inoculés par voie intra-cérébrale à au moins 6 souriceaux de 1 à 3 jours. Le second passage doit induire une réduction de la période d’incubation (2 à 5 jours) et 100 % d’infectiosité. Le typage du virus peut être réalisé directement à partir des cerveaux de souris soit par la technique conventionnelle de séroneutralisation, soit par extraction et séquençage de l’ARN. d) Méthode immuno-enzymatique sandwich Au moins deux techniques ELISA sandwich spécifiques de groupe ont été mises au point et appliquées à la détection de l’antigène de l’AHSV à la fois sur des prélèvements de terrain et sur des cultures de cellules infectées au laboratoire (13, 18). L’une (13), utilise des AcPs et l’autre (18), des AcMs vis-à-vis de l’une des protéines majeures la mieux conservée parmi les sérotypes – la protéine VP7. Les deux méthodes se sont révélées convenables pour le diagnostic de la PE, en raison de leur grande sensibilité et spécificité ainsi que de l’obtention des résultats en seulement 2 à 4 h (30). L’utilisation de l’immunoglobuline IgY dans un ELISA en double sandwich d’anticorps pour la détection de tous les sérotypes de l’AHSV, a aussi été décrite (6). Les réactifs nécessaires à l’ELISA peuvent être obtenus auprès des Laboratoires de référence de l’OIE pour la peste équine (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre). 904 ! Ce qui suit est un exemple d’ELISA utilisant des anticorps monoclonaux i) Phase solide : adsorber sur les plaques ELISA (par exemple Nunc Maxisorb à haute capacité d’adsorption) un mélange de AcM 5G5 et 3D2 dilué en PBS, pH 7,2 (10 µg/ml). Incuber une nuit à 4 °C ; ii) Laver les plaques 5 fois avec de l’eau distillée contenant 0,05 % (v/v) de Tween 20 (solution de lavage). Tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante pour éliminer le liquide résiduel ; iii) Saturer les plaques avec du PBS + 1 % de sérum-albumine bovine (SAB), pH 7,2, 200 µl par puits, pendant 1 h à 37 °C ; iv) Éliminer la solution de blocage et tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante ; Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.1. — Peste équine v) Prélèvements à tester : ajouter les prélèvements à tester (dilutions de 2 en 2 en commençant par les homogénats ou les surnageant de cultures de cellules non dilués) dilués en PBS + 1 % SAB, pH 7,2, 100 µl par puits. Incuber pendant 1 h à 37 °C. (homogénat de rate : homogénéiser environ 2 cm3 [1 g] de rate dans 3 ml de milieu de culture MEM [milieu essentiel minimum]. Centrifuger à 600 g pendant 10 min et récupérer le surnageant) ; vi) Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ; vii) Conjugué : répartir 100 µl par puits de 5G5 AcM marqué à la biotine, dilué au 1/500 en PBS + 1 % de SAB, pH 7,2. Incuber 1 h à 37 °C. Laver les plaques comme décrit à l’étape ii). Ajouter 100 µl par puits d’avidine/peroxidase à la dilution optimale en PBS + 1 % de SAB. Incuber 45 min à la température ambiante ; viii) Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ; e) ix) Substrat : ajouter 200 µl par puits de solution de substrat (10 ml de DMAB 80,6 mM [diméthyl amino benzaldéhyde] + 10 ml de MBTH 1,56 mM [3-méthyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone hydrochlorure] + 5 µl de H2O2). Le développement de la couleur est stoppé par addition de 50 µl de H2SO4 3 N, après environ 5 à 10 min (avant que les témoins négatifs commencent à se colorer) ; x) Lire les plaques à 600 nm (ou 620 nm) ; xi) Interprétation des résultats : calculer le seuil critique de la façon suivante : C + ou – 0,06 = Seuil (où C est la valeur de densité optique [DO] obtenue avec le témoin négatif). Les prélèvements donnant des DO inférieures au seuil sont considérés négatifs. Les prélèvements donnant des DO supérieures de + 0,20 sont considérés positifs. Les échantillons donnant des DO intermédiaires sont douteux et doivent faire l’objet d’une autre technique afin de confirmer les résultats. Réaction d’amplification en chaîne par polymérase Une technique RT-PCR a été mise au point pour la mise en évidence spécifique du génome viral. Cette épreuve (méthode 1) peut être utilisée pour détecter l’ARN viral dans le sang collecté sur éthylène diamine tétra-acétique (EDTA), ou dans des tissus équins ou de souris ou dans des cultures cellulaires. Les amorces correspondent aux extrémités 5’ (nucléotides 1-21) et 3’ (nucléotides 1160-1179) du segment 7 de l’ARN (4, 22, 33, 40) et amplifient le segment 7 en entier. Plus récemment, une nouvelle technique conventionnelle (méthode 2) et une RT-PCR en temps réel (méthode 3) utilisant des amorces d’une région très conservée du même segment 7 de l’ARN viral ont été mises au point afin d’améliorer la sensibilité et la rapidité du diagnostic de la PE (10). Les 3 techniques de RT-PCR peuvent détecter les 9 sérotypes ; elles sont décrites ci-dessous. ! Protocole de la méthode 1 (4) L’extraction des acides nucléiques à partir de prélèvements de rate, est effectuée de la façon suivante : 1 g du prélèvement tissulaire est homogénéisé dans 1 ml de solution dénaturante (thiocyanate de guanidium 4 M, citrate de sodium 25 mM, 2-mercaptoéthanol 0,1 M, sarcosyl 0,5 %). Après