FIEVRE DE WEST NILE

1168 Manuel terrestre de l’OIE 2005
CHAPITRE 2.10.7.
FIEVRE DE WEST NILE
RÉSUMÉ
Le virus de la fièvre de West Nile (WNV pour West Nile virus) est un membre du genre Flavivirus
appartenant à la famille Flaviviridae. Cet arbovirus se maintient dans la nature en circulant de
manière cyclique chez les oiseaux et les moustiques ; de nombreuses espèces d’oiseaux et de
moustiques assurent la réplication de ce virus. Pour de nombreuses espèces aviaires, l'infection
par le WNV ne cause aucun signe manifeste tandis que d'autres oiseaux, tels que les corneilles
américaines (Corvus brachrhynchos) et les geais bleus (Cyanocitta cristata), succombent à une
maladie systémique mortelle. Parmi les mammifères, la maladie se déclare principalement chez les
chevaux et les humains.
Chez les chevaux, les signes cliniques induits par l'infection par le WNV correspondent à une
encéphalite ou à une encéphalomyélite virale. Les infections sont transmises par les moustiques et
sont saisonnières dans les climats tempérés, avec un pic au début de l’automne dans l'hémisphère
Nord. Les chevaux affectés montrent fréquemment une ataxie légère à sévère. Les signes cliniques
peuvent aller d’une incoordination légère au décubitus. Quelques chevaux présentent également
un affaiblissement, des tremblements musculaires, et des déficits des nerfs crâniens. La fièvre n'est
pas un facteur de la maladie uniformément présent chez les chevaux.
Identification de l'agent pathogène : les tissus aviaires contiennent généralement des
concentrations plus élevées de virus que les tissus équins. Le cerveau et la moelle épinière sont
les tissus de prédilection pour l'isolement du virus chez les chevaux. Chez les oiseaux, le rein, le
cœur, le cerveau ou l'intestin peuvent contenir le virus. Les cultures de cellules de rein de lapin ou
les cellules Vero sont le plus généralement employées pour l'isolement du virus. Le WNV induit un
effet cytopathogène (ECP) dans les cultures cellulaires sensibles à l’infection. L'acide nucléique
viral et les antigènes viraux peuvent être détectés dans les tissus des animaux infectés par la
technique de la transcription inverse couplée à une réaction d'amplification en chaîne par
polymérase (RT-PCR) et par immunohistochimie. La méthode la plus sensible pour identifier le
WNV dans les tissus équins est une RT-PCR nichée.
Épreuves sérologiques : les anticorps contenus dans le sérum équin peuvent être identifiés par
une méthode immuno-enzymatique (ELISA) de capture d'IgM ou d’IgG, une inhibition de
l’hémagglutination (IH), ou par une séroneutralisation par réduction de plages (PRN). Les
méthodes IH et PRN sont les plus généralement employées pour identifier les anticorps dans le
sérum aviaire. Des réactions sérologiques croisées avec des flavivirus apparentés, tels que le virus
de l’encéphalite de St-Louis ou le virus de l’encéphalite japonaise, peuvent survenir.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
deux vaccins contre le WNV sont disponibles pour utilisation chez les chevaux : un vaccin inactivé
au formol et dérivé d’une culture de tissus et un vaccin vivant utilisant le canarypoxvirus comme
vecteur.
