Hiérarchie des cellules souches
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M1 UE CANCERO Cours du 23/09/11 de 16h à 17h C11 L. Mauvieux Groupe KUNTZ Salomé & LACAN Laure CELLULES SOUCHES ET CELLULES PROLIFERANTES REGULATION ET DIFFERENCIATION CELLULAIRE I. Propriétés des cellules souches Cellule à longue durée de vie Capable d’auto renouvellement (duplication sans perte des capacités de Développement) Peuvent donner naissance à de multiples types cellulaires (différenciation) Dans les conditions adéquates, peuvent se différencier en cellules originaires normalement des 3 couches embryonnaires : ectoderme, mésoderme, endoderme Capable de prolifération De régénérer des tissus après blessure De plasticité dans ces différentes options. II. Hiérarchie des cellules souches La cellule la plus primitive est une cellule qui peut reconstituer un organisme entier. Ce sont des cellules totipotentes. La cellule qui peut reconstituer plusieurs tissus dans un embryon est une cellule pluripotente. Dans un organisme adulte, une cellule à renouvellement rapide qui peut donner différents types cellulaires mais restreints à un même organe est une cellule multipotente, elles sont aussi appelées cellules tissulaires somatiques. Dans les cellules pluripotentes, on trouve les cellules souches embryonnaires qui nous intéressent ici. Ensuite, elles deviennent des cellules multipotentes, capables de donner des cellules souches nerveuses, des cellules souches de l’intestin ou encore des cellules souches hématopoïétiques. A noter que : Potence : définit la capacité à se différencier en différents types cellulaires Pluripotence : peut donner naissance à tous types cellulaires adultes ex : CSE Page 1 sur 14 M1 UE CANCERO Groupe Cours du 23/09/11 de 16h à 17h KUNTZ Salomé & LACAN Laure C11 L. Mauvieux Multipotence : peut se différencier en de multiples types cellulaires spécialisés, mais pas tous, restreint à un type cellulaire, role de régénèrer ex : les CS tissulaires III. Hétérogénéité des cellules souches (CS) A. Les cellules souches embryonnaires (CSE) Il en existe 2 sortes : les cellules ES les cellules somatiques « repogrammées » (induced pluripotent stem cell) 1. Les cellules ES Dérivées du blastocyste en culture capable de produire tous les types cellulaires du fœtus lorsqu’elle est replacée dans le blastocyste Autorenouvellement illimité dans les bonnes conditions de culture Peuvent se différencier in vitro dans tous les types cellulaires Elles sont dérivées des blastocystes en culture par transfert nucléaire d’une cellule somatique dans un œuf énuclée. Dérivation des cellules souches embryonnaires : De J0 à J5, il y a des divisions cellulaires. A J5, il y formation d’une masse interne appelé le blastocyste. Si on met en culture ce blastocyste avec un soutien de cellules de fibroblastes, on peut entretenir une lignée de cellules souches embryonnaires (ces cellules poussent sous forme de colonies sur des cellules de soutien qui sont des fibroblastes). Les cellules ES elles sont différenciées, on peut les isoler de façon précoce, et les mettre à cultiver, dans un environnement favorable. Elles se peuvent donner différents tissus. Si on les modifie, on peut les réintroduire dans le blastocyste et qui aura les caractéristiques de la cellule prélevée. Elles ont un intérêt fondamental en recherche. Critères pour caractériser le caractère de cellule souche : Auto renouvellement Potentiel de renouvellement illimité in vitro Expression de facteurs de transcription caractérisant la cellule souche Pluripotence in vitro Formation de tératomes dans la souris immunocompétente (potentiel tumoral) Page 2 sur 14 M1 UE CANCERO Cours du 23/09/11 de 16h à 17h C11 L. Mauvieux Groupe KUNTZ Salomé & LACAN Laure Les lignées de cellules ES sont fabriquées à partir de la masse cellulaire interne du blastocyste. 