centrifugation, 1 µg d’ARN de levure, 0,1 ml d’acétate de sodium 2 M pH 4, 1 ml de phénol et 0,2 ml d’un mélange (49/1) de chloroforme/alcool isoamylique, sont ajoutés au surnageant. La suspension est agitée vigoureusement et placée sur glace pendant 15 min. Après centrifugation, l’ARN présent dans la phase aqueuse est extrait au phénol, précipité à l’éthanol et repris en eau stérile. Les méthodes de synthèse de l’ADNc et d’amplification en PCR sont appliquées, dans tous les cas, à une température de régénération de 37 °C. Les séquences d’amorces PCR utilisées sont : 5’-GTT-AAA-ATT-CGG-TTA-GGA-TG-3’, qui correspond à la polarité de l’ARN messager et 5’-GTA-AGT-GTA-TTC-GGT-ATT-G-3’, qui est complémentaire de la polarité de l’ARN messager. Le protocole PCR proprement dit comprend 40 cycles (94 °C pendant 1 min, 55 °C durant 1,5 min, 72 °C pendant 2,5 min et 70 °C durant 7 min) puis les tubes PCR sont conservés à 4 °C. L’analyse des produits PCR est conduite par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1,2 % (poids/volume) contenant du bromure d’éthidium. Les prélèvements positifs donneront des bandes de 1179 paires de base. ! Protocole de la méthode 2 (10) L’extraction de l’ARN double brin peut être réalisée en utilisant le kit commercialisé High Pure Viral Nucleic Acid (Roche Diagnostics), décrit ci-dessous. D’autres kits d’extraction de l’ARN sont disponibles dans le commerce pour la préparation de matrices convenant à la RT-PCR selon l’échantillon à analyser et peuvent être utilisées. Différents échantillons peuvent être soumis à analyse selon cette procédure comme des surnageants de cultures cellulaires, du sang récolté sur EDTA, du sérum ou des tissus homogénéisés. Le kit High Pure Viral Nucleic Acid (Roche Diagnostics) comprend les réactifs suivants : un tampon de liaison, de l’ARN porteur de Poly (A), la protéinase K, un tampon qui élmine les inhibiteurs, un tampon de lavage et des tubes filtres (high pure filter tubes) et des tubes de collecte. Manuel terrestre de l’OIE 2008 905 Chapitre 2.5.1. — Peste équine Pour les échantillons d’organe ou de tissu, il convient de préparer d’abord une suspension homogénéisée au 1/10 dans du PBS, puis de la clarifier par centrifugation à 12 000 g pendant 5 min. Extraire l’ARN du surnageant. Parfois, il est recommandé d’analyser en parallèle une dilution au 1/10 du surnageant. Extraction à partir des échantillons témoins : homogénéiser en diluant au 1/10 le même tissu que celui des échantillons à traiter ; (a) pour le témoin négatif utiliser 200 µl du tissu indemne de virus et (b) pour le témoin positifs, 200 µl d’homogénat de tissu contenant du virus. Traiter les deux témoins en même temps que les échantillons à analyser. i) À l’aide d’une pipette, déposer 200 µl d’échantillon dans un microtube à centrifuger de 1,5 ml ; ii) Ajouter 200 µl de tampon de liaison supplémenté en poly(A) et 50 µl de protéinase K ; mélanger immédiatement et incuber à 72 °C pendant 10 min ; iii) Centrifuger brièvement le microtube pour éliminer les gouttes à l’intérieur du bouchon ; iv) Mélanger l’échantillon avec 100 µl de tampon de liaison ; centrifuger brièvement le microtube pour éliminer les gouttes à l’intérieur du bouchon ; v) Insérer un tube filtre (high pure filter tube) dans un tube de collecte et pipetter l’échantillon dans le réservoir supérieur ; centrifuger pendant 1 min à 8 000 tr/min (pour les échantillons de sang recommencer la centrifugation si l’échantillon est resté dans le tube filtre) ; vi) Éliminer le filtrat et le tube de collecte et placer le tube filtre dans un nouveau tube de collecte ; vii) Ajouter 500 µl de tampon d’élimination des inhibiteurs dans le réservoir supérieur et centrifuger pendant 1 min à 8 000 tr/min ; viii) Éliminer le filtrat et le tube de collecte et placer le tube filtre dans un nouveau tube de collecte ; ix) Ajouter 450 µl de tampon de rinçage dans le réservoir supérieur et centrifuger pendant 1 min à 8 000 tr/min ; x) Éliminer le filtrat et le tube de collecte et répéter l’étape de lavage ; xi) Éliminer le tube de collecte et placer le tube filtre dans un tube de collecte propre ; centrifuger pendant 10 s à 13 000 tr/min pour éliminer le tampon de rinçage résiduel ; xii) Éliminer le tube de collecte et placer le tube filtre dans un microtube à centrifuger de 1,5 ml ; xiii) Pour éluer l’ARN, ajouter 50 µl d’eau stérile sans RNAse et préchauffée à 70 °C dans le réservoir supérieur et centrifuger pendant 1 min à 8 000 tr/min ; xiv) Traiter immédiatement ou conserver à –20 °C pour traitement ultérieur. 