A. INTRODUCTION
Le virus de la fièvre de West Nile (WNV) est un arbovirus transmis par les moustiques qui appartient au genre
Flavivirus de la famille Flaviviridae. Le genre Flavivirus contient également d’autres virus tels que ceux de
l'encéphalite japonaise (voir le Chapitre 2.2.15.), de l’encéphalite de St-Louis, et le virus de Kunjin (5). Le WNV a
une large répartition géographique incluant des régions d'Afrique, d'Asie, d'Australie, d'Amérique du Nord et
d’Europe. La dispersion ainsi que la réintroduction du virus à partir de secteurs enzootiques vers des régions qui

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subissent des épizooties sporadiques s’effectueraient par les oiseaux migrateurs (5). Le WNV se maintient grâce
à un cycle de transmission moustique-oiseau-moustique, tandis que les humains et les chevaux sont des culs-de-
sac épidémiologiques. L'analyse génétique des isolats divise les souches en 2 clades. Les isolats de la lignée
1 sont isolés en Afrique centrale et du nord, en Amérique du Nord, en Australie (virus de Kunjin), en Europe, en
Inde et en Israël. Les souches de la lignée 2 sont enzootiques à Madagascar et en Afrique australe et centrale
avec une cocirculation des 2 lignées du virus en Afrique centrale (2, 6). Les souches de chaque lignée sont
responsables des maladies humaines et animales tandis que les épidémies humaines et équines récentes sont
provoquées par des virus appartenant à la lignée 1.
Le virus de la fièvre de West Nile a été identifié comme étant un organisme pathogène humain en Afrique durant
la première moitié du 20e siècle. Bien que plusieurs épidémies de fièvre de West Nile aient été décrites,
l'encéphalite comme conséquence de l’infection humaine n’a que rarement été décrite avant 1996, mais depuis
lors, des épidémies d'encéphalite humaine causées par le WNV ont été rapportées en Roumanie, Russie, Israël
et Amérique du Nord (3, 10, 11). Pendant les années 1960, la fièvre de West Nile chez les chevaux a été
signalée en Égypte et en France (17, 19). Depuis 1998, des manifestations de fièvre de West Nile ont été
rapportées en Italie, en France, et en Amérique du Nord (7, 14, 15). En Amérique du Nord, de 1999 à 2002, la
répartition géographique du virus s’est nettement agrandie partant d'une région discrète le long de la côte Est de
l'État de New York pour inclure la majeure partie des États-Unis d'Amérique continentaux (USA), et le Canada,
avec une augmentation du nombre de chevaux et d'oiseaux sauvages affectés chaque année (15, 16, 22).
La période d'incubation de la fièvre de West Nile est estimée de 3 à 15 jours après la transmission par les
moustiques. Une virémie passagère accompagnée d’un faible titre de virus précède le début de la phase clinique
(4, 19). La fièvre de West Nile se produit seulement chez 1 % des chevaux infectés ; la majorité des chevaux
infectés ne présente pas de signes cliniques (15). La maladie chez les chevaux est fréquemment caractérisée par
une ataxie allant de légère à sévère. De plus, les chevaux peuvent présenter des signes de faiblesse, de
tremblements musculaires et des déficits des nerfs crâniens (7, 15, 16, 20). La fièvre n’est pas présente de
manière systématique. Le traitement est symptomatique et les signes cliniques peuvent progresser jusqu’à un
décubitus final. Le taux de mortalité est approximativement de 1 sur 3 chevaux cliniquement affectés. Le
diagnostic différentiel inclut d'autres encéphalites arbovirales (par exemple, les encéphalomyélites équines
vénézuélienne, de l’Est ou de l’Ouest et l’encéphalite japonaise), la myélite équine protozoaire (Sarcocystis
neurona), l’herpesvirus équin 1, la maladie de Borna et la rage.
Bien que beaucoup d'espèces aviaires, y compris les poulets, soient résistantes à la maladie, l'infection est
généralement mortelle chez les oiseaux sensibles à l’infection. Les oiseaux peuvent présenter des signes
nerveux avant la mort (21). Le WNV a été associé à une maladie sporadique dans un nombre restreint d'autres
espèces, notamment chez les écureuils, les tamias, les chauves-souris, les chiens, les chats, les rennes, les
moutons, les alpacas, les alligators et chez un phoque commun pendant des périodes d’intense activité virale
localement. La plupart des infections humaines se produisent lors d’une transmission normale par les
moustiques, mais des infections acquises en laboratoire ont été rapportées. Dans des cas cliniquement suspects,
les échantillons destinés au diagnostic de tous les animaux, en particulier les oiseaux, devraient être manipulés
dans un laboratoire de confinement de niveau 3 (voir le Chapitre I.1.6., « La biosécurité au laboratoire de
microbiologie vétérinaire ») (18).
