L`ovocyte et l`embryon : de la morphologie aux gènes

Revue
L’ovocyte et l’embryon :
de la morphologie aux gènes
Oocyte and embryo: from morphology to gene expression therapy
Samir Hamamah
Delphine Haouzi
Stephan Gasca
Frank Pellestor
Tal Anahory
John De Vos
Hervé Dechaud
Département de Médecine
et Biologie de la Reproduction,
Inserm U 847, Hôpital Arnaud de
Villeneuve, 34295 Montpellier cedex 5
<[e-mail]>
Résumé.Les taux d’embryons et de grossesses obtenus à partir d’ovocytes fertilisés in vitro
restent faibles, que ce soit dans le cas de la fécondation in vitro classique (FIVc) ou dans celui
de la micro-injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI). Ces échecs de la fécon-
dation in vitro sont le plus souvent associés à une mauvaise qualité embryonnaire, dépendant
elle-même de la qualité des gamètes. Jusqu’à présent, les gamètes et les embryons sont
sélectionnés sur des critères exclusivement morphologiques, et par conséquent subjectifs. La
connaissance de l’expression des gènes dans les ovocytes, les cellules du cumulus, et de
l’embryon précoce, par la technique de microarray, devrait permettre de mieux appréhender
et comprendre le développement ovocytaire et embryonnaire précoce. À plus long terme, ce
type d’approche favorisera l’identification de marqueurs fiables de la qualité ovocytaire et
embryonnaire. L’utilisation d’une signature génétique de la qualité ovocytaire et embryon-
naire devrait, quant à elle, permettre d’améliorer les taux de réussite de FIVc et d’ISCI basés
essentiellement à l’heure actuelle sur des critères morphologiques.
Mots clés : ovocyte, embryon, cumulus, gène, critère de sélection
Abstract.The embryo and pregnancy rates that are obtained after in vitro oocyte fertilization
remains low, in conventional IVF (IVFc) as well as after ICSI. These failures of fecundation are
more often associated with poor embryo quality that results itself from poor gamete quality. So
far, gametes and embryos are selected on purely morphological criteria, thus subjective. The
knowledge about gene expression within oocyte, cumulus cells and early embryo with the
microarray technique should allow better considering and understanding the early oocyte and
embryo development. Later on, this kind of approach will facilitate the identification of
reliable markers of oocyte and embryo quality. The use of a genetic signature of oocyte and
embryo quality should allow improving the success rate of IVFc and ICSI that are so far based
exclusively on morphological criteria.
Key words: oocyte, embryo, cumulus, gene, selection criterium
Environ 60 000 couples en âge de
procréer en France sont confrontés
tous les ans à des problèmes d’inferti-
lité, dont près de 60 % des cas sont à
mettre sur le compte des infertilités
féminines. L’apparition de la féconda-
tion in vitro (FIV) en 1978 a permis de
traiter en partie ces problèmes d’infer-
tilités féminines. Depuis, les deman-
des d’aide médicale à la procréation
(AMP) augmentent chaque année. En
2005, d’après le rapport de l’Agence
de la biomédecine « Bilan des activi-
tés de procréation et génétique humai-
nes en France 2002-2005 » : 9 026
enfants sont nés en France après une
AMP. Plus de vingt et un mille
(21 635) FIV classiques (FIVc), 30 049
fécondations in vitro avec micro-
injection intracytoplasmique de sper-
matozoïdes (ICSI) ont été pratiquées,
et 13 539 transferts d’embryons
congelés (TEC) ont été réalisés.
Ces chiffres encourageants ne sau-
raient néanmoins masquer deux faits.
D’une part, que le taux des embryons
obtenu par ovocyte injecté est de
55,8 % dans le cas de la FIVc et de
62,9 % dans le cas de l’ICSI, d’autre
part qu’il persiste une certaine stabilité
dans les chances de grossesse (de l’or-
dre de 22 à 23 % par cycle de FIVc, de
21 à 24 % par cycle d’ICSI, et de
17,1 % pour les TEC) ainsi que des
risques augmentés de grossesses mul-
tiples (de l’ordre de 23 %) dues aux
mt médecine de la reproduction 2007 ; 9 (6) : 381-8
Tirés à part : S. Hamamah
doi: 10.1684/mte.2008.0120
mt médecine de la reproduction, vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2007 381
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transferts intra-utérins de deux embryons ou plus. Les trois
quarts de ces grossesses aidées médicalement conduisent
à un accouchement, comme dans les cas de grossesses
naturelles. Les échecs inhérents d’AMP sont le plus sou-
vent associés à une mauvaise qualité embryonnaire, qui
dépend elle-même de la qualité des gamètes. La sélection
des ovocytes et des embryons dans les laboratoires d’AMP
se réalisant sur l’évaluation de critères essentiellement
morphologiques, et donc subjectifs, il convient de s’inter-
roger sur les manières d’améliorer les méthodes d’évalua-
tion de la qualité ovocytaire et embryonnaire afin d’aug-
menter les chances de grossesse.