906 ! Solutions mères pour RT-PCR - Eau stérile dépourvue de nucléase ; - Kit One-step RT-PCR disponible dans le commerce auprès de Qiagen, et qui contient pour la RT et la PCR : les enzymes, le mélange de nucléotide, le tampon avec du chlorure de magnésium et une solution Q ; - Une enzyme inhibitrice de la RNAse disponible dans le commerce auprès de plusieurs fournisseurs ; - Les amorces à une concentration de 20 pmol/µl. Séquence de l’amorce 1 : 5’-GGC-TCC-AAC-ACTCAC-AAG-ATG-T-3’ (amorce de tête); séquence de l’amorce 2 : 5’-GGC-GGA-TTA-ATA-GGC-TGCATA-3’ (amorce inverse) ; - Tampon de charge concentré 10× : 0,2 % de xylène cyanol ; 0,2 % de bleu de bromophénol ; 30 % de glycérol ; - Tampon TAE (50×) pour gel d’agarose : Tris base (242 g) ; acide acétique glacial (57,1 ml) ; 0, 5 M EDTA, pH 8 (100 ml) ; eau distillée (qsp 1 litre) ; - Marqueurs ADN : une échelle de 100 paires de bases est disponible dans le commerce. ! Épreuve d’amplification par RT-PCR i) Il est recommandé de dénaturer l’ARN viral double brin avant de réaliser la RT-PCR. Préparer le mélange suivant pour chaque échantillon : amorce 1 : 20 pmol/µl (0,5 µl) ; amorce 2 : 20 pmol/µl (0,5 µl) ; 7 µl d’eau stérile sans nucléase ; et 2 µl de la matrice de l’échantillon extrait ; Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.1. — Peste équine ii) Placer les tubes dans le thermocycleur ou la base chauffante et incuber à 95 °C pendant 5 min. Centrifuger brièvement les tubes pour éliminer les gouttelettes accrochées au couvercle et placer immédiatement les tubes sur de la glace ; iii) Pour chaque échantillon préparer le mélange réactionnel pour la RT-PCR (décrit ci-dessous) dans un microtube à centrifugation de 1,5 ml. Préparer le mélange réactionnel en quantité suffisante pour l’ensemble des échantillons en prévoyant un supplément équivalent à un échantillon ; iv) Eau stérile sans nucléase (3,25 µl), tampon de PCR 5× avec du chlorure de magnésium (5 µl), mélange de dNTP 10 mM (0,5 µl), solution Q 5× (5 µl), inhibiteur de la RNAse 20 U/µl (0,25 µl), mélange d’enzymes (1 µl) ; v) Ajouter 15 µl du mélange réactionnel pour RT-PCR dans chaque tube de PCR contenant la matrice ARN dénaturée ; vi) Inclure un témoin positif (2 µl d’ARN du virus de la PE) et un témoin négatif (2 µl d’eau distillée) dans chaque test de RT-PCR ; vii) Placer les tubes dans un thermocycleur automatisé et suivre le programme suivant : - Un cycle à 55 °C pendant 30 min ; - Un cycle à 95 °C pendant 15 min ; - 40 cycles à 94 °C pendant 30 s, 58 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; - Un cycle à 72 °C pendant 7 min ; - Maintenir à 4 °C. viii) Retirer les tubes de PCR à la fin du programme et ajouter dans chaque tube 2,5 µl de tampon de charge (10×) ; ix) Placer tous les échantillons sur un gel d’agarose à 3 % dans du tampon TAE contenant du bromure d’éthidium à la concentration finale de 0,5 µg/ml. Ajouter l’échelle ADN dans des pistes de chaque côté du gel ; x) Réaliser l’électrophorèse à un voltage constant entre 150 et 200 volts pendant environ 30 min ; xi) Lecture des résultats : examiner le gel sous lumière ultra-violette. Une bande discrète apparaît dans un échantillon positif qui doit migrer de façon identique à ce qui se passe dans le témoin positif. Calculer la taille des produits d’amplification dans les échantillons à tester et dans le témoin positif en comparant avec les échelles ADN. Les produits d’amplification du témoin positif ont une taille de 102 paires de bases. Aucune bande ne doit être observée avec le témoin négatif. ! Protocole de la méthode 3 : RT-PCR en temps réel (10) Pour la préparation des échantillons et l’extraction de l’ARN, suivre le même protocole que celui décrit pour la méthode 2 de RT-PCR conventionnelle. ! Solutions mères pour la RT-PCR i) Eau stérile dépourvue de nucléase ; ii) Kit One-step RT-PCR disponible dans le commerce auprès de Qiagen, et qui contient les enzymes pour la RT (mélange RT) et la PCR, le mélange de nucléotide et le tampon avec du chlorure de magnésium (mélange primaire) ; iii) Une enzyme inhibitrice de la RNAse disponible dans le commerce auprès de plusieurs fournisseurs ; iv) Utiliser les mêmes amorces que pour la méthode 2 de la RT-PCR conventionnelle décrite plus haut. Les amorces sont à une concentration de 20 pmol/µl. Séquence de l’amorce 1 (sens positif) : 5’-GGCTCC-AAC-ACT-CAC-AAG-ATG-T-3’ ; séquence de l’amorce 2 (sens négatif) : 5’-GGC-GGA-TTA-ATAGGC-TGC-ATA-3’ ; v) ® Sonde fluorogénique TaqMan-MGB à la concentration de 10 pmol/µl : (5’-[6-carboxy-fluoréscéine (FAM)-TGG-CAC-GCC-TTA-CGC-GC-[MGB - Minor Groove Binder Molecule]-3’). ! Épreuve d’amplification par RT-PCR i) il est recommandé de dénaturer l’ARN viral double brin avant de réaliser la RT-PCR. Préparer le mélange suivant pour chaque échantillon : amorce 1 : 20 pmol/µl (0,75 µl) ; amorce 2 : 20 pmol/µl (0,75 µl) ; 6,5 µl d’eau stérile dépourvue de nucléase ; et 2 µl de la matrice de l’échantillon extrait ; Manuel terrestre de l’OIE 2008 907 Chapitre 2.5.1. — Peste équine ii) Placer les tubes dans le thermocycleur ou la base chauffante et incuber à 95 °C pendant 5 min. Centrifuger brièvement les tubes pour éliminer les gouttelettes accrochées au couvercle et placer immédiatement les tubes sur de la glace ; iii) Pour chaque échantillon préparer le mélange réactionnel pour la RT-PCR (décrit ci-dessous) dans un microtube à centrifugation de 1,5 ml. Préparer le mélange réactionnel en quantité suffisante pour l’ensemble des échantillons en prévoyant un supplément équivalent à un échantillon ; iv) Eau stérile dépourvue de nucléase (1,375 µl), sonde TaqMan - MGB® 10 pmol/µl (0,625 µl), mélange primaire 2× (12,5 µl), inhibiteur de la RNAse 20 U/µl (0,25 µl), mélange pour RT (0,25 