1 In vitro, les cellules ES sont capables de s’autorenouveler indéfiniment. Chez la souris, cet autorenouvellement est sous le contrôle du LIF (leukemia inhibitory factor). 2 In vitro, les cellules ES sont capables de se différencier en cellules des trois feuillets primitifs, ectoderme, mésoderme et endoderme. 3 Ces cellules précurseurs sont ensuite capables de se différencier en cellules matures fonctionnelles comme des neurones, des cardiomyocytes ou des cellules β pancréatiques. 4 Les cellules ES peuvent être modifiées génétiquement. 5 Une seule cellule ainsi modifiée peut être ensuite implantée dans un blastocyste receveur où elle va poursuivre son programme de différenciation (6) et contribuer à la formation de tous les lignages constituant l’organisme adulte. On constitue donc un produit chimérique. Et on peut ainsi sélectionner les caractères à transmettre dans les lignées germinales, on aboutit ainsi à une souris transgénique. 7 La greffe de cellules ES dans une souris adulte produit un tératocarcinome (8) composé de cellules souches embryonnaires pluripotentes et de cellules différenciées représentant les trois feuillets embryonnaires, ectoderme, mésoderme et endoderme. Donc, la principale caractéristique des cellules ES est de se différencier en ectoderme, mésoderme, et endoderme. C’est une notion très importante dans la thérapie cellulaire. Page 3 sur 14 M1 UE CANCERO Groupe Cours du 23/09/11 de 16h à 17h KUNTZ Salomé & LACAN Laure C11 L. Mauvieux Cependant, il peut se former des tératomes : C’est une tumeur hétérogène composée de cellules issues des 3 feuillets embryonnaire : ectoderme (peau, poils, dents, ...), mésoderme (os, cartilage, muscle, ...), endoderme (épithélium gastrointestinal, bronchique, ...). Ce sont des structures tumorales qui contiennent différents types cellulaires. On peut mettre en évidence la PLURIPOTENCE des cellules ES in vitro : ces cellules sont très maniables : selon le milieu on obtiendra telle ou telle lignée de 2. Les cellules souches « reprogrammées » ou IPS les cellules somatiques « reprogrammées » ou IPS On réalise une expérience (Yamakanha) pour comprendre s’il y a des facteurs de transcription qui amènent des cellules différenciées à des cellules immatures. On part du postulat suivant : si toutes les cellules viennent d’une cellule souche, le matériel reste le même théoriquement. Il n’y a pas de modification irréversible. Donc en partant d’une cellule on pourrait être capable de revenir à une cellule souche. Ces cellules souches (CS) ont sans doute subit des modifications chromatiniennes, du noyau, qui permettent de sélectionner certains gènes amenant à la différenciation. On pourrait alors reprogrammer des cellules matures pour revenir cellules souches. C’est une idée simple : prendre un gène exprimé par la cellule souche sur lequel on ajoute un marqueur résistant à la néomycine. Quand celui-ci est exprimé, la cellule se trouve donc résistante à la néomycine. Ces CS modifiées vont générer des cellules transgéniques avec le marqueur. On prélève donc des fibroblastes et pour savoir si on peut reprogrammer la cellule, on les sélectionne à la néomycine : il ne reste que des cellules avec les caractéristiques des cellules Page 4 sur 14 M1 UE CANCERO Cours du 23/09/11 de 16h à 17h C11 L. Mauvieux souches. Groupe KUNTZ Salomé & LACAN Laure Ainsi, plus en détails : FBX15 n’est exprimé que dans les cellules souches, on lui ajoute un gène de résistance à la néomycine. On prend les cellules souches embryonnaires recombinantes qui portent FBX15 avec des gènes de résistance à la néomycine et on en prend des fibroblastes. Dans les cellules souches embryonnaires, on a des gènes exprimés qui sont responsable de la différenciation. Donc on prend certains facteurs de croissance comme CMYC, OCT4, KLF4, SOX2 avec un fibroblaste, on la reprogramme pour obtenir une cellule souche embryonnaire. Ces cellules expriment des facteurs de transcription et expriment des marqueurs de cellules souches embryonnaires (qui sont capable de faire des tératomes et de se différencier in vitro). Ainsi il suffirait de faire exprimer à la cellule 4 gènes pour avoir des cellules ayant des propriétés similaires aux CS : les gènes concernés sont des oncogènes ou encore des gènes impliqués dans le développement. 