Transfert de cellules germinales primordiales de

J. Embryol. exp. Morph. Vol. 21, 3, pp. 485-507, June 1969 4g5
Printed in Great Britain
Transfert de cellules
germinales primordiales de Dindon a Fembryon
de Poulet par injection intravasculaire
Par GEORGES REYNAUD1
Faculte des Sciences, Universite d'Aix-Marseille
et Laboratoire Hubrecht, Utrecht
Les recherches descriptives et experimentales concernant l'etude des rapports
entre soma et germen, suscitees par les theories de Nussbaum (1880) et de
Weismann (1885), ont montre que chez la plupart des Metazoaires — et notam-
ment chez la quasi totalite des Vertebres — le soma et le germen constituent des
lignees cellulaires deja distinctes au debut du developpement puisque la destruc-
tion des elements germinaux entraine la sterilite sexuelle definitive des individus.
La segregation complete et irreversible des lignees somatique et germinale
n'implique pas pour autant leur independance metabolique. Des travaux por-
tant sur la differentiation des cellules germinales et la maturation des gametes
ont en effet demontre qu'elles necessitent un apport de substances provenant
des tissus somatiques de la gonade. Des lors, on pouvait se demander si cer-
taines de ces substances n'etaient pas porteuses d'information. La resolution
experimentale de ce probleme necessitait la colonisation d'un tissu somatique
de gonade par des cellules germinales de speciflcite zoologique differente.
Chez les Amphibiens, des experiences ont ete tentees par Blackler (1962).
Elles ont consiste a remplacer, au stade neurula, 1'endoderme ventral d'un
embryon de Xenopus laevis laevis, qui renferme a ce stade les gonocytes primor-
diaux, par 1'endoderme homologue provenant d'une neurula de Xenopus laevis
victorianus de meme age. L'auteur a constate que les individus ainsi operes
produisent des gametes de meme speciflcite que le greffon, c'est-a-dire apparem-
ment non modifies par leur sejour prolonge dans une gonade etrangere. Les
resultats de ces travaux ne plaident done pas en faveur d'une transmission de
substances porteuses d'information des cellules somatiques aux cellules germi-
nales mais, a ma connaissance, l'analyse genetique n'a pas encore ete poussee
assez loin pour les considerer comme definitifs.
Chez les Oiseaux, les cellules germinales sont regroupees au debut du
developpement, dans une aire extra-embryonnaire decrite par Swift (1914) sous
1 Adresse de
Vauteur: Laboratoire de Morphogenetique Animale, Faculte des Sciences,
Place Victor Hugo, Marseille, France.

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le nom de 'croissant germinal'. Elles quittent ensuite ce territoire et empruntent
la circulation sanguine pour aller coloniser les ebauches gonadiques. Reagan
(1916) et DantchakofT (1929) avaient envisage la possibility d'un transfert
precoce des gonocytes primordiaux par transplantation du croissant germinal
mais c'est seulement a une date recente que Simon (1960) est parvenu, en
mettant en parabiose circulatoire un embryon de Canard intact et un embryon
de Poulet prive de ses gonades presomptives, a faire coloniser les ebauches
gonadiques du Canard par des cellules germinales des deux especes. Ces associa-
tions, faites in vitro et maintenues en culture organoptypique, ne peuvent fournir
aucun renseignement sur la destinee des gonocytes de Poulet parvenus aux
ebauches gonadiques du Canard car la survie des parabiontes n'excede pas le
4e jour d'incubation.
La technique experimentale decrite ci-dessous a ete mise au point dans le but
de suivre plus longuement, et si possible au-dela de l'eclosion, la destinee de
gonocytes effectuant leur maturation dans une gonade etrangere. Les travaux
de Simonsen (1955) ayant demontre une large tolerance immunologique
reciproque entre Poulet et Dindon, et le Poulet s'elevant plus facilement que le
Dindon, la premiere espece a ete choisie comme receveur, la deuxieme a fourni
les gonocytes. Le processus experimental comporte trois series d'operations:
(1) la sterilisation sexuelle precoce d'un embryon de Poulet par destruction des
cellules germinales contenues dans le croissant germinal; (2) la recuperation des
cellulues germinales d'un embryon de Dindon avant leur migration vers les
ebauches gonadiques; (3) l'injection des cellules germinales ainsi recuperees
dans le reseau vasculaire de l'embryon de Poulet que Ton a prive de ses propres
gonocytes.
STERILISATION SEXUELLE DES EMBRYONS DE POULET
La plupart des travaux descriptifs et experimentaux effectues sur le germen
des Oiseaux au cours des cinquante dernieres annees tendent a confirmer les
observations de Swift (1914) selon lesquelles les cellules germinales primordiales
subissent, aux premiers stades du developpement, une segregation a partir d'un
materiel extra-embryonnaire. La realite du croissant germinal decrit par cet
auteur chez le blastoderme parvenu au stade de la ligne primitive
s'est progres-
sivement imposee a la suite des observations histologiques de Hulpieu (1925),
Woodger (1925), Goldsmith (1928) et DantchakofT, (1931a, b). Une nouvelle
technique (Reynaud, 1967), combinant l'isolement des feuiJlets blastodermiques
et l'application du procede de coloration P.A.S. au feuillet profond etale sur
lamelle, a fourni une demonstration supplementaire du regroupement tem-
poraire des gonocytes primordiaux dans un territoire precephalique en forme de
croissant (voir plus bas).
Cette localisation des gonocytes au stade de la ligne primitive permet la
sterilisation precoce des embryons. Parmi les techniques experimentales utilisees,
l'excision du croissant germinal (Reagan, 1916) et sa cauterisation (Dantchakoff,