µl) ; v) Ajouter 15 µl du mélange réactionnel pour RT-PCR dans chaque tube optique pour PCR ou dans chaque puits d’une plaque optique contenant la matrice ARN dénaturée ; vi) Inclure un témoin positif (2 µl d’ARN du virus de la PE) et un témoin négatif (2 µl d’eau distillée) dans chaque test de RT-PCR ; vii) Placer les tubes dans un thermocycleur automatisé et suivre le programme suivant : - Un cycle à 55 °C pendant 30 min. - Un cycle à 95 °C pendant 15 min. - 45 cycles à 94 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min. Faire les mesures de la fluorescence à la fin de chaque cycle à une longueur d’onde appropriée. viii) Lecture des résultats : déterminer une valeur seuil du cycle (Ct) pour chaque réaction de PCR à partir d’une grille des points d’amplification (un point dû au signal de fluorescence en rapport avec le nombre du cycle). Les échantillons négatifs, les témoins négatifs non infectés ou les témoins « blancs » doivent avoir une valeur Ct > 45,0. Les échantillons à tester positifs et les témoins positifs doivent avoir une valeur Ct < 45,0 (les échantillons fortement positifs ont une valeur Ct < 30). ! Sérotypage du virus de la peste équine (AHSV) Il y a encore peu de temps, la séroneutralisation (SN) était, grâce à des antisérums spécifiques, la méthode de choix pour le sérotypage ainsi que l’épreuve étalon (gold standard) pour l’identification des souches de virus isolées sur le terrain (37). Cette technique nécessite au moins 5 jours avant que les résultats ne soient disponibles. La mise au point récente d’une épreuve RT-PCR spécifique de type pouvant servir à l’identification et à la différentiation des 9 sérotypes du virus a fourni une méthode qui confirme en quelques heures l’identité du virus dans les échantillons de tissu (27, 31). Neufs paires d’amorces ont été préparées à partir du segment 2 du génome viral de chaque sérotype. Les résultats obtenus par la RT-PCR sont en concordance parfaite avec ceux de la séroneutralisation. Le typage des 9 sérotypes du virus équipestique a aussi été réalisé avec des sondes obtenues d’une série de gènes entiers clonés de VP2 et cette technique peut être une alternative à l’amplification du segment génomique 2 (17). 3. Épreuves sérologiques Des sérums de référence internationale OIE sont disponibles (consulter le site web de l’OIE [www.oie.int] pour l’adresse). Ces sérums ont été produits afin de normaliser l’ELISA, qui est une épreuve prescrite par l’OIE. De plus, un ensemble de sérums de référence a été évalué et des études comparatives entre différentes techniques ELISA utilisant des AcMs et des AcPs, impliquant plusieurs laboratoires, ont été réalisées. Les résultats ont révélé un degré élevé de corrélation en utilisant l’ELISA de compétition ou indirect pour la mise en évidence des anticorps (12, 20, 30). Plus récemment, un ensemble de sérums a été produit et est utilisé aujourd’hui pour les contrôles annuels de qualité de trois épreuves de détection des anticorps par ELISA adoptés par les laboratoires nationaux en Europe (9, 12, 20). Les épreuves ELISA indirecte ou de compétition utilisant soit l’antigène soluble de l’AHSV soit une protéine VP7 recombinante (12, 20) se sont révélés de bonnes méthodes de détection des anticorps spécifiques de groupe, notamment pour des recherches à grande échelle (30). L’ensemble de ces épreuves a été reconnu par la Commission Européenne (9). L’ELISA de compétition peut aussi être utilisé chez les animaux sauvages puisque les anti-globulines spécifiques d’espèce ne sont pas nécessaires avec cette méthode. Une épreuve d’immunoempreinte a été appliquée à la recherche des anticorps anti-AHSV (20). Elle est particulièrement adaptée à l’étude d’un petit nombre de sérums. Un ELISA indirect utilisant la protéine non structurale NS3 du sérotype 4 comme antigène, est aussi disponible ; il peut être utilisé pour différencier les animaux infectés ou vaccinés avec le vaccin à virus vivant de ceux vaccinés avec le vaccin inactivé préparé à partir de virions purifiés (21). Il convient néanmoins de remarquer qu’aucun vaccin inactivé n’est commercialisé à l’heure actuelle. La réaction de fixation du complément (FC) a été largement utilisée, mais certains sérums se révèlent anti-complémentaires, notamment ceux des ânes et des zèbres. 908 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.1. — Peste équine a) Méthode immuno-enzymatique indirecte (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) La protéine VP7 recombinante a été utilisée comme antigène pour la recherche des anticorps anti-AHSV et a révélé une grande sensibilité et spécificité (20, 38). Les autres avantages de cet antigène résident dans sa stabilité et son innocuité (23). ! Protocole i) Phase solide : fixer sur les plaques ELISA (par exemple des plaques Nunc Maxisorb à haute capacité d’adsorption) le recombinant AHSV-4 VP7 dilué en tampon carbonate/bicarbonate, pH 9,6. Incuber une nuit à 4 °C ; ii) Laver les plaques 5 fois à l’eau distillée contenant 0,01 % (v/v) de Tween 20 (solution de lavage). Retourner et tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante pour éliminer le liquide résiduel ; iii) Saturer les plaques avec du PBS, pH 7,2 + 5 % (poids/volume) de lait écrémé, 200 µl par puits, pendant 1 h à 37 °C ; iv) Éliminer la solution de blocage et tapoter délicatement les plaques sur la substance absorbante ; v) Prélèvements à tester : les prélèvements de sérum à tester et les sérums témoins positif et négatif sont dilués au 1/25 en PBS + 5 % (poids/volume) de lait écrémé + 0,05 % (v/v) de Tween 20, 100 µl par puits. Incuber durant 1 h à 37 °C. Lors de titrage, ajouter des dilutions en série de raison 2, à partir de la dilution au 1/25 (100 µl/puits), un sérum par colonne, et faire la même chose avec les témoins positif et négatif. Incuber 1 h à 37 °C ; vi) Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ; vii) Conjugué : Répartir 100 µl/puits d’anti-gamma globuline de cheval conjuguée à la peroxydase de raifort, diluée en PBS + 5 % de lait + 0,05 % de Tween 20, pH 7,2. Incuber 1 h à 37 °C ; viii) Laver les plaques comme indiqué en ii) ; b) ix) Substrat : ajouter 200 µl/puits de solution de substrat (10 ml de DMAB + 10 ml de MBTH + 5 µl de H2O2). Le développement de la couleur est stoppé en ajoutant 50 µl de H2SO4 3 N, après environ 5 à 10 min (avant que le témoin négatif ne commence à se colorer). D’autres substrats tels que l’ABTS (acide 2,2’-azino-di-[3-éthyl-benzothiazoline]-6-sulphonique), le TMB (tétraméthyl benzidine) ou l’OPD (orthophényldiamine) peuvent aussi être utilisés ; x) Lire les plaques à 600 nm (ou 620 nm) ; xi) Interprétation des résultats : calculer le seuil critique en ajoutant 0,6 à la valeur obtenue pour le témoin négatif (0,6 est la déviation standard calculée sur un ensemble de 30 sérums négatifs). Les sérums donnant une densité optique (DO) inférieure au seuil sont considérés négatifs ; ceux donnant une DO supérieure de +0,15 sont considérés positifs. Les sérums donnant des DO intermédiaires sont suspects et doivent faire l’objet d’une seconde technique pour confirmer le résultat. Immuno-empreinte (immunoblotting) La fixation d’anticorps sur des protéines virales séparées par électrophorèse et transférées sur film de nitrocellulose, a été appliquée à la recherche des anticorps anti-AHSV (20). ! Protocole Des protéines de virus équipestique semi-purifiées sont séparées par SDS/PAGE (électrophorèse sodium dodecyl sulfate/gel de polyacrylamide) dans des gels à 15 % (poids/volume) de DATD (acrylamide-N,N’diallyltartar-diamide). Les protéines séparées sont transférées sur une membrane de nitrocellulose sous un courant constant de 280 mA pendant 6 h à 4 °C. L’immuno-empreinte d’une membrane de nitrocellulose découpée en bande est réalisée avec des sérums dilués à 1/20, une immunoglobuline de lapin anti-globuline de cheval conjuguée à la peroxydase à la dilution de 1/500 et un temps d’incubation de 1 h à 37 °C. Les bandes reconnues par les sérums sont développées par la méthode du 4-chloro-naphtanol. Interprétation des résultats : la comparaison avec les bandes obtenues des sérums témoins positif et négatif permet l’identification des bandes spécifiques du virus. L’apparition d’au moins deux de ces bandes spécifiques avec un sérum posant problème permet de considérer celui-ci comme un sérum positif. c) NS3 ELISA Un ELISA indirect permettant de différencier les chevaux infectés des chevaux vaccinés avec un vaccin inactivé purifié de sérotype 4, utilisant un recombinant de la protéine NS3 comme antigène, a été décrit (21). Les résultats obtenus indiquent que le recombinant NS3 permet de bien différencier les animaux infectés de Manuel terrestre de l’OIE 2008 909 Chapitre 2.5.1. — Peste équine ceux vaccinés par un vaccin inactivé. De ce fait, ce recombinant peut être un réactif de diagnostic essentiel pouvant autoriser le transport des chevaux vaccinés. Pour assurer la fiabilité des résultats, il est fondamental que le vaccin anti-peste équine inactivé soit un vaccin purifié. Il faut s’assurer de l’absence de traces de NS3 car celles-ci stimuleraient la production d’anticorps anti-NS3 chez les chevaux vaccinés, qui risqueraient d’être considérés comme présentant une réponse à une infection naturelle. Ce type d’ELISA pourrait aussi être utile pour distinguer les chevaux infectés de ceux vaccinés avec un vaccin sous-unités dépourvu de protéine NS3. Il convient néanmoins de remarquer qu’aucun vaccin inactivé n’est commercialisé à l’heure actuelle. d) Fixation du Complément (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) La fixation du complément (FC) a été largement utilisée, mais en raison du pouvoir anti-complémentaire de certains sérums et des bons résultats donnés par l’ELISA, elle est quelque peu délaissée. La FC est surtout utilisée pour la recherche des anticorps anti-AHSV spécifiques de groupe. Un extrait sucrose/acétone de cerveau de souris est communément utilisé comme antigène. ! Réactifs i) Tampon salin véronal contenant 1 % de gélatine (VBSG) ; ii) Les sérums, exempts d’érythrocytes, doivent être inactivés par la chaleur : à 56 °C pour le cheval, 60 °C pour le zèbre, 62 °C pour l’âne, pendant 30 min ; iii) L’antigène est un extrait sucrose/acétone de cerveau de souris infectée par le virus. Le témoin antigène