SB-DB en UV

Document janvier 2010
Simple faisceau / double faisceau – Spectro UV-Vis
Q : Y-a-t-il aussi simple faisceau et double faisceau dans un spectromètre UV-Visible ?
R : Dans tout système optique de spectromètre d’absorption, atomique ou moléculaire, dans lequel on
mesure l’absorption d’un rayonnement à travers une cellule de mesure, on retrouve le même souci de
garantir une mesure d’absorbance fiable dans le temps, quelle que soit la source d’excitation utilisée,
soit :
A = log I
0 /
I
t
En spectrométrie d’absorption moléculaire UV-Visible, il existe une proportion importante d’appareils
“simple faisceau” qui cohabitent avec les “double faisceau” ; chaque technologie a sans doute sa
raison d’être.
L’optique simple faisceau
La figure ci-dessus représente un appareil simple faisceau : l’énergie issue de la lampe est tout
d’abord rendue monochromatique à travers un monochromateur (ici réseau et fente de sortie), puis
traverse la cellule de mesure avant de rejoindre le détecteur.

Document janvier 2010
Cas de la lecture d’absorbance à longueur d’onde fixe :
C’est le cas le plus courant des applications de la technique ; pour effectuer la mesure d’absorbance
sur un étalon ou échantillon, il faut d’abord sélectionner la longueur d’onde de mesure, puis présenter
un blanc dans la cellule et effectuer un « zéro » : l’intensité du faisceau incident I
0
reçue est alors
« mémorisée » ; lorsque l’échantillon ou l’étalon est présenté, l’intensité I
t1
du même faisceau est
mesurée, et l’absorbance calculée par la formule :
A
1
= log I
0 /
I
t1
Lorsque les étalons ou échantillons suivants sont présentés, leurs lectures I
t2,
I
t3,
I
t4,
etc..sont mesurées
et les absorbances A
2,
A
3,
A
4,
etc.. déduites du même type d’équation, avec le même I
0
! Le problème
est que rien ne prouve que ce I
0
reste le même tout au long des mesures : c’est totalement
improbable ! Pour garantir chaque mesure, il faudrait refaire un « zéro » périodiquement, de manière à
ce que la valeur d’absorbance soit chaque fois calculée avec une valeur « actualisée » de I
0
…Cela
peut être contraignant, d’autant que l’on ne sait pas adopter une fréquence de « re-zéro ». La dérive
de l’intensité du faisceau I
0
dépend de plusieurs facteurs :
- type de lampe : deutérium, xénon, quartz-iode,…
- âge de la lampe,
- courant de lampe,
- temps de préchauffage de la lampe
La dérive non contrôlée de I
0
provoque donc une variation aléatoire de la valeur du zéro
d’absorbance, une difficulté pour la mesure de signaux très faibles.
Il s’agit donc bien du principal inconvénient de l’optique simple faisceau.
Cette technologie est donc utilisée principalement dans les appareils de bas prix (mesure simple de
« couleur », petit nombre d’échantillons)
Cas de tracé de spectre d’absorption
Peut-on effectuer un « scan » avec un appareil simple faisceau ? Automatiquement non, mais
pourquoi pas avec de la patience..
Pour effectuer cela, par exemple entre 300 et 400 nm en absorbance, il faut définir le nombre de
points nécessaires pour retracer un spectre suffisamment précis (dépend de la finesse des bandes
d’absorption à observer) ; par exemple 1 point tous les 5 nm « pour voir » : nous avons donc 20
mesures d’absorbance à faire et pour chacune d’elle : changer la longueur d’onde, effectuer le zéro
sur le blanc, lire d’absorbance sur l’échantillon, puis déplacer la longueur d’onde de 5 nm, et refaire un
zéro sur le blanc, lire d’absorbance sur l’échantillon, etc…Oui, l’énergie de la source change avec la
longueur d’onde, il est donc indispensable de « re-mémoriser » le nouveau I
0
à chaque fois !
Fastidieux avec le simple faisceau ! De plus il faudra entrer les valeurs des paires longueur
d’onde/absorbance dans un logiciel de calcul de courbes…et peut-être tout reprendre si la définition
du spectre obtenu n’est pas suffisante (tous les 5 nm à refaire tous les 2, ou même 1 nm !!)

