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Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella bronchiseptica Bordetella beta- protéobactérie bronchiseptica Coccobacille gram négatif, mobile aérobie S et N + tractus respiratoire présent chez de nombreux mammifères responsable de bronchopneumonie chez les animaux zoonose possible parent de B. pertussis et B. parapertussis génome séquencé (5.3Mbase) Bordetella ssp. facteurs de virulence (adhesines et toxine) exprimées sous le contrôle d’un système à 2 composants (BvgAS system) nécessité d’un TTSS pour induire la cytotoxicité, la colonisation à long terme de la trachée Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella bronchiseptica BvgAS système: BvgS: protéine membranaire histidine kinase senseur du milieu extracellulaire activée , phosphoryle BvgA BvgA: facteur de transcription pour les gènes de virulence régulation du TTSS Système de sécrétion de type 3 : très conservé chez les bactéries Gramun des mécanismes très impliqué dans la virulence translocation des effecteurs du cytosol de la bactérie dans le cytoplasme de la cellule hôte selon le stade de l’infection, les effecteurs peuvent variés Représentation d’un TTSS Protéines sécrétées via le TTSS : 4 protéines identifiées chez Bordetella. BopB, BopD, BopN et Bsp22 BopB/D complexe de perforation de la membrane plasmique BopN ATPase permettant la sécrétion Objetif de l’étude: Identifier de nouveaux effecteurs de Bordetella passant via le TTSS Recherche de protéines sécrétées via le TTSS -Comparaison des profils protéiques des surnageants de culture des souches wt et ΔTTSS en SDS-PAGE 10 bandes différentes entre les 2 pistes dont BopB, BopN, BopD, Bsp 22 -Extraction du gel des 6 bandes non identifiées -Trypsination et analyse par spectromètre de masse pour identification des protéines MALDI-TOF MS ou ESI-MS/MS -génération in silico d’une banque de peptides à partir du génome Recherche de protéines sécrétées via le TTSS -Analyse des séquences peptidiques: 3 bandes sont des produits de dégradation de Bsp22 et BopD Bande a 1 peptide résidus 33-44 de HP p69 Bande b 5 peptides Une seule protéine a été identifié à l’issue du screening. HP de 69 kDa renommée BopC Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent –elles à une seule protéine BopC? Génération d’un mutant ΔBopC Clonage puis délétion du gène bopC via le système Gateway™ Introduction dans un plasmide suicide conjugatif (pRK6) Complémentation du mutant ΔBopC par le plasmide pBopC Clonage d’une cassette promoteur fha- bopC- terminateur rrnB1 fha hémagglutinine filamenteuse de Bordetella activé par BvgA Introduction dans un plasmide réplicatif conjugatif (pRK415) Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent –elles à une seule protéine BopC? Comparaison des profils de sécrétion formation de complexe multimérique sécrétion dépendante d’un TTSS BopC a-t-elle un effet cytoyoxique? Recherche d’un effet cytotoxique de BopC Infection de cellules L2 de rat pendant 20 min Coloration avec une solution de Giemsa (différenciation nucléaire et cytoplasmique) 95% des cellules infectées par les témoins + sont détruites Pas de cellules dégradées pour les mutants ΔbopC et ΔTTSS BopC a-t-elle un effet cytoyoxique? Recherche d’un effet cytotoxique de BopC Infection de cellules HeLa Evaluation de la cytotoxicité par mesure de la LDH La cytotoxité de B. brochiseptica est associée à bopC. BopC a-t-elle un effet cytoyoxique? Recherche d’un effet cytotoxique de BopC Infection de cellules HeLa pendant 1h Evaluation de la mortalité par coloration au bleu trypan 57% 48% BopC a-t-elle un effet cytoyoxique? Données bibliographiques B. brochiseptica induit une nécrose des cellules sans activation des caspases Cependant, observation de certaines cellules infectées TUNEL + (terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP-biotin nick end-labelling) Coloration différentielle de la mort cellulaire: Cellules apoptotiques coloration dense au niveau du noyau Cellules non apoptotiques: coloration diffuse du noyau BopC a-t-elle un effet cytoyoxique? Evaluation de la mort cellulaire Observation des cellules HeLa infectées à 2h (ou 5h pour la stauroporine) BopC