Cours UE2 les concepts généraux

Licence Pro Biotechnologies
Module UE2 Cultures Cellulaires
La culture primaire
Devenir d’une culture primaire
Courbe de croissance des cellules en culture
Cellules HEK 293
ATCC® Number: CRL-1573 ™
Organism :
Source:
Homo sapiens
(human)
Organ: kidney
Cell type: transformed
with adenovirus 5 DNA
Application: transfection host
Receptors: vitronectin, expressed
Tumorigenic: Yes, forms tumors in
nude mice
Age:fetus
Cytogenetic analysis :
This is a hypotriploid human cell line. The modal chromosome
number was 64, occurring in 30% of cells.
The rate of cells with higher ploidies was 4.2 %.
Comments:
Although an earlier report suggested that the cells contained
Adenovirus 5 DNA from both the right and left ends of the viral
genome [RF32764],
it is now clear that only left end sequences are present. [39768]
The line is excellent for titrating human adenoviruses.
The cells express an unusual cell surface receptor for vitronectin
composed of the integrin beta-1 subunit and the vitronectin receptor
alpha-v subunit. [23406]
The Ad5 insert was cloned and sequenced, and it was determined that
a colinear seqment from nts 1 to 4344 is integrated into
chromosome 19 (19q13.2). [39768]
Références bibliographiques
Eagle’s Minimum Essential Medium EMEM
Inorganic Salts (g/liter)
CaCl2 (anhydrous) 0.20000
MgSO4 (anhydrous) 0.09767
KCl 0.40000
NaHCO3 1.50000
NaCl 6.80000
NaH2PO4·H2O 0.14000
Vitamins (g/liter)
Choline Chloride 0.00100
Folic Acid 0.00100
myo-Inositol 0.00200
Nicotinamide 0.00100
D-Pantothenic Acid 0.00100
(hemicalcium)
Pyridoxine·HCl 0.00100
Riboflavin 0.00010
Thiamine·HCl 0.00100
Autres (g/liter)
D-Glucose 1.00000
Sodium Pyruvate 0.11000
Phenol Red, Sodium Salt 0.01000
Amino Acids (g/liter)
L-Alanine 0.00890
L-Arginine·HCl 0.12640
L-Asparagine·H2O 0.01500
L-Aspartic Acid 0.01330
L-Cystine·2HCl 0.03120
L-Glutamic Acid 0.01470
L-Glutamine 0.29200
Glycine 0.00750
L-Histidine·HCl·H2O 0.04190
L-Isoleucine 0.05250
L-Leucine 0.05250
L-Lysine·HCl 0.07250
L-Methionine 0.01500
L-Phenylalanine 0.03250
L-Proline 0.01150
L-Serine 0.01050
L-Threonine 0.04760
L-Tryptophan 0.01000
L-Tyrosine·2Na·2H2O 0.05190
L-Valine 0.04680
Les systèmes de maintien du pH
Système CO2/bicarbonate de Na+
bicarbonate
Acide carbonique
H2O + CO2
NaHCO3
H+ + HCO3-
H2CO3
Na+ + HCO3-
L’équation de Handerson-Hasselbach prédit la valeur
du pH: pH = 6.0966+log([HCO3- ]/[CO2 ])
Autres Systèmes
Tampons organiques de type HEPES, PIPES
(Tampons phosphate)
Eagle’s Minimum Essential Medium EMEM
Inorganic Salts (g/liter)
CaCl2 (anhydrous) 0.20000
MgSO4 (anhydrous) 0.09767
KCl 0.40000
NaHCO3 1.50000
NaCl 6.80000
NaH2PO4·H2O 0.14000
Vitamins (g/liter)
Choline Chloride 0.00100
Folic Acid 0.00100
myo-Inositol 0.00200
Nicotinamide 0.00100
D-Pantothenic Acid 0.00100
(hemicalcium)
Pyridoxine·HCl 0.00100
Riboflavin 0.00010
Thiamine·HCl 0.00100
Autres (g/liter)
D-Glucose 1.00000
Phenol Red, Sodium Salt 0.01000
Sodium Pyruvate 0.11000
Amino Acids (g/liter)
L-Alanine 0.00890
L-Arginine·HCl 0.12640
L-Asparagine·H2O 0.01500
L-Aspartic Acid 0.01330
L-Cystine·2HCl 0.03120
L-Glutamic Acid 0.01470
L-Glutamine 0.29200
L-Glycine 0.00750
L-Histidine·HCl·H2O 0.04190
L-Isoleucine 0.05250
L-Leucine 0.05250
L-Lysine·HCl 0.07250
L-Methionine 0.01500
L-Phenylalanine 0.03250
L-Proline 0.01150
L-Serine 0.01050
L-Threonine 0.04760
L-Tryptophan 0.01000
L-Tyrosine·2Na·2H2O 0.05190
L-Valine 0.04680
On ajoute dans le milieu : antibiotiques et antifongiques
Bactéries
Champignons
Levures
……
…..
Mycoplasmes
Microscopie électronique
Serum
Source de protéines, acides aminés, facteurs de croissance,
lipides, sucres, hormones, transporteurs (acides gras, fer…)
Facteurs d’adhésion (notamment fibronectine)
Pouvoir tampon et il participe donc à la régulation du pH
Inactive certaines enzymes protéolytiques
viscosité du milieu
Problème plus général de l’attachement des cellules
Matériel de culture traité pour l’adhésion
Nécessité d’un “Coating“ de la surface:
Collagène, laminine, poly L-Lysine….
Nécessité de la présence d’une véritable
MEC: Collagène IV + laminine + protéoglycane…
La conservation des cellules
Principe: Congélation des cellules et
conservation à basse température
→ Le choc thermique
→ Le phénomène de cristallisation de l’eau
Congélation extra- et intracellulaire en fonction
de la vitesse de refroidissement
-2°C
-5°C
Refroidissement: 1. lent; 2. rapide
-10°C
Effets de la vitesse de refroidissement
LES PALIERS DE TEMPERATURE
Effets d’un agent cryoprotecteur: le DMSO
(diméthylsulfoxide)
Décongélation:
→ Rapide (pour éviter l’instabilité des cristaux intracellulaires)
Dilution des cellules dans le milieu:
→ Lente (dilution brusque du DMSO: choc osmotique)
Centrifugation:
→ Nécessaire uniquement si les cellules sont très sensibles au DMSO
En résumé
Attention à :
-Vitesses de congélation
-Température de stockage longue durée
- Processus de décongélation
Cellules HEK 293
Propagation des cellules:
ATCC complete growth medium: Minimum Essential Medium (Eagle) with 2 mM
L-glutamine and Earle's BSS adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate, 0.1 mM
non-essential amino acids and 1.0 mM sodium pyruvate, 90%; heat-inactivated horse
serum, 10%
Temperature: 37.0°C
Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%
Growth Conditions: The cell line does not adhere to the substrate when left at room
temperature for any length of time, therefore, live cultures may be received with the
cells detached. The cells will re-attach to the flask over a period of several days in
culture at 37C.
Conservation des cellules:
Freeze medium: Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSO
Storage temperature: liquid nitrogen vapor phase