Activation des intégrines et adhérence des leucocytes et des

Revue
Hématologie 2006 ; 12 (1) : 21-33
Activation des intégrines et adhérence
des leucocytes et des plaquettes
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Nouvelles données sur des voies
de signalisation communes
Leukocyte and platelet integrin activation and adhesion
New data on common signaling pathways
Mohamed Bouaouina
Lise Halbwachs-Mecarelli
INSERM U507, Hôpital Necker,
161 rue de Sèvres, 75015 Paris
<[email protected]>
Résumé. Une caractéristique des leucocytes et des plaquettes est leur passage très
rapide de l’état circulant à l’état adhérent, sous l’effet de stimuli inflammatoires ou
thrombotiques. Ce passage se fait grâce aux intégrines, qui changent de conformation pour acquérir une affinité pour des substrats d’adhérence. Des signalisations
complexes, dites signalisation inside-out conduisent ainsi à l’activation des intégrines b2 dans les leucocytes et de l’intégrine aIIbb3 dans les plaquettes. Les patients
ayant un déficit d’adhérence leucocytaire de type III (LAD-III ou variants LAD-1)
souffrent d’infections sévères et de saignements, dus à un défaut de signalisation
inside-out se traduisant par un défaut d’activation des intégrines sur les leucocytes
et les plaquettes. Ce déficit d’adhérence révèle ainsi l’existence d’éléments
communs de signalisation inside-out d’activation des intégrines des cellules du
système hématopoïétique. Cette revue, centrée sur les intégrines b2 du neutrophile
et aIIbb3 des plaquettes, donne la vision actuelle que l’on peut avoir de la structure
de ces intégrines et de leurs changements vers une conformation de forte affinité
pour leurs ligands. L’ensemble des fonctions des neutrophiles et des plaquettes
faisant intervenir les intégrines est détaillée. La dernière partie rapporte les
données les plus récentes concernant les voies de signalisation inside-out, déclenchées par différents stimuli dans les cellules hématopoïétiques, pour en souligner
les points communs.
Mots clés : neutrophile, plaquette, intégrine, adhérence, LAD
Abstract. A peculiar feature of leukocytes and platelets is their rapid switching from
a circulating to an adhesive status, upon activation by inflammation or thrombotic
stimuli. This is due to the rapid conformational change of their integrins, which
acquire an affinity for adhesion substrates. Complex “inside-out” signaling
pathways lead to b2 integrin activation in leukocytes and aIIbb3 integrin activation
in platelets. Patients with leukocyte adhesion deficiency type III (LAD-III or LAD1variant) suffer from recurrent infection and from easy bruising, due to a defective
“inside-out” signaling that prevents integrin activation in both leukocytes and
platelets. This adhesion deficiency underscores common features of “inside-out”
signaling leading to integrins activation in hematopoietic cells. The present review
is focused on neutrophil b2 integrins and platelet aIIbb3 integrin. It gives the most
recent data on integrins structure and describes the conformational change leading
to the high affinity for ligands. Neutrophil and platelet functions involving integrins
are detailed. It reviews extensively the present knowledge on integrin “inside-out”
signaling pathways triggered by various stimuli in hematopoietic cells.
Correspondance et tirés à part :
L. Halbwachs-Mecarelli
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
Key words: neutrophil, platelet, integrin, adhesion, LAD
21
L
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a particularité des leucocytes et des plaquettes,
en termes d’adhérence cellulaire, réside dans la
rapidité avec laquelle ces cellules passent de
l’état circulant à l’état de cellules adhérentes.
Entraînées passivement par le flux sanguin, les
plaquettes s’immobilisent instantanément à la surface de
l’endothélium lésé et s’agrègent pour former le thrombus. De
même, les leucocytes ralentissent au contact de l’endothélium
activé par des stimuli inflammatoires et, en quelques minutes,
adhèrent fermement à cet endothélium pour entreprendre une
migration à travers les tissus. Les molécules qui permettent
aux cellules d’effectuer ce changement sont principalement
les intégrines, c’est-à-dire des protéines transmembranaires
exposées sur leur membrane plasmique et capables de lier
des ligands cellulaires ou matriciels. En effet, les intégrines
leucocytaires et plaquettaires (intégrines b2 et aIIbb3, comme
nous le verrons en détail, mais aussi intégrines b1) sont
susceptibles de passer très rapidement d’une conformation
inerte à une conformation active ayant une forte affinité pour
les ligands.
L’importance des processus d’adhérence des leucocytes et
des plaquettes a été en grande partie révélée par l’observation de déficits génétiques touchant les intégrines : chez
l’homme, le déficit génétique en chaîne b2 de l’intégrine est
à l’origine d’un syndrome sévère, le déficit d’adhérence
leucocytaire de type 1 ou leukocyte adhesion deficiency
type 1 (LAD-1), responsable chez l’enfant d’infections bactériennes récurrentes létales. Ce déficit se traduit par une
incapacité des cellules de l’immunité innée (neutrophiles et
macrophages) à adhérer à l’endothélium vasculaire, à transmigrer vers les sites inflammatoires et à effectuer d’autres
fonctions dépendantes de l’adhérence et cruciales dans la
réponse immunitaire, comme la phagocytose, l’explosion
respiratoire, la dégranulation. De la même façon, le déficit
génétique en intégrine plaquettaire aIIbb3 (GPIIbIIIa) se traduit par une pathologie, connue sous le nom de thrombasthénie de Glanzman, caractérisée par de graves troubles hémorragiques dus à un défaut d’agrégation des plaquettes.
