ii. article 1 - Université Paul Sabatier

« Une personne qui n'a jamais commis d'erreurs
n'a jamais tenté d'innover. »
Albert Einstein
REMERCIEMENTS
Etant lié par une parole, la première page de ces remerciements sera consacrée
exclusivement à mon président de jury et néanmoins ami : le Pr. Claude KNAUF.
Ayant assez d’espace pour des remerciements chaleureux, je vais les décomposer en
différents items correspondants aux différents aspects des choses qui justifient l’ensemble de ces
remerciements.
Tout d’abord, le point essentiel : le côté scientifique. Tu n’as pas besoin de moi pour savoir
que tu es un très bon scientifique, tes différents fans clubs le clament suffisamment. Je vais donc
m’attacher à te remercier sincèrement d’avoir accepté de présider mon jury alors que la thématique
n’était pas ton thème de prédilection. Merci d’avoir pris le temps de lire ma thèse et d’avoir réussi la
prouesse (encore une) de ressortir de cet écrit des questions de …. Physiologie.
Merci pour ces commentaires sur le manuscrit et donc pour ces questions extrêmement pertinentes.
Je voulais aussi te remercier pour ton accessibilité et ta sympathie qui ne se sont jamais
démenties. Je connais assez peu de personnes dans ta position aussi ouverte au dialogue et à la
discussion que ce soit sur le plan scientifique ou humain. Ton récent investissement dans la
préparation d’un ami commun, ont encore démontré que tu es un homme de valeur, c’est assez rare
pour pouvoir le constater et s’en féliciter.
Le volet scientifique et humain étant refermé je tenais aussi à souligner d’autres aspects qui
font de toi un exemple à suivre.
En tant que professeur, il est important d’avoir un esprit sain dans un corps sain. Ainsi, tu es
et tu restes pour moi le joueur de foot Troyen le plus talentueux de ta génération. Malheureusement,
comme tout génie en quelque matière que ce soit tu es resté incompris, la vie est injuste. Néanmoins
sache que chaque contrôle ou passe que je rate te sont dédiés comme un hommage que l’on fait aux
personnes importantes. Car si tu es un jour reconnu à ta juste valeur, je deviendrais par la même
occasion un visionnaire ayant su déceler en toi le talent à l’état pur.
Enfin je voulais aussi remercier ta modestie, qui t’oblige à perdre systématiquement à une
célèbre simulation de football. En cela tu nous permets de croire qu’il existe quelque chose dans la
vie où tu ne surpasses pas tout le monde. C’est là encore une preuve d’altruisme de ta part, visant à
renforcer la confiance en soi de ceux qui t’entoure. En cela, la ténacité de cette modestie (qui se
traduit en défaite systématique) et là encore un trait de caractère rendant un homme meilleur.
Pour finir, plus sérieusement, tu es quelqu’un de sympa, accessible et avec beaucoup
d’autodérision (j’espère). Merci sincèrement pour la thèse et pour tout le reste !
Je tenais aussi à remercier chaleureusement mes rapporteurs, Pr. PERRET Christine et Dr.
VIGNJEVIC Danijela, pour les conseils judicieux et la bienveillance dont elles ont fait preuve que se
soit lors de la lecture du manuscrit ou lors de la soutenance de ma thèse. Je voulais aussi remercier
Pr. ROCHE Serge pour avoir accepté d'être l'examinateur de cet examen.
Nous voici donc à la fin de cette aventure que fut ma thèse. Je tenais tout d'abord à dire que
ce fut une expérience enrichissant tant sur le plan humain que scientifique. J'y ai trouvé de nombreux
amis ainsi que des gens de valeur.
En premier lieu, je tiens à remercier mais deux directrices de thèse Audrey et Aline.
Audrey, voilà maintenant 4 ans que l'on travaille ensemble, merci de m'avoir fait confiance
depuis le début. Merci pour ton soutien lors des moments difficiles comme le peuvent l'être un
master 2 ou une fin de thèse. Tu as toujours eu confiance en moi et ça je ne l'oublierais pas. Merci
aussi pour ton soutien lors de l'annonce de ma réorientation après la thèse. Tu as très bien compris
mes choix et c'est très important à mes yeux. Si je devais résumer ma pensée, MERCI, pour tout ce
que tu as fait pour moi !
Aline, merci pour tes précieux conseils scientifiques et humains ! Merci aussi et surtout pour
ta patience, tu auras été mon souffre-douleur préféré et tu as toujours su garder ton sourire malgré
mon cas qui par moment a pu de sembler désespéré... Sérieusement, merci pour tout ce que tu m'as
apporté.
Cathy, je voulais te remercier pour avoir été une oreille attentive lors des moments plus
difficiles. Merci pour tes conseils et ton écoute.
Perrine, merci beaucoup d'avoir été présente au cours de la thèse. Merci aussi d'avoir été si
sympa lors de mon arrivé à l'ICR. Merci aussi pour les délires ou les séances de psychologies de groupe
qui ont ponctué mon quotidien. C'était vraiment génial !!!
Merci aussi à Aurélien, tu as réussi l'exploit de me supporter au quotidien et de travailler
avec moi pendant 6 mois. Merci pour ton travail mais aussi pour ta gentillesse, ton sens de l'humour,
qui ont fait de ces 6 mois un moment de ma thèse que j'apprécie particulièrement.
Je voulais aussi remercier des anciens membres de l'équipe. Merci Clo-clo et Catherine, vous
formiez l'un des binômes les plus drôles qu'il m'a été permis de voir. Vous étiez un rayon de soleil et
de fantaisie pour moi. Merci pour tout, les rigolades comme les discussions sérieuses ! Merci aussi à
Souad, tu as été une oreille attentive et quelqu'un d'important au cours de ma thèse. Merci pour
tout !
