Lymphocytes B M. Alessandra Rosenthal-Allieri Laboratoire Central d’Immunologie Hôpital de l’Archet CHU-Nice Plan I. Lymphocytes B 1. Immunoglobulines : caractéristiques, génétique 2. BCR 3. Molécules de surface du lymphocyte B II. Différenciation des lymphocytes B 1. Maturation Ag indépendante 2. Maturation Ag dépendant 3. Localisation anatomique III. Lymphocytes B mémoire et sous-populations I. Lymphocytes B - Les lymphocytes B sont le support de l’immunité adaptative humorale par la production d’anticorps spécifiques. - Cette immunité é transférable par le sérum. - Chez l’homme, les lymphocytes B représentent 5 à 15% des lymphocytes sanguins, soit 20 à 400/mm3. Lymphocytes B Origine : - Bourse de Fabricius (oiseaux) - moelle osseuse (homme) Fonctions : a) l’activation par l’Ag induit leur transformation en plasmocytes (immunoglobulines sécrétées) b) capacité de se comporter en CPAg : peuvent fixer un Ag soluble : C3 CD4+ - spécifiquement par BCR - non spécifiquement par les récepteurs des complexes immunes pour les parties constantes des IgG ou pour les fragments du puis l’endocyter, le dégrader, le ré-exprimer à la surface, associé aux molécules HLA classe II, et le présenter aux lymphocytes T Sous-populations : pas de sous-populations comme pour les lymphocytes T, hormis les B-1 des cavités séreuses 1. Immunoglobulines : caractéristiques 5 isotypes, définis par la nature de la chaîne lourde : IgG (IgG1 à 4) IgM IgA (IgA1 et 2) IgD IgE Bifonctionelles : Extrémité N terminal : • régions charpentes ( framework FR1 à 4) • zones hyper-variables (complementary determining regions = CDR 1 à 3): spécificité Extrémité C terminale : • Fc (fonctions effectrices : capacité à activer le C’, à se lier aux FcR) Répartition : IgM intra-vasculaires IgG sérum et tissus IgA surface muqueuse respiratoire et intestinale IgE liées aux mastocytes et basophiles 1. Immunoglobulines : génétique - 1 Trois complexes génétiques : IgH en 14q32 Igk en 2p12 Igl en 22q11 Chaque complexe se compose de 3 ou 4 régions : V D J C = = = = variables diversité chaîne J constant Lorsque un précurseur lymphoïde s’oriente vers la lignée B, le génome codant pour les chaînes des Ig va subir des réarrangements au hasard : Chaînes lourdes : un gène D va se rapprocher au gène J (DJ), puis le gène VH se rapproche (VDJ) Chaînes légères : seul existe le rapprochement VJ Chaque gène V contribue environ aux premiers 100 Aa du domaine variable, tandis que les segments D et J codent pour les derniers Aa. L’ensemble VDJ constitue le 3ème CDR, composant essentielle de la spécificité Ab 1. Immunoglobulines : génétique - 2 Les réarrangements et l’expression des gènes d’Ig se déroulent selon une cinétique ordonnée et sont contrôles à trois niveaux distincts la lignée cellulaire. Les Ig ne sont exprimées que par les lymphocytes B. le stade de la différenciation cellulaire. Au sein d'une lignée cellulaire, les recombinaisons et l'expression des gènes d'Ig sont ordonnées selon le stade du développement de la cellule. Ainsi, les réarrangements et l'expression des gènes du locus IgH précèdent ceux des gènes des chaînes légères. De plus, au sein du locus IgH, les réarrangements des segments géniques sont temporellement régulés. exclusion allélique. Le réarrangement complet sur un des allèles, aboutissant à la formation d'un produit VHDJH ou VLJL codant, entraîne l'inhibition du réarrangement sur l'autre allèle. 2. Le BCR Lymphocytes B : les seules cellules à porter sur leur surface des IgS (environ 100 000/cellule) IgS : récepteur spécifique pour l’Ag, synthétisé et exprimé avant toute rencontre avec l’Ag Chaque lymphocyte B n’est porteur que d’un seul isotype k ou l (2/3 k, 1/3 l) et la forme dimérique de la chaîne µ, souvent associées aux chaînes d : phénotype IgM+ IgD+ = cellule matures. Isotypes g, a et e sont < 1% dans le sang, mais IgA surtout dans le tissu lymphoïde associé aux muqueuses IgS : même structure que l’Ig sécrétée avec modification de l’extrémité C’ des chaînes lourdes pour leur encrage sur la membrane Le BCR est étroitement associé à un complexe