Les critères morphologiques
de sélection ovocytaire
et embryonnaire
Les ovocytes
Pour apprécier la qualité ovocytaire, il est nécessaire
d’enlever préalablement les cellules du cumulus de l’ovo-
cyte afin de vérifier que celui-ci est mature et se trouve en
métaphase II, qui se caractérise par la présence du 1er
globule polaire dans l’espace périvitellin, entre la surface
de l’ovocyte et la zone pellucide.
Les premiers critères morphologiques excluant de
facto un ovocyte à candidature à la fécondation sont sa
forme, sa taille, ou sa couleur anormale, des anomalies de
la zone pellucide qu’il s’agisse d’une épaisseur excessive,
de son ovale, ou de son hétérogénéité, une granularité ou
une homogénéité du cytoplasme ovocytaire (figure 1).
L’absence d’organites cytoplasmiques dans la zone corti-
cale, la présence de vacuoles plus ou moins importantes,
d’inclusions cytoplasmiques, de corps rétractiles, de zo-
nes nécrotiques ou d’accumulation de réticulum endo-
plasmique lisse sont également des éléments rédhibitoi-
res. De même, la taille de l’espace périvitellin et la
présence d’éventuel débris dans cet espace, des anoma-
lies dans la taille du premier globule polaire ou sa frag-
mentation excluent d’office les ovocytes pour une tenta-
tive de fécondation (figure 1). Certains ovocytes peuvent
d’ailleurs cumuler plusieurs de ces dysmorphies. Les cau-
ses de ces dysmorphies peuvent être d’origine multiple :
l’âge de la patiente, le type de stimulation ovarienne,
l’environnement hormonal dans le follicule de l’ovocyte,
ou encore des pathologies ovocytaires propres à la pa-
tiente. Même s’il a été montré dans plusieurs études qu’il
n’existe pas de corrélation directe entre les dysmorphies
ovocytaires et les taux de fécondation en FIVc ou en ISCI,
et le développement embryonnaire [1], il semble que ces
dysmorphies ovocytaires soient pourtant associées à un
taux élevé de fausses couches spontanées. Cependant,
une étude portant sur des femmes ayant eu des anomalies
morphologiques sous stimulation par gonadotrophines,
l’adjonction d’hormone de croissance pendant la stimula-
tion ovarienne a permis de doubler les taux de grossesse
alors que les ovocytes des patientes présentaient au mini-
mum 2 dysmorphies [2].
D’autres anomalies paraissent être rédhibitoires pour
la FIVc ou l’ICSI. Ainsi, la visualisation du fuseau méioti-
que apparaît comme une condition sine qua non àla
qualité embryonnaire [3-4]. Si le fuseau méiotique n’est
pas visualisable dans les ovocytes, seul moins d’un tiers
des embryons sont de bonne qualité, alors que s’il est
visible, la qualité de l’ensemble des embryons obtenus se
révèle tout à fait satisfaisante. La taille des ovocytes sem-
ble également déterminante. Les ovocytes géants (mesu-
rant plus de 220 lm) sont de bien moins bons candidats à
la fécondation comparés aux ovocytes normaux (mesu-
rant entre 120 et 150 lm), car étant souvent diploïdes et
pouvant contenir deux nucleus, ils donnent fréquemment
des embryons triploïdes, et même polyploïdes [5-6] (fi-
gure 1). Cette information est à rapprocher du facteur âge
de la patiente. En effet, d’après une étude, à partir de
38 ans, les ovocytes des patientes présentent un taux
d’aneuploïdies de plus de 50 % [7].
Les embryons
Des critères de sélection morphologiques des em-
bryons peuvent être appliqués dès le stade zygote (fi-
gure 1). Ces critères portent notamment sur l’aspect des
pronuclei au moment de la fécondation. Une étude a
montré que quand la morphologie des zygotes est nor-
male, c’est-à-dire caractérisée par la présence de deux
pronuclei de taille égale et centrés dans le cytoplasme, les
taux de grossesse par transfert sont doublés et passent de
28 % à 49,5 % [8]. De même, des nucléoles bien position-
nés font augmenter le taux de grossesse de 9 % à 50 % [9].