Merci aussi à Nico et Julie, pour leurs bonnes humeurs, leurs blagues et de manière générale
leurs sympathies qui m'a régulièrement fait du bien. Merci aussi à Cécile, tu n'as été là que 6 mois
mais on a bien rigolé. Merci à Antony pour sa patience envers moi malgré que j'aimais bien l’embêter
et lui piquer sa thésarde ! Merci aussi à Caro, Judith et Olivia pour votre gentillesse. Enfin, merci à
Elisabeth et Christine d'avoir été toujours de bon conseil lors de mes présentations.
Je tenais aussi à remercier particulièrement l'intégralité du 4ème et du 3ème étage du
bâtiment L3 de Rangeuil, évoluer parmi vous m'a permis de faire de belles rencontres. Parmi ces
rencontres, je voulais dire un grand merci à tous les thésards du 4ème qui ont été un soutien sans
faille tout au long de ma thèse :
Tout d'abord, Yannick merci ! Tu es un mec génial (je le savais avant d'arriver au labo). Merci
pour ces délires et ces blagues dont on fut les complices. Notre amour commun pour la nature nous
a rapproché et nous a permis de bien rigoler...
Je tenais aussi à remercier la touche de blondeur de cet étage, Camille. Tu es une fille super.
Merci pour nos psychothérapies réciproques, nos rigolades, ta bonne humeur, tu auras été quelqu'un
de précieux au cours de cette thèse.
Je voulais remercier aussi Carline, qui elle aussi (comme tout le monde je crois) a été patiente
avec moi. Je ne sais pas pourquoi j'ai toujours aimé t'embêter, mais tu as toujours été super gentille
malgré ton envie régulière de me frapper... Non sérieusement, c'était super de te rencontrer.
Merci à Charline, tu auras été une partenaire de volley douée, pas autant que moi ok mais
doué quand même... Merci pour ta bonne humeur, ton entrain et ton humour. Toi aussi j'aimais bien
t'embêter et toi aussi tu as été patiente, merci pour ça aussi.
Merci aussi à Bruno Mars euh... David, tu es arrivé un peu plus tard mais ton esprit « affûté »
t'a permis de rattraper ce retard rapidement...
Merci aussi à Mounira pour ta gentillesse et pour les discussions que l'on a eu.
Merci à Romain, malgré que tu sois un psychopathe tu es quelqu'un de très drôle, merci pour
toutes ces rigolades.
Merci aussi à Marion, ta passion pour les poneys ont été une source d'inspiration inépuisable
de blagues pour moi et de crises pour toi, merci pour ta gentillesse et pour ta bonne humeur.
Mais tous les gens ne sont des thésards. Alors merci beaucoup à Bernard, pour toutes tes
blagues, tes conseils, tu as toujours été là pour moi merci beaucoup. Merci aussi à Emeline pour ces
discussions tard en culture qui furent des moments très agréables (alors que ce n’était pas gagné)
merci pour ta gentillesse. Merci à Corinne de m'avoir si souvent rendu service au cours de ma thèse,
merci pour les discussions scientifiques ou non et pour le soutien dont tu as fait preuve. Merci aussi
à Pierre pour ton humour et ta bonne humeur merci beaucoup. Je voulais aussi remercier les autres
membres de ces équipes pour leur soutien et leur gentillesse.
Enfin je voulais remercier d'autres membres des équipes de Rangueil.
Dans l'équipe d’Hervé Prats, je tenais à remercier particulièrement Eric. Merci d'avoir accepté
d'être mon tuteur d'enseignement au cours de ma thèse, merci pour ces conseils et discussion au
sujet de mon avenir d'enseignant.
Merci aussi à toute la bande du L4 : Anne, Matteo, Dédé... merci pour ces soirées très
amusantes passé en votre compagnie.
Autre lieu mais même ambiance, je voulais aussi remercier toutes les personnes de Purpan :
Gavin (Bichette), Johann, Lolo, Lili et Aurore. Vous faites une belle équipe merci pour toutes ces
soirées très sympas.
Je voulais aussi remercier Alex & Charlotte, vous étiez des collègues vous êtes maintenant de
vrai amis, merci pour tout !!! Les soirées, week-ends, semaines passés ensemble ont été les moments
magiques et il y en aura d'autres ! Je
Merci aussi à mes amis hors boulot : Seb, Bob, Djé, Paupo, Flo, Kevin, Destinée, Antho,
Camille... Vous êtes au top ne changez rien !!!
Merci bien sûr à ma famille d'être toujours là pour moi.
Merci à ma maman qui m'a toujours soutenu et qui me soutient toujours quel que soit mes
choix. Je ne vais pas énumérer tout ce pour quoi je peux te remercier mais merci pour tout !
Je voulais aussi remercier celle qui me supporte au quotidien, Caro. T'avoir à mes côtés faits
de moi un homme meilleur merci d'être présente à mes côtés.
Merci aussi à ma belle-famille, où le mot belle n'est pas fortuit. Merci pour tout ce que vous
faites pour moi.
Enfin, je voulais remercier mon père. J'espère que d'où tu es, tu es fier de moi. Merci pour
tout ce que tu m'as apporté.
Tous ces remerciements sont pour ceux qui de manière générale m'ont permis d'avancer
dans ma vie, ont fait de moi un homme meilleur tant humainement que scientifiquement. Merci à
tous pour ça aussi.
