Etude de l`effet de l`administration d`une benzodiazépine chez la

Protocole_Groupe_29
TP UE-6.5:
Etude de l’effet de l’administration d’une benzodiazépine chez
la souris
I)
Objectifs
Lors de TP, nous allons nous intéresser aux effets secondaires d’un anxiolytique, le diazépam
(Valium®) en essayant de répondre aux interrogations suivantes:
- En dehors de l’effet anxiolytique, quels sont les effets secondaires du Valium® ?
- Comment ces effets secondaires se manifestent-ils en fonction de la dose administrée ?
II) Matériel et Méthodes
• Groupe de souris
On dispose de 6 souris mâles âgées de 8 semaines.
• Doses de médicament et voie d’injection (les calculs sont faits pour des souris pesant 30g, les
valeurs seront ajustées lors de la séance de TP selon les masses des souris pesées)
Pour les injections, nous disposons des solutions suivantes:
- sérum physiologique (0.9% NaCl)
- ampoule de diazépam en solution à 10mg/2mL
En premier lieu, avec une balance, nous commençons par peser les souris. En effet, les doses
de solution, devant être injectées, varient en fonction de la masse de la souris.
Nous allons réaliser sur chaque souris une injection péritonéale soit de la solution de sérum
physiologique, soit de la solution de diazépam.
Pour cela, nous séparons les souris en 3 groupes:
- le « groupe T », c’est le groupe témoin. Nous injectons une solution de sérum
physiologique à 10mL/kg. Pour des souris de 30g, nous injectons donc 300µL de sérum
physiologique à chaque souris du « groupe T ».
- le « groupe M », c’est le groupe de souris sur lequel nous voulons obtenir un effet
myorelaxant. Pour avoir un effet myorelaxant, nous optons pour une dose de Valium® de
2,5mg/kg. Pour des souris de 30g, nous injectons donc 300µL de solution fille M de
diazépam à chaque souris du « groupe M ».
- le « groupe S », c’est le groupe de souris sur lequel nous voulons obtenir un effet sédatif.
Pour avoir un effet sédatif, nous optons pour une dose de Valium® de 5mg/kg. Pour des
souris de 30g, nous injectons donc 300µL de solution fille S de diazépam à chaque souris
du « groupe S ».
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Pour pouvoir faire les différentes injections, nous avons besoin de préparer des solutions filles M et
S correspondantes respectivement à l’effet myorelaxant et à l’effet sédatif. Voici les calculs ayant
permis la préparation de ces 2 solutions:
Effet myorelaxant: dose = 2,5mg/kg
Effet sédatif: dose = 5mg/kg
Masse totale des souris: 30x2= 60g
Masse totale de Valium® pour les 2 souris:
2,5x0,06= 0,15mg
Masse totale de Valium® pour les 2 souris:
5x0,06= 0,30mg
Voie intrapéritonéale: 10mL/kg
donc pour 2 souris, nous injectons:
V=0,06x10= 0,6mL= 600µL
La solution mère a une concentration de 10mg/2mL soit 5mg/mL
Nous voulons préparer une solution fille de
2mL, nous devons donc prélever un volume de
solution mère V=(0,25x2)/5=0,1mL=100µL
Nous voulons préparer une solution fille de
2mL, nous devons donc prélever un volume de
solution mère V=(0,5x2)/5=0,2mL=200µL
La solution fille M sera composée de 100µL de
solution mère et de 1,9mL de NaCL à 0.9%.
La solution fille S sera composée de 200µL de
solution mère et de 1,8mL de NaCL à 0.9%
Pour s’assurer de distinguer les groupes de souris, nous colorons le bout de leur queue avec un
marqueur de couleur différente pour chacun des 3 groupes.
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• Chronogramme expliqué
-
On réalise :
Une injection de sérum physiologique (placebo) aux souris T (au temps T0);
10 minutes plus tard, on injecte 2,5 mg de diazépam par kilogramme aux souris M (au
temps T10);
Encore 10 minutes plus tard, on injecte 5 mg de diazépam par kilogramme aux souris S (au
temps T20).