22
Plus récemment, un nouveau déficit génétique, touchant la
fonction des intégrines à la fois des leucocytes et des plaquettes, a été décrit sous le nom de LAD-III ou LAD I-like. À ce jour,
quatre patients ont été décrits [1-4] avec un syndrome caractérisé par des infections à répétitions dues à un défaut
d’adhérence des cellules de l’immunité, et par des saignements dus à un défaut d’adhérence des plaquettes. Les
cellules de tous ces patients exprimaient des taux normaux
d’intégrines. Cependant, les leucocytes et les plaquettes de
ces patients présentaient un défaut fonctionnel de leurs intégrines, ce qui n’était pas le cas des autres cellules de
l’organisme. Si la nature exacte de ce déficit est encore
inconnue, il touche un élément de signalisation commun aux
cellules du système hématopoïétique et impliqué dans le
passage des intégrines de leur conformation inerte vers leur
conformation active. Cette observation révèle l’existence de
voies communes de transduction, mises en jeu par toute une
variété de stimuli inflammatoires et thrombotiques pour aboutir à l’activation des intégrines leucocytaires ou plaquettaires.
Nous nous proposons de passer ici en revue ces voies de
signalisation.
Présentation des intégrines
et de leurs ligands
Les intégrines forment donc une famille de récepteurs transmembranaires [5] permettant aux cellules d’adhérer à différents substrats et ligands solubles, exposés par la matrice
extracellulaire ou exprimés par les cellules de l’organisme.
Ces récepteurs sont des hétérodimères composés de deux
sous-unités ab liées de façon non covalente. Chez les mammifères, 18 chaînes a et 8 chaînes b ont été décrites, mais on ne
compte que 24 combinaisons (ou récepteurs) ab. Les intégrines sont classées selon le type de la chaîne b partagée par
différentes chaînes a, qui détermine un répertoire spécifique
de ligands. Elles sont synthétisées et glycosylées au niveau du
Golgi, où elles s’associent en dimères. Cette association est
une condition obligatoire à la stabilité et à l’expression du
dimère au niveau de la membrane.
Les intégrines partagent entre elles la même structure, qui
comprend un large domaine extracellulaire et un domaine
cytoplasmique court, séparés par une portion transmembranaire (figure 1).
Les segments extracellulaires des intégrines sont asymétriques et forment une « tête » globulaire portée par deux
« pieds » ancrés dans la membrane. Ces derniers possèdent,
au niveau de leur structure, un domaine flexible, ou
« genou », qui permet au récepteur exprimé à la membrane
d’adopter une forme fléchie ou une forme tendue (encart
figure 1).
La partie globulaire de l’hétérodimères ab assure la fonction
d’adhérence du récepteur grâce à la présence d’un ou deux
domaines I : l’inserted domain (I), encore appelé domaine A
en raison de son homologie avec le domaine A du facteur
von Willebrand [6] (FVW), représente le site d’interaction
avec le ligand. Il est présent dans la moitié des sous-unités a et
dans toutes les sous-unités b, avec une structure très similaire
appelée I-like. Le domaine I-like joue un double rôle, selon
que la chaîne a associée porte ou non un domaine I. Quand
le domaine I de la sous-unité a est absent (par exemple la
chaîne aIIb de l’intégrine plaquettaire aIIbb3), la liaison avec
le ligand est totalement assurée par le domaine I-like de la
chaîne b. Dans le cas des intégrines leucocytaires b2, la
chaîne a (aM, aL, aX et aD) possède un domaine I qui assure la
liaison avec le ligand. Le domaine I-like de la sous-unité b
devient alors un domaine régulateur de son homologue I
[7, 8].
La spécificité de l’interaction est régie par une séquence
déterminant la spécificité du ligand SDL (specificity-determing
loop), située au niveau des domaines I et I-like.
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
Activation
DOMAINE EXTRACELLULAIRE
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Inactivation
Thigh
Calf
1
E2E1
Hybride
E3
I-like
Calf
2
E4
I
Domaine
transmembranaire
Domaine
intracellulaire
Figure 1. Structure de l’intégrine.
L’intégrine (inactive) sous sa conformation de faible affinité est fléchie, la sous-unité a recouvrant la sous-unité b. Le domaine
extracellulaire est composé de :
- la chaine a, formée par les domaines : Calf-2, Calf-1, Thigh et b-propeller, porteur d’un domaine I (aM,L,X,D...) ou non (aIIb) ;
- la chaine b, formée par les domaines : b-TD, E4, E3, E2, E1 ainsi que le domaine Hybride porteur d’un domaine I-like.
Les jonctions Calf-1/Thigh ainsi que E2-E1/Hybride sont flexibles. Ceci permet à l’intégrine de se redresser lors de son activation
(encadré). Le domaine intracellulaire est court et porteur de plusieurs sites d’interaction avec des composants cytoplasmiques.
Les études cristallographiques du domaine I de la chaîne aM
ont mis en évidence deux conformations possibles en relation
directe avec la fonction du récepteur ab :
– La conformation fermée, de bas niveau énergétique et
adoptée par défaut par l’intégrine à la surface de la cellule
circulante, correspond à l’état inactif de faible affinité pour le
ligand ;
– La conformation ouverte, induite, dépendante des cations
(Mg2+, Mn2+) et à plus haut niveau énergétique, correspond
à l’état actif de forte affinité pour le substrat. C’est le substrat
lui-même qui stabilise l’état actif de l’intégrine en liant le
domaine I/I-like au niveau d’un site de liaison appelé MIDAS
(metal ion-dependant adhesion site).
Ainsi l’intégrine, selon l’état de son domaine I/I-like, peut ou
non lier son ligand. En effet, cette liaison se fait entre le site
MIDAS du domaine I et un motif RGD (arginine-glycine-acide
aspartique), présent sur le substrat : les cations, dont dépend
l’interaction, établissent des liaisons avec les résidus du
domaine I d’une part et avec le résidu glutamine du motif
RGD d’autre part.
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
Les deux pieds de l’intégrine sont formés de domaines
différemment articulés les uns par rapport aux autres : quatre
domaines de la famille des facteurs de croissance EGF
(epidermal growth factor-like), se caractérisant par leur structure rigide et deux domaines Calf(mollet)-1 et Calf-2 solidement liés entre eux. Ils forment ainsi une sorte de tige
soutenant la partie de « tête » N-terminale.
Par ailleurs, les liaisons entre les domaines thigh (cuisse) et
Calf-1 de la chaîne a, ou les domaines Hybride et EGF de la
chaîne b sont flexibles à la manière d’un genou permettant à
la partie N-terminale de l’intégrine de s’articuler entre une
position droite et une position fléchie.