LISTE DES ABREVIATIONS :
ADAM : A Distengrin And Métalloproteases
ADK : Adenocarcinoma
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
APC : Adenomatosis Polyposis Coli
ARN : Acide RiboNucléique
FSP-1 : Fibroblast Specific Protein 1
FU : Fluorouracile
GSK3β : Glycogen Synthase Kinase 3 beta
HGF : Hepatocyte Growth Factor
HIF : Hypoxia Inducible Factor
BAX : Bcl-2–Associated X protein
HNPCC : Hereditary Non-Polyposis Colorectal
Cancer
B-Raf : v-Raf murine sarcoma viral oncogene
homolog B1
IFN : interferon
BUB : Budding Uninhibited by Benzimidazoles
CAF : Cancer Associated Fibroblast
IGF : Insulin-like Growth Factor
IL : InterLeukine
CCL : Chemokine (C-C motif) Ligand
K-Ras : Kirsten Rat Sarcoma viral oncogene
homolog
c-FOS : FBJ murine osteosarcoma viral
oncogene homolog
LB : Lymphocyte B
CIMP : CpG Island Methylator Phenotype
CIN : instabilité chromosomique
CPA : Cellule Présentatrice d’Antigène
CRC : ColoRectal Cancer
CSF : Colony Stimulation Factor
CTGF : Connective Tissue Growth Factor
CXCL : Chemokine (C-X-C motif) ligand
DNMT : ADN méthyltransférases
DPPIV : DiPeptidyl-Peptidases IV
EGF : Epidermal Growth Factor
EMT : Epithelio-Mesenchymal Transition
ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase
FABP : Fatty Acid Binding Protein
FAPα : Fibroblast Activation Protein alpha
FCA : Foyer de Crypte Aberrante
FGF : Fibroblast Growth Factor
LOH : Loss Of Heterozygosity
LRP : LDL Related Protein
LT : Lymphocyte T
MAD : Mothers Against Decapentaplegic
MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase
MCP1 : Monocyte Chemoattractant Protein 1
MCT4 : MonoCarboxylate Transporter 4
MEC : Matrice ExtraCellulaire
MGMT : MéthylGuanine DNA
MéthylTranférase
MLH : MutL Homologue
MMP : Matrix MetalloProtease
MMR : Mismatch repair
MSC : Cellule Souche Mésenchymateuse
MSH : MutS Homologue
MSI : Instabilité Microsatellitaire
NCID : Notch IntraCellular Domain
NfkB : Nuclear factor-kappa B
PTEN : Phosphatase and TENsin homolog
PAF : Polypose Adénomateuse Familiale
RCPG : Récepteur Couplé aux Protéines G
PAM : Polypose Associée aux Mutations de
MUTYH
RTK : Récepteur aux Tyrosines Kinases
SDF-1 : Stromal cell-Derived Factor 1
PAMP : Pathogen Associated Molecular
Pattern
SSA : Sessile Serrated Ademona
PAR : Protease-Activated Receptor
STAT : Signal Transducers and Activators of
Transcription
PDGF : Platelet-Derived Growth Factor
PDK : 3-Phosphoinositide Dependant Kinase
TAM : Tumour Associated Macrophage
TCF4 : TransCription Factor 4
PECAM : Platelet-Endothelial Cell Adhesion
Molecule
TGFβ : Transforming Growth Factor
PG : ProGastrine
TNF : Tumor Necrosis Factor
PGE2 : ProstaGlandine E2
TSA : Traditionnal Serrated Ademona
PH : Polype Hyperplasique
uPA : urokinase type Plasminogen Activator
PI3K : PhosphatidylInositide 3-Kinases
VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor
PIP : PhosphatIdylinositol Phosphate
Wnt : Wingless integration site
PKC : Protein Kinase C
αSMA : Smooth Muscle Actin alpha
PRR : Pattern Recognition Receptors
TABLE DES MATIERES :
Introduction bibliographique ........................................................ 1
A. Le Cancer Colorectal ............................................................................ 1
I. Epidémiologie : .................................................................................... 1
II. Origine du CRC : ................................................................................... 1
a)
Prédispositions environnementales : .................................................................... 1
1. Mode de vie : ..................................................................................................... 1
2. Activité physique et obésité : ............................................................................ 2
3. Tabagisme et alcool : ......................................................................................... 2
b) Inflammation chronique : ...................................................................................... 2
c) Prédispositions génétiques :.................................................................................. 3
1. Polypose adénomateuse familiale (PAF) : ......................................................... 3
2. Le syndrome de Lynch (HNPCC):........................................................................ 4
III.