En raison de l'existence d’infections inapparentes par le WNV, les critères de diagnostic impliquent une
association de l’évaluation clinique et de l'analyse de laboratoire.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l'agent pathogène
a) Culture
Les prélèvements pour l'isolement du virus comprennent le cerveau et la moelle épinière des chevaux
atteints d’encéphalites (15, 16) ; divers prélèvements de tissus d'oiseau comprenant le cœur, le cerveau ou
l'intestin peuvent également être utilisés avec succès (21). En général, l’isolement du virus est obtenu plus
facilement à partir d’échantillons aviaires. Le virus peut être propagé sur des cultures de cellules sensibles,
telles que les cellules de rein de lapin (RK-13) et les cellules de rein du singe vert africain (Vero), ou encore
des œufs embryonnés de poulet. Les inoculations intracérébrales de souriceaux nouveau-nés sont moins
efficaces pour isoler le virus à partir de tissus de mammifères que les méthodes de culture de cellules. En
culture de cellules, plus d'un passage doit être effectué pour observer un effet cytopathogène (ECP). La
confirmation de l’isolement du WNV est réalisée par un marquage indirect par des anticorps fluorescents sur
les cultures de cellules infectées ou par des méthodes de détection de l’acide nucléique (voir ci-dessous).

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b) Méthodes immunologiques
Le marquage immunohistochimique (IHC) de tissus aviaires après fixation au formol est une méthode fiable
pour l'identification de l'infection du WNV chez les oiseaux. La spécificité de l'identification (par exemple,
spécifique des flavivirus ou spécifique du WNV) dépend du choix de l'anticorps détecteur. Les tissus du
cerveau et de la moelle épinière des chevaux atteints de la fièvre de West Nile ne sont pas positifs dans les
tests IHC ; environ 50 % des cas de fièvre de West Nile équine donnent des résultats faux-négatifs.
L’absence d’identification d’un antigène du WNV dans le système nerveux central équin ne permet pas
d’exclure la présence de l'infection.
c) Méthodes d'identification de l’acide nucléique
La détection de l’acide nucléique par la technique de la transcription inverse couplée à une réaction
d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) augmente de manière significative l'identification des
tissus infectés par le WNV, plus particulièrement quand une PCR nichée est réalisée sur des échantillons
équins, frais et non fixés, de cerveau et de moelle épinière (12). La méthode de RT-PCR nichée pour
détecter l'acide nucléique du WNV codant une partie du gène E est décrite ci-dessous. Cette méthode,
développée en utilisant un isolat nord-américain de 1999, a permis de détecter l'ARN du WNV à partir de
tissus animaux lors de récentes épizooties nord-américaines. Le virus de l’encéphalite de St Louis n'est pas
détecté par cette méthode. Les virus de la fièvre de West Nile, appartenant à la lignée 1, de Chine, de
France, d'Égypte, d'Israël, d'Italie, du Kenya, du Mexique et de Russie montrent une séquence nucléotidique
fortement conservée dans la région ciblée, indépendamment de l'espèce d'origine. L'analyse de la séquence
pour la souche Ouganda 1937 (GenBank M12294), appartenant à la lignée 2, dans la région visée par les
amorces de PCR indique qu’il n’y aurait pas amplification pour les souches du WNV de la lignée 2. D'autres
virus du sérogroupe de l’encéphalite japonaise n'ont pas été examinés. Les méthodes non nichées, y
compris la PCR en temps réel, présentent moins de risques de contamination transversale en laboratoire et
peuvent être appliquées avec succès aux échantillons de tissus aviaires (13). Les tissus choisis pour la PCR
sont identiques à ceux choisis pour l’isolement viral.