4 gènes sont nécessaires pour obtenir des cellules iPS : OCT4/KLF4/CMYC/SOX2 Dans cette expérience, les chercheurs n’ont pas réussi à reconstituer des souris. En 2007, des chercheurs ont fait à peu près les mêmes manipulations et ont conclu qu’il existe des risques de tumeurs importants chez la souris. En novembre 2007, ces manipulations on été réalisés chez l’homme. A partir de fibroblastes, on a fait des iPS. On peut faire pousser ces cellules iPS et on peut les obtenir à partir de cellules différenciées. Ceci permet de dire qu’il est possible de faire des cellules souches embryonnaires chez l’homme lors de pathologies qui le nécessitent. Page 5 sur 14 M1 UE CANCERO Cours du 23/09/11 de 16h à 17h C11 L. Mauvieux B. Les cellules souches adultes Groupe KUNTZ Salomé & LACAN Laure 1. Caractéristiques Ces cellules souches sont présentes dans de nombreux tissus à l’âge adulte. On comprend facilement qu’il y ait des cellules souches dans les tissus à renouvellement rapide comme la peau ou les cheveux, l’épithélium digestif, et la moelle osseuse à l’origine de la fabrication des cellules du sang. Ce sont les cellules souches hématopoïétiques qui sont de très loin les mieux connues. Des cellules souches ont été également décrites dans le SNC et dans le muscle, mais beaucoup plus rares et dificiles à étudier L’homéostasie d’un organisme adulte résulte de l’équilibre entre l’état quiescent de ces cellules souches (pool de réserve) et leur mise en cycle (amplification cellulaire pour le renouvellement tissulaire) Ainsi : • Les cellules souches adultes sont cruciales pour le renouvellement tissulaire • Ces cellules sont capables d’auto-renouvellement et de différenciation 2. Modèle CSH (cellules souches hématopoïétiques) Elles durent toutes la vie A l’origine de toute l’hématopoïèse à la base des greffes de moelle allogénique qui est la thérapie cellulaire de loin la plus utilisée c’est le modèle CS le mieux connu (souris) 3. Mise en évidence CSH La première conception de cellules souches date de 1961. Des souris irradiées (elles n’ont plus de cellules hématopoïétiques) ont subis une greffe de moelle. A J10, quand on prélève la rate, on voit apparaître des colonies de cellules hématopoïétiques qui sont clonales et qui ont des cellules de lignées hématopoïétiques (CFU-S). A partir des cellules injectées en intra veineux, on a des cellules qui ont migré vers la rate pour former des colonies. Une autre expérience donne les résultats suivants : Les souris irradiées sont mortes après 10-15 jours Les souris irradiées auxquelles on ajoute 105 cellule de la moelle meurent au bout de 3-4 semaines Les souris irradiées auxquelles on ajoute 5x106 cellules de la moelle survivent et il y a une reconstitution à long terme de la moelle hématopoïétique Les souris irradiées auxquelles on ajoute 106 cellules de la moelle et du 5FU (5fluorouracile qui est un antibiotique) survivent et il y a une reconstitution à long terme de la moelle hématopoïétique. Page 6 sur 14 M1 UE CANCERO Cours du 23/09/11 de 16h à 17h C11 L. Mauvieux Groupe KUNTZ Salomé & LACAN Laure Nous pouvons dire que dans les 5x106 cellules de la moelle de la troisième manipulation, il y a des cellules qui peuvent refaire les cellules