multi-moléculaire pour la transduction du signal d’activation : dimères Iga (CD79a) Igb (CD79b), analogues fonctionnels du CD3 dans le T 3. Molécules de surface du lymphocyte B 1) Marqueurs de la lignée B (panB) CD19, CD20, CD22, CD24, CD10 CD19: phosphoprotéine, forme des complexes avec CD21 et CD81 (TAPA). Stabilise le BCR à tous les stades de maturation CD20: molécule de canal calcique, apparaît sur les cellules matures CD22 impliquée dans le signal de transduction du BCR CD10 : endopeptidase neutre (CALLA : common acute lymphoid leukemia antigen) présent à la fois aux stades précoces de la lymphopoïèse et sur les B matures activés intra-folliculaires 2) Complexe CD19-CD21-CD81 CD21 récepteur pour C3d du complément : lorsque un Ag active le système complémentaire avec production de C3d, il se produit un co-engagement des IgS et de CD21, induisant leur rapprochement sur la membrane. CD21 est étroitement liée à CD19, dont la queue intra-cytoplasmique liée à la tyrosine kinase lyn provoque des activation moléculaires en cascade (signalling) BCR et molécules accessoires De plus : récepteurs pour les fractions du complément (CD21, CD35) et pour les Immunoglobulines 3) CD32 (RFcgIIB) : Fonctions différentes du RFcgII A et B ( 2 gènes producteurs) RFcgIIA sur phagocytes -déclenche l’endocytose des particules revêtues d’Ag -possède dans sa queue cytoplasmique une séquence ITAM-like phosphorylable et capable d’initier une cascade activatrice Syk dépendante, activant la phagocytose et la secretion de cytokines inflammatoires RFcgIIB sur phagocyte, mastocytes, lympho B -pas de phagocytose, mais rétrocontrôle de la synthèse d’Ac. -séquence ITIM intra-cytoplasmique activant une tyrosine phosphatase (SHIP) dont l’activation va inhiber diverses fonctions cellulaires Lorsque un complexe Ag/Ac provoque un co-engagement des IgS et des RFcgIIB il y a potentialisation de l’activation lymphocytarie mais aussi retro-contrôle de la synthèse d’Ac par des Ac de même spécificité, pour éviter des recrutements cellulaires inutiles. De même, lorsque des complexes immuns à IgG sollicitent simultanément le RFcgIIA et le RFcgIIB sur les macrophages, le résultat net est l’inhibition de la phagocytose (PTI et IgG IV) 4) CD40 BCR Reconnaissance de l’Ag Internalisation Ag Ré-expression des peptides Ag à la surface en association à HLA classe II Présentation aux lymphocyte T : dialogue T-B L’oligomérisation du TCR induit l’expression du CD40 ligand (CD40L ou CD154) sur le T qui en s’associant à son contre récepteur CD40, constitutivement exprimé sur les B, représente un puissant signal de : - prolifération et de prévention d’apoptose - de commutation isotypique L’activation de CD40 provoque l’apparition de CD86 et ensuite de CD80 sur le B, récepteurs de CD28 sur le lymphocyte T : amplification de la réponse cytokinique du T, production de cytokines favorisant la différentiation des B et la production d’Ac. II. La différentiation des lymphocytes B 2 grandes phases dans l’ontogénie B : 1) antigène indépendante a lieu dans l’organe lymphoïde primaire conduit à la formation de ly B matures naïfs élimine les ly B autoréactifs: établissement de la tolérance 2) antigène dépendante a lieu dans les organes lymphoïdes secondaires Formation des cellules effectrices Différenciation Maturation Production d’Ac Lympho B mémoire 1. Maturation antigène indépendante Foie foetal Moelle osseuse À partir des cellules CD34+ IL7 Stem cell factor CD19+ CD24+ CD10+ CD20+ CD22+ Cellules matures exprimant le BCR Quittent la moelle pour aller dans les organes lymphoïdes périphériques 1. Maturation antigène indépendante Etape indépendente de l’Ag : 4 stades de différentiation correlés avec le réarrangements des gènes des Ig et l’expression d’autres molécules de surface: 1. Cellules pro-B (progéniteurs B) 2. Cellules pré-B (précurseurs B) 3. Cellules B immatures 4. Cellules B matures Le stade pro-B Réarrangement des gènes du locus de la chaîne lourde des Ig (d’abord recombinaison DJ, puis VDJ) Si le réarrangement est fonctionnel, une chaine lourde d’isotype µ est synthetisée, tout