• Technique de la transcription inverse couplée à une réaction d'amplification en chaîne niche par
polymérase (RT-nPCR)
La RT-nPCR décrite ici comprend plusieurs procédures : l’extraction de l’ARN, la transcription inverse pour
produire de l'ADN à partir de l’ARN et la première étape de la PCR, la deuxième étape de la PCR en
utilisant les amorces « nichées », et la détection de l'amplicon de taille appropriée par migration dans un gel
d'électrophorèse. Les régions de 445 et 248 pb (paire de bases) du gène codant la protéine E du WNV sont
respectivement amplifiées dans la première étape de la PCR et PCR nichée. Les trousses de diagnostic et
les réactifs décrits ci-dessous sont fournis comme exemple. Des produits équivalents peuvent être
disponibles par d'autres sources. Une précaution extrême en manipulant tous les matériaux et l’utilisation de
témoins appropriés sont essentiels pour assurer des résultats précis. Les précautions à prendre ont été
couvertes dans le Chapitre I.1.4., « Validation et contrôle qualité des méthodes d'amplification en chaîne par
polymérase (PCR) utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses ». Des échantillons en double de
chaque prélèvement devraient être traités et examinés pour augmenter la confiance des résultats de
l’analyse. Il faut respecter les précautions appropriées lors de manipulation de réactifs dangereux tels que le
bromure d'éthidium.
• Extraction de l’ARN viral
De 50 à 100 mg de tissus sont utilisés pour extraire l’ARN total avec le réactif Trizol® (Life Technologies,
Grand Island, NY, USA) selon les instructions du fabricant. Parallèlement de l’ARN total est extrait d’un
stock témoin du WNV contenant 10-100 DICC50 (dose infectieuse pour 50 % d’une culture de cellules) pour
un volume de 100 µl.
• Transcription inverse et première étape PCR
Amorces de la première étape :
1401: 5’-ACC-AAC-TAC-TGT-GGA-GTC-3’
1845: 5’-TTC-CAT-CTT-CAC-TCT-ACA-CT-3’
i) Dissoudre les échantillons d’ARN extraits dans 12 µl d’eau purifiée de toute RNase.
ii) Dénaturer à 70°C pendant 10 min.
iii) Ajouter 2 µl de chaque échantillon d’ARN dénaturé à 48 µl de mélange RT-PCR dont la composition
finale est de :

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10 mM de Tris/HCl, pH 8,3
50 mM de KCl
2,0 mM de MgCl2
0,8 mM de mélange de déoxynucléoside triphosphate (dNTP)
25 unités de M-MLV (Moloney murine leukaemia virus) RT
1,25 unités d’inhibiteur de RNase
1,25 unités d’AmpliTaq GoldTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
37,5 pmol d’amorces de la première étape.
Inclure des témoins négatifs en utilisant 2 µl d’eau purifiée de toute RNase à la place de l’ARN
dénaturé.
iv) Incuber les tubes de réaction à 45°C pendant 45 min.
v) Incuber les tubes de réaction à 95°C pendant 11 min.
vi) PCR de 35 cycles :
Dénaturation à 95°C pendant 30 secondes,
Hybridation des amorces à 55°C pendant 45 secondes,
Elongation des amorces à 72°C pendant 60 secondes, (pour le 35e cycle, élongation des amorces à
72°C pendant 5 min).
