Les Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) - Définition - Fonctions / développement embryonnaire - Niche et motilité - CSH en thérapies Matthieu ROULEAU, PhD INSERM U898 (Faculté de Mèdecine) [email protected] Qu’est-ce qu’une cellule souche? Quelle est sa fonction au sein d’un tissu ou d’un organe ? Une cellule souche va assurer: l’homéostasie à long terme du tissus/organe Maintien tout au long de la vie de l’individu de la fonction du tissu/organe la réparation du tissus en cas de lésion Qu’est-ce qu’une cellule souche? Une cellule souche possède les caractéristiques uniques de: s’auto-renouveler indéfiniment ou de manière prolongée se différencier c’est à dire produire différentes cellules spécialisées (différenciées) Notion de Plasticité Différents niveaux de plasticité Totipotence : capacité à générer toutes les cellules d’un organisme (y compris le tissu extra-embryonnaire) pour former un être vivant structuré multicellulaire = œuf fécondé Pluripotence : capacité à générer toutes les cellules d’un organisme = les cellules souches embryonnaires (ES) Multipotence : capacité à générer certaines cellules constitutives d’un organe = cellules souches adultes tissulaires Unipotence : capacité à générer un seul type de cellules = progéniteurs unipotents (maturation fonctionnelle d’une cellule) Les différent types de cellules souches iPS cell (cell. Souches Pluripotentes induites) Prolifératives Lignées cellulaires Quiescentes, Faible nombre Accès difficile Culture difficile Difficiles à étudier Caractéristiques typiques des cellules souches tissulaires Auto-renouvellement : division cellulaire qui engendre au moins une cellule fille qui conserve le potentiel souche Multipotence : capacité à engendrer des cellules progénitrices de tous les types cellulaires composant le tissus Quiecence in vivo, Caractéristiques clefs pour assurer l’homéostasie/le renouvellement du tissu/réparation tissulaire mais parfois fort taux prolifératif in vitro Notion de holo-, méro- et para-clones (Barrandon & Green PNAS 1985) Très faible nombre in vivo Absence de marqueur spécifique Cellules difficiles à analyser Notion de « niche » une structure responsable du maitien de la CS dans un état de non différenciation Les différent types de cellules d’origine hématopoiétique Auto-renouvellement Cellules quiescentes Cellules souches multipotentes CSH (0.003%) CD34+ Multipotence CD34+ progéniteur commun myéloide Progéniteurs: Cellules multipotentes Cellules prolifératives progéniteur commun lymphoide Facteurs de croissance: EPO ,TPO, G-CSF, GM-CSF, etc…. myélocytes granulocyte myélocytes eosinophiliques monocyte basophiliques Précurseurs: cellules engagées Cellules différentiées cellule T eosinophiles mégakaryocytes globules monocytes/neutrophiles basophiles CD4+ + rouges CD41 macrophages CD8+ CD33+ 1011 cellules/jours plaquettes CD38+ cellule B CD19+ 1961-63: Till et McCulloch identifient les ”CFU-S”: 1ère évidence de cellules multipotentes CFU-S: Colony-forming unit-Spleen (1) Différenciation Irradiation létale Nodules (Cellules érythroïdes, granulocytiques, macrophages…) 8-12 jours (rate) Moelle osseuse (3) Auto-renouvellement (partiel) (2) Clonogénicité Cassures ADN 8-12 jours Moelle osseuse Irradiée (faible dose) MAIS CFU-S ≠ CSH car ne donnent pas de lymphocytes Auto-renouvellement Cellules quiescentes Cellules souches multipotentes CSH CD34+ Multipotence Progéniteurs: Cellules multipotentes progéniteur commun myeloïde Cellules prolifératives CD34+ CFU-S CFU-GEMM progéniteur commun lymphoïde Facteurs de croissance: EPO ,TPO, G-CSF, GM-CSF, etc…. CFU-Meg Précurseurs: cellules engagées Cellules différentiées CFU-E myélocytes granulocyte myélocytes eosinophiliques monocyte basophiliques CFU-GM CD38+ eosinophiles cellule T globules megakaryocytesmonocytes/ neutrophiles basophiles + CD4+ rouges CD41 macrophages CD33+ 1011 cellules/jours plaquettes CD8+ cellule B CD19+ Méthodes expérimentales de caractérisation des CSH Difficultés: 1) Absence de marqueurs spécifiques > combinaison de marqueurs CSH souris CSH homme CD34low/Sca-1+ Thy1+/low CD38+ c-kit (CD117)+ Lignage- CD34+ Thy1+ (CD90) CD38low/c-kit-/low Lignage(14 marqueurs de diff.) (14 marqueurs de diff.) 2) Différenciation spontanée et faible expansion des CSH in vitro 3) Identification fonctionnelle a posteriori Detection des CFU: Colony forming unit Test de reconstitution in vivo Capacité à régénérer un système hématopoïétique complet à long-terme chez une