Une autre étude a montré que le transfert d’un embryon
provenant d’un zygote présentant un nombre et une dis-
tribution spatiale des nucléoles identiques dans les deux
pronuclei provoque un taux de grossesses de 44,8 % et
d’implantation de 30,2 %, alors que ces taux sont respec-
tivement de 22,1 % et 11,2 % quand l’embryon transféré
provient d’un zygote jugé anormal [10]. Les zygotes dys-
morphiques présentant 3 pronuclei par exemple donnent
des embryons porteurs d’anomalies chromosomiques
dans la grande majorité des cas (figure 1). Inversement, le
transfert d’embryons issus de zygotes ayant présenté un
clivage précoce entre la 25
e
et la 27
e
heure après insémi-
nation fait augmenter aussi bien les taux d’implantation
que les taux de grossesse [11-12]. Cependant, des zygotes
avec des pronuclei normaux ne conduisent pas nécessai-
rement à des embryons de bonne qualité, ce qui semble
indiquer que morphologie du zygote et morphologie de
l’embryon sont deux paramètres indépendants [13].
Les critères morphologiques de sélection des em-
bryons préimplantatoires sont, quant à eux, évalués le jour
du transfert, deux ou trois jours après la ponction ovocy-
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taire et la fécondation. L’évaluation des embryons les plus
compétents, c’est-à-dire au potentiel de développement et
de transfert le plus élevé, est réalisée en fonction de leur
cinétique de division, de leur nombre de blastomères et de
leur régularité, de la présence de blastomères multinu-
cléés, et enfin du taux de fragmentation cellulaire
(figure 1). En ce qui concerne la cinétique du développe-
ment embryonnaire et du nombre de blastomères, il appa-
raît que si celle-ci est trop lente ou présente un arrêt au
jour 3, 70 % des embryons sont porteurs d’une anomalie
chromosomique [14-15]. La régularité des blastomères
apparaît tout aussi déterminante puisque quand les em-
bryons comportent un blastomère dominant, celui-ci est
fréquemment polyploïde et multinucléé [16-17]. Lors
d’une FIVc ou d’une ICSI, environ 12 % des embryons
présentent une multinucléation ou une micronucléation.
Les données de la littérature montrent que si tous les
embryons transférés sont multinucléés, alors les taux de
grossesse varient de8à16%,tandis que si aucun des
embryons transférés ne présente de multinucléation les
taux de grossesse sont de 28 à 32 %, [18-19]. À peu près
80 % des embryons obtenus in vitro présentent une frag-
Nombre de pronuclei
Fragmentation
Taille des blastomères
Granularité
excessive ZP anormaleVacuoles
A
BDéveloppement
normal
Développement
anormal
Contrôle Ovocyte géant
GP fragmenté
Figure 1. Paramètres morphologiques ovocytaires et embryonnaires. A) Dysmorphies ovocytaires. GP : globule polaire, ZP : zone
pellucide ; B) Anomalies de développement embryonnaire pré-implantatoire.
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mentation cellulaire. Ce taux de fragmentation embryon-
naire semble être lié au taux de mosaïque, plus le premier
est élevé dans l’embryon, plus le second augmente [20].
Une fragmentation embryonnaire élevée semble égale-
ment être liée à un moindre taux d’évolution vers le stade
blastocyste [21]. De même, à partir de 35 % de fragmen-
tation cellulaire, le nombre d’anomalies chromosomiques
s’accroît [22]. Ces données sont corrélées avec les chan-
ces d’accouchement qui sont de l’ordre de 23 % pour un
taux de fragmentation inférieur à 10 % par embryon, de
11 % quand le taux de fragmentation est compris entre 10
et 25 %, et de 1 % quand la fragmentation par embryon
est supérieure à 25 % [23]. Les raisons de ce rôle néfaste
de la fragmentation sur le développement embryonnaire
préimplantatoire ne sont pas précisément connues. Les
fragments pourraient gêner physiquement des interactions
intercellulaires, ce qui interférerait avec le développement
de l’embryon, en particulier aux stades de la compaction,
de la cavitation et de la formation de blastocyste [24-25].
Ces fragments pourraient diminuer le volume cytoplasmi-
que et, de ce fait, dépléter les embryons d’organelles
essentielles ou de domaines polarisés indispensables au
bon déroulement du développement embryonnaire [26].
Enfin, ces fragments pourraient libérer des substances
toxiques endommageant les cellules voisines [27-28].