Les domaines intracytoplasmiques courts des deux sousunités de l’intégrine n’ont aucune fonction enzymatique intrinsèque (kinase, phosphatase...) mais ils participent directement à la régulation de l’activation et de la signalisation des
intégrines. En effet, ils interagissent avec différentes molécules cytoplasmiques [9-11], dont certaines sont critiques pour
l’activation de l’intégrine, comme nous le verrons par la suite.
23
Ligands des intégrines
La séquence RGD (arginine-glycine-acide aspartique) est
présente dans de nombreuses protéines ligands des intégrines [12], qu’il s’agisse de protéines matricielles, de protéines
glycosylées de surface des cellules ou de protéines solubles.
Ce motif est universellement reconnu par plusieurs intégrines.
D’autres peptides, comme GFOGER [13], reconnu sur le
collagène par l’intégrine a2b1, ou KQAGDV [14], reconnu
sur le fibrinogène par l’intégrine aIIbb3, participent notamment au recrutement des plaquettes.
Intégrines leucocytaires ayant en commun
la chaîne b2 (CD18)
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Cette sous-famille d’intégrine est spécifique aux leucocytes.
Elle
comprend
quatre
intégrines :
aLb2
(LFA-1,
CD11a/CD18), aMb2 (Mac-1, CD11b/CD18), aXb2
(CD11c/CD18) et aDb2, présentant des panels d’expression
différents. L’intégrine aLb2 est la plus exprimée sur les lymphocytes, alors que aMb2 est la principale intégrine des
polynucléaires neutrophiles et des monocytes. L’isoforme
aXb2 s’exprime aussi sur les lymphocytes, les macrophages
et les cellules NK (natural killer). L’isoforme aDb2 n’est
présent que sur les macrophages.
Dans les polynucléaires circulants, les réserves d’intégrines
b2 sont majoritairement stockées dans les granules spécifiques et les vésicules de sécrétion et sont rapidement mobilisables sous l’effet de faibles concentrations d’agonistes.
Les intégrines b2 sont des récepteurs d’adhérence pouvant
lier différents substrats tels que : ICAM-1, ICAM-2, le fibrinogène, le facteur X, iC3b, le plasminogène... Les intégrines
aMb2 (aussi appelée CR3, complement receptor 3) et aXb2
(CR4) sont des récepteurs pour le facteur du complément
iC3b. Elles participent à ce titre à la réponse immune en
interagissant avec les pathogènes opsonisées par le complément et coopèrent avec d’autres récepteurs comme le CR1 et
les récepteurs FccR au cours du processus de la phagocytose.
Intégrines plaquettaires
Intégrine aIIbb3(GPIIb,IIIa)
aIIbb3 est l’intégrine plaquettaire type, exprimée exclusivement dans les cellules du lignage mégacaryocytaire. L’hétérodimère aIIbb3 est fortement exprimé dans les plaquettes
matures (environ 100 000 copies par plaquette), au niveau
de la membrane plasmique et des granules cytoplasmiques,
où il représente une réserve mobilisable après activation de
la plaquette.
L’intégrine aIIbb3 joue un rôle physiologique primordial dans
l’homéostasie et l’agrégation plaquettaire. aIIbb3 est une
molécule d’adhérence pouvant lier plusieurs types de substrats solubles ou immobilisés sur une surface : le facteur von
Willebrand (FVW), le fibrinogène, la fibronectine, la vitronectine, la thrombospondine...
Intégrine a2b1
24
L’intégrine a2b1 a été le premier récepteur aux collagènes
(type I, II et IV) identifié sur la plaquette. Dans la plaquette au
repos, l’intégrine a2b1 se lie très faiblement au collagène
soluble. En revanche l’activation de la plaquette potentialise
la liaison de a2b1 au collagène et cette intégrine joue alors un
rôle majeur dans l’adhérence des plaquettes à la matrice
sous-endothéliale lors de la thrombogenèse.
Enfin, aussi bien les plaquettes que les neutrophiles expriment
d’autres intégrines qui participent à leurs fonctions, comme
aVb3, a4b1, a5b1, a6b1 et a9b1.
Rôle des intégrines
dans les fonctions des neutrophiles
Les données exposées ici sur la structure, l’activation des
intégrines de la sous-famille b2 et sur leur rôle dans la
migration concernent tous les leucocytes, lymphocytes et
monocytes aussi bien que polynucléaires. La taille de cette
revue ne nous permet pas de développer toutes les fonctions
des leucocytes impliquant les intégrines. Nous nous concentrerons donc sur celles des polynucléaires neutrophiles
(figure 2). Le polynucléaire neutrophile est un acteur majeur
de l’inflammation [15]. Il est rapidement recruté sur les sites
inflammatoires et est un élément essentiel de la réponse
immune innée aux microbes, grâce au contenu toxique de ses
granules et à sa capacité à phagocyter et à tuer les particules
pathogènes, notamment par la production de dérivés toxiques de l’oxygène (reactive oxygen species, ROS). Il participe aussi au recrutement ultérieur des autres cellules immunitaires comme les monocytes/macrophages.
Adhérence ferme à l’endothélium
Ces particularités du neutrophile découlent de son aptitude à
passer d’un état circulant à un état adhérant, sous l’effet des
stimuli inflammatoires et ceci grâce aux propriétés dynamiques de ses intégrines. Il s’agit de la première étape du
recrutement du neutrophile au cours du processus inflammatoire. Elle met en jeu une étroite collaboration entre le
neutrophile et les cellules endothéliales qui tapissent la
lumière des capillaires pulmonaires et des veinules postcapillaires. À proximité immédiate d’un foyer infectieux
et/ou inflammatoire, les cellules endothéliales présentent à
leur surface des stimuli inflammatoires ainsi que des molécules d’adhérence particulières, les sélectines [16]. Les interactions réversibles des sélectines avec leurs ligands de la famille
des mucines amorcent :
– la décélération du neutrophile pris dans le flux sanguin
(rolling),
– l’activation des récepteurs du chimiotactisme du neutrophile au contact des stimuli exposés par l’endothélium (IL-8,
notamment).