vii) Laisser les échantillons à 4°C jusqu’à la deuxième étape de la PCR
• Seconde étape PCR (nichée)
Amorces de la deuxième étape:
1485: 5’-GCC-TTC-ATA-CAC-ACT-AAA-G-3’
5’-CCA-ATG-CTA-TCA-CAG-ACT-3’
i) Pour chaque échantillon et témoin, ajouter 1,5 µl du produit de la première étape d’amplification dans :
48,5 µl du mélange de PCR avec une composition finale de :
10 mM de Tris/HCl, pH 8,3
50 mM de KCl
2,0 mM de MgCl2
0,8 mM d’un mélange de déoxynucléoside triphosphate (dNTP)
1,25 unités d’AmpliTaq GoldTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
37,5 pmol de chaque amorce niche.
ii) Incuber les tubes de réaction à 95°C pendant 11 min.
iii) PCR de 35 cycles :
Dénaturation à 95°C pendant 30 secondes,
Hybridation des amorces à 55°C pendant 45 secondes,
Elongation des amorces à 72°C pendant 60 secondes, (pour le 35ème cycle, élongation de l’amorce à
72°C pendant 5 min).
iv) Laisser les échantillons à 4°C ou –20°C jusqu’à l’électrophorèse.
• Analyse des produits de PCR par migration en gel d’électrophorèse
i) Préparer une solution d’agarose 2,5 % NuSieve® 3/1 (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, USA) dans
du Tris/borate 0,045 mM, pH 8,6, EDTA 1,5 mM (acide tétra-acétique de diamine d'éthylène)
(1x tampon TBE). Faire bouillir l'agarose sur une plaque chauffante ou dans un four à micro-ondes
jusqu'à ce qu’elle soit complètement dissoute. Refroidir l'agarose à 45-55°C. Ajouter 5 µl de bromure
d'éthidium (10 mg/ml) pour 100 ml d'agarose chaude et couler le gel d'agarose avec un peigne. Laisser
solidifier et ensuite retirer le peigne.
ii) Ajouter 30 µl de la solution de bromure d'éthidium (10 mg/ml) pour 600 ml du tampon TBE 1x. Placer le
gel dans l’appareil d’électrophorèse et remplir le réservoir de tampon.
iii) Mélanger 15 µl de chaque échantillon et témoin avec 5 µl de solution de chargement du gel (par
exemple, produit G-2526, Sigma, St Louis, MO, USA). Ajouter le marqueur de poids moléculaire de
100 pb (par exemple, Life technologies, Grand Island, NY, produit 15268-019, USA, s'étendant de
100 à 1 500 pb) dans au moins un puits du gel. Charger les échantillons dans les puits d'agar et lancer
l’électrophorèse à 65-75 volts jusqu'à ce que le colorant de chargement de gel ait parcouru
approximativement 2/3 de la longueur du gel.
iv) Visualiser et photographier le gel sous une lumière ultraviolette.

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• Interprétation du résultat
Pour que l’analyse par PCR soit valide, les témoins positifs doivent montrer une bande de taille appropriée
(248 pb). Les témoins « no ARN » ne devraient pas présenter de bande. Les échantillons sont considérés
comme positifs s'il y a une bande de la même taille que le témoin positif. Les échantillons doubles doivent
présenter la même réaction. S'il y a une disparité, l'analyse devrait être répétée, en commençant par
l'extraction à partir du tissu. Si davantage de validation est exigée, le produit final de la PCR nichée peut
être séquencé et comparé aux séquences du WNV publiées et disponibles dans GenBank.