est du cerveau de souris non infecté extrait de la même façon. En l’absence d’un sérum étalon international, l’antigène doit être titré avec un sérum témoin positif préparé localement. Dans le test, 4 à 8 unités antigéniques sont utilisées ; iv) Le complément est un sérum normal de cobaye ; v) L’hémolysine est un sérum de lapin anti-globules rouges de mouton (GRMs) ; vi) Les GRMs sont obtenus par ponction stérile de la veine jugulaire et conservés en solution d’Alsever ou en citrate de sodium ; vii) Le système hémolytique (SH) est préparé en diluant l’hémolysine pour obtenir 2 doses hémolytiques et en utilisant cette dilution pour sensibiliser les GRMs lavées. Les GRMs sont normalisées à une concentration de 3 % ; 1 viii) Sérums témoin : un sérum témoin positif est obtenu localement et validé. Un sérum provenant d’un cheval en bonne santé et dépourvu d’anticorps est retenu comme témoin négatif. e) ! Protocole i) Les sérums, le complément et l’antigène sont répartis dans des plaques de micro-titrage à fond rond, ou dans des tubes si la macro-technique est choisie, puis incubés à 4 °C pendant 18 h ; ii) Les GRMs (3 %) sensibilisés sont ajoutés dans tous les puits de la plaque ; iii) La plaque est incubée à 37 °C pendant 30 min ; iv) Les plaques sont alors centrifugées à 200 g, et les puits sont examinés pour juger de l’hémolyse ; v) Les témoins suivants sont utilisés : (a) sérum et complément ; (b) sérum et GRMs ; (c) antigène FC et témoin antigène chacun avec 4 CH50 (50 % unité hémolytique de complément), 2 CH50 et 1 CH50 de complément ; (d) antigène FC et GRMs ; (e) témoin antigène et GRMs ; (f) dilutions de complément de 4 CH50, 2 CH50, et 1 CH50 ; (g) GRMs ; vi) Les résultats sont lus en retenant l’hémolyse à 50 % comme seuil. L’inverse de la plus haute dilution de sérum fixant spécifiquement le complément avec l’antigène FC, constitue le titre ; vii) Un titre de 1/10 ou plus est considéré positif, négatif si inférieur à 1/10. Séroneutralisation virale La séroneutralisation du virus permet de détecter les anticorps spécifiques de type (14, 15). Elle présente aussi un intérêt pour la surveillance épidémiologique et les études de transmission, notamment dans les régions d’enzootie où plusieurs sérotypes sont susceptibles de circuler (27). 1 910 Dextrose : 20,5 g (114 mM) ; citrate de sodium 2H2O : 7,9 g (27 mM), NaCl : 4,2 g (71 mM) ; H2O qsp 1 litre. Ajuster le pH avec de l’acide citrique 1 M. Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.1. — Peste équine ! Protocole i) Le virus stock est dilué de façon à obtenir 100 DICT50 (Dose de virus infectant 50 % de la culture tissulaire) avec un éventail allant de 30 à 300 DICT50 dans 25 µl, et 25 µl sont ajoutés à chacun de 4 puits de plaque de micro-titrage contenant 25 µl de dilutions de sérum. Pour réaliser une épreuve de dépistage, une dilution finale de 1/10 est utilisée. Des dilutions de 2 en 2 sont utilisées pour les titrages. ii) Les mélanges sérums/virus sont incubés à 37 °C pendant 60 min avant l’addition de 0,1 ml de suspension de cellules Vero (200 000 cellules/ml) dans chaque puits. iii) Un titrage de confirmation du virus stock est préparé pour chaque épreuve en utilisant 4 puits par dilution de 10 en 10, 25 µl par puits. Les plaques sont incubées à 37 °C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité pendant 4 à 5 jours, jusqu’à ce que le titrage de vérification indique que le virus stock contient de 30 à 100 DICT50. iv) Les plaques sont alors fixées et colorées par une solution à 0,15 % (poids/volume) de cristal violet dans 2 % (v/v) de glutaraldéhyde, puis sont rincées. En alternative, elles peuvent être fixées à l’éthanol à 70 % et colorées avec de la fuschsine basique à 1 %. v) Le titre au point 50 % du sérum est calculé par la méthode de Spearman-Kärber et exprimé en log10 négatif. C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Des vaccins polyvalents ou monovalents vivants atténués de la PE, issus de la sélection en culture de cellules Vero de macro-plaques génétiquement stables, sont disponibles dans le commerce auprès de Onderstepoort Biological Products, Onderstepoort, Afrique du Sud (8). Un vaccin monovalent inactivé (anti-sérotype 4) préparé par purification du virus et inactivation au formol a été produit, mais n’est pas disponible à l’heure actuelle (5, 16). Les exigences à la fois pour les vaccins atténués et inactivés sont résumées ci-dessous. Les prescriptions pour la production des vaccins à usage vétérinaire sont données au Chapitre 1.1.8., « Principes de fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les instructions données ici et dans le Chapitre 1.1.8. ont une portée générale et peuvent être complétées par des exigences nationales et régionales. C1. Vaccin équipestique atténué 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale Elle est issue de la sélection, en cellules Vero, de grandes plaques génétiquement stables apparues après un petit nombre de passages de l’AHSV. Les mutants « plaque » sont multipliés par 3 passages supplémentaires sur cellules Vero. Une grande quantité de cet antigène est alors lyophilisée et stockée à –20 °C en tant que stock de semence antigène. b) Méthode de culture Le virus semence est produit en culture de cellules Vero en flacons roulants. c) Validation de la semence candidate comme semence vaccinale Le virus semence doit se révéler exempt de virus contaminants, de bactéries et de mycoplasmes, suite à la mise en œuvre des techniques appropriées. L’identité du sérotype doit être confirmée. 