de l’hématopoïèse qui ne sont pas présentes dans les 105 cellules de la deuxième manipulation. Ainsi, quand on peu de cellules, on a pas assez de matériel et donc peu de cellule souche, donc si les cellules souches existent, elles sont présentes en quantité très faibles. Dans la moelle, on a des cellules qui permettent de recréer l’hématopoïèse lors de greffe dans une autre espèce. Ceci prouve la notion d’auto renouvellement. En 2005 a été montré que les cellules qui résistent au 5FU sont des cellules qui sont en G0 du cycle cellulaire c’est-à-dire que se sont des cellules qui ne se divisent pas. Les cellules souches sont donc des cellules quiescentes. Tri des cellules par cytométrie en flux donne les informations suivantes : • Très rares: ~1/10.000 cellules • Indifférenciées: « lineage negatives » (Lin-) • Expriment (CD34+), CD133, c-kit • Haute activité d’aldehyde deshydrogénase • Capables d’effluer des colorants (Rhodamine, Hoechst) par des transporteurs ABC: ABSG2 et MDR1: cellules SP-1 : grâce à cette capacité, on a pu identifier des CS dans différents tissu dont le tissu mammaire. • Capables de reconstituer l’hématopoïèse • Cellules quiescentes 4. Caractéristiques des CSH • Existent dans de nombreux tissus • 2 modes de divisions - symétriques pour assurer leur renouvellement - asymétrique pour produire 1 CS et une cellule qui peut s’engager dans Page 7 sur 14 M1 UE CANCERO Groupe Cours du 23/09/11 de 16h à 17h KUNTZ Salomé & LACAN Laure C11 L. Mauvieux la différenciation : on parle de polarisation de la CSH. Au moment de la division, si les cellules sont polarisées, elles donnent 2 cellules avec des constituant différents. La polarisation donne l’orientation du fuseau mitotique qui oriente la division : 1 cellule proche de la niche (stroma) qui est la future CS et l’autre plus éloignée de la niche hématopoïétique qui va se différencier (séparation physique). NB : Protéine numb impliquée dans plusieurs voies de signalisation • La régulation de ces phénomènes se fait dans une « niche », qui permet: Les interactions avec le stroma auxquelles elles adhèrent La persistance et la quiescence des CS La production de cellules plus matures Dans la moelle osseuse, le nombre de cellules souches hématopoïétique reste relativement constant en absence de perte de sang ou d’autres traumatismes. L’état de quiescence est corrélé avec leur caractère multipotent. IV. Organisation de la quiescence/différenciation moelle hématopoïétique : régulation A noter que : • La majorité des CSH est quiescente • En cas de « stress » (perte sanguine par ex): Sortie de la quiescence Expansion rapide Différenciation rapide Les cellules dormantes sont présentes contre les ostéoblastes qui font partie intégrante de cette moelle. Si une différenciation est nécessaire, ces cellules passent dans un compartiment vasculaire, déroulent le système de différenciation, de maturation pour passer enfin dans la circulation générale. A. La niche hématopoïétique adulte – niche ostéoblastique Rappel : Moelle hématopoïétique: zone osseuse et zone vasculaire, siège de l’hématopoïèse: la « niche hématopoïétique » Zone « osseuses » sont composées de travées osseuses bordées de cellules qui fabriquent l’os: les ostéoblastes. Les cellules souches quiescentes sont au contact de ces ostéoblastes et avec lesquelles de très nombreuses interactions existent (maintenance de la quiescence). Ces CSH quiescentes, en réponse à différents stimuli, vont s’activer, se déplacer dans la zone vasculaire et se diviser, se différencier progressivement tout en se multipliant, pour sortir de la moelle via les nombreux vaisseaux sanguins de la M.O et circuler dans le sang. Les mécanismes de communication entre la zone « enosteale » et la zone « vasculaire » sont encore très peu connus. Page 