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1931 a, b; Hukao, 1937) paraissent les plus efficaces mais ne sont pas compatibles
avec la survie des embryons. D'autres techniques moins nocives, comme les
irradiations aux rayons ultra-violets (Benoit, 1930), /? (Dantchakoff &
Lacassagne, 1932) et y (Dulbecco, 1946), n'entrainent, dans bien des cas,
qu'une sterilite sexuelle partielle. Le fait qu'un croissant germinal bien delimite
est encore en place chez des embryons de Poulet pourvus de 5 a 10 paires de
somites (Simon, 1960) a permis a Dubois (1962) de provoquer a coup sur et
dans de brefs delais une sterilisation totale a ces stades, au moyen d'une irradia-
tion fractionnee aux rayons X du croissant germinal. Malheureusement, cette
technique compromet encore gravement la survie embryonnaire puisque seule-
ment 6 sujets sur 100 sont encore en vie apres 3 jours d'incubation et meurent
avant la fin du 5e jour.
L'irradiation du croissant germinal aux rayons ultra-violets a ete tentee par
Benoit en 1930. Elle
s'est averee tres maniable et tres efficace dans la destruction
des cellules germinales primordiales mais son intervention a un stade tres
precoce du developpement (entre 18 et 21 h d'incubation) et rinsuffisance de
protection des ebauches embryonnaires limitaient aussi la survie des sujets
experimentes. Neanmoins, les rayons u.v. sont sans doute mieux adaptes a la
destruction elective de cellules eparses dans un mince feuillet puisqu'ils sont a
la fois moins penetrants et beaucoup plus facilement absorbes que les radiations
ionisantes (Errera, 1959). C'est pourquoi je les ai utilises, mais a un stade plus
tardif ou, d'apres Simon (I960), le croissant germinal est encore en place.
L'irradiation du croissant germinal a ete ainsi pratiquee chez des embryons de
Poulet pourvus de
5 a 10 paires de somites (Fig. 1), c'est-a-dire aux stades prece-
dant ^incorporation des cellules germinales primordiales aux ilots sanguins
extra-embryonnaires. Quelques blastodermes ont ete cependant irradies au
stade de la ligne primitive (15 h d'incubation) afin d'examiner les effets immedi-
ats des rayons u.v. sur les cellules du croissant de Swift. Enfin, je me suis
egalement inspire des techniques de Dubois (1962) pour la protection des
embryons par des ecrans de forme appropriee.
Technique de destruction des gonocytes primordiaux
Les experiences ont ete faites sur des embryons de Poulet de la race Rhode
Island. Les oeufs, incubes a 39 °C, sont sortis de la couveuse au terme du delai
necessaire pour parvenir au stade choisi pour le traitement. Pour decouvrir
1'embryon, une fenetre est pratiquee dans l'ceuf en decoupant, dans la region
de la coquille qui recouvre le blastoderme, un carre de 8 a 10 mm de cote.
Avant d'enlever les membranes coquillieres sous-jacentes, on perfore la chambre
a air, ce qui a pour efTet de deprimer le contenu de l'ceuf dans la coquille et de
faire descendre le blastoderme a quelques millimetres au-dessous du plan de la
fenetre ainsi menagee (technique de Hara, 1961). Les oeufs dont
1'embryon a
depasse le stade favorable sont elimines; ceux chez lesquels il ne l'a pas atteint
sont remis en incubation apres obturation de la fenetre.