autre réarrangement du locus de la chaine H est stoppé La chaîne lourde µ intracellulaire s’associe avec une pseudo chaîne légère, composée des 2 protéines l5 et VpréB et les chaînes Iga et Igb pour former le récepteur pré-B Une fraction de récepteur est exporté à la surface cellulaire et la cellule progresse vers la phase pré-B Expression à la surface de CD45R et CD19 Le stade pré-B Expression transitoire d’un récepteur pré-B (55% des cellules atteignent le stade pré-B) Etape de prolifération: expansion de la population avec génération de multiples cellules pré-B identiques, mais chacune d’elle pourra faire un réarrangement différent des gènes de la chaine légère Arrêt de l’expression de la pseudo-chaîne légère, d’abord sur le locus k, et s’il n’y a pas eu de réarrangement k fonctionnel, sur le locus l Le réarrangement fonctionnel d’un locus de la chaîne légère permet la progression au stade B immature Les cellules où il n’y a pas eu le réarrangement fonctionnel sont éliminées par apoptose Cellule B immature Expression à la membrane d’une molécule d’IgM complète formant le BCR Apparition à la surface des marqueurs CD22, CD23 et CD40 Sélection négative: mécanisme d’acquisition d’un répertoire B tolérant Le “receptor editing” : mécanisme durant lequel les cellules B immatures qui reconnaissent un ligand endogène réarrangent les gènes des domaines V afin de modifier la spécificité à l’Ag du BCR Les cellules dont le récepteur persiste à être réactif au soi sont éliminées par apoptose, ou inactivées (anergie). Les autres quittent la moelle osseuse pour poursuivre leur différenciation vers les organes lymphoides secondaires Cellule B mature naïve BCR : IgM+ et IgD+ Circule en permanence entre les différents organes lymphoides secondaires à la rencontre de l’Ag spécifique Demi-vie courte en absence de rencontre de l’Ag spécifique : 3 jours Si la rencontre avec l’Ag spécifique a lieu, on passe à la 2ème étape de développement dépendante de l’Ag 1. Maturation antigène indépendante en fonction de l’expression des molécules de surface Les molécules qui caractérisent la lignée B apparaissent progressivement et permettent de définir chaque étape de maturation: Molécules de surface exprimées B1 pro-B CD19, CD22, CD79b B2 pré-B CD19, CD22, CD79b CD10 B3 immature CD19, CD22, CD79b CD10 B4 mature CD19, CD22, CD79b +/-CD10 µ cytopl. IgM de surface NB: Sur la base de l’expression des molecules de surface lors du développement de la lignée B, il est possible de classer les lymphoproliférations aigues de type B (LAL-B) 2. Maturation antigène-dépendante A lieu au niveau des organes lymphoides secondaires périphérique (ganglions, rate, MALT) Les organes lymphoides secondaires ont une architecture hautement organisée avec des zones B, les follicules, et des zones T - lieu de rencontre entre le Ly B et l’Ag spécifique - lieu de la commutation isotypique - lieu d’hypermutation somatique avec sélection positive des ly B dont le BCR présente une maturation d’affinité pour l’Ag 2. Maturation antigène-dépendante Reconnaissance spécifique de l’Ag par le BCR : événement central nécessaire mais non suffisant à l’activation : 1er signal La cooperation du ly B avec le ly T CD4+TH2 spécifique du même Ag est nécessaire à la différenciation en LyB effecteur : 2è signal Cette collaboration B-TCD4+TH2 fait intervenir - protéines de surface : CD40 du ly B avec CD40L du ly T - cytokines secrétées: IL4, IL5, IL6, IL10 …suite La collaboration B/T va d’abord déclencher la division de la cellule B Une petite partie va se transformer rapidement en plasmocytes secreteurs d’Ac de faible affinité Une grande partie de ces cellules B vont constituer le centre germinatif des follicules lymphoides avec : commutation isotypique (switch) de la chaine lourde de l’Ig: mecanisme changeant la classe de l’Ig et ainsi permettant d’associer à une même fonction Ac des fonctions effectrices différentes hypermutation somatique : processus qui introduit des mutations ponctuelles dans les regions V réarrangées de l’Ig et par consequant peuvent modifier l’affinité de liaison à