8 sur 14 M1 UE CANCERO Cours du 23/09/11 de 16h à 17h C11 L. Mauvieux Groupe KUNTZ Salomé & LACAN Laure La niche hématopoïétique : • Au contact de l’endosteum et des sinus veineux • Au contact de cellules stromales: « cellules souches mésenchymateuses » • Au contact de fibres nerveuses adrénergiques qui gouvernent un rythme circadien de mobilisation des cellules souches Quels sont les mécanismes pour savoir si la cellule doit rester quiescente ou pas ? En cas de stress, la CS est induite à se différencier. L’équilibre entre quiescence et prolifération est étroitement régulé: Mécanismes intrinsèques et extrinsèques de la CSH En interaction avec leur micro-environement (niche) La connaissance de ces mécanismes permet de mieux utiliser les greffes de moelle B. REGULATION DE LA QUIESCENCE 1. Régulation positive - Mécanismes extrinsèques a) Rôle des ostéoblastes (OB) – Situés à l’interface os/moelle fabriquent la trame osseuse supportent le développement des CSH: Page 9 sur 14 M1 UE CANCERO Groupe Cours du 23/09/11 de 16h à 17h KUNTZ Salomé & LACAN Laure C11 L. Mauvieux – Leur nombre est corrélé avec le nombre de cellules quiescentes (maintenance de la dormance) (Visnjic, 2004) – La co-transplantation de d’ostéoblastes avec les cellules souches augmente la prise de greffe (Tachman, Hematology 2000) – interaction CSH-OB: Attachement de la CSH à l’endostéum Sécrétion de facteurs impliqués dans ces interactions (Stem cell factor, angiopoietine-1, thrombopoietin) Si le nombre d’ostéoblastes est diminué: on a une diminution de la cellularité dans la moelle osseuse et une diminution des cellules hématopoïétiques en dehors de la moelle osseuse. Expérience pour prouver les préférentielles des CSH avec les OB : interactions Cellules souches Lin- : - marquées à la fluorescéine - Injectée à une souris témoin - analyse 15h après Localisation des cellules souches au niveau de l’endostéum, au contact des ostéoblastes => Interactions préférentielles b) Signalisation par c-kit • C-kit est un récepteur de surface à activité tyrosine kinase (=CD117) exprimé par les CSH • son ligand est le Stem cell factor (SCF), secrété par les ostéoblastes • La signalisation kit-SCF est essentielle pour la maintenance de la quiescence • Les souris avec mutation de SCF ont une capacité très réduite de formation de CFU-S et d’activité de cellules souches Représentation schématique des voies de signalisation principales médiées par c-kit dans les cellules souches hématopoïétiques. - promotion de l’auto-renouvellement via l’activation de STAT3 et STAT 5 - Activation de PIP3=> activation AKT=>inactivation du facteur de transcription O3A (47) and activation de la voie des protéines kinases mitogéniques. On a deux voies principales : Voie Jak 2 -> STAT 2 -> protéine clef pour l’auto-renouvellement de la cellule Voie PI3K -> AKT -> provoque l’expression de protéines de l’autorenouvellement. Si on a une mutation de c-kit, on a une mutation de l’activité tyrosine kinase et une dérégulation de la quiescence. Page 10 sur 14 M1 UE CANCERO Cours du 23/09/11 de 16h à 17h C11 L. Mauvieux Groupe KUNTZ Salomé & LACAN Laure c) Signalisation Tie-2 / Angiopoietine 1 • CSH hématopoietiques expriment le recepteur à activité Tyrosine kinase Tie-2 • Les ostéoblastes expriment le ligand de Tie-2: Ang1 • Tie2/Ang-1 active l’intégrine B1 et la N-Cadherine => interactions avec la matrice EC et les ostéoblastes • => empêche la division celllulaire • => maintient la quiescence • =>favorise la survie de la CSH La cellule souche exprime des molécules qui vont interagir avec les ostéoblastes dans la niche hématopoïétique. Ces cellules hématopoïétiques expriment la Ncadhérine qui l’amorce sur l’ostéoblaste. Il y a également la présence de Ang1 et Tie2 qui sont associés à la quiescence de