Aussi, un enjeu majeur pour l’amélioration des taux de
succès de la FIV est l’approfondissement de nos connais-
sances sur l’expression des gènes dans les ovocytes, les
cellules du cumulus et de l’embryon précoce, afin d’iden-
tifier des indicateurs pertinents et fiables de la qualité
ovocytaire et embryonnaire.
Une approche d’avenir,
la face cachée de l’ovocyte
et de l’embryon : le génome
La fréquence excessive d’embryons préimplantatoires
présentant des anomalies chromosomiques est une don-
née bien connue et en FIVc ou en ICSI. Cependant, la
sélection embryonnaire par ce critère non morphologique
n’est mise en œuvre que dans des cas où les parents
présentent des risques élevés de transmettre des anomalies
chromosomiques ou des mutations génétiques : caryotype
parental altéré, âge maternel supérieur à 38 ans, multiples
avortements spontanés, échecs répétés de FIVc ou ICSI,
maladie autosomique monogénique dominante (réces-
sive, si les deux personnes du couple sont affectées par la
maladie), anomalies chromosomiques de structure, pa-
rents porteurs d’une maladie liée au sexe. Dans ces cas
bien précis, et encadrés par la loi, les laboratoires procè-
dent à un diagnostic préimplantatoire (DPI). Le DPI repose
sur l’analyse génétique d’un ou deux blastomères prélevés
sur des embryons obtenus par FIVc ou ICSI au troisième
jour de leur développement au stade6à8cellules. Selon
l’indication spécifique de chaque DPI, l’étude génétique
des embryons se fait par des techniques cytogénétiques ou
moléculaires. L’analyse cytogénétique permet la recher-
che d’anomalies chromosomiques de nombre ou de struc-
ture par la technique de fluorescent in situ hybridization
(FISH). L’analyse moléculaire par réaction en chaîne par
polymérase (PCR) permet la recherche des maladies mo-
nogéniques. Malgré son indéniable utilité, le DPI reste une
technique lourde en raison même de l’ablation d’un ou
deux blastomères nécessaire aux analyses. Cette ablation
pose en outre la question de la pertinence de ce genre
d’approche, en raison même de l’hétérogénie des anoma-
lies qui peut exister d’un blastomère à un autre. La tech-
nique a cependant le mérite de pointer de nouvelles pistes
de recherche.
Les critères morphologiques de sélection des ovocytes,
zygotes, et embryons préimplantatoires étant probable-
ment en partie associés aux résultats insuffisants de la FIVc
et de l’ICSI, il est important de pouvoir accéder aux
signatures moléculaires pour comprendre au mieux le
développement ovocytaire et celui de l’embryon préim-
plantatoire. La connaissance de l’expression des gènes est
également la première étape indispensable à l’identifica-
tion de potentiels marqueurs moléculaires de l’expression
de gènes anormaux aussi bien dans les ovocytes que dans
les embryons préimplantatoires. Ce type d’approche a
déjà été en partie réalisé sur les cellules du cumulus, sur
des ovocytes, et sur des embryons préimplantatoires hu-
mains (figure 2).
Lors de leur maturation, les ovocytes requièrent l’ex-
pression de nombreux gènes spécifiques. Certains de ces
gènes sont activés pour le métabolisme de l’ovocyte du-
rant le processus spécifique de maturation. Grâce aux
récents développements de l’amplification linéaire per-
mettant de réussir à détecter par microarray de très petites
quantités d’ARN, l’analyse de l’expression des gènes d’un
seul ovocyte a été rendue possible [29]. Sur des ovocytes
isolés, il a été montré par PCR que les ARNm de SUMO-1,
SUMO-2, SUMO-3 (small ubiquitin related modifier), et le
lactate deshydrogénase-B (LDH-B), des protéines impli-
quées dans le métabolisme énergétique de la cellule,
étaient détectés dans tous les ovocytes [30]. Une autre
étude a réussi à comparer chez la souris le niveau d’ex-
pression de 86 gènes associés à la reprogrammation épi-
génétique dans des ovocytes matures au stade MII, le stade
capable de reprogrammer la chromatine spermatique. Sur
ces 86 gènes, 57 ont pu être détectés. Quatre étaient
surexprimés dans les ovocytes, 18 étaient sous-exprimés,
et 35 avaient leur expression inchangée [31]. Outre le fait
que quelques-uns des mécanismes que l’ovocyte emploie
pour se reprogrammer après la fertilisation ont été éluci-
dés, cette étude montre la présence de nombreux gènes
exclusivement exprimés dans l’ovocyte (figure 2).
