II.1 - Biotechnologies Animales - Culture cellulaires
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Les cultures cellulaires •Passage d’un organisme à des cellules isolées dans un milieu et des conditions de croissance artificiels •Intérêts et limites •Définition de « in vitro » Notion de stérilité Culture ne contenant que les cellules que l’on souhaite y trouver et aucun autre organisme (autre cellule eucaryote, bactéries, champignons, levure, virus) Pourquoi? •Induit du stress par déprivation (le contaminant prolifère plus vite et consomme les nutriments du milieu) •Stress par des signaux de danger qui modifient les réactions d’une cellule Les contaminants les plus courants •Les bactéries de notre peau, E. Coli, S. Aereus •Levures •Mycoplasmes •Autres types cellulaires (quand un même expérimentateur travaille au même endroit avec plusieurs types cellulaires) Eviter les contaminations • filtre 0,22 mm (ne laisse passer que les virus) • autoclavage Une pièce de culture cellulaire Laboratoire type L2 assurant la protection des manipulateurs et de l’environnement contre les risques biologiques •SAS d’entrée •Les hottes sont des PSM (poste de sécurité microbiologique) •Une différence de pression limite les échanges d’air L’air est filtré avant d’être rejeté vers l’extérieur Détecter une contamination •Le plus souvent la contamination se perçoit à cause de la turbidité du milieu et de sa couleur Le contaminant (bactérie ou levure) prolifère plus vite que des cellules de mammifères Comme il est plus petit, il va flotter dans le milieu et lui donner un aspect opalescent La plupart des milieux de culture incluent un indicateur de pH Généralement la présence de bactéries acidifie le milieu, celle des levures le rend plus basique •La contamination par les mycoplasmes est plus pernicieuse. Ce sont des parasites intracellulaires, capables de coloniser toutes les cellules de mammifère, avec les mêmes conséquences que toute autre contamination. Pour déceler leur présence, il faut une microscopie à fluorescence, qui permettra de voir les noyaux des parasites dans le cytoplasme des cellules, ou un kit de détection (par technique ELISA ou par PCR) commercial Les milieux de culture Les milieux de culture doivent répondre aux exigences multiples et complexes des cellules eucaryotes: - eau - ions minéraux nombreux et variés à des concentrations adéquates. L'osmolarité du milieu doit être celle du sérum physiologique - source de carbone et d'énergie - source d'azote : acides aminés obligatoirement - facteurs de croissance - gaz : le dioxygène, les cellules étant aérobies strictes - pH maintenu constant vers 7,4 On évite la multiplication microbienne par l'ajout d'antibiotiques. Les milieux de culture (suite) Les facteurs de croissance cellulaires sont en général apportés par le sérum de veau foetal 1,5 à 10 % (SVF=FCS) Ces facteurs de croissance sont notamment: - l'EGF (facteur de croissance épidermique), - le FGF (facteur de croissance fibroblastique), - le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes), - l’ IL2 (facteur de croissance des cellules T)... Ce sont en règle générale des mitogènes. Le sérum de veau foetal apporte aussi : de l'insuline et de la fibronectine qui permet l'ancrage des cellules aux parois du flacon Conservation des cellules On utilise le DMSO pour les congeler. Ce produit protège les membranes lysosomiales et empêche le relargage des protéines.On congèle une suspension de 3 à 4 106 cellules par ml de milieu en phase exponentielle, à -40°C lentement (1 à 4°C par min) puis dans l’azote liquide. La décongélation est rapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un contrôle de viabilité. Contrôle de viabilité des cellules • soit grâce à des colorants vitaux tels que le rouge neutre incorporé dans les lysosomes des cellules vivantes • soit grâce à des colorants d'exclusion tels que le bleu Trypan pénétrant dans les cellules mortes . Les cellules sont ensuite comptées sous microscope. Évolution d'une culture cellulaire au cours du temps Cas général: Après un certain nombre de repiquages, variable mais constant selon les espèces, on constate que les cellules cessent de se multiplier et meurent : c'est le phénomène de mort cellulaire programmée ou apoptose. Très rapidement, il est apparu que certaines cellules tumorales, se multipliant activement ne présentent plus ce mécanisme de mort programmée: ces cellules sont dites transformées. Les lignées cellulaires Les lignées cellulaires sont des cellules "immortelles", c'est-à-dire que l'on peut maintenir en culture indéfiniment. Ce sont des cellules qui ont été rendues immortelles car : •elles sont cancéreuses •elles sont contaminées par un virus qui les rend immortelles (comme