Ainsi, naissent dans le neutrophile des signaux de préactivation (priming) qui déclenchent l’activation des intégrines leucocytaires b2. Le ralentissement du neutrophile permet
à ses intégrines de lier fermement leurs ligands endothéliaux,
de la famille des molécules d’adhérence intercellulaire (ICAM),
et d’immobiliser le neutrophile à la surface endothéliale.
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
Neutrophile circulant
Rolling
Polarisation - adhérence ferme
Transmigration de l’endothélium
PSGL-1
Intégrine β2
active
Intégrine β2
Inactive
Uropode
Front de
migration
ICAM-1
Sélectine
PECAM-1/
CD99
JAM
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Endothélium
Ligands matriciels
Bactéries opsonisées
Élimination du pathogène
Migration
Figure 2. Les différentes étapes du recrutement des neutrophiles sur les sites inflammatoires.
À l’approche du site inflammatoire, le neutrophile entre en contact avec l’endothélium activé par les stimuli inflammatoires. Les interactions
réversibles entre les sélectines et leurs ligands ralentissent la course du neutrophile et le mettent en contact avec les stimuli inflammatoires
exposés par l’endothélium. Ceci préactive le neutrophile et déclenche la signalisation inside-out activatrice des intégrines b2.
La liaison des intégrines b2 à leurs ligands ICAM-1 est à l’origine de la polarisation et de l’adhérence ferme du leucocyte.
Le neutrophile se meut sur la surface de l’endothélium par des réactions d’adhérence des intégrines au niveau du front de migration,
stabilisant les projections membranaires et une désadhérence au niveau de l’uropode, permettant sa rétraction et le recyclage des
intégrines vers l’avant.
Au niveau de la jonction endothéliale et en collaboration avec le neutrophile, les cellules endothéliales desserrent leur jonction et offrent au
leucocyte des ligands (JAM) de substitution pour ses intégrines b2, en plus des interactions homophiles des molécules PECAM-1 et CD99
lui permettant de progresser à travers l’endothélium vers la matrice.
La migration dans la matrice met en jeu, en plus des intégrines b2, d’autres types d’intégrines (b1, b3...) qui se lient à des ligands matriciels
divers.
Sur le site inflammatoire, les intégrines b2 participent au processus de phagocytose en liant spécifiquement le facteur C3 du complément
opsonisant des bactéries.
Locomotion et transmigration
L’engagement des intégrines avec leur ligand déclenche un
réarrangement du cytosquelette cellulaire autour de leur
partie intracytoplasmique, ce qui renforce leur ancrage dans
la cellule et permet l’adhérence ferme du neutrophile. Par
cette même réorganisation du cytosquelette, le neutrophile
adopte une forme polarisée [17] avec :
– La mise en place, vers l’avant de la cellule, d’un large front
de migration, site d’intense activité de polymérisation de
l’actine avec émission de filopodes et de lamellipodes.
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
Ces projections membranaires portent des intégrines qui les
stabilisent en adhérant et permettent ainsi l’avancement de la
cellule. Au niveau du front de migration du neutrophile, se
concentrent aussi les récepteurs aux chimioattractants qui, à
l’image d’un organe olfactif, lui permettent de s’orienter et
d’avancer dans le sens du gradient des stimuli chimioattractants ;
– La formation de l’uropode à l’arrière du corps cellulaire, où
le cytosquelette se contracte fortement et qui est le site de
décollement de la cellule. Ainsi, l’étalement vers l’avant de la
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cellule est compensé par un décollement à l’arrière. Le corps
cellulaire, au milieu, joue un rôle régulateur et est traîné sur le
substratum au cours du mouvement.
Le déplacement des leucocytes sur l’endothélium et dans les
tissus s’opère ainsi par un processus continuel de réactions
d’adhérence et de dé adhérence au substrat, orienté par les
récepteurs aux chimioattractants. Au cours de ce processus,
les intégrines, actives à l’avant vers le front de migration et
souvent assimilées aux chenilles d’un char d’assaut, se retrouvent progressivement à l’arrière en raison de l’avancement
de la cellule. Elles perdent leur activité à l’arrière de la cellule,
ce qui permet le détachement de l’uropode, et sont ensuite
recyclées de l’arrière vers l’avant de la cellule, par un
transport vésiculaire orienté [18].
Le passage du neutrophile à travers l’endothélium est une
étape importante de son recrutement. Il met en jeu des
interactions homophiles entre des récepteurs d’adhérence du
leucocyte et les mêmes molécules bordant les jonctions endothéliales. Ces interactions permettent la diapédèse des leucocytes en garantissant l’intégrité de la barrière endothéliale :
les molécules mises en jeu sont PECAM-1, CD99 et la famille
des molécules JAM (junctional adhesion molecule) qui, en
plus, se substituent aux molécules d’ICAM en liant les intégrines leucocytaires.
La plus grande partie du périple du neutrophile, avant
d’atteindre le site inflammatoire, se passe dans la matrice
extracellulaire. Il s’agit d’un réseau de macromolécules,
polysaccharides ou glycosaminoglycanes et de protéines
fibreuses de structure. La progression met en jeu les intégrines
b2, ainsi que les récepteurs pour la fibronectine, la vitronectine, la laminine et le collagène respectivement : a5b1, aVb3,
a6b1 et a2b1. Elle est d’autant plus facilitée par la sécrétion
de protéases telles que les métalloprotéases (MMP-9...) qui
digèrent la matrice à l’avant de la cellule et démasquent, sur
les composants matriciels, des sites d’adhérence cryptiques
reconnus spécifiquement par les intégrines.
Enfin, la traversée de l’épithélium, dans le cas d’inflammations bronchiques, intestinales, urinaires, etc., se fait par des
mécanismes encore mal connus mettant en jeu notamment les
intégrines b2 et les molécules de jonction JAM [19].