est requis pour l’induction de la mort cellulaire, mais n’induit pas d’apoptose. Stsp: staurosporine, inhibiteur des PK BopC a-t-elle un effet cytoyoxique? BopC est-elle une protéine formant un pore du TTSS? Mesure de l’activité hémolytique (30min de contact) Contrairement à BopB/D, BopC n’appartient pas au complexe de perforation de la membrane plasmique BopC et phosphorilation Données bibliographiques B. brochiseptica induit des déphosphorylations dans des cellules L2 infectées. Ce phénomène est TTSS dépendant. Recherche d’un effet de BopC sur les protéines tyrosine phosphorylées (PY). Observation par immunofluorescence de différents facteurs: adhérence bactérienne ( actine et bactérie) Etat de phosphorylation des PY BopC et phosphorilation Observation des cellules HeLA après 0, 20 min ou 1h d’infection BopC et phosphorilation Au cours du développement de l’infection: •l’adhésion et la colonisation des cellules ne sont pas modifiées chez les mutants ΔbopC et ΔTTSS. •l’état de phosphorylation des PY est modifié par la souche wt mais ni par le mutant ΔbopC, ni par le mutant ΔTTSS BopC induit une déphosphorylation des PY dans les cellules infectées. BopC et phosphorilation Au cours du développement de l’infection B. brochiseptica BopC : •requis pour l’induction de la mort cellulaire •modifie l’état de phosphorylation des PY Sur quel aspect BopC agit principalement? Infection de cellules HeLa en présence d’inhibiteur de la déphosphorylation, le sodium orthovanadate Observation en microscopie à fluorescence Mesure de la cytotoxicité (LDH et TUNEL) BopC et phosphorilation Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica wt en présence ou non de vanadate + - L’état de déphosphorylation des PY dans les cellules en présence de vanadate est relativement atténué. BopC et phosphorilation Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate Observation sur 200cellules au hasard La présence de vanadate atténue la déphosphorylation des PY induite par BopC. BopC et phosphorilation Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate BopC et phosphorilation Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate Le vanadate et donc l’état de déphosphorylation des PY n’ont pas d’effet sur la cytotoxité cellulaire. ↓[PY] dans les cellules infectées par B. brochiseptica a lieu après la mort cellulaire dépendante de BopC. BopC et sécrétion via le TTSS Données bibliographiques Les effecteurs TTSS dépendants sont introduits directement dans la cellule hôte depuis le cytoplasme bactérien via le TTSS. BopC est-elle un effecteur de type III? Utilisation d’un système rapporteur TEM-1 β-lactamase ( Charpentier et Oswald, 2004) Fluorescence Resonance Energy Transfert BopC et sécrétion via le TTSS Génération des fusions TEM1 Amplification PCR des gènes bopC, bcrH2 (protéine cytoplasmique induit par BvgA) et map (effecteur de EPEC) Clonage dans le pCX340 (fusion traductionnelle avec TEM1) puis PCR pour introduction dans un plasmide réplicatif conjugatif (pRK415) via le système Gateway™, BopC et sécrétion via le TTSS Analyse des transformants ΔbopC et ΔbopB et ΔTTSS avec les plasmides TEM1 Protéines totales Protéines sécrétées 5% 20% Les produits de fusion BopC-TEM1 sont correctement synthétisés et sécrétés exceptés dans la souche ΔTTSS. BopC et sécrétion via le TTSS Cellules HeLa infectées+ CCF2-AM 70% FRET+ BopC est transloquée via le TTSS dans la cellule hôte. Le signal d’adressage se situe dans les 48 premiers acides aminés N-ter. BopC et cytotoxicité dans la cellule hôte BopC a un effet cytotoxique mais est-il direct ou résulte –t- il d’une cascade de régulation? Clonage de BopC dans un plasmide d’expression eucaryote Transfection des cellules COS-7, HeLa, 293T Mesure de la cytotoxicité à 18h L’expression de BopC directement dans la cellule permet d’induire la mort cellulaire sans intervention d’autres facteurs de virulence. Discussion BopC (Bordetella outer protein involved in cytotoxicity) protéine de 69kDa impliquée dans la mort cellulaire protéines sécrétées via le TTSS : pore forming proteins (translocators) (1) ou effecteurs (translocated protéins) (2) effecteur de cytotoxicité qui provoque la nécrose des cellules infectées. Analyse