un virus du groupe Herpès ou le SV40) •elles ont été modifiées par génie génétique pour être immortelles ; le plus simple étant de leur injecter le gène codant pour la protéine rendant immortel (comme le gène T du virus SV40). Les lignées cellulaires (suite) Leur culture est considérée comme facile, car elles échappent à tout phénomène de sénescence, et échappent plus ou moins à l'apoptose. Elles s'adaptent donc facilement aux conditions de culture artificielles. En conséquence, les lignées sont exposées au risque de dérivation de souche, qui pose des problèmes de reproductibilité entre deux laboratoires différents. En pratique, une lignée est isolée dans un laboratoire X. Ses caractéristiques sont publiées et la lignée est distribuée ou vendue dans le monde entier. Chaque laboratoire va avoir ses propres conditions et habitudes de manipulation, qui vont induire des pressions de sélection différentes. Les lignées sont très adaptables, et vont donc suivre la pression pour s'adapter. Il en résulte que tous les laboratoires qui pensent travailler sur la souche du laboratoire X, travaillent en fait sur des souches légèrement différentes. Plus le temps passe, et plus les habitudes de manipulation sont éloignées des standards, et plus les souches dérivent, ce qui conduit parfois à des querelles entre laboratoires de recherche. Pour cette raison, les laboratoires doivent constituer des banques de lignées, conservées dans l'azote liquide, avec le plus petit nombre de passages possible. Le cas échéant, il faut re-faire une expérience avec une lignée "jeune" pour valider ce qu'on a pu obtenir avec une lignée passée des dizaines de fois. Les lignées cellulaires adhérentes Les cellules adhérentes occupent la surface du flacon de culture, et sont donc soumises à l'inhibition de contact, c'est-à-dire que lorsque la culture approche de la confluence (c'est-à-dire que toute la surface ou presque est occupée par les cellules), les cellules cessent de pousser ou se différencient. Dans les deux cas, la manière avec laquelle les cellules poussent va changer, ce qui perturbera la culture. Il faut donc passer les cellules avant la confluence. Il faut pour cela les détacher du support pour pouvoir les resuspendre dans du milieu de culture neuf. Pour les détacher, il existe plusieurs méthodes : •L'utilisation d'un grattoir, qui va racler les cellules ; •L'utilisation de trypsine, qui va opérer une digestion enzymatique des protéines d'adhésion ; •L'utilisation d'un chélateur du calcium, type EDTA, qui va empêcher l'action des lectines. De toutes ces méthodes, la chélation du calcium stresse le moins les cellules, mais ne suffit pas toujours. De plus, cela va empêcher les cellules de coller au plastique ou au verre, mais pas de coller entre elles. De ce point de vue là, l'utilisation de la trypsine sera d'une efficacité maximale Les lignées cellulaires flottantes Les cellules flottantes occupent le volume de milieu disponible. Elles ne sont pas directement concernées par l'inhibition de contact, mais par la déprivation du milieu en nutriments. Il faut donc surveiller leur densité, la plupart des cellules de type lymphocytaire supportant bien des densités de 105 à 106 cellules par mL. Certains types de cellules, notamment les hybridomes, sont cultivés de manière très dense, pour forcer la production de la protéine d'intérêt Bases moléculaires du cancer : les oncogènes Mise en évidence des oncogènes par transfection d’ADN de tumeurs humaines dans des lignées cellulaires de souris. Les oncogènes sont des gènes cellulaires impliqués dans la prolifération cellulaire. Lorsque ces gènes sont mutés ou que leurs régulateurs sont mutés, la prolifération cellulaire devient anarchique et se fait au détriment de la différenciation cellulaire. Deux classes d’oncogènes ont ainsi été caractérisées : Classe I: oncogène immortalisant Classe II: oncogène transformant 2 types de lignées cellulaires Les lignées cellulaires immortalisées : - nombre de génération infini - maintien de l’inhibition de contact - dépendance d’ancrage Les lignées cellulaires transformées : - nombre de génération infini - perte de l’inhibition de contact - indépendance d’ancrage : croissance en agar Exemples de lignées transformées ou immortalisées - cellules Hela provenant d'une tumeur utérine - cellules KB provenant d'un carcinome oral humain - cellules Jurkatt provenant d’un lymphome humain - cellules 3T3 provenant d'un embryon de souris - cellules Véro et Cos provenant de rein de singe - cellules MRC-5 provenant de poumons de foetus humain Les cultures primaires La notion de culture primaire est simple: il s'agit d'aller chercher une cellule dans un organisme pluricellulaire et de la faire pousser in vitro. En