l’Ag. Les ly B dont le BCR présente une maturation d’affinité pour l’Ag seront sélectionnées positivement et poursuivent leurs différenciation en: Plasmocytes sécréteurs d’Ag Cellules mémoire qui permettent une reponse secondaire plus rapide, plus intense et plus efficace (interet des rappels au cours des vaccinations). Ganglion 3. Localisation anatomique 3.Prolifération et différenciation B 2.Activation B 1.Activation initial T et B 4.Sécrétion d’Ac par plasmocytes 2) Maturation antigène dépendante - suite Après initiation de la réponse dans la zone T, quelques rares cellules B gagnent les follicules primaires pour donner naissance aux centres germinatifs où ont lieu : - Expansion clonale d’un nombre initial très limités de B - Hypermutations somatiques ponctuelles des régions variables des chaînes H et L - Sélection positive des B spécifiques de l’Ag - Différenciation en plasmocytes ou lymphocytes B mémoire 2. Maturation antigène dépendante : sélection Dans les follicules lymphoïdes les B deviennent des cellules matures primaires capables de répondre à l‘Ag. En l’absence d’Ag : mort par apoptose après quelques semaines. Contrairement au répertoire du T mature à la sortie du thymus, celui des lymphocytes B primaires est poly-réactif et auto-réactif : la sélection se fait au sein des centres germinatifs des follicules lymphoïdes avec mise en place d’un répertoire spécifique et sans auto-réactivité. Les follicules lymphoïdes primaires sont constitué d’un dense réseau de cellules dendritiques folliculaires qui présentent les Ag aux B. Les lymphocytes B activés par le BCR et aidés par les lymphocytes T via le couple CD40/CD40L, après une phase d’expansion clonale, deviendront des plasmocytes secrétant des IgM. Organes lymphoïdes secondaires Follicules lymphoïdes primaires L’accès à cette « niche de survie » est soumis à compétition et les lymphocytes B immatures auto-réactifs ayant rencontré l’Ag ne peuvent y pénétrer et meurent par apoptose en 72h (phénomène lié à la perte de récepteurs des chimiokines impliqués dans cette migration) Mécanisme de contrôle qui « purge » le système immunitaire des lymphocytes B possédant une forte affinité pour les autoAg : clones potentiellement dangereux 2) Maturation antigène dépendante : follicules Les lymphocytes B activés entrent dans le follicule lymphoïde et se multiplient, puis se regroupent dans la zone sombre du centre germinatif: ils sont appelés centroblastes (IgM-, CD5-, CD38+). Les petits lymphocytes recirculants sont refoules en périphérie et forment la zone du manteau (IgM+, IgD+, CD5+). En se divisant, les centroblastes: -accumulent de nombreuses mutations somatiques qui modifient l’affinité de l’Ig -modifient la spécificité isotypique (commutations de classe) des Ig synthetisées. Les lymphocytes se transforment en centrocytes, migrant dans le zone claire du centre germinatif : re-expression de IgS. Les CDF présentent des antigènes natifs à leur surface. La reconnaissance de l’Ag induit pour le centrocyte un signal de survie, tandis que les cellules B ayant une affinité insuffisante pour l’Ag subissent l’apoptose (coopération T-B via CD40/CD40L). Rôle des cytokines dans ces phénomènes (ex. IL-4 = IgE, TGFb = IgA) III. Lymphocytes B mémoire Lymphocytes impliqués dans la réponse immunitaire secondaire, par opposition aux lymphocytes vierges de la réponse primaire Les cellules mémoire sont quiescents, en phase G0 et présentent des caractéristiques différentes des cellules naïves : - durée de vie plus longue - nombre d’IgS plus faible, mais de meilleure affinité pour l’Ag L’Ag ne se fixera que sur les cellules possédant un récepteur de haute affinité Ceci sélectionne les clones capables de produire des IgS de haute affinité pour l’Ag Ces cellules présentent les Ag CMH classe II fortement exprimés et la molécule de surface CD27 Lymphocytes B : sous populations Lymphocyte B : CD23CD21+ CD5Lymphocytes B-1 : CD5+ CD21+ CD23IL-12 dépendants Cavité péritonéale production d’autoAc Lymphoprolifération malignes B pas éliminés dans la moelle osseuse, ni rendus anergiques en périphérie