ces cellules. d) Environnement hypoxique • Zone endostéale loi des capillaires: zone hypoxique • Les cellules souches sont retrouvées en plus grand nombre dans les zones Page 11 sur 14 M1 UE CANCERO Groupe Cours du 23/09/11 de 16h à 17h KUNTZ Salomé & LACAN Laure C11 L. Mauvieux hypoxiques • Se lie avec des marqueurs de l’hypoxie (pimonidazole) • L’hypoxie entraine la stabilisation de HIF1a qui entraine l’expression dans le stroma de gènes comme c-kit, sDF1 Les cellules survivent dans ces conditions, il y a une corrélation entre le degré d’hypoxie et le nombre de CSH. Plus le degré d’hypoxie est élevé, plus le nombre de CHS augmente. e) Le gradient calcique • Les concentrations de Ca++ sont plus importantes près de l’endostéum • Les CSH expriment des senseurs du Ca++ • Favorise les interactions entre le CSH et la niche hématopoiétique • Les CSH dans lesquelles ont a invalidé les senseurs du Ca++: Perte de la capacité de greffe Incapable de se localiser dans la niche endostéale Mécanismes intrinsèques ( pas à retenir) • Facteur de transcription Gfi-1 et pbx1, GATA-2 • P53 • SCL-Tal • Interferon regulatory factor 2 • Inhibiteurs des Cyclin dependant kinase: p21, p57 • Phosphatase pTEN • Régulateur du cycle cellulaire ATM • Dérivés réactifs de l’oxygène 2. Régulation négative – Mécanismes extrinsèques : voie Hedge Hog (pas développé en cours) C’est un environnement complexe, impossible à reproduire in vitro. La complexité de l’interaction de la CSH avec son environnement est comparable à celle d’une synapse. C. MOBILISATION DE LA CELLULE SOUCHE • Les ostéoblastes comme les cellules réticulaires de la niche vasculaire expriment CXCR4, un récepteur qui se lie de façon spécifique à la chemokine CXCL12 • G-CSF (granulocyte-growth stimulating factor) =>Disparition des macrophages qui entraîne le détachement des cellules de la niche et leur différenciation. Baisse de la synthèse par les OB: V-CAM, c-kit, ang-1 baisse très importante de CXCL12 et le passage dans la circulation sanguine • Un nouveau médicament, le AMD3100 (genzyme) est un antagoniste de cette liaison et permet d’augmenter considérablement la mobilisation des cellules souches. Page 12 sur 14 M1 UE CANCERO Cours du 23/09/11 de 16h à 17h C11 L. Mauvieux Groupe KUNTZ Salomé & LACAN Laure La méthode pour faire CS est le facteur de croissance qu’on injecte au patient et qui entraine modifie et les CH vont s’activer et on va branche SYNTHESE • Les CSH intègrent des signaux qui proviennent de l’interaction avec: les ostéoblastes, les cellules réticulaires (mésenchymateuses) mais aussi du micro-environement médullaire qui est ouvert notamment en raison de la riche vascularisation de la moelle osseuse Régulation fine de l'homéostasie dans les niches hématopoïétiques • Comment peut s’opérer la différenciation et l’expansion des cellules hématopoïétiques? • Comment ces mécanismes se mettent-ils en place ? Régulation simultanée: • Auto-renouvellement de la CSH • Engagement dans la différenciation • Spécification de la lignée • Homéostasie Mécanismes: • Machinerie transcriptionnelle (intrinsèque) • Signaux extrinsèques: cytokines, facteurs de croissance Contrôle intra-cellulaire: facteurs de transcription Contrôle extra-cellulaire: facteurs de croissance, cytokines Différenciation des CSH • CSH médullaires vont se différentier vers polynucléaires PNN ou PNE ou PNB, Globules rouges (GR) Mégacaryocytes (plaquettes) Lymphocytes (B,T, NK) Page 13 sur 14 M1 UE CANCERO Cours du 23/09/11 de 16h à 17h C11 L. Mauvieux • action intriquée de nombreux facteurs Facteurs de croissance, interleukines Molécules d’adhésion Facteurs de transcription • 2 modèles d’étude: Par les gènes spécifiques de la lignée Par les déficits Pathologies Souris KO Page 14 sur 14 Groupe KUNTZ Salomé & LACAN Laure