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Deux ecrans tailles dans du papier d'aluminium sont places au-dessus du
blastoderme: le premier comporte un secteur evide respectant la forme du
croissant germinal; le second, en forme de languette, a pour but de renforcer la
protection de l'extremite cephalique de l'embryon (Fig. 2). La surface decouverte
est seule exposee aux u.v. La source de rayons est constitutee par une lampe a
vapeur de mercure (type S. 100 de Leitz), placee sur socle de maniere a donner
un faisceau vertical dirige de haut en bas. L'interposition de divers filtres sur le
Fig. 1 Fig. 2
Fig. 1. Schema d'un embryon de Poulet au moment ou se pratique l'irradiation
du croissant germinal (stade a huit paires de somites). En pointille: le croissant
germinal. (D'apres Simon et Dubois, modifie.)
Fig. 2. Systeme des ecrans de papier d'aluminium utilises pour l'irradiation, vu de
dessus. En pointille: ecran evide. En hachures: ecran plein en forme de languette.
(D'apres Dubois, modifie.)
trajet lumineux permet de disposer d'une bande plus ou moins etendue d'ultra-
violet. En dehors du choix du filtre et de la duree d'irradiation, toutes les
caracteristiques du dispositif experimental utilise peuvent etre considerees
comme constantes. En ce qui concerne l'energie incidente du spectre d'emission,
il n'a ete procede a aucune evaluation de sa valeur absolue: on ne dispose que
de valeurs relatives en rapport avec les durees d'exposition.
Apres irradiation, les ecrans sont retires et on aspire par la perforation faite
au gros bout de
l'oeuf, une quantite d'albumine necessaire pour faire redescendre
le blastoderme a quelques millimetres au-dessous du plan de la fenetre. On
referme celle-ci au moyen d'une bande de ruban adhesif et on replace l'oeuf
opere a l'incubateur. Tant que l'embryon n'est pas entierement recouvert par
l'amnios, il est necessaire d'humecter le blastoderme a intervalles reguliers avec
du liquide physiologique, pour eviter la dessiccation.
Controles
histologiques
Le controle histologique des sujets d'experience et des temoins a beneflcie
de la decouverte de Mintz (1960) et de Meyer (1960) concernant la richesse des
cellules germinales de Poulet en enclaves glycogeniques P.A.S.
( + ). Clawson &

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Domm (1963) et Meyer (1964), apres avoir utilise ce resultat pour suivre la
migration des cellules germinales, ont constate que cette richesse en glycogene
diminue a la fin du cinquieme jour d'incubation et s'annule completement dans
le courant du 7e jour. Chez le Poulet et le Dindon, la meme technique, legere-
ment modifiee dans ses temps, peut s'etendre a la mise en evidence des cellules
germinales primordiales contenues dans le feuillet profond du croissant germinal
isole et etale sur lamelle (Reynaud, 1967). Elle va done etre appliquee sous cette
forme a tous les embryons normaux ou irradies recuperes entre le stade de la
ligne primitive (15 h d'incubation) et celui du repli cephalique (21 h). Les
individus recuperes entre 3 et 6 jours d'incubation sont evidemment trop
developpes pour etre examines in toto; aussi, apres avoir ete colores par la
technique preconisee par Meyer (1960), ils sont inclus dans la paraffine et
coupes a
5 fi ou a 7,5 fi. Seule une region troncale comprenant tres largement
les ebauches gonadiques est conservee. Chez les embryons sacrifies ou morts
au-dela du 6e jour d'incubation, on disseque et on conserve l'ensemble du
mesonephros et de la gonade. Celui-ci est fixe au Bouin et colore, apres section,
suivant une technique histologique courante: hemalun de Mayer, hematoxyline-
eosine ou trichromique de Masson.
Les feuillets entoblastiques provenant de blastodermes irradies au stade de
la ligne primitive (15 h) ont ete compares a des feuillets temoins. Chez ceux-ci,
on trouve constamment de nombreuses cellules germinales primordiales, recon-
naissables non seulement a leurs granulations P.A.S.
( + ) mais encore a leur
grande taille, environ double de celle des cellules entoblastiques banales, et a
leur gros noyau montrant souvent deux masses irregulieres de chromatine. En
outre, a partir du stade du prolongement cephalique, la presence de pseudopodes
est frequente chez ces cellules (Fig. 3
A). Chez les blastodermes irradies depuis
quelques heures, on a pu observer les premieres phases de la destruction des
gonocytes. Les cellules germinales sont souvent hypertrophiees, jusqu'a quatre
et cinq fois plus grosses que les cellules entoblastiques. Leurs enclaves glyco-
geniques et leurs granules vitellins sont tres rarefies (Fig. 3B). On rencontre
meme quelques cellules a l'aspect totalement vide (Fig. 3C). Enfin, chez les
blastodermes parvenus au stade du repli cephalique (21 h), les gonocytes
primordiaux adherant au feuillet germinal profond ne presentent pas de
pseudopodes.
L'examen des ebauches gonadiques d'embryons temoins de 3 a 6 jours
d'incubation revele la presence de nombreux gonocytes primaires, en tous
points comparables aux cellules germinales du croissant de Swift, et donnant
en particulier une intense reaction cytoplasmique P.A.S. positive (Fig. 3D, E).
L'observation des glandes sexuelles chez les temoins de plus de
6 jours d'incuba-
tion permet de retrouver de tres nombreux gonocytes primaires ou de tres nom-
breuses gonies incorpores a l'epithelium et aux cordons germinatifs. Les gono-
cytes ont pu etre denombres chez six embryons temoins ages de 3 a 7 jours
d'incubation (tableau 1). Les nombres obtenus, auxquels on a adjoint des