Élimination des pathogènes
26
Lorsqu’il atteint le site inflammatoire, le neutrophile s’attaque
à l’agent pathogène : il phagocyte les particules pathogènes
opsonisées et le contenu délétère de ses granules (défensines,
serprocidines, élastase...) se déverse dans le phagosome
pour les dégrader. La phagocytose se fait grâce aux intégrines leucocytaires aMb2 (CR3) et aXb2 (CR4) qui lient spécifiquement iC3b et collaborent avec les récepteurs membranaires des immunoglobulines (FccR) pour fixer et internaliser les
particules. Enfin, le neutrophile réassocie les composants de
la NADPH oxydase au niveau de sa membrane, ce qui
permet son activation. Cette oxydase majeure des granulocytes produit massivement des dérivés actifs de l’oxygène
(ROS) oxydants et toxiques pour les micro-organismes, dans
l’espace extracellulaire et dans les phagosomes, c’est l’explosion respiratoire.
Rôle des intégrines
dans les fonctions plaquettaires
Les plaquettes ont pour fonction primaire de colmater les
lésions vasculaires et de s’opposer à l’hémorragie dans les
vaisseaux endommagés (figure 3) [20]. Le sang contient les
éléments cellulaires et plasmatiques nécessaires au déclenchement et à la réalisation de cette réparation et les intégrines des plaquettes y jouent un rôle de premier plan.
Capture et adhérence des plaquettes
à la paroi endothéliale
L’altération de l’intégrité de la paroi endothéliale, mettant à
nu la matrice sous-jacente, déclenche la liaison du FVW
plasmatique à cette matrice. Les plaquettes interagissent avec
le FVW par le récepteur GPIb-IX-V, pour former un complexe
FVW-GPIb-IX-V caractérisé par une très grande rapidité
d’association et de dissociation. Cette réversibilité d’interaction est cruciale pour capturer la plaquette, emportée par le
flux sanguin et soumise à des forces de cisaillement élevées.
Le déficit structurel ou fonctionnel en GPIb-IX-V est connu sous
le nom du syndrome de Bernard-Soulier (BSS) caractérisé par
des troubles hémorragiques.
Au contact de l’endothélium, la plaquette perd sa forme
discoïde et se met à rouler, c’est la phase du rolling pendant
laquelle sa vitesse diminue, ce qui permet à d’autres récepteurs, comme le récepteur au collagène GPVI, de lier leurs
ligands matriciels. D’un autre coté, l’engagement de GPIbIX-V et du GPVI induit des signaux intracellulaires conduisant
à l’activation des intégrines plaquettaires, notamment a2b1,
aIIbb3 et aVb3.
Quand la vitesse de rolling diminue, les intégrines a2b1
adhèrent fermement au collagène sous-endothélial, de même
que l’intégrine aIIbb3 lie le FVW, permettant l’ancrage de la
plaquette qui s’aplatit contre la matrice.
Agrégation plaquettaire
et formation du thrombus
Pendant cette deuxième phase, les plaquettes adhérentes
recrutent d’autres plaquettes de la circulation, qui viennent
s’agréger les unes contre les autres pour former le « clou
plaquettaire » lequel évoluera en « thrombus » [21].
Les plaquettes adhérentes déjà activées libèrent le contenu de
leurs granules riches en récepteurs d’adhérence (aIIbb3, GPIbIX-V, aVb3...), en agonistes (ADP, sérotonine...) et en substrats
d’adhérence (FVW, fibrinogène, thrombospondine, fibronectine...) qui en se fixant à leur surface, permettent le rolling des
plaquettes nouvellement recrutées. Celles-ci commencent
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Flux sanguin
Étalement
irréversible
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Arrêt de la plaquette
Plaquette
discoïde
circulante
Rolling de
la plaquette
rondissante
Adhérence des filipodes
(GP Ib-FVW)
é
Agrégation
f
è e
FVW
Ralentissement et
signalisation inside-out
par l'interaction
GP Ib-FVW
Ralentissement et
signalisation inside-out
par l'interaction
GPVI-Collagène
é
outside-in à partir de
é
FVW
Figure 3. Différentes étapes de l’adhérence des plaquettes.
La première étape du rolling est médiée par le GPIb-IX-V qui se lie au FVW et à plus faible vitesse par le GPVI qui se lie au collagène. Elle
permet le ralentissement de la plaquette et induit une signalisation cytoplasmique conduisant à la perte de la forme discoïde, l’émission de
filopodes ainsi qu’une signalisation inside-out à destination des intégrines aIIbb3 et a2b1.
Les plaquettes adhèrent grâce à leurs intégrines activées. Ceci permet l’ancrage des filopodes ainsi que l’induction de la signalisation
outside-in par les intégrines engagées.
L’engagement des intégrines aIIbb3 induit la signalisation outside-in responsable de la formation et la stabilisation des points focaux
d’adhérence par le cytosquelette. Ceci se traduit par l’étalement de la plaquette, qui renforce ainsi son adhérence avec le substrat.
La plaquette adhérente recrute à son tour (par ses sécrétions, ses molécules d’adhérence...) d’autres plaquettes circulantes qui viennent
s’agréger initiant la formation du thrombus.
(D’après Kuwahara M, Sugimoto M, Tsuji S, Matsui H, Mizuno T, Miyata S, Yoshioka A. Platelet shape changes and adhesion under high
shear flow Arterioscler thromb Vasc Biol 2002; 22: 329-34.
donc par interagir de manière réversible, par leurs récepteurs
GPIb-IX-V, avec le FVW exposé par les plaquettes adhérentes. Puis, les agonistes solubles (ADP, thrombine, TxA2),
libérés par ces dernières, renforcent leur adhérence en
déclenchant l’activation des intégrines aIIbb3. La liaison de
aIIbb3 au FVW et au fibrinogène arrête la plaquette, la fixe
fermement à l’agrégat en croissance et entraîne son étalement et sa dégranulation. La plaquette recrutée devient alors
à son tour recruteuse.