Du fait que l’on se place dans les mêmes conditions expérimentales, les 3 groupes de
souris deviennent comparables. De plus, on s’affranchit du biais « temps » en les exposant au
diazépam à des durées identiques.
Les tests réalisés sont (dans l’ordre chronologique) :
1. Le test de la planche à trous;
2. Le test de Porsolt (ou test de la nage forcée);
3. Le test de la barre fixe;
4. Le test du Rotarod;
5. Le test de retournement.
• Description des tests et de ce qui est évalué
Test de la planche à trous (5 minutes)
On test les capacités exploratrices et les capacités psychomotrices de la souris. La capacité
exploratrice reflète l’état d’esprit de la souris, donc l’atteinte affective de la souris. On la mesure en
comptant le nombre de trou explorés par la souris : on définit l’exploration par le fait de rentrer la
tête jusqu’aux oreilles dans un trou. On évalue la capacité psychomotrice (atteinte de la sphère
noétique) par le nombre de trébuchement effectués par l’animal : Si la souris se relève
immédiatement après un trébuchement, c’est que ses capacités psychomotrices ne sont pas
affectées.
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Test de Porsolt (nage forcée, 10 minutes)
Ce test est utilisé pour tester l’action d’antidépresseurs. Il consiste à mettre la souris dans une
situation ou elle doit lutter pour survivre, mais sans possibilité pour elle de s’en sortir. On mesure
alors la volonté que la souris a de s’en sortir. On utilise le dispositif suivant : un récipient est rempli
d’eau tiède à 37°C de façon à ce que la souris n’ait pas pied (et ne puisse pas prendre appuie
avec sa queue) et qu’elle ne puisse pas en sortir. On utilise de l’eau à 37°C pour éviter
l’hydrocution. On place ensuite délicatement l’animal dans l’eau, en faisant attention à ce que la
tête ne soit pas immergée.
L’expérience débute alors à partir de ce moment et pendant 10 minutes. On mesure différentes
choses : le temps de nage avant le premier arrêt, la latence de la première période d’immobilité, le
nombre total d’arrêts avec le temps passé immobile et le temps total de nage.
Remarquons que si le psychotrope agit également sur le plan neuro-musculaire, la réponse de la
souris sera différente dans cette situation. S’il provoque une baisse du tonus musculaire par
exemple, la souris ne pourra pas se battre autant qu’une souris témoin.
Au moindre problème, on retire la souris de l’eau. Si, par exemple, la souris commence à mettre la
tête sous l’eau, il faut vite la sortir. Au moment de la sortie, on sèche la souris dans un linge avant
de la remettre en cage.
Test de la barre fixe (5 secondes)
On test la capacité qu’a une souris, que l’on pend par les pattes à un fil métallique, à se rétablir en
positionnant au moins une de ses pattes postérieures sur ce fil. Le test est positif si l’animal se
rétabli en moins de 5 secondes et négatif dans le cas contraire (aussi si l’animal ne saisi pas le fil).
Une souris normale effectue immédiatement ce rétablissement.
Test du Rotarod
Il s'agit de placer l'animal sur le cylindre rotatif suspendu au-dessus du plancher de l'appareil à une
hauteur idéale pour ne pas blesser l'animal dans sa chute, mais suffisamment élevée pour induire
l'évitement de la chute. Les souris tentent naturellement de rester sur le Rotarod et évitent de
tomber au sol. Elles tomberont quand la vitesse de rotation de l'axe sera supérieure à leur capacité
de coordination motrice. Cette vitesse à laquelle tombe l'animal reflète l'équilibre, la coordination et
la condition physique. On programme le Rotarod à une vitesse initiale de 4 rotations par minute.
On place la souris sur le Rotarod et on maintien cette vitesse pendant 5 secondes. Au bout de
ème
cette 5
seconde, on impose une accélération de 10 rotations par minute. On note la vitesse de
rotation atteinte au moment où la souris est tombée. Si une souris tombe durant les 5 premières
secondes du test, le test est à refaire.
Test du retournement
On essaye de positionner la souris sur le dos : si on n’y arrive pas ou si la souris se retourne
immédiatement, le test est positif. Dans le cas contraire, où la souris mettrait du temps à se
relever, on peut soupçonner une atteinte psychomotrice.
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