souris irradiée Irradiation létale 2) 1) Survie (progéniteurs), Prise de greffe (% chimérisme) 2-5 mois 3) Transplantation en serie Seul test des CSH les plus pluripotentes!! Moelle osseuse/CSH Seule 1 sur 10 000 cellules de moelle osseuse possède cette capacité de reconstitution à long terme Dévelopment embryonnaire des CSH Succession de sites pour l’hématopoïèse: 1) Le sac vitellin (extra-embryonnaire) Hémangioblastes (Cellules souches endo/hémato) - pas de CSH pluripotentes, - érythrocytes primitifs, - ne participent pas à l’hématopoïèse adulte Ilôts sanguins 2) La région aorte-gonade-mésonephros (AGM): 1er site des CSH - CSH pluripotentes (faible nombre), - Progéniteurs multipotents, - pas de différenciation in situ - participent à l’hématopoïèse adulte 3) Le foie fetal: 1er site d’une hématopoïèse complete - Colonization des CSH pluripotentes de l’AGM - expansion des CSH (nombre définitif) - différenciation importante Migration des cellules du foie vers: 4) Le thymus fétal 5) La rate fétale 6) La moelle osseuse fétale et adulte LT-HSC = long term HSC ST-HSC = short term HSC CMP = Common Myeloid CLP = Common Lymphoid Progenitor Differentiated cells Caractéristiques marquantes Choix possible entre autorenouvellement et differenciation Multipotence Auto-renouvellement Peuvent s’expandre temporairement mais continuent à se différencier Cellules matures différenciées fonctionnelles Unipotence Pas d’auto-renouvellement Notion d’Auto-renouvellement Homéostasie tissulaire : division symétrique vs asymétrique Division cellulaire symétrique 2 SC Auto-renouvellement symétrique 2 cellules engagées Division cellulaire asymétrique SC Cellule engagée Différenciation symétrique La division d’une cellule souche est asymétrique : les cellules filles ne sont pas identiques, et seule une des deux est identique à la cellule mère Maintien d’un nombre constant de cellules souches (SC) Notion d’Auto-renouvellement Homéostasie tissulaire : division symétrique vs asymétrique Division cellulaire symétrique 2 SC Division cellulaire asymétrique SC Cellule engagée Auto-renouvellement symétrique Expansion des CSH dans le foie fœtal; Reconstitution hématopoiétique après déplétion (chimiothérapie, …) Les “niches” des cellules souches: des environnements ultra-spécialisés Follicule pileux Moelle osseuse Crypte intestinale Shofield (1978): 1) Site anatomiquement défini 2) Maintien des fonctions des CSH 3) Inhibition de la différenciation 4) Contrôle nombre de CSH 5) Capacité de réversion (?) La “niche” des CSH dans la moelle osseuse Endosteum (Ostéoblastes Ostéoclastes) Les constituants de la “niche” des CSH 1) Les cellules Ostéoblastes (sécretent SDF-1, contrôlent le nombre de CSH…) Cellules stromales (ex: cellules réticulaires) Cellules endothéliales 2) Facteurs solubles: Cytokines, hormones etc….. 3) Matrice extracellulaire : interface avec la matrice osseuse SDF-1/CXCR4 Différentes niches des CSH? Niche de quiescence Niche d’auto-renouvellement Niches fonctionnelles: Niche de quiescence, niche d’auto-renouvellement, niche de prolifération/différentiation? Niches anatomiques: Niche ostéoblastique et niche vasculaire? Niche d’auto-renouvellement Les CSH et thérapies cellulaires 1- les transplantations 1) Restorer une fonction chez des patients avec mutations génétiques: Cancers du système hématopoïétique (leucémies) Maladies génétiques (immunologiques, métaboliques) > Allogreffe 2) Conserver et re-injecter les CSH saines après traitement: Tumeurs solides, Lymphomes ou certaines leucémies > Autogreffe Autogreffe Allogreffe Maladies non-malignes • Aplasies médullaires (Fanconi) • Déficits immunitaires combinés sévères • Hémoglobinopathies • Déficit enzymatique (Gaucher) • Autres (ostéopétrose) • Maladies auto-immunes • Maladies génétiques+ thérapie génique Maladies malignes • Leucémies aiguës myeloïdes et lymphoblastiques • Leucémies myéloïdes chroniques • Syndromes myélodisplasiques • Lymphomes, Myélomes, • Leucémie lymphoïde chronique • Syndromes myéloprolifératifs • Tumeurs solides • Myélomes • Lymphomes non-hodgkiniens • Maladie de Hodgkin • Tumeurs solides (cancer du sein, neuroblastomes...) 3 propriétés fondamentales des CSH/progéniteurs pour la réussite de la greffe: 1) La multipotence: Obtention de tous les types cellulaires hématopoiétiques 2) L’auto-renouvellement: Assure le maintien du système hématopoïétique reconstitué à long terme 3) La capacité de “homing” (domiciliation): Permet aux CSH de retourner dans la moelle osseuse après injection I.V. La présence des progéniteurs est importante pour la reconstitution à court-terme! 