Au premier stade de sa formation, le thrombus est formé
essentiellement de plaquettes agrégées, cimentées par leurs
sécrétions de fibrinogène, fibronectine et vitronectine. L’activation de la cascade de la coagulation génère, par protéolyse du fibrinogène plasmatique, de la fibrine qui se dépose
dans le thrombus en formation et sert de support d’adhérence
aux intégrines aIIbb3 plaquettaires.
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
Activation des intégrines
Les intégrines nécessitent une activation préalable leur permettant de basculer vers une conformation à forte affinité
envers le substrat. In vivo, cette activation est provoquée par
différents stimuli qui induisent l’adhérence des leucocytes ou
l’agrégation plaquettaire (cytokines inflammatoires, agents
thrombotiques, facteurs de croissance...). La signalisation
intracellulaire qui aboutit à l’activation de l’intégrine est
appelée signalisation inside-out car des signaux intracytoplasmiques aboutissent à un changement extracellulaire de
l’intégrine. L’intégrine activée et liant son ligand, à l’extérieur
de la cellule, déclenche à son tour une signalisation intracellulaire, dite outside-in et renseignant la cellule sur son état
d’adhérence. Elle est la conséquence directe de la signalisation inside-out et en représente une boucle d’amplification car
27
TNFR
TLR
GPCR
Adhérence au substrat
FcR/GPVI
Activation
G
Syk
ITAM
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PL C
PKC
Réarrangement
du cytosquelette
Taline
Calpaïne
Ca2+
Oxydase
Signalisation
outside-in
ROS
MAP kinases
p38
Signalisation inside-out
Figure 4. Signalisation inside-out.
La signalisation inside-out est déclenchée par différents agonistes et différents types de récepteurs : les récepteurs TNFR et TLR induisent
la génération de ROS par un système oxydoréducteur régulant l’activation de la voie des MAP kinases p38. Les récepteurs couplés aux
protéines G (GPCR), ainsi que ceux portant un domaine ITAM (FcR, GPVI), induisent le flux calcique et l’activation des PKC. Ces voies
s’interconnectent entre elles et aboutissent à des maillons communs tels que les calpaïnes. Les calpaïnes activées clivent la taline, libérant
ainsi son domaine de tête et y démasquant un site de liaison à la chaine b des intégrines. La liaison de ce domaine dissocie l’interaction
inhibitrice entre la chaine a et la chaine b de l’intégrine et l’active. L’adhérence au substrat des intégrines activées, ainsi que leur
regroupement, déclenchent le réarrangement du cytosquelette et la transduction d’une autre signalisation, la signalisation outside-in,
responsable des réponses immunitaires et hémostatique respectivement des neutrophiles et des plaquettes.
28
ses effets sont beaucoup plus intenses et divers à l’échelle de
la cellule.
Par ailleurs, l’adhérence peut résulter non de l’augmentation
de l’affinité mais de l’avidité des intégrines regroupées.
L’affinité et l’avidité sont deux mécanismes, non mutuellement
exclusifs, contribuant à l’augmentation de l’adhérence. La
modulation de l’affinité est associée à des changements
conformationnels individuels affectant les intégrines aboutissant à une augmentation de la durée de vie du complexe
ligand-récepteur et à un renforcement de leur interaction.
La modulation de l’avidité met en jeu une redistribution des
récepteurs au niveau de la membrane, renforçant l’adhérence par l’augmentation du nombre de liaisons ligandrécepteur. Bien que le regroupement des intégrines b2 ou b3
soit un élément important de la dynamique de l’adhérence
des leucocytes et des plaquettes [22, 23], nous ne détaillerons ici que la signalisation aboutissant à l’augmentation de
l’affinité de ces intégrines.
Signalisation inside-out
Voie calcique
Dans les conditions inflammatoires ou thrombotiques physiologiques, les médiateurs solubles chiomioattractants (IL-8,
formyl-peptides, C5a...) ou thrombogéniques (ADP, thromboxane A2...) sont les éléments qui déclenchent le recrutement des neutrophiles et des plaquettes (figure 4) [17, 21,
24]. Ils agissent par des récepteurs spécifiques appartenant à
la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires
qui, lorsqu’ils fixent leur ligand, activent une protéine G
intracytoplasmique. Les sous-unités a et bc de cette protéine
G déclenchent la signalisation par une activation des
PI3Kinase et des phospholipases C.
Ces deux enzymes sont responsables de la génération de
produits phospholipidiques, membranaires et cytosoliques,
primordiaux dans la propagation du signal d’activation.
Les PI3K et les PLC métabolisent le phosphatidylinositol-4,5bisphosphate (PIP2) présent dans la membrane plasmique :
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
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la PI3K produit, par phosphorylation, le PIP3, responsable de
la polarisation des neutrophiles ainsi que du recrutement
d’éléments de signalisation au niveau de la membrane. La
phospholipase C produit, par hydrolyse du PIP2, le diacylglycérol (DAG), qui active les protein kinases C (PKC) et l’inositol
triphosphate (IP3), qui se fixe sur ses récepteurs IP3R au
niveau des systèmes membranaires intracellulaires (réticulum
endoplasmique...) et induit la libération des stocks de calcium.
D’autres récepteurs transmembranaires capables de déclencher la libération des réserves intracellulaires de calcium et
l’activation des intégrines, sont les récepteurs porteurs du
motif intracellulaire ITAM (immunoreceptor tyrosine-based
activation motif), caractéristique des récepteurs aux parties
Fc des immunoglobulines (FcR). Leur chaîne intracellulaire
peut, dans la plaquette, être couplée au récepteur au collagène (GPVI) et participer à la signalisation activatrice des
intégrines dans les premières phases de la thrombogenèse.
Le motif ITAM (YXXL-7x-YXXL) comporte deux résidus tyrosines
dont la phosphorylation, par des kinases membranaires de la
famille Src, est facilitée par le regroupement des récepteurs.
Lorsqu’elles sont phosphorylées, ces tyrosines peuvent lier la
kinase Syk, qui phosphoryle et active la PLCc2 et la PI3K,
rejoignant ainsi la voie induite par les GPCR.