in silico du gène bopC BopC a une fonction protein-tyrosine phosphatase (PTPase) comme YopH mais rBopC activité PTPase – membre de la famille PTPase activité catalytique sur la cystéine 403 dans YopH BopC n’a pas de cystéine L’effet PTPase ne serait pas lié à BopC Discussion Analyse in silico du gène bopC •Recherche de protéines homologues et ou de motifs conservés Présent uniquement chez les souches de Bordetella (identité >95%) •Localisation à l’extérieur du locus TTSS idem pour d’autres effecteurs de TTSS (SopE, SigD, orf3,Nle5) •Recherche d’îlots de pathogénie dans une région de 20kb flanquant bopC transposase 5kb en amont de bopC B.parapertussis transposase 2kb en amont et intégrase 1.6kb en aval de bopC B. pertussis Rien chez B. bronchiseptica •Régulation + de bopC par le système BvgAS Discussion La protéine BopC •BopC est sécrétée sous forme de multimère ou compléxée (150-200kDa >69kDa) observation en SDS-PAGE de tels phénomènes pour des protéines ayant de nombreux segments TM mais BopC possède un seul TM prédit (619-643aa) la multimérisation de BopC serait porté par la partie Cter (449-658 aa) de BopC BopC et TTSS •Les TTSS peuvent sécréter des effecteurs hétérologues: Xanthomonas TTSS reconnaît YopE; Yersinia TTSS reconnaît Pseudomonas AvrB et AvrPto; Bordetella TTSS reconnaît EPEC Map bien que moins stable ( absence de la chaperone CesT) •BopC aurait un effet régulateur sur l’expression des autres protéines du TTSS La spectrophotométrie de masse MALDI-TOF Matrix –assisted laser desorption/ionization ESI Electrospray Ionization Time of Fly Phage lambda recombination in E. coli cos The Gateway® System Phage l attP relies on five sets of 232 bp specific and non cross- x reacting att sequences attB E. coli 21 bp Integration (Int, IHF) Excision (Int, IHF, Xis) The specificity is given by the 7 nucleotides of the core region attL attR 96 bp 157 bp Lysogen Glossary of terms used in Gateway® cloning att site – A defined length of DNA that constitutes a recombination site. There are 4 classes of att sites called attB, attP, attL, and attR. ccdB gene – A counterselectable gene that allows for negative selection of unwanted byproduct plasmids after recombination. Donor (pDONR) Vector – A vector with attP sites flanking a counterselectable gene that recombines with a gene of interest flanked by attB sites. BP reaction – A recombination event between attB and attP sites catalyzed by BP Clonase™ II Entry (pENTR) clone – A vector that contains your gene of interest flanked by attL or attR sites. LR reaction – A recombination event between attL and attR sites catalyzed by LR Clonase™ II Destination (DEST) Vector – An application-geared vector with attR sites flanking a counterselectable gene that will recombine with one or more entry clones. MultiSite Gateway® Technology – A system that allows simultaneous assembly of multiple DNA fragments into a single destination vector Building a Gateway® Entry Clone gene attL1 ccdB attP1 attB1 gene attB2 + Entry Clone attP2 attR1 Donor Vector KanR attL2 ccdB attR2 + KanR BP Clonase™ II 90-99% correct clones on Kan plates Obtaining a Gateway® Expression Clone gene attB1 attL1 attR1 attL2 Entry Clone KanR ccdB ccdB gene + attR2 attP1 AmpR LR Clonase™ II Expression Clone attP2 Donor Vector Destination Vector attB2 + AmpR KanR 90-99% correct clones on Amp plates Standard Gateway® CTGCTTTTTTGTACAAACTTG attB1 CAGCTTTCTTGTACAAAGTTG attB2 CAACTTTATTATACAAAGTTG attB3 CAACTTTTCTATACAAAGTTG attB4 CAACTTTTGTATACAAAGTTG attB5 MultiSite Gateway® 2-fragment MultiSite Gateway® Pro PCR Fragments pDONRs attB1 attB5r attB5 attB2 X X X X attP1 attP5r attP5 attP2 BP reactions attL5 Entry Clones attL2 X attL1 attR5 X Destination Vectors attR1 attR2 LR reaction Expression clones attB1 attB5 attB2 Invitrogen Proprietary & Confidential MultiSite Gateway® Three-Fragment Vector Construction Kit PCR Fragments pDONRs attB4 attB1r attB1 attB2 attB2r attB3 X X X X X X attP4 attP1r attP1 attP2 attP2r attP3 BP reactions Entry clones Destination vector attL4 attR4 attR1 attR2 X X attL1 attL2 CmR ccdB attL3 attR3 LR reaction Expression clone attB4 attB1 attB2 attB3 Invitrogen Proprietary & Confidential Système TEM
