Cours 5

Partie 2
4 et 5.3.09
Revenons un peu en arrière….
Sur la capacité inductrice de
la lèvre dorsale du blastopore
Une expérience ancienne, mais déterminante !
Expérience de Spemann
et Mangold (1924)
Analyse histologique
Conclusion:
L’analyse histologique met en évidence deux axes embryonnaires
complet.
La distribution du pigment révèle les contributions respectives de
l’implant et des tissus de l’hôte:
- chorde
- région proximale des somites
- toit de l’archentéron de l’embryon secondaire
La lèvre dorsale est
un tissu inducteur =
centre de Spemann
Conclusion
Les cellules de l’embryon en segmentation
sont déterminées.
(cellules inductrices)
Molécules inductrices sécrétées
(cellules cibles)
Récepteurs spécifiques
Signalisation > protéines cytoplasmiques
Réponse cellulaire
Les cultures de blastomères isolés mettent en évidence
un processus d’induction
V
D
Les blastomères dorso-végétatifs
forment un centre inducteur
= centre de Nieuwkoop
expériences de Nieuwkoop (1980)
Les cellules de la zone marginale dorsale (ZMD) répondent
à des facteurs diffusibles et constituent le centre de
Spemann >>> dorsalisation
V
D
centre de Spemann
Voir expérience de Spemann et Mangold (1924)
5) Recherche de molécules participant à
l’induction du mésoderme
5.1. Identifier et quantifier les molécules responsables
Techniques
Détection:
ARN: hybridation « in situ »
(sondes spécifiques)
Protéines: immunolocalisation
(anticorps spécifiques)
Quantification
ARN: Northern blot
Protéines: Western blot
Vésicule
germinative
Exemple: hybridation « in situ » avec une sonde « Vg1 »
(ovocyte au stade prophase I)
Quantifier les ARN par Northern Blot
•
On prélève le tissu d’intérêt et
on extrait les ARN totaux
•
On fait migrer les ARN sur un
gel d’electrophorèse
•
On transfert les ARN sur une
membrane de nitrocellulose
•
On dépose sur la membrane
une sonde radioactive
(spécifique de l’ARN d’intérêt)
•
On révèle par
autoradiographie
Quantifier les protéines par Western Blot
- Extraction des protéines
- Migration
- Transfert
- Révélation par un anticorps
couplé à une molécule qui
colore un substrat
Tests in vitro
Dissection du toit d’un embryon au stade blastula
Incubation des cellules avec une molécule à tester
¾ Analyse histologique
- Nature des structures induites?
- Recherche des marqueurs dorsaux ou ventraux?
Tests in vivo (1)
1) Irradiation du pôle végétatif par des rayons U.V.
¾ Résultat: absence de structures dorsales
2) Injection de l’ARNm d’un inducteur potentiel:
¾ Question: restauration de structures dorsales?
Tests in vivo (2)
Injection dans un blastomère végétatif de la région
ventrale d’un ARNm codant pour une protéine à tester
Question: production d’un axe surnuméraire?
5.2. Identification de facteurs inducteurs du mésoderme:
des facteurs de croissance
Parmi l’ensemble des facteurs de croissance, 2 familles
identifiées :
-FGF (Fibroblast Growth Factor)
-TGFβ (Transforming Growth Factor)
Peptides de masse moléculaire de 15 à 35 kDa
Remarque: chez l’adulte, les facteurs de croissance
influencent la prolifération et la différenciation cellulaires.
FGF = Fibroblast Growth Factor
Fixation du FGF
Dimérisation du récepteur
Phosphorylation des tyrosines
cytoplasmiques
Deux voies de signalisation
activées
¾une voie requise: MPAK
Chez l’amphibien, au moins 4 FGF identifiés, localisés
dans les blastomères végétatifs
Expérience:
+ FGF
V
D
Voie MAPK
On note une modification d’expression
de gènes cibles (exemple: Xbra =
Xenopus brachyury)
Résultat: induction de mésoderme
Conclusion: les FGF sont des candidats
TGFβ, famille d’une
trentaine de
molécules:
Sous-famille des
activines, Vg1,
Nodal, et BMP
Récepteur
hétérodimérique
Sérine, thréonine
kinase
Phosphorylation
des smad, médiateurs
intracellulaires de
signalisation
Translocation et
modulation de la
transcription
Les TGFβ inducteurs de mésoderme?