a)
Carcinogenèse colorectale: ............................................................... 5
Principales voies de signalisations impliquées dans le CRC : ................................ 5
1. La voie Wnt ou APC / β-Caténine :..................................................................... 5
2. La voie Ras / MAPK : .......................................................................................... 8
3. La voie p53 : ..................................................................................................... 10
4. La voie Phosphatidyl Inositol 3 Kinase (PI3K) / AKT : ....................................... 11
5. La voie du Transforming Growth Factor β (TGFβ) : ......................................... 13
6. La voie Notch : ................................................................................................. 14
b) Processus initiateurs de la carcinogénèse : ......................................................... 15
1. L’instabilité chromosomique (CIN) : ................................................................ 15
2. L’instabilité microsatellitaire (MSI) : ................................................................ 17
3. L’hyperméthylation des îlots CpG (CIMP) : ...................................................... 18
c) Histopathologie de la carcinogénèse colorectale : ............................................. 19
1. Les foyers de cryptes aberrantes : ................................................................... 19
2. Les polypes : ..................................................................................................... 20
3. Les différents types d’adénomes du CRC : ...................................................... 21
a) La voie de l’instabilité chromosomique (CIN) : groupe 4 ............................. 21
b) Les voies des tumeurs festonnées : groupe 1, 2 et 3 ................................... 22
c) Le syndrome de Lynch : groupe 5 ................................................................ 25
4. Les adénocarcinomes colorectaux : ................................................................. 25
a) - Les adénocarcinomes mucineux : .............................................................. 25
b) - Les carcinomes à cellules en bague à chaton : .......................................... 25
c) - Les carcinomes médullaires : ..................................................................... 26
d) Classification des adénocarcinomes colorectaux : .............................................. 26
e) Les traitements du cancer colorectal : ................................................................ 27
B. Le stroma en condition physiologique & tumoral ...............................31
I. Les cellules souches mésenchymateuses (MSC) : ............................... 32
a) En condition physiologique : ............................................................................... 32
b) En condition tumorale : ....................................................................................... 34
c) Les MSCs dans le cancer colorectal : ................................................................... 34
II. Les cellules endothéliales : ................................................................. 35
d) En condition physiologique : ............................................................................... 35
b) En condition tumorale : ....................................................................................... 36
c) Modulation du VEGF dans le cancer colorectal :................................................. 40
III.
IV.
Les cellules nerveuses : ................................................................... 40
La crypte intestinale et le système immunitaire : ............................ 41
a) En condition physiologique : ............................................................................... 41
b) En condition tumorale : ....................................................................................... 44
V. Les fibroblastes / myofibroblastes : ................................................... 46
VI. Composante matricielle : ................................................................ 48
a)
b)
c)
d)
Composition et rôle de la matrice en condition physiologique : ........................ 48
Interaction entre la matrice et les cellules tumorales : ...................................... 51
Les métalloprotéases matricielles (MMP) : ......................................................... 53
Remodelage de la matrice et MMPs dans le cancer colorectal : ........................ 54
C. Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs .......................................55
I. Découverte : ...................................................................................... 55
II. Origine : ............................................................................................. 55
III. Activation des CAFs : ....................................................................... 57
IV. Altérations génétiques des CAFs : ................................................... 59
V. Participation des CAFs à la carcinogénèse : ........................................ 60
a)
b)
c)
d)
Facteurs de croissance induits par les CAFs : ...................................................... 60
Les cytokines : principaux médiateurs de l’action des CAFs ............................... 61
Les protéases : acteurs dans le remodelage de l’environnement des CAFs ....... 62
Modification du métabolisme énergétique des CAFs : ....................................... 63
VI.
VII.
Le stroma tumoral, nouvelle cible thérapeutique ? ........................ 63
rôle des CAFs dans la carcinogenèse colorectale :........................... 64
a)
b)
c)
d)
e)
Les CAFs ont un rôle dans la dérégulation de la voie APC / β-caténine : ............ 65
Les CAFS induisent la croissance des tumeurs colorectales :.............................. 65
Influence des CAFs dans l’angiogenèse colorectale : .......................................... 65
Rôle des CAFs dans les processus métastatiques :.............................................. 66
Valeurs pronostiques / diagnostiques des CAFs dans le cancer colique :........... 66
Résultats .................................................................................... 68
A. 1er article ............................................................................................69
I. Introduction bibliographique ............................................................. 69
a)
La progastrine : .................................................................................................... 69
1. Expression de la progastrine : .......................................................................... 69
2. Rôle de la progastrine dans la carcinogenèse : ............................................... 71
3. Impact de la progastrine sur les CAFs : ............................................................ 72
II. Article 1 :............................................................................................ 73
III. Conclusion de l’article 1 : ................................................................ 97
B. 2nd article............................................................................................99
I. Introduction bibliographique ............................................................. 99
a)
Les polypes hyperplasiques dans le CRC : ........................................................... 99
1. Epidémiologie des polypes hyperplasiques : ................................................... 99
2. Histologie des polypes hyperplasiques : ........................................................ 100
3. Caractéristiques moléculaires des polypes hyperplasiques : ........................ 101
a) Méthylation des îlots CpG (phénotype CIMP) : ......................................... 101
b) Instabilité microsatellitaire (phénotype MSI) : .......................................... 101
c) Les voies du signal impliquées dans les polypes hyperplasiques : ............ 101
4. Les polypes hyperplasiques dans la carcinogenèse colorectale : .................. 101
5. Présence de polypes hyperplasiques et apparition de lésions adénomateuses :
102
b) FAPα (Fibroblast activation protein alpha) :...................................................... 102
1. Caractérisation : ............................................................................................. 102
2. Effet de FAPα dans la carcinogenèse : ........................................................... 103
3. FAPα, cible thérapeutique : ........................................................................... 103
II. Article 2 :.......................................................................................... 105
III. Conclusion de l’article 2 : ................................................................ 122
Conclusions & Perspectives ....................................................... 123
Références bibliographiques ..................................................... 126
INTRODUCTION
BIBLIOGRAPHIQUE
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
A. LE CANCER COLORECTAL
I. EPIDEMIOLOGIE :
Le cancer colorectal (CRC) est l’un des cancers les plus fréquents (GLOBOCAN, 2002).
Il représente plus de 9% des patients atteints de cancer dans le monde (Boyle and Langman
2000). En France, en 2011, le CRC est le 3ème type de cancer le plus diagnostiqué, après le
cancer de la prostate et du sein, il représente la 2nd cause de décès par cancer (source :
institut de veille sanitaire).
