CCT Blanc L2SVS MBG

Examen de MBG (Microbiologie générale) LSV2 (2h)
- 15 janvier 2013 -
1/ Les flagelles bactériens (5 points) :
- utilisation pour la classification
- structure chez une bactérie à Gram négatif
- principe de la mobilité chez Escherichia coli
- tactisme : définition et mécanisme
Développez les différents points ci-dessus en vous appuyant sur des schémas soignés et clairement
légendés
2/ Bioremédiation d’un polluant aquatique, le méthyl-tertiobutyl éther (MTBE), par Mycobacterium
Le méthyl-tertiobutyl éther (MTBE) est un additif de l'essence qui contribue à réduire les émissions de
monoxyde de carbone et d'hydrocarbures imbrulés. En raison de sa grande solubilité dans l'eau et de la
fréquence élevée des déversements, le MTBE contamine de nombreux environnements aquifères. Des
chercheurs en microbiologie environnementale recherchent des bactéries capables d’utiliser et de
convertir le MTBE en produits inoffensifs, afin de décontaminer des zones polluées.
2.1/ Isolement de bactéries capables de dégrader le MTBE (1 point)
Q1/ Décrivez le milieu de culture permettant d’isoler des souches bactériennes capables de dégrader le
MTBE. Proposez différents environnements où vous pourriez prélever des échantillons à tester sur le
milieu que vous avez élaboré.
2.2/ Voie de dégradation du MTBE chez Mycobacterium austroafricanum (3 points)
Parmi les différentes espèces bactériennes isolées, les chercheurs s’intéressent plus particulièrement à
Mycobacterium austroafricanum, bactérie capable de dégrader le MTBE.
Afin de connaître la voie de catabolisme de ce composé, les chercheurs réalisent une mutagénèse
aléatoire de M. austroafricanum afin d’isoler des mutants incapables de dégrader le MTBE. Ce travail
permet d’isoler différents mutants (1 à 6) présentant différents profils de croissance sur les
intermédiaires métaboliques de cette voie (Tableau 1).
Q2/ Grâce au Tableau 1, ci-dessous, donnez l’ordre de la voie de catabolisme du MTBE et positionnez les
étapes affectées dans les différents mutants. Justifiez votre réponse avec un exemple.
Tableau 1
Souches
MTBE
2-propanol
TBA
Hydroxyiso-
butyraldehyde
TBF
M1,2-PD
HIBA
Sauvage
+
+
+
+
+
+
+
mutant 1
-
+
-
+
-
+
+
mutant 2
-
+
-
-
-
-
-
mutant 3
-
+
+
+
+
+
+
mutant 4
-
+
-
-
-
-
+
mutant 5
-
+
-
+
-
-
+
mutant 6
-
+
+
+
-
+
+
2.3/ Etude de la fonction des gènes mpdB et mpdC de Mycobacterium austroafricanum dans
l’utilisation du MTBE
Les auteurs isolent et clonent une région du génome de la bactérie portant les gènes mpdB et mpdC.
Afin de comprendre le rôle de ces gènes dans le catabolisme du MTBE, les auteurs disposent de la
bactérie modèle Mycobacterium smegmatis, qui ne métabolise pas le MTBE et du vecteur pCL4D
portant un gène de résistance à la kanamycine (kanR).

Transformation de M. smegmatis (3 points)
Les auteurs souhaitent transformer M. smegmatis avec de l’ADN plasmidique. Cette espèce étant
difficilement transformable par les techniques habituelles, ils décident d’utiliser la technique
d’électroporation. Cette méthode consiste à soumettre une suspension de bactéries à un champ
électrique d’intensité et de durée précise.
Une culture de M. smegmatis en milieu LB est réalisée jusqu’en phase exponentielle de croissance, puis
les cellules sont lavées et resuspendues dans du tampon glycérol (« cellules compétentes »). Puis 100 µL
de ces cellules « compétentes » sont mises en contact avec 25 ng de pCL4D vide. Ce mélange est ensuite
soumis à un champ électrique. 900 µL de milieu de culture LB sont ensuite ajoutés et l’ensemble est
agité à 37°C pendant 2 heures avant étalement de 200 µL sur milieu LB + kanamycine à la dilution
indiquée dans le tableau 2 ci-dessous. Les colonies sont ensuite dénombrées.
Tableau 2
Condition d’électroporation
(intensité et durée du choc
électrique)
Colonies sur LB+Kan :
Dilutions Nombre
Nombre de
transformants
Taux de
transformation
1000 V – 10 msec
10-3 168
1000 V – 20 msec
10-2 250
2000 V – 10 msec
10-6 365
2000 V – 20 msec
10-4 110
Q3/ Calculez (détaillez vos calculs) le nombre de transformants et le taux de transformation obtenus, en
fonction de la durée et de l’intensité du champ électrique. Complétez le tableau.
D’après vos résultats, quelle condition retiendriez-vous pour l’électroporation de M. smegmatis ?
Dégradation de M1,2-PD par différentes souches de M. smegmatis transformées par différents
plasmides. (3 points)
On dispose de 4 souches :
- La souche possédant le plasmide pCL4D vide
- La souche possédant le plasmide pCL4D avec un fragment portant les gènes mpdB et mpdC
- La souche possédant le plasmide pCL4D avec un fragment portant le gène mpdB seul
- La souche possédant le plasmide pCL4D avec un fragment portant le gène mpdC seul
Ces souches sont cultivées et mises en contact avec du M1,2-PD radioactif. Après incubation pendant
10h, un extrait cellulaire est réalisé et la nature des constituants radioactifs est recherchée. Les résultats
sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3
Nature et proportion des composés radioactifs détectés (en %)
10h après contact cellules – M1,2-PD radioactif
M1,2-PD
HIBA
Hydroxy-isobutyraldehyde
Souches
de M.
smegmatis
pCL4D vide
100
0
0
pCL4D avec gènes mpdB et
mpdC
50
20
30
pCL4D avec gène mpdB
50
0
50
pCL4D avec gène mpdC
100
0
0
Q4/ Expliquez ces résultats. En vous appuyant sur la voie catabolique que vous avez caractérisée
précédemment, précisez la fonction des protéines codées par les gènes mpdB et mpdC.