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Le dialogue entre l’ovocyte et les cellules somatiques
qui l’entourent, particulièrement les cellules du cumulus,
est essentiel à l’acquisition par l’ovocyte de sa compé-
tence à la méiose et au développement embryonnaire.
D’un côté, l’ovocyte contrôle la croissance des cellules du
follicule et sa méiose, mais aussi en partie la prolifération
et la différenciation des cellules du cumulus. De l’autre,
les cellules du cumulus du fait de leur différenciation
influencent à la fois la croissance et la maturation ovocy-
taire. La compréhension des mécanismes qui régissent la
maturation des ovocytes humains est toutefois encore
rudimentaire. A ce titre, les études de l’expression des
gènes dans les ovocytes humains et dans les cellules du
cumulus sont doublement intéressantes. D’une part, elles
pourraient contribuer à l’identification des facteurs impli-
qués dans la voie de maturation de l’ovocyte, d’autre part,
elles pourraient aussi fournir des marqueurs moléculaires
fiables de l’expression de gènes anormaux dans les ovo-
cytes à compétence réduite. Des avancées ont d’ailleurs
déjà été réalisées dans la connaissance des profils des
expressions différentielles des transcrits exprimés dans les
ovocytes matures, dans les ovocytes immatures, et dans
les cellules du cumulus (figure 2). Par une approche selon
la technique des microarrays à oligonucléotides sur
30 000 gènes, il a été mis en évidence que 1 514 gènes
sont surexprimés dans l’ovocyte humain, et 2 600 dans les
cellules du cumulus [32]. L’analyse de la liste de ces gènes
a permis de montrer que les ovocytes surexpriment des
gènes impliqués dans la méiose. Alors que 24 % des gènes
surexprimés dans les cellules du cumulus ont une voca-
tion membranaire ou extracellulaire, démontrant ainsi
une forte polarisation de ces cellules vers des gènes impli-
qués dans la communication intercellulaire. En s’ap-
puyant sur ces données, une autre étude a pu montrer que
le gène RB1, qui code une protéine suppresseur de tumeur
contrôlant le cycle cellulaire, ne s’exprimait pas dans les
ovocytes matures ou immatures, mais uniquement dans
les cellules du cumulus, alors même qu’il est présent dans
la plupart des tissus humains [33]. L’expression de facteurs
interagissant avec RB1, tel que RBL1 qui est seulement
exprimé dans les cellules du cumulus laisse à penser que
la régulation par RB1 est à l’œuvre dans ces cellules. RBL1
apparaît donc comme un potentiel marqueur spécifique
dans les cellules du cumulus.
La fécondation de l’ovocyte par le spermatozoïde li-
bère le zygote, ainsi formé, du cycle cellulaire arrêté en
métaphase méiotique II et initie l’activation du génome
embryonnaire. De nombreux gènes qui n’étaient pas ex-
primés dans l’ovocyte en cours de maturation sont présu-
més entrer en activité durant les premières étapes du
développement embryonnaire, avant l’activation de l’ex-
pression du zygote. Chez l’être humain, comme chez de
nombreux animaux vertébrés et invertébrés, la fusion des
gamètes est suivie par une brève période sans transcription
dans l’embryon nouvellement formé. Cette période est
marquée par une transition de l’ovocyte vers le zygote
dans laquelle le programme de développement est
d’abord exécuté par des informations maternellement hé-
ritées avant d’être transféré sous le contrôle des gènes
embryonnaire. Cette période de transition dure jusqu’au
stade4à8cellules chez l’être humain, c’est-à-dire 2 ou
GV
VG MI MII Cumulus
MI
GDF9
BMP15
DAZL
AURKC
MII
Cumulus cells
INHA
INHBA
PAPPA
LHCGR
Figure 2. Profil d’expression des gènes des ovocytes et des
cellules du cumulus.
Les signatures géniques des ovocytes et des cellules du cumulus sont
schématisées par un cluster hiérarchique non supervisé de 15 000
probesets. Le gradient colorimétrique indique l’expression relative de
chaque gène pour chaque échantillon (noir : expression non modulée ;
jaune : surexpression ; bleu : sous-expression). Le cluster a représente
un groupe de gènes surexprimés dans les ovocytes: GDF9,BMP15,
DAZL et AURKC. Le cluster b illustre des gènes surexprimés dans les
cellules du cumulus: INHIBIN A,ACTIVINE A,PAPPA et LHCGR.VG :
vésicule germinale, MI : métaphase I, MII : métaphase II.
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