Cours 1 D1 2008

cellule
souche
1. auto-renouvellement
2. prolifération
3. différenciation
cellules
progénitrices
(d'amplification
transitoire)
cellules
différenciées
Tissus à renouvellement rapide:
épiderme (2-3 semaines)
intestin (108 cellules/jour)
cellules sanguines (1012 globules/jour)
Tissus ne se renouvelant pas ou peu:
muscle (satellites)
cerveau (hippocampe, plancher du IVe ventricule)
foie (cellules ovales)
cœur (?)
2. Régénération d'un tissu blessé
La position hiérarchique définit l’efficacité thérapeutique
Cellules souches
Remplacement permanent de l’ensemble
du tissu- Efficacité retardée
- Cellules souches hématopoïétiques
-Cellules souches épidermiques
-MAPC? CS mésenchymateuses?
Remplacement transitoire des tissus
Efficacité rapide
Progéniteurs intermédiaires
- Progéniteurs endothéliaux , myoblastes
- Progéniteurs ilôts b de Langherans
-Précurseurs ostéoblastiques /
chondroblastiques
- Neurones foetaux
Remplacement très transitoire
Efficacité immédiate
Précurseurs matures
- Transfusion de globules rouges
A quoi sert une cellule souche ?
épiderme
Cellule
souche
derme
Mesenchymal connective tissue
Peau, intestin (108 cell/j), système hématopoïétique 1012 globules/jour
A quoi sert une cellule souche en thérapie cellulaire ?
Thérapies liées au système hématopoïétique (ex. leucémie)
T
CS
hématopoïétique
Lignées
hématopoïétiques
1000 rads
Reconstitution du
système immunitaire
6 mois
Greffe
de moëlle
ou autre tissu
Till & Mc Culloch, 1961
A quoi sert une cellule souche en thérapie cellulaire ?
Thérapie des grands brûlés
Bouton embryonnaire
(ICM)
trophoblaste
Pluripotentes
cellules souches
embryonnaires (ES)
œuf
fécondé
(jour 1)
stade 8 cellules
(3 jours)
embryon
pré-implantatoire
Totipotentes
Pluripotentes
ou multipotentes
(> 200 types cellulaires)
(ne se reproduisent pas)
cellules foetales
Embryon de 6 semaines
Pluripotentes
Cellules de carcinome
embryonnaire (EC)
Nouveau-né
Pluripotentes
cellules souches
germinales
embryonnaires (EG)
Pluripotentes
ou multipotentes
cellules souches
de sang de cordon
Multipotentes
et unipotence
cellules souches
adultes
Tératocarcinome
(cellules tumorales
testiculaires)
adulte
Pourquoi s’interesse-t-on aux cellules souches ?
1. Etude des mécanismes de différenciation
2. Evaluation d’un potentiel thérapeutique
3. Comprendre des pathologies liées à l’auto-renouvellement et à la
différenciation (cancer).
Comment identifier les cellules souches adultes ?
EVIDENCES INDIRECTES :
• EXCLUSION DU COLORANT
• “LABEL-RETAINING ABILITY”
• CLONOGENICITE
• IN VIVO RECONSTITUTION
• MARQUEURS DE SURFACE
Comment identifier les cellules souches adultes ?
EVIDENCES INDIRECTES :
• EXCLUSION DU COLORANT
• “LABEL-RETAINING ABILITY”
• CLONOGENICITE
Le transporteur “ATP-binding cassette
transporter” expulse le colorant vital.
Excitation à 350 nm (UV)
Emission fluorescence à 2  différents.
• IN VIVO RECONSTITUTION
• MARQUEURS DE SURFACE
Hoechst red
(675 nm)
Hoechst blue (440 nm)
Verapamil
(inh. du transporteur ABC)
Comment identifier les cellules souches adultes ?
EVIDENCES INDIRECTES:
• EXCLUSION DU COLORANT
cellules
différenciées
• “LABEL-RETAINING ABILITY”
assise basale
(couche
proliférative)
• CLONOGENICITE
• IN VIVO RECONSTITUTION
• MARQUEURS DE SURFACE
Injection de 5-bromo-deoxyuridine (BrdU),
BrdU remplace la dT
4 semaines de chasse sans BrdU
Impossible chez l'homme (greffe)
Comment identifier les cellules souches adultes ?
EVIDENCES INDIRECTES :
• EXCLUSION DU COLORANT
Ensemencement
en condition diluée
• “LABEL-RETAINING ABILITY”
• CLONOGENICITE
• IN VIVO RECONSTITUTION
• MARQUEURS DE SURFACE
paraclone
méroclone
holoclone
Localisations principales des kératinocytes clonogeniques
(BrdU, 3H-Thy)
clonogénicité
faible activité
mitotique
in vivo
forte activité
clonogénique
in vitro
glande
sébacée
bulge
bulbe
forte activité
mitotique
in vivo
faible activité
clonogénique
in vitro
Comment identifier les cellules souches adultes ?
EVIDENCES INDIRECTES :
1000 rads
• EXCLUSION DU COLORANT
• “LABEL-RETAINING ABILITY”
• CLONOGENICITE
• IN VIVO RECONSTITUTION
• MARQUEURS DE SURFACE
Reconstitution d’un système
hématopoïétique
Contribution tissulaire
Traitement des leucémies
(pathologies du système hématopoïétique)
6 mois
Till & Mc Culloch, 1961
Greffe
de moëlle
Multipotence des cellules souches épidermiques
épiderme
multipotence
glande
sébacée
follicule
pileux
10 semaines
Transplantation
in utero d'un bulge ß-gal
Transfert du greffon
sur souris nude
Plusieurs classes de cellules souches épidermiques
Ghazizadeh and Taichman (2001) Embo J 20,1215-1222
En condition de réparation
ou également en situation physiologique ?