La répartition des cas de cancers colorectaux diagnostiqués n’est pas uniforme dans
le monde, ceci est principalement relié au mode de vie et à la capacité de dépistage et de
détection selon les pays. En effet, les zones développées telles que l’Amérique du Nord,
l’Europe de l’ouest et l’Australie représentent plus de 60 % des cas de CRC détectés (Ferlay,
Shin et al.). Cependant, le développement rapide de certains pays, entrainant l’adoption d’un
mode de vie occidental et donc un meilleur suivi de la population avec la mise en place de
campagnes de dépistage, a conduit à une augmentation très importante des cas de CRC
reportés. Par exemple, le nombre de cas de CRC diagnostiqués a doublé en Europe de l’Est
depuis les années 70.
II. ORIGINE DU CRC :
Les causes du CRC sont multiples. En effet le CRC peut être avoir pour origine des
prédispositions environnementales ou génétiques ou un terrain inflammatoire.
a) PREDISPOSITIONS ENVIRONNEMENTALES :
1. Mode de vie :
Comme évoqué dans le paragraphe précèdent, le mode de vie « occidental » est un
facteur de risque important dans le cancer colorectal. Les facteurs environnementaux qui
sont définis comme des facteurs culturels, sociaux et de mode de vie, ont une importance
capitale dans ce type de pathologie. L’un des facteurs le plus important est l’alimentation, il
a été estimé que le risque d’apparition de CRC pourrait être diminué de 70% en changeant
les habitudes alimentaires occidentales (Boyle and Langman 2000). Par exemple, un régime
riche en graisse animale est corrélé à un risque accru de développement de cancer
colorectal. La production d’hydrocarbures aromatiques polycycliques résultant de la cuisson
de la viande rouge est un autre facteur de risque, ces molécules étant connues pour posséder
des propriétés tumorales. D’autre part, il a été montré qu’un régime alimentaire riche en
fibres végétales diminuait le risque d’apparition du CRC.
1
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
2. Activité physique et obésité :
Le mode de vie sédentaire, le surpoids et le manque d’activité physique sont
impliqués dans le cancer colorectal. Il existe une corrélation inverse entre la fréquence
d’activité physique et le risque de développer ce type de cancer (Lee, Inoue et al. 2007). Le
lien entre l’activité physique et la survenue d’un CRC s’explique entre autres par le fait que
l’augmentation d’activité physique permet d’augmenter la vitesse de digestion et diminue le
risque d’obésité. Or l’obésité augmente de 50 à 80% le risque de développer un CRC
(Campbell, Cotterchio et al. 2007) (Wolin, Yan et al. 2009). En effet, l’obésité va créer une
série de dérégulation touchant notamment l’insuline, la leptine et les hormones stéroïdes.
Ces dérégulations ont des effets synergiques avec les mécanismes initiateurs de tumeurs.
Par exemple, l’hyperinsulinémie, qui est une conséquence largement décrite de l’obésité, va
induire une prolifération anormale des cellules épithéliales et va déréguler l’apoptose de ces
cellules (Lee, Inoue et al. 2007).
3. Tabagisme et alcool :
Le tabagisme et la consommation d’alcool sont aussi associés à l’apparition de
cancers colorectaux. Il a été estimé que 12% des CRC sont imputables au tabagisme. De plus,
la consommation de tabac et d’alcool favorise une apparition plus précoce du CRC (Zisman,
Nickolov et al. 2006) (Tsong, Koh et al. 2007). En effet, les métabolites de l’alcool comme
l’acétaldéhyde sont cancérigènes et le tabac engendre des mutations dans l’ADN qui sont
moins efficacement réparées en présence d’alcool (Poschl and Seitz 2004). De plus, l’alcool
augmente la pénétration des autres carcinogènes dans la muqueuse et favorise la création
de radicaux libres qui sont cancérigènes.
b) INFLAMMATION CHRONIQUE :
Les deux formes d’inflammation chronique du colon et du rectum sont les
rectocolites hémorragiques et la maladie de Crohn.
La rectocolite hémorragique est une inflammation chronique qui apparait
généralement au niveau du rectum et qui se propage progressivement au niveau du colon
au cours du développement de la pathologie. Son principal symptôme est l’apparition de
diarrhées hémorragiques. La cause principale de la maladie est encore débattue. Ici, le
système immunitaire, qui doit normalement agir contre les agents extérieurs, fabrique des
anticorps dirigés contre le corps lui-même. Suite à cette dérégulation, une inflammation des
organes affectés est constatée. Les causes de cette dérégulation ne sont pas encore
élucidées même si l’on suppose l’implication de plusieurs facteurs génétiques, hormonaux
et environnementaux. Néanmoins, la maladie étant plus fréquente dans les pays
occidentaux, un lien avec le mode de vie a pu être établi montrant que l’apparition de la
maladie peut être liée aux mêmes facteurs environnementaux que le CRC (Ordas, Eckmann
et al.). De plus, le risque de développer un CRC quand on est atteint de cette pathologie est
2
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
augmenté de 19 fois par rapport à un sujet sain. Ainsi, 8% des patients atteints de cette
pathologie vont développer un CRC (Gillen, Walmsley et al. 1994).