Document janvier 2010
L’optique double faisceau
La figure ci-dessus représente la version double faisceau de l’appareil simple faisceau précédent : il
s’agit d’un appareil avec cellule de référence (il existe des appareils double faisceau sans cellule de
référence) : le faisceau monochromatique passe à travers un disque tournant contenant 3 secteurs :
un secteur « vide », un secteur « noir » opaque et un secteur « miroir » : lorsque le faisceau traverse
le secteur vide, il se rend directement dans la cellule de mesure ou se trouve l’échantillon ou l’étalon à
mesure, et se déplace vers un second disque tournant appairé avec le premier, mais en déphasage, il
rencontre alors le secteur « miroir »qui le renvoie directement vers le détecteur où est mesuré le I
t
.
Quelques millisecondes plus tard (dépend de la vitesse de rotation des secteurs tournants) les
secteurs tournants se sont décalés d’un tiers, et le premier passe en « miroir » pour envoyer le
faisceau à travers la cellule de référence où se trouve le blanc, puis à travers la portion « vide » du
secteur tournant pour arriver à son tour au détecteur où est mesuré I
0
. L’absorbance A peut alors être
calculée à la longueur d’onde demandée. Si l’appareil doit effectuer une série de mesures à
différentes longueurs d’onde pour faire un spectre d’absorption, alors, selon ce qui a été programmé
dans l’appareil le monochromateur se déplace rapidement de l’intervalle de longueur d’onde demandé
(en nm) pendant que les secteurs tournants obturent tous deux le faisceau à l’aide du secteur « noir ».
Puis le monochromateur s’immobilise et le cycle de mesure recommence…Les paramètres principaux
à préciser à l’appareil avant la mesure sont donc l’intervalle entre chaque longueur d’onde à explorer,
la plage à observer et le temps de mesure sur chaque point.
On mesure alors toute l’importance d’un appareil double faisceau dans ce dernier cas.
C’est certainement dans ce cas que le double faisceau rend le plus grand service
Pour la mesure d’absorbances à longueurs d’onde fixes, l’intérêt du double faisceau sera d’éliminer
les fluctuations ou la dérive en intensité de la lampe en fonction du temps : un appareil double
faisceau verra son zéro stable pendant des heures, après une période de préchauffage de lampe de
quelques minutes .

Document janvier 2010
Cellule de référence ?
Quelques appareils double faisceau ne possèdent pas de cellule de référence, alors à quoi sert cette
cellule ?
L’intérêt de la présence d’une cellule de référence contenant le blanc de réaction n’est indispensable
que si l’absorbance du blanc n’est pas constante dans le temps, par exemple dans certaines réactions
enzymatiques, ou dans le cas de cuves thermostatées, le réactif ajouté pour déclencher la réaction
qui permet la mesure provoque une absorbance non nulle, qui évolue avec le temps : la présence de
la cellule de référence permet de tenir compte de cette variation en permanence. En l’absence de
cellule de référence, il serait nécessaire de repasser le blanc de réaction périodiquement pour
demander un zéro (réactualiser la valeur de I
0
).
Dans le cas de mesures où le blanc n’évolue pas (majorité des cas), il n’est pas utile de mettre en
place un blanc en permanence dans la cellule de référence, cela vous oblige à mettre également un
blanc dans la cellule de mesure pour faire le zéro : faites le zéro avec le blanc dans la cellule de
mesure, celui-ci sera effectué par rapport à une cellule de référence vide, sans cuve ni réactif. Le seul
cas où la présence d’une cellule de référence contenant le blanc est utile se trouve dans la situation
où le blanc référence (qui se retrouve aussi dans l’échantillon à mesurer) provoque une absorbance
élevée (par exemple > 0.500) Dans ce cas en effet la justesse de mesure est plus grande si le rapport
des absorbances entre l’échantillon et la référence et minimisé.