2. Épreuves sérologiques
Les anticorps peuvent être identifiés dans le sérum équin par technique immuno-enzymatique (ELISA) de capture
IgM, par inhibition de l’hémagglutination (IH), par ELISA IgG ou par séroneutralisation par réduction des plages
(PRN) (1, 9). L’ELISA de capture IgM décrit ci-dessous est particulièrement utile pour détecter les anticorps
résultant d’une exposition naturelle et récente au WNV. Les IgM équines spécifiques du WNV sont habituellement
détectables à partir de 7 à 10 jours jusqu’à 1 à 2 mois après l’infection. La plupart des chevaux sont positifs en
ELISA de capture IgM pour la fièvre de West Nile lorsque les premiers signes cliniques sont observés. Les
anticorps neutralisant le WNV sont détectables dans les sérums équins, 2 semaines après l’infection et peuvent
persister pendant plus d’une année. Les méthodes d’IH et de PRN sont le plus généralement employées pour
identifier les anticorps anti-WNV dans les sérums aviaires. Dans certaines analyses sérologiques, des réactions
croisées avec des flavivirus apparentés, tels que le virus de l'encéphalite de St Louis ou le virus de l'encéphalite
japonaise, peuvent survenir. L'analyse par PRN est la plus spécifique parmi les analyses sérologiques du WNV ;
quand nécessaire, les titres en anticorps dirigés contre des flavivirus apparentés peuvent être examinés en
parallèle dans le sérum. En conclusion, l'historique de la vaccination contre le WNV doit être considérée dans
l'interprétation des résultats de la sérologie, en particulier dans l'analyse PRN et l’ELISA IgG. L’ELISA de capture
IgM peut être employé pour examiner les espèces aviaires ou autres à condition que l'anticorps de capture
spécifique de l'espèce soit disponible (par exemple, anti-poulet IgM). L'analyse par PRN est applicable sur
n'importe quelle espèce, y compris les oiseaux.
a) ELISA de capture IgM équine
Le WNV et les antigènes normaux pour l’ELISA de capture IgM peuvent être préparés à partir du cerveau de
souris (voir le Chapitre 2.5.3.), de culture de tissus ou de lignées de cellules recombinantes (8). Les sources
commerciales des réactifs d'analyse du WNV sont disponibles en Amérique du Nord. Le sérum témoin
équin, bien qu’il ne soit pas un étalon international, peut être obtenu à partir des laboratoires nationaux des
services vétérinaires, Ames, Iowa, États-Unis. Le virus et les antigènes témoins devraient être préparés en
parallèle pour une analyse par ELISA. Les préparations d'antigène doivent être titrées avec des sérums
témoins pour optimiser la sensibilité et la spécificité de l'analyse. Les échantillons de sérum équin sont
examinés à une dilution de 1/400 et les échantillons équins de liquides céphalo-rachidiens sont examinés à
une dilution de 1/2. Pour assurer la spécificité, chaque échantillon de sérum est examiné pour sa réactivité
avec l'antigène viral et l'antigène témoin.
• Protocole
i) Ajouter sur des plaques ELISA de 96 puits à fond plat (par exemple, Immulon 2HB, Dynex
Technologies, Chantilly, VA, USA) 100 µl/puits d’IgM anti-équin diluées dans une solution tampon de
carbonate 0,5 M, pH 9,6, selon la dilution suggérée par le fabricant pour l'utilisation comme anticorps
de capture.
ii) Incuber les plaques durant une nuit à 4°C en chambre humide. Les plaques sensibilisées peuvent être
conservées pendant plusieurs semaines.
iii) Avant l'utilisation, les plaques doivent être lavées 2 fois avec 200 à 300 µl/puits de solution
physiologique tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 M, pH 7,2, contenant 0,05 % de Tween
20 (PBST).
iv) Bloquer les plaques en ajoutant 300 µl/puits de lait écrémé en poudre à 5 %, fraîchement préparé dans
du PBST et incuber 60 min à température ambiante. Après incubation, enlever la solution de blocage
et laver les plaques 3 fois avec du PBST.
v) Les sérums témoins et à tester sont dilués au 1/400 (le liquide céphalorachidien est dilué au 1/2) dans
du PBST et 50 µl/puits de chaque échantillon sont ajoutés aux puits dupliqués (total de 4 puits par
échantillon) de la plaque. Inclure les témoins positif et négatif préparés de la même manière que les
échantillons.
vi) Recouvrir les plaques et incuber 75 min à 37°C dans une chambre humide.
vii) Enlever le sérum et laver les plaques 3 fois dans du PBST.