western blot
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WESTERN BLOT Test de confirmation d’infection HIV Séminaire : Méthodes de séparation analytique, EPFL, semestre d’hiver 2004-2005 Table des matières Introduction VIH Explication de la méthode • Électrophorèse sur gel • Incubation • Révélation • Interprétation Étude de cas Conclusion Introduction Le dépistage HIV se fait de la façon suivante: Test ELISA effectué en premier lieu Si test positif, deuxième test ELISA Si toujours positif, Western Blot comme confirmation car ELISA peut donner des ‘faux positifs’ Western Blot : recherche spécifique des anticorps anti-HIV du patient. VIH-composition Glycoprotéines de la membrane: GP160, GP110/120, GP 41 Protéines membranaires: p24/25 Protéines de la capsule interne: p18 Protéines internes: p55, p40 Transcriptase inverse: p68, p52 Endonucléase (=intégrase): p34 Explication de la méthode Le principe est de détecter les anticorps antiHIV du patient par immuno-empreinte. Permet de caractériser les anticorps dirigés contre chacune des protéines virales très spécifiquement Électrophorèse sur gel La première étape est la dénaturation du virus par un détergent ou autre agent (S-dodécyl sulfate) Les protéines virales (antigènes) sont séparés selon des critères de masse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La dernière étape consiste au transfert des protéines sur un buvard (blot) de nitrocellulose. SDS-PAGE L’agent SDS est une molécule portant une forte charge négative. Lorsqu’elle se lie à une protéine, elle cache totalement la charge propre à cette dernière. Pendant l’électrophorèse, les molécules vont donc migrer à une vitesse limitée uniquement par leur masse. Incubation La bandelette de nitrocellulose est incubée avec le sérum du patient contenant (ou non!) les anticorps anti-HIV Les anticorps spécifiques se lient aux antigènes du blot. La bandelette est rincée pour faire partir les anticorps non complexés. Révélation Les complexes antigèneanticorps sont révélés par un deuxième anticorps couplé à une enzyme. Le nouvel anticorps se lie au complexe lors de l’incubation. Les anticorps non liés sont rincés. Au contact du substrat de l’enzyme, une couleur apparaît Bandes témoins Deux bandes témoins sont utilisées : Contrôle positif : synthétisée en mettant en contact les antigène du blot avec tous les anticorps complexant. Cela révèle l’emplacement sur le blot de chaque complexe. Contrôle négatif : sans présence des anticorps. Une bande de contrôle interne : elle contient des immunoglobulines à la place des antigènes de départ. Ceci permet la vérification du bon déroulement de la réaction enzymatique Interprétation Protéine virale Gène Aspect de l'immunoempreinte G160 ENV Bande nette GP110/120 ENV Bande à bords diffus P68 POL Bande nette P55 GAG Doublet P52 POL Bande nette GP41 ENV Bande diffuse P40 GAG Bande nette P34 POL Bande nette P24/25 GAG Bande nette P18 GAG Parfois doublet Le test est considéré positif si la présence de deux glycoprotéines membranaires, d’une tierce protéine membranaire ou interne du virus ainsi qu’une enzyme sont détectés Le résultat (indéterminé) peut faire suspecter une séroconversion ou éventuellement une réaction croisée avec d’autres rétrovirus Profil Positif 2 ENV ± GAG ± POL Indéterminé 1 ENV ± GAG ± POL ou GAG + POL ou GAG ou POL Négatif Aucune bande ou bandes non répertoriées Étude de cas Cas n°1 : patient récemment infecté Premier examen : Western Blot négatif, c’est la primo-infection Ensuite, augmentation dans le temps des anticorps anti-VIH, la séroconversion Etude de cas Cas n°2 : patient malade Dans ce cas, la dispartition des anticorps anti-HIV en fin de SIDA témoigne de l’effondrement du système immunitaire du sujet. Conclusion Le test Western Blot permet de confirmer la présence du HIV Utilisation de l’électrophorèse Il permet de suivre l’évolution dans le temps de la concentration des anticorps du patient Technique très sélective mais moins sensible que la technique ELISA
