2009 - ASSO-ETUD

Travaux Pratique
Chimie Organique IA
Semestre d’été 2009
13 mai 2009 - 1 - Coralie Fournier
Chromatographie analytique sur couche mince et purification d’un produit à
l’aide d’une colonne chromatographique

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Semestre d’été 2009
13 mai 2009 - 2 - Coralie Fournier
1. But de l’expérience
Identifier les acides aminés contenus dans un mélange par la méthode de
chromatographie sur couche mince. Puis purifier un mélange, en séparant l’alcool et l’ester et en
éliminant le colorant alimentaire, à l’aide de la chromatographie sur colonne.
2. Principe de la méthode
La chromatographie est une méthode de séparation de produits. La séparation à lieu en
fonction des affinités qu’ont les différents produit avec les deux phases : mobile et stationnaire.
La chromatographie sur couche mince (ccm) sert aussi bien à séparer les produits qu’à
les identifier. Le procédé de la couche mince est le suivant, déposer une goutte du produit à analyser
sur une plaque, généralement de silice, puis y déposer aussi des gouttes des produit de références. La
plaque est alors plongée dans une cuve avec du solvant qui montera le long de la plaque par capillarité.
Les différents composés migrent avec le solvant à des vitesses différentes. Plus ils auront d’affinité
avec le solvant plus ils migreront vite.
La chromatographie sur colonne est une technique de séparation efficace lorsqu’un
produit contient encore des impuretés. La colonne contient souvent un gel de silice (phase
stationnaire). Les substances introduites au sommet de la colonne sont plus ou moins retenues dans la
phase stationnaire suivant leur polarité et sont donc plus ou moins facilement entraînées par le solvant
qui migre dans la colonne.
3. Chromatographie analytique sur couche mince (ECHANTILLON N° 3)
Acides aminées contenus dans le mélange : Alanine – Phénylalanine – Sérine – Valine.
3.1 Partie expérimentale
Déposer sur une plaque de silice, sur une même ligne, un spot de référence pour
chaque acide aminés et un spot du mélange. Mettre la plaque dans la cuve où se trouve un fond de
solvant. Dans ce cas, le solvant est un mélange de N-butanol(56.5%), CH3COOH (21.7%) et H2O
distillée (21.8%). Laisser un moment, le temps que le solvant migre le long de la plaque. Ressortir la
plaque de la cuve, la laisser sécher, puis y vaporiser de la ninhydrine comme révélateur. La ninhydrine
réagit avec les acides aminés en donnant le pourpre de Ruhemann ce qui permet de donner de la
couleur et donc d’observer les acides aminés. Finalement le coefficient de rétention peut être calculé.
Réaction acide aminé et ninhydrine :
RH
H2NCOOH2
O
O
O
O
O
NH+
O
O
O
O
OH
HO
Acide aminé Ninhydrine Pourpre de Ruhemann Hydrindantine
O
-O

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3.2 Résultats
Schéma de la plaque de chromatographie obtenue :
Tableau N°1 : Coefficient de rétention des acides aminés de référence
Acide aminé
Migration [cm]
Rf
Alanine
3.7
0.50
Phénylalanine
5.5
0.74
Sérine
3.4
0.46
Valine
4.4
0.59
Tableau N°2 : Coefficient de rétention des acides aminés contenu dans le mélange
Acide aminé
Migration [cm]
Rf
Alanine
3.5
0.47
Phénylalanine
5.3
0.72
Sérine
3.0
0.40
Valine
4.3
0.58
3.3 Discussion
Nous remarquons facilement que les quatre acides aminés sont contenus dans le
mélange. Les Rf obtenus avec les acides aminés de référence sont légèrement différents de ceux
obtenus pour le mélange, mais il reste tout de même très proche. Cette différence est peut-être due au
faite que l’éluant ne migre pas à la même vitesse uniformément sur toute la plaque de silice.

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4. Purification d’un produit organique à l’aide d’une colonne
chromatographique
Rendement de la colonne = 95%
4.1 Partie expérimentale
Préparer la colonne, avec du gel de silice, y introduire le produit dilué à la surface.
Attendre que la produit migre le long de la colonne. Plusieurs fractions sont récupérées dans des
éprouvettes. Les premières éprouvettes ne contiennent pas de produits, uniquement du solvant. La
présence de produit dans les éprouvettes est vérifiée par CCM et observée sous lumière UV. Dans les
prochaines éprouvettes sont récupérés les produits, tout d’abord les moins polaires suivis de ceux qui le
sont plus. Les éprouvettes contenant les mêmes produits sont réunies et passées au rotavap pour
évaporer tout le solvant, les produits séparés peuvent alors être récupérés.
4.2 Résultats
Schéma des plaques CCM obtenues :

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Masse d’alcool pur = 0.7 g
Masse mélange alcool et ester (avec principalement de l’ester = 1.1 g
Masse ester pur = 0.1 g
Calcul du rendement :
€
η =MassePr oduitRécupéré
MassePr oduitDépart =1.9 2.0 =0.95 =95%
4.3 Discussion
Nous obtenons un bon rendement, la petite perte est due au colorant alimentaire qui ne
migre pas dans la colonne, car trop polaire, il reste donc retenu par la phase stationnaire.
Nous remarquons que c’est tout d’abord l’alcool qui migre et sort de la colonne, il est
donc moins polaire que l’ester qui ne sort qu’en second.
Dans les éprouvettes 6 et 7, il persiste un mélange des deux produits, mais l’ester y est
présent en grande majorité.