1961: Till et McCulloch: 1ère évidence de cellules multipotentes CSH mobilisées par G-CSF Eliane Gluckman, Paris E Donnall Thomas Modèles expérimentaux Cellule souche leucémique Alain Fisher, Paris CSH et thérapie génique Sources de CSH en transplantation 1- Moelle osseuse (ponction sous anesthésie générale: 500-1200ml) 2- Sang périphérique par cytaphérèse (Cellules CD34+ mobilisées avec G-CSF: 0.05% 5%) 3- Sang de cordon ombilical Registre France Greffe de Moelle http://www.dondemoelleosseuse.fr Etapes de la transplantation de CSH Collecte des CSH du donneur (allogreffe) 1- Conditionnement (irradiation, chimiothérapie) 2- Transfusion veineuse des CSH “Homing” vers la moelle osseuse 3- Traitement adjuvant Stockage des CSH du donneur “purge” éventuelle (autogreffe) Transfusion globules rouges, plaquettes Immunosuppression Antibiotiques, G-CSF 4- Reconstitutions hématologique (12 à 30 jours) et immunologique (1 an) Migration/Trafficking des cellules CSH Mécanismes moléculaires Homing / prise de greffe sang moelle osseuse Mobilisation Situations physiologiques Très faible recirculation permanente à l’état normal ( 0.01% CD34+ dans le sang) Mais ?? Procédures médicales Greffe de CSH Collecte de CSH (G-CSF) CXCR4 cellule Mouvement SDF-1 La chimiokine SDF-1 régule le homing des CSH (Chimiokines: cytokines chimioattractantes) Gradient de chimiokine Anti-SDF-1 Souris NOD/SCID Cellules CD34+ CFU-GM CFU-E CFU-GEMM Cellules CD34+ Anti-CD34 (CTL) Cellules CD34+ Anti-CXCR4 CXCR4 CD34 moelle Test de détection des colonies humaines in vitro Mécanisme de mobilisation des CSH?? G-CSF induit une réduction de SDF-1 dans la moelle osseuse Moelle osseuse (homme) Moelle osseuse (Souris) SDF-1 (ng/ml) ( ) SDF-1 G-CSF 20 4 15 10 3 * 2 5 1 ** 0 CTL 1 jr 5 jrs G-CSF 0 CFC-C dans le sang (x103/ml) ( ) CTL G-CSF Système nerveux Activation des ostéoclastes Protéases neutrophiliques ARNm SDF-1 Inhibition des ostéoblastes protéine SDF-1 Diminution de SDF-1 dans la moelle osseuse Mobilisation des CSH/progéniteurs Protéases protéine SDF-1 Stratégies actuelles pour améliorer les transplantations Expansion du greffon Cytokines, Facteurs de croissance Sang Homing Expression de CXCR4 Inhibition de CD26 (qui Moelle osseuse Mobilisation GM-CSF AMD3100 (inhibiteur de CXCR4) dégrade SDF-1) Retention, Auto-renouvellement Activer signaux de la niche: parathormone (augmente ostéoblastes) Niche des CSH Les CSH et thérapies cellulaires Réparation cardiaque (essais cliniques 2005- ) • Injectées au niveau de la lésion cardiaque après infarctus • Les CSH agissent en activant l’angiogénèse • Efficacité non encore démontrée CSH et thérapies géniques (essais cliniques 2000- ) Culture des CSH in vitro (cytokines) et transfert de gène (virus) Immunodéficiences (ADA-SCID, X linked-SCID, X linked-CGD) Maladies métaboliques Résultats: Bonne correction, Cellules T fonctionnelles MAIS: 4/10 enfants (Fisher, Paris) et 1/10 (Londres) ont développé des leucémies (LMO2) Les CSH et induction de tolérance expériences limitées actuellement à des modèles animaux • utilisation de CSH “purifiées” (élimination des lymphoT contaminant pour éviter les problèmes de GVHD) allogéniques • transplantation de ces CSH (sans compatibilité de MHC et/ou de mHC) Reconstitution d’un système hématopoiétique équivalent à celui du donneur • transplantation d’un organe solide issus du même donneur que les CSH Absence de rejet de ce greffon. Il y a eu induction de tolérance spécifique : Un greffon obtenu d’un donneur tierce sera rejeté. Les CSH et induction de tolérance (suite) > 3000 CSH (H-2b) + cœur (H-2b) = pas de rejet > 6x106 cell de MO (H-2b) + cœur (H-2b) = pas de rejet Transplantations contrôles : > 3000 CSH (H-2b) + cœur “tierce”(H-2k) = rejet à 100% > cœur (H-2d) tpl ds souris C57BL/Ka (H-2b) = rejet à 100% Gandy et al Transplantaion 1998 Les cellules souches pluripotentes iPS Reprogrammation Induced pluripotent stem cells Avantages: Cellules différentiées évite pb éthique hES autologues Problèmes à résoudre pour la thérapie: Utilisation de virus Protocoles de différenciation Thérapie génique à partir de cellules iPS HbSS HbA 2/2 A/T 2/2S Science, nov 2007 (4) Transplantation des cellules CSH (1) Obtention de cellules iPS autologues LoxP c-myc LoxP Gène muté Gène sain (3) Différenciation en cellules CSH (2) Correction du gène muté (recombinaison homologue)