La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique intestinale d’origine
inconnue. Cette pathologie atteint principalement la partie terminale de l’intestin grêle et le
colon. Les causes de cette maladie sont inconnues et semblent multifactorielles
(susceptibilité génétique, flore intestinale particulière, dysfonctionnement du système
immunitaire). Il y a 18 fois plus de risque de développement d’un CRC au cours de la vie d’un
patient atteint de la maladie de Crohn. En effet, 7% des patients atteints de la maladie de
Crohn développeront un CRC (Gillen, Walmsley et al. 1994).
c) PREDISPOSITIONS GENETIQUES :
Il existe deux formes de cancers colorectaux. Les formes dites familiales qui
représentent 20 à 25% des cas (de la Chapelle 2004) et la forme sporadique qui représente
75 à 80% des cancers colorectaux diagnostiqués. Les cancers dits cancers familiaux, sont
principalement issus du développement de deux pathologies : la polypose adénomateuse
familiale et le syndrome de Lynch. Il existe aussi le syndrome de Li-Fraumeni, principalement
dû à une mutation germinale sur le gène suppresseur de tumeur TP53 dans 70% des cas et
augmentant de 2 fois le risque de développer un CRC (Vogelstein, Fearon et al. 1988). D’autre
part, la polypose associée aux mutations de MUTYH (PAM) correspond à un syndrome
autosomique récessif caractérisé par la présence d’un nombre variable de polypes
colorectaux (>10) de phénotypes histologiques différents ayant tendance à évoluer vers des
carcinomes mais ici le risque associé à cette polypose et la survenue de CRC n’est pas connu.
1. Polypose adénomateuse familiale (PAF) :
La polypose adénomateuse familiale (PAF) est caractérisée par l’apparition de
centaines voire de milliers de polypes sur la paroi interne du côlon et du rectum dès
l’adolescence. La PAF est une maladie autosomique dominante rare causée par la mutation
germinale du gène suppresseur de tumeur Adenomatous Polyposis Coli (APC) (Potter 1999).
La mutation du gène se situe sur le bras long du chromosome 5q, elle est rarement commune
à plusieurs individus atteints de PAF mais induit toujours la formation d’un codon stop
aboutissant à une forme tronquée de la protéine (Nishisho, Nakamura et al. 1991). La
protéine APC tronquée va ainsi provoquer une activation de la voie Wnt (voir page 5 partie
VI. A) 1. voie Wnt / APC). Les adénomes qui apparaissent au cours de la pathologie ne
donnent pas plus de tumeur que des polypes sporadiques mais le nombre de ces polypes fait
qu’ils évoluent naturellement vers des adénocarcinomes en moyenne dès l’âge de 40 ans
soit bien plus précocement que lors des formes sporadiques qui touchent une population
plus âgée (Jarvinen 1985).
3
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
2. Le syndrome de Lynch (HNPCC):
Le syndrome de Lynch (ou Hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC) est un
syndrome autosomique dominant. Il représente 5% des CRC diagnostiqués. Ce syndrome
résulte de mutations touchant le système de réparation des mésappariements de l’ADN
(Mismatch repair, MMR) qui induit un défaut de réparation des erreurs faites par l’ADN
polymérase lors de la réplication (Kolodner 1995). Ces mutations interviennent surtout sur
les gènes qui possèdent de nombreuses répétitions mononucléotidiques et en particulier
des répétitions d’adénines (Chang, Metzgar et al. 2001). Les gènes principaux mis en cause
sont : hMSH2 (MutS Homologue 2), hMLH1 (MutL Homologue 1). Les mutations de ces gènes
ont été observées majoritairement sur l’exon 12 du gène de hMSH2 et sur l’exon 16 du gène
de hMLH1. Elles sont majoritairement uniques et très peu de mutations communes entre les
patients HNPCC sont observées (Lynch, Lynch et al. 2009).
Les patients atteints par ce syndrome développent en moyenne un CRC dès l’âge de
45 ans (Vasen, Watson et al. 1999). Les 2/3 des CRC diagnostiqués sont localisés dans le colon
distal et 90% d’entre eux possèdent une instabilité microsatellitaire (MSI). Les patients
atteints par ce syndrome possèdent généralement des antécédents familiaux de CRC
survenu avant l’âge de 50 ans. Ce syndrome se caractérise non seulement par l’apparition
de CRC précocement mais aussi par l’apparition de cancer de l’endomètre, des voies
urinaires, de l’estomac et des voies biliaires (Lynch, Lynch et al. 2009). Deux voies
importantes de la signalisation cellulaire dans le CRC sont touchées par le défaut de MMR
chez les patients atteints de HNPCC : la voie TGFβ (Transforming Growth Factor β) et la voie
APC (Adenomatous Polyposis Coli).
Dans les cellules épithéliales colorectales, la voie TGFβ est une voie aboutissant à une
répression de la prolifération cellulaire. Le défaut engendré par le défaut de MMR aboutit à
l’expression d’un récepteur TGFβR2 mutant inactif, ce qui a pour conséquence un blocage
de la voie, et à une levée de l’inhibition de prolifération (voir page 13, partie VI. a) 5. Voie du
TGFβ).
La voie APC-βCaténine est une voie considérée comme initiatrice du développement
du cancer colorectal (Kinzler and Vogelstein 1996). Cette voie est impactée dans le syndrome
de Lynch. La mutation fréquente de la β-Caténine résultant du défaut du système de
réparation MMR aboutit à une protéine incapable d’interagir avec la protéine suppresseur
de tumeur APC rendant la voie inactive. Les mécanismes impliqués dans l’inactivation de
cette voie et ses conséquences seront décrits dans la partie concernant la voie du signal Wnt
/ APC.
4
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
III. CARCINOGENESE COLORECTALE:
La carcinogénèse colorectale sporadique est un processus multi-étape qui conduit à
l’accumulation de mutations au cours du développement tumoral. Ce modèle multi-étape a
été mis en évidence par Vogelstein et Fearon dans les années 90 et montrent qu’au cours de
l’évolution de la pathologie tumorale colique, allant de foyers de cryptes aberrantes jusqu’à
l’adénocarcinome, un nombre croissant de mutations peuvent être observées (Vogelstein,
Fearon et al. 1988) (Fearon and Vogelstein 1990) (figure 1). Ces mutations sont responsables
de la dérégulation de plusieurs voies de signalisation cellulaire régulant des processus
comme la prolifération, la survie, la migration ou encore l’invasion.