Bien que les PKC soient un élément majeur dans l’activation
des neutrophiles et des plaquettes régulant plusieurs de leurs
fonctions (adhérence, chimiotactisme, dégranulation, remaniement du cytosquelette...), leur implication directe dans
l’activation des intégrines est cependant moins précise.
Le calcium, par contre, agit comme un second messager en
activant différents effecteurs permettant la régulation de l’activation des intégrines :
– La calmoduline est un enzyme dépendant du Ca2+ qui
déclenche une cascade de sérine/thréonine kinases, les
Ca2+/calmodulin-dependant kinases (CaMKs). Celles-ci
régulent, par exemple, négativement l’adhérence des neutrophiles à la vitronectine par l’intégrine aVb3. La mise en jeu de
la calmoduline permet de désengager la liaison de l’intégrine
avec son substrat, phénomène indispensable au détachement de l’uropode et au recyclage des intégrines au cours de
la migration cellulaire [18] ;
– Les calpaïnes sont une famille de protéases cytoplasmiques
ayant différents substrats. Les neutrophiles et les plaquettes,
expriment majoritairement la l-calpaïne, activée directement
par des concentrations micro molaires de calcium. Les études
récentes ont mis en lumière son rôle important dans l’activation des intégrines aIIbb3 et aMb2, et dans la signalisation
inside-out, comme il sera détaillé par la suite. En bref, la
calpaïne, en clivant la taline, molécule du cytosquelette,
libère un domaine de celle-ci qui se lie à l’intégrine et l’active.
Voie des MAP kinases
Le schéma de la voie calcique pour activer les intégrines est le
plus communément admis. Toutefois, d’autres voies ont été
mises en évidence, mises en jeu notamment par les récepteurs
au facteur nécrosant des tumeurs (tumor necrosis factor, TNF)
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
ou aux lipopolysaccharides (LPS). Ces récepteurs ne sont pas
connus pour induire la libération de calcium mais pour
activer la voie du facteur nucléaire NF-jB et des MAP kinases
[25, 26]. Les mitogen activated protein kinases (MAP kinases) sont une famille de sérine thréonine kinases dont les
différents membres s’organisent en trois grandes voies de
signalisation reconnues par leurs derniers effecteurs : p38
kinase, extra-cellular signal-regulated kinase (ERK) et c-JunNH2-terminal kinase (JNK). Les MAP kinases forment des
cascades d’activation séquentielles hiérarchisées. Les MAP
kinases p38, Erk et JNK ont plusieurs isoformes qui agissent
sur différents substrats cytoplasmiques ou nucléaires après
leur translocation. Des études menées sur des lignées cellulaires transfectées ont permis de mettre en évidence une régulation inhibitrice exercée par la voie Erk sur l’activation des
intégrines [27]. Par contre, d’autres études plus récentes
attribuent un rôle activateur des MAP kinases p38 dans
l’activation des intégrines leucocytaires et plaquettaires [28]
(voir aussi : Bouaouina M, Baruch D, Halbwachs-Mecarelli L.
Common transduction pathways in the « inside-out » signaling for b2 integrin activation in neutrophils and b3 integrin
activation in platelets [en préparation]). Un pas nouveau a
été franchi dans l’identification des maillons potentiels de ces
voies d’activation grâce à la mise en évidence d’une régulation, par les dérivés actifs de l’oxygène, ROS, de l’activation
des MAP kinases p38 et de celle des intégrines en aval.
Les ROS sont des molécules hyperréactives, avides de réagir
avec d’autres molécules pour les oxyder ou les réduire. Si
leurs effets peuvent être toxiques et participent à la défense
anti-infectieuse, ils sont de plus en plus reconnus aussi comme
des seconds messagers dans la signalisation intracellulaire.
Ils peuvent en effet, grâce à leur hyperréactivité, activer ou
désactiver, par oxydoréduction, des molécules impliquées
dans la transmission du signal [29].
Le neutrophile utilise les oxydants comme un moyen de
défense contre les agents pathogènes, en libérant de grandes
quantités de ROS dans ses phagosomes ou dans l’espace
extracellulaire lorsqu’il arrive sur le site inflammatoire. Toutefois, l’oxydase majeure qui lui permet d’exercer ses fonctions
antibactériennes, la NADPH oxydase, ne semble pas être à
l’origine des oxydants impliqués dans l’activation de ses
intégrines. En effet, les neutrophiles de patients atteints d’un
déficit fonctionnel de la NADPH oxydase (CGD ou granulomatose septique) adhèrent et migrent normalement, alors
qu’ils sont incapables de tuer les agents infectieux [30].
Les plaquettes sont aussi productrices de différents types
d’oxydants qui agissent de façon autocrine sur les plaquettes
elles-mêmes et peuvent avoir des effets pro- ou antithrombotiques. Ainsi, le monoxyde d’azote (NO) inhibe l’agrégation
plaquettaire alors que l’anion superoxyde (O2-) la stimule.
Dans la voie d’activation inside-out des intégrines, les ROS
agissent sur une cible encore inconnue en amont de l’activation des MAP kinases p38. L’étude de cette voie n’en est
encore qu’à ses débuts et la ou les oxydases participant à
l’activation des MAP kinases p38 et des intégrines reste(nt) à
29
RGD
Ligand
I
Ilike
I-like
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I
Inside-out
Ilike
I-like
Inside-out
Figure 5. Modèles d’activation des intégrines : leucocytaire aMb2 et plaquettaire aIIbb3.
L’étape finale de la signalisation inside-out aboutit à l’activation de la taline par protéolyse. Le domaine de tête de la taline se lie au
domaine cytoplasmique de la chaîne b, perturbant l’interaction entre les deux chaînes de l’intégrine et déclenchant son activation :
- La séparation des deux pieds entraîne le redressement du domaine extracellulaire par basculement de la tête globulaire s’articulant sur
les deux pieds ;
- Le mouvement est transmis aux domaines I et I-like. La 7e hélice du domaine I-like s’étire vers le bas, permettant le réarrangement du site
MIDAS et son activation (gris→rouge). Quand il est seul (aIIbb3), le domaine I-like lie directement le motif RGD porté par le ligand,
permettant ainsi l’adhérence ;
- En présence du domaine I, le domaine I-like joue un rôle régulateur du domaine I en stabilisant son activation. Les réarrangements
affectant le domaine I se traduisent entre autres par le basculement, vers le bas, de sa 7e hélice. Le résidu aspartate en bas de la chaîne se
lie au domaine I-like, ce qui fixe le domaine I dans son état actif et permet à son site MIDAS réarrangé de fixer le motif RGD du ligand.