Comment identifier les cellules souches adultes ?
EVIDENCES INDIRECTES :
• EXCLUSION DU COLORANT
• “LABEL-RETAINING ABILITY”
• CLONOGENICITE
• IN VIVO RECONSTITUTION
CD= cluster designation
• MARQUEURS DE SURFACE
CSH
Lymphocyte T
CD7+
Natural Killer
Lymphocyte B
CD19+
Monocytes
Polyneutrophiles
CD13+
Cellules dendritiques
Hématies
CD41+
CD34+ DRCD38- CD33-
CD34+ DR+
CD38 + CD3 +
Mégacaryocyte
(plaquettes)
CD34-
Le concept de "niche"
Notch
Wnt (ß-caténine/LEF1)
c-Myc
BMPs
Cellule
souche
cellules différencées
épiderme
progéniteur
multipotent
follicule pileux
Cellule
souche
glande
sébacée
Influence réciproque
cellules différencées
progéniteur
unipotent
Cellule
souche
épiderme
follicule pileux
Cellule
souche
glande
sébacée
La cellule souche: cible privilégiée de la cancérogenèse?
checkpoint
G2
Stress génotoxiques
(UV, stress oxydants, hypoxie,…)
M
G1
S
Dommages à l'ADN
S
checkpoint
Arrêt du cycle
réparation
apoptose
p53
Accumulation
de mutations
Instabilité télomérique (ALT)
Tumeur
Mutation p53 (UV)
TA
Cellule
différenciée
CS
Expansion clonale:augmente le nb de cellules qui peuvent ainsi accumuler de nouvelles mutations
Mutation
p53
Expansion clonale
UV-B soutenue
initiateur DMBA
(Ha-ras)
Promoteur TPA
Accumulation
de mutations
cancers cutanés
Papilloma
&
Squamous cell
carcinoma
(Ras, p53, PTEN)
épiderme
Sebaceous
Adenoma
(LEF-1, MSH2)
Basal cell
Carcinoma
(SHH, p53)
Trichofolliculoma
(ß-caténine, PTEN)
&
Pilomatricoma
derme
Plasticité des cellules souches
Invertébrés:
hydre
Regénère même sa tête!!
Persistence d’une niche de
cellules totipotentes,
Cnidaires: méduses, les coraux,
les anémones de mer et autres polypes.
Coupé, formera autant
de vers complets!!
plathelminthe: vers plats
recrutées en cas de lésion.
Plasticité des cellules souches
Vertébrés:
Cicatrisation
(Days 1-2)
salamandre
(régénère tous ses membres
(œil, queue, portions de cœur)
amphibiens nocturnes,
de l’ordre des urocèles
Les cellules à proximité de la lésion
(surtout fibres musculaires)
se dédifférencient pour former
un blastème régénératif contenant
des progéniteurs mésenchymateux.
Dé-differenciation
(Days 3-12)
Formation du blastème
(Days 13-21)
Re-différentiation
(Days 22-40)
Plasticité des cellules souches
Differentiation
Morphallaxis
(allaxis= exchange)
Hydre
La régénération d’une partie
du corps se fait par une
réorganisation cellulaire et
structurale avec un nombre
restreint de nouvelles cellules
(pas de prolifération)
Cellules souches
totipotentes
Differentiation
Cellules souches ou
progénitrices
Epimorphosis
recrutement de
néoblastes hors de
l’organe blessé (forte
prolifération)
Salamandre
L’Homme est-il:
Une Hydre ?
+
ou
Une Salamandre ?
A quoi est due cette incapacité régénératrice chez l’Homme?
Absence de persistence de cellules totipotentes? (Hydre)
Limitation du niveau de dédifférenciation? (Salamandre)
“Transdifférenciation (plasticité)”
astrocytes
CERVEAU
Précurseurs
neuronaux
neurones
oligodendrocytes
FOIE
hépatocytes
Muscle
squelettique
PANCREAS
(Seaberg 2004 Nat Biotech
Choi 2004 Stem cells)
CŒUR
cardiomyocytes
MOELLE
OSSEUSE
CSH
Chondrocytes
ostéocytes
pancreatic endocrine
ß-, - and -cells,
pancreatic exocrine,
stellate cells
Cellules
endothéliales
PEAU
Kératinocytes
Fibroblastes
Adipocytes (liposuccion)
Révolution de dogmes:
- passage au travers des feuillets embryonnaires ?
-potentiel en médecine régénératrice ?
Protocole date de 1961 mais la plupart de ces observations faites entre 1999 et 2004!!!!!
1000 rads
Observation dans les
6 mois
différents tissus
chez la souris
et post mortem chez l’homme
(receveur de greffe de MO)
Greffe
de moëlle
ou autre tissu
Till & Mc Culloch, 1961
Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC)
Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC)
(Jiang et al. Nature 2002 418, 41-9)
-Conversion à l’échelon clonal des MAPC en:
- cellules endothéliales,
-ectodermiques et endodermiques, in vitro et in vivo
Thérapie cellulaire:
Skeletal
muscle
Réparer une fonction déficiente
1.
Reconstitution du tissu d'origine
2.
Reconstitution d'un tissu autre que celui
d'origine (plasticité)
L’Homme n’est donc ni une hydre, ni une salamandre…
•Contaminant de cellules circulantes
•Population hétérogène (non clonale)
•Fusion cellulaire
cell fusion causes confusion!
Cerveau
Cellules ES
Promoter oct4gfp/puromycin
Isolement de cellules neurales
puroR et gfp+