Activine A
culture de cellules + activine A Induction de structures
endodermiques
mésodermiques
(cellules musculaires,
Smith, (1987)
corde)
Mais…..
1) Expression du messager après la transition blastuléenne
2) Effet dépendant de la dose
Conclusion: il existe d’autres facteurs plus précoces
Vg1
Autre approche: biologie moléculaire
¾ recherche d’ARNm exprimés uniquement
dans les blastomères végétatifs
Melton, 1987
- Vg1 présent dans l’ovocyte I (forme inactive dans
l’hémisphère végétatif) (voir marquage in situ plus haut)
- Activation de Vg1 suite à la réaction corticale et
l’activation d’une protéase
Des ARNm et des protéines
sont concentrés au niveau
du cortex de l’hémisphère
végétatif
Vg1
Vg1
Au cours de la segmentation, répartition différentielle
des constituants dans les blastomères > Vg1 (ARNm)
est enrichi dans les blastomères végétatifs dorsaux
Expériences:
1)
calotte animale + Vg1
mésoderme dorsal
2)
Restauration d’un axe embryonnaire (structures
dorsales) surnuméraire si l’ARNm est injecté dans un
blastomère végétatif ventral au stage morula
Conclusion: Vg1 est un composant du centre inducteur
de Nieuwkoop.
Nodal
Gradient spatio-temporel d’expression chez la blastula:
cellules végétatives dorsales > ventrales
Expérience indirecte
+ injection d’un fragment
de la protéine: effet
inhibiteur de la fixation de
nodal sur son récepteur
¾ Résultat: absence de
cellules de chorde,
musculaires et sanguines
Wnt
Wnt = contraction de Wingless (wg) et de int(integration site)
Protéines de signalisation
Récepteurs: frizzled (Fzd) et LRP
Mais…..16 membres chez le xénope ! !
Conclusion
Plusieurs facteurs de croissance sont impliqués dans la formation du
mésoderme: FGF, Vg1, Nodal…
Question: dans les sous-familles Wnt et BMP (famille TGFβ),
quel facteur est plus précisément impliqué?
5.3. Les facteurs de croissance impliqués
provoquent un changement d’expression du génome
grâce à des facteurs de transcription spécifiques
Recherche de facteurs de transcription spécifiques
et de protéines régulatrices cytoplasmiques et/ou
sécrétées
Parmi ces protéines de signalisation…
Dsh (Dishevelled), protéine cytoplasmique
GSK3, Glycogen-synthase kinase-3
β-caténine, facteur de transcription et…
protéine de jonction !
Revenons à l’ovocyte fécondé…
Distribution des ARNm et des protéines stockés
ARNm Vg1
Protéine Dsh, dishevelled
La protéine Dsh (Dishevelled) est ancrée aux
microtubules, concentrée dans la région du
pôle végétatif
La distribution de Dsh n’est plus uniforme:
enrichissement dans la future région dorsale
Dsh est une protéine cytoplasmique intermédiaire
dans la voie de signalisation Wnt
Conclusion:
En absence de Wnt, GSK3 est active, et une fraction importante de
la β-caténine est dégradée
En présence de Wnt, GSK3 est inhibée, la β-caténine est libérée
du complexe, et peut agir comme facteur de transcription
Conséquence
Si cette hypothèse est
correcte, on doit retrouver
des protéines impliquées
dans le signal comme la
β-caténine
Localisation de la β-caténine en début de gastrulation,
par une technique d’immunofluorescence.
Blastocèle
La ß-caténine est
prépondérante dans
la future région
dorsale
La β-caténine elle-même répond-elle aux critères
d’inducteur de dorsalisation?
Expérience:
Injection de
β- caténine
dans la région
ventrale
Résultat: obtention d’un embryon double,
comme lors de la greffe ventrale de la lèvre
dorsale du blastopore dans l’expérience de
Spemann et Mangold !
Dans la famille Wnt, quel est celui (ou ceux)
qui provoque(nt) la synthèse de β-caténine ?