2. Méthode de fabrication En début de fabrication, les antigènes choisis sont produits à partir du stock de semence antigène, en culture soit de cellules BHK-21 soit de cellules Vero. Les antigènes dits « de travail » sont testés pour leur 6 stérilité, pureté et identité ; ils doivent renfermer au moins 1 × 10 unités formant plaque (UFP)/ml de virus infectieux. Manuel terrestre de l’OIE 2008 911 Chapitre 2.5.1. — Peste équine Des cultures de cellules Vero ou BHK-21 en flacons roulants sont réalisées en utilisant du sérum bovin traité par des radiations gamma, dans le milieu de culture. Une fois les cultures confluentes, le milieu est éliminé et les cellules sont ensemencées avec les antigènes de travail. Après 1 h, le milieu d’entretien est ajouté aux cultures. L’incubation est poursuivie à 37 °C pendant 2 à 3 jours. Lorsque l’ECP est bien développé, les cellules ainsi que le surnageant sont récoltés. Les produits issus d’un même sérotype sont mélangés et stockés à 4 °C. 3. Contrôles en cours de fabrication Les récoltes de chaque sérotypes subissent individuellement un contrôle de stérilité et un titrage sur cellules Vero en plaques de titrage. Le titre minimum acceptable est de 1 × 106 UFP/ml. Finalement, deux vaccins quadrivalents sont préparés en mélangeant respectivement des volumes égaux de sérotypes 1, 3, 4, 5 et 2, 6, 7, 8. Par la suite, le sérotype 5 fut retiré de ce vaccin. Un vaccin monovalent peut aussi être préparé. Après addition d’un stabilisant convenable, le vaccin est distribué sous un volume de 1,0 ml en flacon de verre et lyophilisé. 4. Contrôles des lots a) Stérilité Suite à la lyophilisation, 5 flacons de vaccin, prélevés au hasard, sont contrôlés pour la stérilité par les méthodes reconnues internationalement. Les tests de stérilité et d’absence de contaminations des produits biologiques sont décrits au Chapitre 1.1.9., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ». b) Innocuité L’innocuité d’un vaccin est déterminée par inoculation du vaccin reconstitué à la souris (0,25 ml par voie intra-péritonéale), au cobaye (1,0 ml par voie intra-péritonéale) et au cheval (5,0 ml par voie sous-cutanée). Tous les animaux sont observés quotidiennement pendant 14 jours. La température rectale du cheval est prise 2 fois par jour pendant 14 jours et ne doit jamais dépasser 39 °C. c) Activité L’activité repose grandement sur la concentration virale du vaccin. La dose immunisante minimum pour chaque sérotype est d’environ 1 × 103 UFP/dose. Le titre infectieux du produit fini est déterminé par titrage sur plaque en culture de cellules Vero et doit être d’au moins 1 × 105 UFP/dose. Le cheval utilisé pour le test d’innocuité est aussi utilisé pour déterminer l’immunogénicité du vaccin. Des prélèvement de sang sont effectués le jour de la vaccination et 21 jours plus tard ; ils sont soumis à une recherche des anticorps neutralisant pour chacun des sérotypes par l’épreuve de réduction des plages utilisant des dilutions de 2 en 2 du sérum et environ 100 UFP de virus. Le cheval doit donner un titre d’anticorps neutralisants d’au moins 20, vis-à-vis d’au moins trois des quatre sérotypes du vaccin quadrivalent. d) Durée de l’immunité La durée de l’immunité n’est pas évaluée pour chaque lot de vaccin, mais l’immunité est connue pour persister au moins 4 ans. Cependant, en raison d’une possible interférence entre les sérotypes dans chacun des vaccins quadrivalents, un rappel annuel est conseillé dans les régions d’enzootie. La vaccination à l’aide du vaccin monovalent induit une immunité valable pour la vie. e) Stabilité A l’état lyophilisé, le vaccin garde son activité pendant de nombreuses années quand il est conservé entre 4 et 8 °C. Néanmoins une durée de conservation de 2 ans est normalement donnée. 912 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.1. — Peste équine C2. Vaccin équipestique inactivé 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale La semence primaire est la souche vaccinale atténuée (AHSV sérotype 4) largement utilisée en Afrique et en Europe du Sud (des stocks de semence sont disponibles auprès du Laboratoire de référence OIE [Onderstepoort]). Le virus a subi 10 passages sur cerveau de souriceaux nouveau-nés pour son atténuation, puis 10 nouveaux passages en cultures de cellules BHK-21 en tubes roulants. Il a été purifié par plaques, 3 fois, en culture de cellules Vero, par sélection de grandes plaques (4 à 6 mm) aux dilutions limites. Le produit de la plaque finale a été passé une fois sur cerveau de souriceau nouveau-né et 4 fois en cultures de cellules Vero. Le produit a été lyophilisé et représente le lot de semence primaire du virus. b) Méthode de culture Le virus atténué est produit par passage sur culture de cellules BHK-21 en flacons