FIGURE 1 : Séquence adénocarcinomale du CRC et mutations associées.
a) PRINCIPALES VOIES DE SIGNALISATIONS IMPLIQUEES DANS LE CRC :
1. La voie Wnt ou APC / β-Caténine :
La voie de signalisation Wnt est activée dans deux types de CRC : les CRC à
instabilité chromosomique (CIN) et à instabilité microsatellitaire (MSI). Ces types de CRC
seront développés dans la partie les
processus initiateurs du CRC (page 15).
La différence entre ces deux
phénotypes est que dans les cancers
CIN, l’activation de la voie Wnt résulte
de la mutation du gène APC, alors que
dans les cancers MSI, ce sont plutôt
des mutations intervenant sur la βcaténine qui sont observées. La
FIGURE 2 : La voie Wnt, A : APC WT / B : APC muté
(Goss and Groden 2000)
fréquence d’activation de la voie Wnt
dans ces deux types de cancer est
proche de 80%, celle-ci apparaît donc comme essentielle dans la carcinogénèse colorectale.
5
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
Les protéines Wnt sont des glycoprotéines riches en cystéine possédant une chaine
d’acide gras attachée de façon covalente à leurs parties N-terminales. Ces protéines vont se
liées au récepteur à 7 domaines transmembranaires couplé aux protéines G : Frizzled. Cette
fixation va induire le rapprochement entre le récepteur Frizzled et son corécepteur LRP (LDL
Related Protein) qui sera phosphorylé. Cette phosphorylation va induire le recrutement à la
membrane de l’axine et de GSK3β. La β-Caténine sera alors présente à l’état libre dans le
cytoplasme (Figure 2).
En condition physiologique, la β-caténine entre dans un complexe avec APC, GSK3β
et l’axine. Ce complexe va provoquer sa phosphorylation, puis elle sera ubiquitinylée,
adressée au protéasome et dégradée. La β-caténine possède deux fonctions distinctes dans
la cellule. D’une part, elle peut former un complexe avec l’E-cadhérine et participe à la
jonction entre le complexe d’adhésion cellule-cellule et le cytosquelette d’actine. D’autre
part, elle peut s’associer au facteur de transcription TCF4, ce complexe une fois formé va
être transloqué dans le noyau et va induire la transcription de nombreux gènes cibles. Il
existe un équilibre entre la quantité de β-caténine affectée aux différentes fonctions et tout
déséquilibre dans une des fonctions va avoir un impact sur l’autre. Dans les CRC, deux types
d’altérations peuvent entrainer une dérégulation des fonctions physiologiques de la βcaténine. L’un touche le gène suppresseur de tumeur APC (Adenomatous Polyposis Coli),
l’autre la β-caténine directement.
Altération d’APC
Le gène APC est situé dans la région du chromosome 5q21-22. Il est le partenaire
essentiel de la voie de signalisation Wnt. Comme vu précédemment, l’altération
constitutionnelle de ce gène est responsable de la polypose adénomateuse familiale. Cette
protéine est retrouvée mutée dans 60 à 80% des CRC de phénotype CIN (Powell, Zilz et al.
1992). Ces mutations sont principalement dues à la délétion ou l’insertion de quelques bases
aboutissant à la synthèse d’une protéine tronquée et non fonctionnelle qui n’est plus
capable d’interagir avec la β-caténine (Laurent-Puig, Beroud et al. 1998). L’évènement qui
suit est généralement la perte de l’autre bras du chromosome 5 ou l’apparition d’une
seconde mutation sur l’autre allèle du gène APC.
Le contrôle d’APC sur le cycle cellulaire se fait par l’intermédiaire de la protéine βcaténine. Après activation du récepteur de Wnt, la β-caténine s’accumule dans le cytoplasme
de la cellule. En absence de protéine APC fonctionnelle le complexe aboutissant à la
dégradation de la β-caténine ne peut pas se former, cette dernière va donc former un autre
complexe avec le facteur de transcription TCF-4. Ce complexe est transloqué dans le noyau
où il permet l’expression de gênes favorisant par exemple la prolifération cellulaire (Goss
and Groden 2000). Il a été montré que, dans les cellules déficientes en protéine APC sauvage,
le complexe β-caténine-TCF4 était stable et donc constitutivement actif entrainant
l’activation constitutive de nombreux gènes dont des oncogènes tels que c-myc, la cycline
D1 mais aussi la progastrine (Koh, Bulitta et al. 2000).
6
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
Une autre conséquence de la formation de ce complexe est la dérégulation de la
liaison entre la β-caténine et l’E-cadhérine. La β-caténine étant complexée avec TCF4 cela
crée une dérégulation de l’équilibre entre le pool de β-caténine cytoplasmique et celui
interagissant avec l’E-cadhérine. Or, cette interaction conditionne l’adhésion cellule-cellule
qui est donc diminuée dans ce cas. Cela participe à la perte d’adhésion entre les cellules et
donc favorise la capacité migratoire des cellules tumorales (Goss and Groden 2000).
Mutation de la β-caténine
Une autre dérégulation de la voie Wnt a été démontrée dans 50% des CRC ne
présentant pas de mutation d’APC. Il s’agit de la mutation activatrice de la β-caténine
empêchant sa dégradation par le protéasome (Powell, Zilz et al. 1992). Cette mutation est
situé dans la majorité des cas sur l’exon 3 du gène de la β-Caténine (CTNNB1) (Sparks, Morin
et al. 1998). Cette mutation permet donc l’accumulation de la β-caténine dans le cytoplasme
et la formation d’un complexe avec TCF4 stable.