pratique, c'est un peu plus compliqué. Difficultés de la culture primaire •Obtention des cellules •Leur maintien en culture •Les cellules primaires ne sont pas immortelles, phénomène de sénescence Obtention de cellules primaires Deux sources de cellules sont possibles : -des cellules isolées dans les liquides biologiques comme le sang (lymphocytes sur gradient de Ficoll avec centrifugation). -des cellules isolées à partir de tissus ou d'organes. Un tissu est formé d'un ensemble de cellules et éventuellement d'une matrice extracellulaire. Les tissus appartiennent en général à un organe constitué d'un tissu principal et de nombreux tissus accessoires : tissus conjonctifs d'emballages, tissus des vaisseaux sanguins, neurones...). Dans un tissu, il existe plusieurs types de cellules • Parfois il y a intérêt à conserver les différents types de cellules qui conservent certaines interactions. • Parfois il y a nécessité de séparer un type cellulaire. Cela est réalisé: - par méthode de clonage - par méthodes de séparation physique Les cultures primaires flottantes Les cellules hématopoïétiques, telles que certaines cellules du sang ou de la moelle osseuse, sont des cellules à développement rapide et faciles à prélever sur un animal ou un humain. •La moelle osseuse est particulièrement riche en précurseurs, qui vont reconstituer une moelle osseuse in vitro, et générer quelques générations de cellules avant de péricliter. •Les cellules du sang sont également faciles à prélever: une prise de sang sur anticoagulant (type héparine/EDTA) permettra d'en récupérer des quantités plus ou moins importante selon le volume de sang et la cellule d'intérêt Les cultures primaires adhérentes Les cellules d'intérêt peuvent aussi faire partie d'un organe, qu'il va falloir dissocier. Les méthode diffèrent selon les organes et les cellules à en extraire, mais généralement, il faut détruire l'architecture de l'organe, mécaniquement ou enzymatiquement, puis séparer les cellules d'intérêt des cellules gênantes. Conditions de cultures primaires Les cellules primaires sont très sensibles à leur environnement. Mis à part les cellules à développement rapide, de moelle osseuse ou d'intestin par exemple, qui sont capables de se développer en formant spontanément une matrice, les autres cellules, comme les lymphocytes par exemple, sont incapables de se développer en culture dans du milieu de culture standard. Dans ces conditions, il faut trouver : •un facteur de croissance spécifique, qui dépend du type de cellule à privilégier. •une cellule nourricière adaptée qui permettra d'habiller le plastique d'une couche de cellules sur lesquelles les cellules d'intérêt pourront pousser et échanger des nutriments Les contaminations en culture primaire La contamination est un problème naturel dans une culture primaire, car l'organisme dont provient les cellules n'était pas stérile. Il faut donc décontaminer les prélèvements, ce qui induit un stress supplémentaire pour les cellules, et ajouter des antibiotiques. Le contaminant cellulaire principal dans une culture primaire issue d'un animal sont les fibroblastes, qui sont les cellules cicatricielles. Elles prolifèrent facilement en s'étendent en tapis de cellule en fuseau, et forment elles-même une couche nourricière parfois bénéfique ; mais parfois aussi elles envahissent la culture et affament les cellules d'intérêt. Il est difficile de s'en débarrasser Les neurones Les cellules adipeuses fibroblasts myoblasts Avantages et inconvénients des lignées cellulaires et des cultures 1aires A vous de répondre! Transfection de cellules eucaryotes -Transfection transitoire : faire exprimer de façon transitoire un gène ou un marqueur dans une lignée cellulaire. Analyse de promoteurs, production de protéines, recherche de partenaires….. Vecteurs d’expression eucaryotes, infection virale -Transfection stable : obtenir une lignée cellulaire clonale exprimant le gène ou le marqueur d’intérêt. Analyse d’une fonction, d’une régulation….. Nécessité d’un gène de sélection Les cellules souches Cellule indifférenciée qui a la capacité de se multiplier quasi infiniment à l’identique (autorenouvellement) et qui a la capacité de se différencier On parle de cellules souches chez les animaux en particulier, mais les méristèmes des plantes en sont aussi constitués. De manière plus globale, tous les organismes pluricellulaires possèdent des cellules souches. Différents types de cellules souches • totipotentes : ovule fécondé ou cellules issues des 1eres divisions de cet œuf (morula de 2 à 8 cellules); permettent le développement d’un individu complet à condition d’être in vivo. C’est seulement à ce stade que peut s’opérer un clonage reproductif par scission embryonnaire • pluripotentes : dont font partie les cellules ES. Les cellules ES ne peuvent pas produire un organisme entier, mais peuvent se différentier en cellules issues des 3 feuillets embryonnaires y compris les cellules germinales. Elles proviennent de la masse interne du blastocyste (au stade 40 cellules). Le clonage reproductif à partir des cellules ES n’est pas possible. • multipotentes : présentes dans l’embryon ou dans l’organisme adulte. Elles conservent leur capacité à s’autorenouveler. Elles sont déjà engagées dans une certaine direction; leurs potentialités sont plus restreintes que les cellules ES. Par ex Les cellules hématopoïétiques Qu’est-ce qu’une cellule souche? Une cellule souche a la capacité unique de: s’auto-renouveler indéfiniment ou de manière prolongée produire différentes cellules spécialisées (différenciées) Qu’entend-on par autorenouvellement? Divisions asymétriques La division d’une cellule souche est asymétrique - les cellules filles ne sont pas identiques, et seule une des deux est identique à la cellule mère Cellules souches et différenciation cellulaire Cellules souches : cellules ayant la double capacité de se diviser et de se différencier 2 catégories de cellules souches selon leur origine: - cellules souches pluripotentes : cellules embryonnaires, pouvant se différencier en tous les types cellulaires présents dans l ’embryon et l ’adulte - cellules souches somatiques: chez l’adulte, cellules multipotentes ou unipotentes spécifiques d ’organe, formant un nombre limité de types cellulaires Attention à ne pas confondre avec les cellules précurseurs ou progéniteurs Trois sources possibles de cellules souches totipotentes Trois types de cellules souches pluripotentes isolées ches les mammifères: - cellules de carcinome embryonnaire (EC) - cellules germinales embryonnaires (EG) - cellules souches embryonnaires (ES) (Evans & Kaufman; Martin - 1981) EC ES EG PGC ICM PGC aneuploïde euploïde euploïde soma soma/germ soma/germ PA + + + Télomérase + + + OCT4 + + + origine caryotype chimère Cellules souches embryonnaires Cellules dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste préimplantatoire. Isolée chez la souris, les primates et l’homme (Thomson, 1998) Définition: - dérivées de l’embryon préimplantatoire - prolifération prolongée dans un état indifférencié - après culture prolongée, différenciation in vitro possible en cellules méso-, ecto- ou endodermiques Euploïdes et haut niveau d’expression de télomérase Les conditions de culture doivent favoriser: •l’état non différencié des cellules de la masse interne : - l ’ajout de LIF (Leukemia inhibitor factor) empêche efficacement la différenciation de ces cellules. - la culture sur une couche de fibroblastes embryonnaires dont les mitoses sont arrêtées favorise l’étalement des cellules. •la multiplication de ces cellules, en répondant à leurs exigences nutritionnelles importantes. Trois critères de totipotence Transfert des ES dans un blastocyste murin: formation d’une souris chimère où les ES participent à tous les tissus y compris la lignée germinale Transfert des ES dans des souris immunodéficientes : formation de tératomes constitués des 3 couches germinales e ES retirées de la couche cellulaire nourricière: différenciation et formation d’une structure 3D appelée corps embryoïde contenant des tissus d’origine méso-, ecto- ou endo-dermique. En fonction des conditions de culture, obtention de cultures enrichies en progéniteurs spécifiques de différents types cellulaires. Intérêt d’obtenir des cultures pures: développement de méthodes de sélection cellulaire Différenciation in vitro obtenue pour différents types cellulaires: -myocytes/cardiomyocytes -adipocytes, chondrocytes -cell endothéliales -neurones, glie -cellules ß des ilots pancréatiques Pureté des cultures - Isolement de cellules L’obtention de lignées pures reste un problème majeur: -identifier des marqueurs de surface : tri cellulaire au FACS -induire l’expression de marqueurs (de surface ou non) permettant un tri cellulaire -induire l’expression de gènes de résistance : contre sélection des populations non désirées L’intérêt Étudier la différentiation au cours du développement embryonnaire et identifier des facteurs impliqués dans ce processus. Ressource unique pour des analyses fonctionnelles du développement précoce de l’embryon. Modèle pour créer des maladies humaines in vitro. Tester des produits tératogènes. Source renouvelable de cellules pour des thérapies par transplantations. . . . etc. Comparaison des cellules ES humaines et murines Établissement des lignées A partir d’embryon congelé Stade de développement Séparation ICM/ trophectoderme Passage des cellules en culture souris homme - + blastocyste (3.5 dpc) séparation