Expérience: les cellules sont
incubées en présence de
différents facteurs Wnt et on
mesure l’expression de ßcaténine (ARNm, technique
du Northern blot)
ß-caténine
Conclusion: Xwnt-8 est un bon candidat pour induire la
synthèse de ß-caténine
Expérience in vivo (sur embryon entier)
Les embryons sont incubés avec ou sans Xwnt-8 et on
observe ensuite où est localisée la β-caténine
(immunohistochimie)
Contrôle
+ Xwnt-8
Résultat: l’expression semble plus importante et la
localisation devient également nucléaire
Conclusion:
Xwnt-8
Stimule la synthèse et la
localisation nucléaire de
ß-caténine
Dorsalisation
Mais combien d’étapes entre ß-caténine et dorsalisation ?
Au niveau de la blastula
Micromères
(zone marginale dorsale
> mésoderme)
ß-caténine
Signaux de
dorsalisation
Récepteur Fzd/LRP
Macromères
(endoderme)
Xwnt-8
Xwnt-8
Centre de
Spemann
Centre de Quelques « acteurs »:
Nieuwkoop Vg1
Nodal (concentration élevée)
β-caténine
Suite:
- Comment la ß-caténine agit pour « dorsaliser » ?
- Quelle(s) cible(s) dans l’organisateur de Spemann ?
Toujours la même stratégie, chercher un gène qui ne
s’exprime que dans l’organisateur de Spemann
Un candidat? « Siamois »
Expérience:
B, C, D: la transcription de
Siamois est bloquée, et on
a injecté dans l’embryon:
B: ARNm de Xwnt8
C: ARNm de ß-caténine
D: ARNm de Siamois
E: Embryon témoin
Malgré Xwnt-8
ou β-caténine, pas de
dorsalisation:
Siamois est donc capital
et est en aval
de Xwnt-8 et de
β-caténine
L’expression du gène siamois est sous la dépendance
du facteur de transcription β-caténine
Conséquence
Xwnt-8
Localisation nucléaire de ß-caténine
Siamois
Dorsalisation
Quel est le rôle de Siamois ?
Expérience: effet de siamois
sur l’expression de gènes
cibles ?
Northern blot (ARNm)
Piste 3: Effet de Siamois
Nog = Noggin
Chd = Chordin
Noggin et chordin sont des protéines sécrétées
Conclusion: la synthèse de Noggin
et de Chordin est stimulée sous l’effet
de Siamois
Localisation et rôle de Noggin, Chordin ?
Chordin, Noggin et Siamois sont localisés dans la future région dorsale
(mesure des ARNm par Northern Blot)
Autre approche: transplantation d’une région marquée
(embryon bleu) et suivi des cellules descendantes (bleues)
En parallèle, suivi de l’expression de chordin
Cellules
Marquées
ARNm
Chordin
Lors de la gastrulation, les cellules qui expriment
chordin se trouvent dans la future région dorsale
Complétons le schéma…
Chordin, Noggin
Micromères
(zone marginale dorsale
> mésoderme)
Signaux de
dorsalisation
Siamois
ß-caténine
Récepteur Fzd/LRP
Macromères
(endoderme)
Xwnt-8
Xwnt-8
Noggin et chordin sont des protéines sécrétées
Elles induisent un axe secondaire et des
structures dorsales
¾ Elles répondent par conséquent aux
critères expérimentaux
Comment Chordin contribue à la dorsalisation?
En empêchant BMP4 d’agir (Bone Morphogenetic Protein 4)
(Famille TGFβ)
BMP4: induit du mésoderme ventral et latéral, protéine
sécrétée.
Les ARNm sont présents dans les cellules de la blastula
Expérience: injection de l’ARNm dans un blastomère
dorsal (stade 4) > embryon ventralisé
Conclusion: effet antagoniste par rapport aux facteurs
de transcription dorsalisants
Chordin et Noggin inhibent la fixation de BMP4 sur son récepteur
Famille des TGFβ
Chordin
Noggin
Signalisation:
Voir précédemment
Phosphorylation de Smad1 et de
Smad5 qui agit avec Smad4.
Complexe de transcription qui
notamment inhibe les gènes de
différenciation nerveuse
(neurectoderme)
ET DONC… !
ventralisation
Chordin, Noggin
sécrétées
BMP4
Micromères
Chordin, Noggin
Siamois
dorsalisation
ß-caténine
Récepteur Fzd/LRP
Macromères
(endoderme)
Xwnt-8
Xwnt-8
Action antagoniste de Xwnt et BMP4
Bien sûr, d’autres molécules interviennent dans ce processus
complexe ! ! Exemple de quelques gènes exprimés dans le
centre ventral et l’organisateur de Spemann