30
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
découvrir ainsi que les maillons suivant jusqu’à l’intégrine.
Par ailleurs, la voie des MAP kinases p38 et la voie calcique
sont vraisemblablement interconnectées ou peuvent agir
simultanément dans la signalisation inside-out.
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Transmission cytoplasme-intégrine
et changement de conformation
de l’intégrine
Comment le signal d’activation intracellulaire est-il délivré à
l’intégrine (figure 5) ? La dernière étape de la signalisation
n’implique pas la phosphorylation ou la déphosphorylation
des parties intracellulaires (de a et b) de l’intégrine, mais fait
intervenir leurs capacités d’interaction avec différentes protéines cytosoliques. Les études récentes, notamment par RMN,
des domaines intracellulaires de différentes intégrines, suggèrent que des motifs conservés parmi les chaînes a et b des
intégrines stabiliseraient, par leurs interactions ioniques, la
conformation inactive de l’intégrine. En effet, la mutation de
ces motifs ou l’expression dans des lignées cellulaires d’un
fragment d’une protéine cytosolique, la taline, qui se lie aux
chaînes b, déclenche la désunion de ces motifs et l’activation
des intégrines [31-34].
La taline est un composant ubiquitaire du cytosquelette formé
d’une tête globulaire liée à une tige ; c’est un substrat des
calpaïnes qui par protéolyse libèrent la tête et démasquent
sur celle-ci un site d’interaction avec la chaîne b des intégrines pour laquelle elle a une forte affinité [35]. L’interaction
entre la tête de la taline et la chaîne b sépare les domaines
cytoplasmiques de a et b, rompant ainsi l’interaction inhibitrice et activant le domaine extracellulaire [36, 37]. Cette
transmission mécanique de l’activation par la taline via la
chaîne b ne peut être remplacée par aucune autre interaction
avec d’autres protéines, et le déficit en taline, chez l’animal,
est létal dès les premiers stades de la gastrulation.
Le dernier niveau de transmission du signal d’activation est
interne à l’intégrine elle-même. La séparation des deux
domaines intracellulaires de a et b déclenche une série de
réarrangements des domaines extracellulaires, comme le
montrent les explorations par RMN. Ces réarrangements
aboutissent à :
- Un redressement de l’intégrine initialement fléchie. Le fléchissement des deux chaînes a et b au niveau du
genou, permet de « plier en deux » le domaine extracellulaire de l’intégrine. Cette disposition rappelle la lame du
couteau pliée. La transmission du signal d’activation, via la
séparation des parties cytoplasmiques de l’intégrine,
entraîne une dissociation des interactions inhibitrices reliant
les deux chaînes et une séparation des deux tiges de l’intégrine. Dans ce modèle, donc, le redressement de l’intégrine
par basculement de la partie de tête s’appuyant sur le
« genou » comme pivot, est analogue à celui de la lame du
couteau qui se redresse sur son manche (modèle du couteau
à cran d’arrêt) [38-40].
Hématologie, vol. 12, n° 1, janvier-février 2006
- L’activation du domaine de liaison au ligand
(I/I-like), se traduisant par l’augmentation de son
affinité pour le ligand. Deux cas de figures se présentent,
selon que l’intégrine est porteuse des deux domaines I et
I-like, comme les intégrines b2 ou d’un domaine I-like seul,
comme aIIbb3, mais les mécanismes d’activation mis en jeu
sont les mêmes. Pour aIIbb3 , le redressement de la partie de
tête s’accompagne d’un étirement vers le bas d’une hélice du
domaine I-like induisant un réarrangement de son site
MIDAS. Celui-ci fixe alors un cation Mg2+ et l’expose pour
qu’il puisse à son tour interagir avec le résidu glutamate du
motif RGD du ligand. C’est la conformation de forte affinité
de l’intégrine pour son ligand. Pour aMb2, les domaines I et
I-like subissent les mêmes réarrangements permettant à leurs
sites MIDAS respectifs d’adopter la configuration à plus forte
affinité. Le domaine I-réarrangé retient vers le bas une hélice
du domaine I, stabilisant ainsi sa conformation active et
relayant le signal d’activation vers le site d’interaction avec le
ligand, tout comme la cloche qui sonne lorsqu’on tire sur sa
corde (modèle bell rope) [38].
Conclusion
La cascade de réactions que nous venons de décrire aboutit
en quelques minutes à l’adhérence ferme des plaquettes ou
des leucocytes. En se liant avec une forte affinité avec leur
ligand cellulaire ou matriciel, les intégrines renvoient alors un
signal en direction du cytoplasme. C’est la signalisation
outside-in, qui informe la cellule sur son état d’adhérence. Elle
déclenche une réorganisation du cytosquelette, permettant
notamment l’étalement de la cellule. De cette signalisation
dépendent les principales fonctions des neutrophiles et des
plaquettes que sont la dégranulation et l’explosion respiratoire.
Les intégrines sont des cibles thérapeutiques dans les maladies inflammatoires et thrombotiques [41]. Des anticorps
humanisés dirigés contre l’intégrine aIIbb3 ou des peptides
bloquant la liaison de cette intégrine à ses substrats sont
utilisés comme thérapie anti-thrombotique [42]. Plus récemment, les anti-intégrines a4b1 se sont révélés efficaces pour
prévenir l’afflux des lymphocytes dans les maladies autoimmunes comme la sclérose en plaques ou la maladie de
Crohn [43]. L’analyse des voies de signalisation inside-out
des intégrines peut permettre de développer des molécules
prévenant leur activation et donc l’adhérence excessive des
leucocytes ou des plaquettes. ■
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