mécanique après quelque jours de culture ou par immunochirurgie à partir des cellules isolées par trypsination Idem (6eme j. après l’insémination) uniquement par immunochirurgie à partir de « paquets »de cellules isolés mécaniquement ou par légère digestion enzymatique Comparaison des cellules ES humaines et murines Caractéristiques des lignées morphologie caryotype Activité phosphatase alcaline Antigènes de surface expression de OCT-4 expression de la télomérase Croissance clonale souris Des colonies de cellules étroitement compactées Normal, diploïde, maintenu au cours des passage La majorité XY, Les XXXO homme Des colonies « plates », cellules moins serrées avec des bordures plus distinctes. Idem, mais la majorité est XX et stable. + + SSE-1 SSE-3, SSE-4 + Élevée dans toutes les cellules. + + Elevée uniquement dans les ES. _ Comparaison des cellules ES humaines et murines Caractéristiques des lignées (2) Conditions de culture Effet du LIF Effet des « feeder » fibroblastes embryonnaires murins souris Empêche la différenciation homme Aucun effet, nécessaire (?) dans un milieu sans sérum Se différencient ou entrent Empêche la différenciation en apoptose Comparaison des cellules ES humaines et murines différenciation Transplantation dans des Souris SCID (sever compromised immunodeficient) Mise en culture à une densité élevée souris Formation de tératomes bénins composés de cellules différenciées (3 feuillets embryonnaires) Formation de corps embryoïde homme idem -Différentiation en endoderme (-feta protéine) -Différentiation partielle en trophoblaste (ß-HCG) d’expression d ’oct-4 Effet des différents facteurs de croissance différenciation en un type de cellules IL-3 macrophages IL-6 lignée d’érythrocyte RA neurone TGF-ß cellule musculaire rarement vers un seule type de cellule mais favorisent ou inhibent la différenciation d ’un type cellulaire. Clonage transfert de noyau d’une cellule somatique Il est possible de produire des cellules souches embryonnaires à partir d’une cellule somatique adulte par transfert de noyau; le noyau d’une cellule adulte est ainsi fusionné avec un ovule dont on a retiré le noyau. Transfert de noyau d’une cellule somatique Les clonages thérapeutiques et reproductifs commencent tous deux par un transfert de noyau d’une cellule somatique, mais le clonage reproductif permet au blastocyste de se transformer en un fœtus. • Le clonage thérapeutique a pour but de récolter des cellules souches embryonnaires en vue de mener des recherches sur d’éventuels traitements l’embryon sert à fabriquer des cellules souches embryonnaires. • Le clonage reproductif a pour but de créer un nouvel organisme, identique à la cellule adulte donneuse Les premières expériences de transplantation nucléaires Tadpole (frog larva) Frog egg cell Nucleus UV Intestinal cell Nucleus Transplantation of nucleus Nucleus destroyed 1962 Tadpole Eight-cell embryo Le clonage de têtards a montré que les noyaux de cellules animales différenciées gardaient tout leur potentiel Gurdon, génétique. 1962 La première expérience de transplantation nucléaire chez un mammifère Le 1er mammifère cloné s’appelle Dolly et a été produit en 1997 Cellules souches et cancer Brain tumour stem cells Première évidence de cellules issues de tumeurs du cerveau ayant des caractéristiques de cellules souches: 2002 Reviewed in Vescovi et al., Nature reviews 2006 Brain tumour stem cells - autorenouvellement (neurospheres) - autorenouvellement in vivo (capacité d’initier une tumeur) - multipotence (astrocytes + neurones) - expression de marqueurs de cellules souches neurales Origine des cellules souches cancéreuses? • Hypothèse traditionnelle: dédifférenciation d’une cellule neurale en réponse à des altérations génétiques • Concept du “cancer stem cell”: similitudes entre autorenouvellement des cellules souches neurales et des cellules cancéreuses Les cancers pourraient dériver d’une cellule souche dont les mécanismes d’auto-renouvellement seraient dérégulés Cellules souches et cancer Figure 1. Les traitements anti-cancéreux traditionnels (en haut) tuent rapidement les cellules tumorales en division (rouge) mais leurs effets sont souvent transitoires, suggérant la persistance de cellules souches cancéreuses (bleu), à l’origine de la récurrence tumorale. L’enjeu actuel (en bas) consiste à développer des outils thérapeutiques capables de cibler directement les cellules souches cancéreuses, afin d’obtenir des rémissions à plus long terme. Risques de tératomes dans les greffes de cellules souches L’implantation de cellules ES de souris dans le cerveau de souris conduit à la formation de tératomes dans 20% des cas. Le risque est réduit si les cellules ont été préalablement différenciées in vitro.