roulants. c) Validation de la semence candidate comme semence vaccinale La semence virale doit être reconnue exempte de contaminants viraux, de bactéries et de mycoplasmes par les techniques appropriées. L’identité du sérotype est confirmée par ELISA double sandwich utilisant un AcM. 2. Méthode de fabrication Le virus est récolté après développement complet de l’ECP. La culture est poursuivie en suspension de cellules dans le milieu de Stocker sans sérum (MEM) à 37 °C. La croissance virale est contrôlée par évaluation de la viabilité cellulaire (ECP), et, quand les conditions optimales sont atteintes, la température de culture du fermenteur est abaissée à 4 °C. La suspension virale est récoltée stérilement. La suspension filtrée du virus atténué est inactivée au formol à une concentration finale de 1/1 000. La suspension est transférée dans un autre récipient et agitée à 4 °C pendant au moins 10 jours pour s’assurer que la totalité du virus soit inactivée. Des contrôles d’inactivation sont effectués. Après inactivation, la suspension antigénique est concentrée par ultrafiltration, puis purifiée par précipitation sélective utilisant le complexe d’oxyde d’éthylène et de cations bivalents, selon la technique brevetée. 3. Contrôles en cours de fabrication Un contrôle d’identité virale par ELISA double sandwich, un titrage du virus sur cellules Vero avant inactivation, une analyse en gradient de sucrose permettant d’estimer la concentration en particules, et des épreuves de stérilité, sont effectués. 4. Contrôle des lots a) Stérilité Les tests de stérilité et d’absence de contamination par des produits biologiques sont décrits au Chapitre 1.1.9. b) Innocuité Des chevaux sensibles à la PE reçoivent par voie intra-musculaire ou sous-cutanée une simple ou une double dose de vaccin. Les températures rectales sont relevées quotidiennement pendant 14 jours et les chevaux sont surveillés cliniquement. Cinq cobayes reçoivent une dose cheval de vaccin par voie intra-musculaire. Les sérums récoltés à J 21 font l’objet d’une recherche d’anticorps par SN. c) Activité Le contrôle d’activité est réalisé par épreuve virulente de chevaux vaccinés. Certains sont vaccinés avec une dose, d’autres avec 2 doses. L’épreuve est effectuée par voie intra-veineuse 77 jours après la première injection. Lorsque 2 injections sont pratiquées, la seconde dose est injectée 21 jours après la première. Manuel terrestre de l’OIE 2008 913 Chapitre 2.5.1. — Peste équine Des prélèvements de sérums sont effectués le jour de la vaccination, puis 21 jours plus tard, et sont soumis à une recherche d’anticorps neutralisants et de virus. d) Durée de l’immunité Aucune épreuve virulente n’a été pratiquée sur le cheval, seules des études sérologiques ont été conduites. Si le taux d’anticorps induit par 2 injections (protocole recommandé sur le terrain) est, 12 mois après la vaccination, équivalent à celui conféré 28 jours après une simple vaccination, les chevaux sont considérés comme protégés. Avec ce principe, la durée de l’immunité est de 1 an, débutant 7 à 10 jours après la première injection. Un rappel annuel est suffisant pour assurer un bon niveau de protection pour les années suivantes. Le protocole de vaccination recommandé par le fabricant est de 2 injections (à 21 jours d’intervalle) et de un rappel 365 jours après la première injection. e) Stabilité Dans la mesure où le vaccin inactivé est relativement un nouveau produit, peu de données sont disponibles sur la durée de sa stabilité. Les résultats disponibles montrent que la stabilité dépasse 3 ans. C3. Vaccin sous-unités équipestique Les protéines de surface de la capside VP2 et VP5 et la protéine interne de capside VP7, issues de simples et de doubles vecteurs d’expression de recombinants baculovirus, ont été utilisées sous différentes combinaisons pour immuniser des chevaux (24). Toutefois, ce vaccin n’est pas commercialisé. Un vaccin expérimental préparé avec des extraits cellulaires bruts contenant les 3 protéines structurales a permis d’obtenir une réponse immunitaire protectrice complète chez des chevaux éprouvés avec un virus PE virulent (106 DICT50). La virémie n’a pas été mise en évidence chez les vaccinés (24). Des analyses supplémentaires de lysats bruts partiellement protecteurs ont révélé que la protéine soluble VP2 seule était capable d’induire des anticorps neutralisants. Il a été possible de définir les sites neutralisants de la protéine virale VP2 pour les sérotypes AHSV 3, 4 et 9 (2, 25, 36) et très récemment, la protection de chevaux immunisés par la protéine recombinante VP2 (AHSV de sérotype 5) adjuvée à la saponine, vis-à-vis d’une épreuve létale a été rapportée (32). Bien que d’autres recherches soient nécessaires pour estimer la durée de l’immunité induite par ces protéines, les données disponibles soulignent l’efficacité de ce candidat vaccin. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. BAYLIS M., MELLOR P.S. & MEISWINKEL R. (1999). Horse sickness and ENSO in South Africa. Nature, 397, 574. 2. BENTLEY L., FEHRSEN J., JORDAAN F., HUISMANS H. & DU PLESSIS D. (2000). 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