Transfert indirect de gènes
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Clonage d’un gène et transfert dans une cellule eucaryote Pages 11 à 15 • Transfert indirect – via une bactérie Agrobacterium tumefaciens • Transfert direct 1 Transfert indirect de gènes Page 11 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Utilisation d’ une bactérie = Agrobactérium tumefaciens ? o Pathogène des végétaux → tumeurs au site d’infection (galle du collet) = Excroissance tumorale = zone de liaison entre tige et racine 2 Transfert indirect de gènes Page 11 3 Transfert indirect de gènes • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Utilisation d’ une bactérie = Agrobactérium tumefaciens o Structure Bâtonnet (bacille) + flagelles 4 Transfert indirect de gènes Page 11 Ti = inducteur de tumeur 5 Transfert indirect de gènes • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Utilisation d’ une bactérie = Agrobactérium tumefaciens o Localisation Sol 6 Transfert indirect de gènes Page 11 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 1.- Blessure au niveau de la plante (microblessures: insectes, vers, formation de racines latérales, gel… 2.- Emission de composés phénoliques 3.- Chimiotactisme d’Agrobactérium tumefaciens 7 Transfert indirect de gènes Page 12 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 4.- Composés phénoliques activent la région de virulence Code une endonucléase → ADN-T 8 Transfert indirect de gènes Page 11 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 5.- La bactérie est capable de se fixer aux Ȼ de la blessure 6.- La bactérie transfert une partie de son matériel génétique 9 Transfert indirect de gènes Page 12 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 10 Transfert indirect de gènes Page 11 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 7.- La 8.L’ADN-T plante produit s’intègre ↑ d’hormones à celui de lade plante croissance 11 Transfert indirect de gènes Page 11 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 9.- Croissance désordonnée et illimitée des Ȼ infectées → tumeur 12 Transfert indirect de gènes Page 12 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 10.- La plante synthétise et libère dans le sol des opines 11.- Opines → nutriments pour Agrobactérium tumefaciens 13 Transfert indirect de gènes • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens Opines: - Petite molécule formée d’un acide aminé + acide cétonique ou un sucre - Source de C et N pour la bactérie 14 Transfert indirect de gènes Page 12 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 15 Transfert indirect de gènes Page 12 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Modification du plasmide d’Agrobactérium tumefaciens avec un gène d’intérêt • Remplacement de l’ADN-T par un gène d’intérêt 16 Transfert indirect de gènes Page 12 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Modification du plasmide d’Agrobactérium tumefaciens avec un gène d’intérêt Gène de sélection ? Gène permettant la survie des Ȼ dans des conditions Repérer facilement les Ȼ qui l’ADN transgénique particulières (résistance à ont un intégré antibiotique) ou gène → molécule fluorescente ou radioactive…. 17 Transfert indirect de gènes • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Provoquer des blessures chez la plante • Fragments de feuille • Fragments de tige • Embryon – Bactéries modifiées misent en contact avec les fragments de plante 18 Transfert indirect de gènes Page 12 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes 19 Transfert indirect de gènes • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Les fragments de plante sont cultivées sur un milieu sélectif (antibiotique) → Mettre en évidence la présence ou l’absence du gène de sélection – Développement de cals (= amas de Ȼ végétales) transgéniques → plantules transgéniques portant et exprimant le gène d’intérêt. 20 Transfert indirect de gènes Page 13 21 Transfert indirect de gènes Page 13 22 Transfert indirect de gènes Page 13 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Première plante tumefaciens modifiée par Agrobactérium = plante de tabac → résistante à certaines chenilles qui les dévorent jusqu’à la tige 23 Transfert indirect de gènes Page 13 • Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes – Autres plantes: • Tomate • Pomme de terre • Soja Pas de céréales • Coton • … 24 Transfert indirect de gènes Page 13 Agrobactérium tumefaciens n’induit pas de tumeur chez les céréales car elles ne produisent pas de composés phénoliques en cas de blessures en quantité suffisante pour permettre l’expression du gène « vir ». 25 Transfert indirect de gènes • Depuis quelques années, des expériences ont été faites pour permettre la transformation du riz ou du maïs – Comment ? • Culture d’embryons de riz et d’Agrobactérium t. en présence de composés phénoliques → ↑ transfert (100%) Souches d’Agrobactérium t. « supervirulente » 26 Clonage d’un gène et transfert dans une cellule eucaryote Page 14 • Transfert indirect – via une bactérie Agrobacterium tumefaciens • Transfert direct – Différentes techniques (4) 27 Transfert direct de gènes Pages 14 - 15 • La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ végétales sans paroi cellulosique (enzymes)) – Techniques chimiques ou physiques (4) • Le polyéthylèneglycol (PEG) • L’électroporation Protoplastes • La microinjection • Méthode biolistique (« canon à gènes ») Ȼ végétales 28 Transfert direct de gènes Page 14 • La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique (enzymes)) – Techniques chimiques ou physiques (4) • Le polyéthylèneglycol (PEG) • L’électroporation • La microinjection • Méthode biolistique (« canon à gènes ») 29 Transfert direct de gènes Page 14 • Le polyéthylèneglycol (PEG) = agent chimique → déstabiliser la membrane plasmique des protoplastes → faciliter la pénétration de l’ADN 30 Transfert direct de gènes Page 14 • La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique) – Techniques chimiques ou physiques (4) • Le polyéthylèneglycol (PEG) • L’électroporation • La microinjection • Méthode biolistique (« canon à gènes ») 31 Transfert direct de gènes Page 14 • L’électroporation (technique plus délicate) = chocs électriques de fort voltage → ouverture de pores au niveau des protoplastes → faciliter le passage de l’ADN 32 Transfert direct de gènes Page 14 33 Transfert direct de gènes Page 14 • Problème avec ces deux techniques – Faible capacité de régénération des protoplastes – Transfert de plusieurs copies → répercussions sur la stabilité de l’insert (gène) ou sur son expression 34 Transfert direct de gènes Page 15 • La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique) – Techniques chimiques ou physiques • Le polyéthylèneglycol (PEG) • L’électroporation • La microinjection • Méthode biolistique (« canon à gènes ») 35 Transfert direct de gènes Page 15 • La microinjection (technique complexe) = introduction directe de molécules, organites dans des cellules isolées à l’aide de microseringues manipulées sous microscope 36 Transfert direct de gènes 37 Transfert direct de gènes Page 15 38 Transfert direct de gènes Page 15 • La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique) – Techniques chimiques ou physiques • Le polyéthylèneglycol (PEG) • L’électroporation • La microinjection • Méthode biolistique (« canon à gènes ») 39 Transfert direct de gènes Page 15 • La méthode biolistique ou canon à gènes = propulsion d’un transgène à l’intérieur de cellules végétales, isolées ou appartenant à un tissu ou à un organe - Constructions moléculaires sont fixées à la surface de projectiles microscopiques (billes d’or) - Bombarder les cellules végétales 40 Transfert direct de gènes Page 15 • La méthode biolistique ou canon à gènes 41