Ainsi, la dérégulation de la voie Wnt se fait par la formation du complexe β-caténineTCF4. Dans les CRC, ce complexe est stabilisé soit par l’inactivation de la protéine APC comme
expliqué ci-dessus, soit par la mutation activatrice de la β-caténine. Cela conduit à la
prolifération des cellules épithéliales coliques et à leur migration vers la surface des cryptes
intestinales permettant la formation de cryptes aberrantes qui est la première lésion
prénéoplasique colorectale.
Modèles animaux :
Afin de déterminer l’importance de la voie APC dans la carcinogénèse colique,
plusieurs modèles animaux ont été générés. L’un des modèles le plus connu est le modèle
de souris APC min/+ (Min, multiple intestinal neoplasia). Ces souris possèdent une mutation
d’APC sur son codon 850 induisant la formation d’un codon stop (TAG) en lieu et place d’une
leucine (TTG). La délétion homozygote d’APC est létale, néanmoins les souris hétérozygotes
développent plusieurs centaines de polypes adénomateux au niveau de l’intestin grêle. Les
animaux plus âgés présentent des tumeurs localement invasives et des adénocarcinomes
(Moser, Pitot et al. 1990) (Su, Kinzler et al. 1992). Dans ces lésions, les cellules épithéliales
ont un niveau de β-caténine augmenté dans le cytoplasme et le noyau.
D’autres modèles de souris transgéniques avec des altérations d’APC ont été générés
dont APCΔ474, APCΔ716 et APCΔ14 par mutagénèse dirigée et ont permis de confirmer ce
phénotype (Oshima, Oshima et al. 1995) (Sasai, Masaki et al. 2000). Dans le modèle murin
APCΔ716, une perte d’hétérozygotie a été détectée (perte de l’allèle non muté) ce qui a permis
de confirmer la théorie de perte du second allèle chez l’homme suite à la mutation
hétérozygote d’un gène (Knudson 1971).
7
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
2. La voie Ras / MAPK :
La voie de Ras/MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) joue de multiples rôles que
ce soit dans la régulation de la prolifération, la différenciation, la survie, la migration
cellulaire ou l’angiogenèse. Parmi les premiers effecteurs de cette voie, les protéines Ras
sont des GTPases appartenant à la famille des petites protéines G monomériques. Ces
dernières sont localisées à la face interne de la membrane plasmique, ancrées dans la couche
lipidique par une palmitoylation au niveau de leur extrémité C-terminale. En condition
normale, leur activation est dépendante de récepteurs membranaires. Ces GTPases vont lier
un GTP, engendrant leurs interactions avec des protéines effectrices, sur lesquelles, elles
transfèrent le phosphate libéré. Il existe trois protéines Ras chez l’homme H-Ras, K-Ras et NRas. Dans les CRC en particulier, les mutations touchent principalement le gène K-Ras, situé
sur le bras court du chromosome 12, il est retrouvé muté dans environ 40%. Ces mutations
se situent sur le codon 12 dans 82% des cas ou sur le codon 13 dans 17% des cas de l’exon 2
du gène KRAS (Amado, Wolf et al. 2008).
Les effecteurs principaux des GTPases
Ras sont les protéines de la famille Raf (A-Raf,
B-Raf et C-Raf chez l’homme). Ces protéines
sont des Sérine/Thréonine kinases. Dans le
CRC, la mutation la plus fréquente se situe
sur le gène BRAF (v-Raf murine sarcoma viral
oncogene homolog B1). Cette mutation est
une substitution d’un acide aminé en
position 599, avec une valine (V) remplacée
par un acide glutamique (E). Cette mutation
V599E conduit à une augmentation de
l’activité kinase de la protéine B-Raf et il a été
constaté que cette mutation avait des
capacités oncogéniques (Davies, Bignell et al.
2002).
FIGURE 3 : La voie des MAPK
(Barault, Veyrie et al. 2008)
L’activation de B-Raf va induire, via la
métabolisation d’ATP en ADP et la phosphorylation d’autres effecteurs de cette voie, les
protéines Sérine/Thréonine kinases MEK. Les MEK vont à leurs tours induire la double
phosphorylation de protéines de la famille ERK. Cela entraine la translocation de ces
dernières dans le noyau et déclencher l’expression de différents facteurs de transcription
tels que c-FOS, c-Myc et c-JUN par exemple. Ces protéines vont à leurs tours déclencher
l’expression d’un grand nombre de gènes régulant notamment la prolifération ou la survie
cellulaire.
8
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
De façon générale, entre 10 et 15% des CRC possèdent une mutation de BRAF, qui
est mutuellement exclusive avec la mutation KRAS (Barault, Veyrie et al. 2008).
Si l’on additionne les mutations sur les gènes KRAS et BRAF, cette voie du signal
apparaît constitutivement active dans 50% des CRC.
Modèles animaux :
De nombreux modèles de souris transgéniques muté KRAS ont été générés afin
d’étudier les fonctions de cette mutation dans la carcinogénèse colique. Cependant, la
variabilité d’approche et de fond génétique utilisés rendent l’interprétation des fonctions de
cette mutation difficile.
Certains modèles reposent sur la surexpression d’un mutant KRAS. Le modèle
a été d’abord développé sous l’influence du promoteur de la fatty acid binding
protein (fabp). Ce modèle induit une surexpression de KRAS muté au niveau de l’intestin.
Dans ces études, les souris ne développent aucune anomalie phénotypique ni aucune
activation de ERKs (Kim, Roth et al. 1993) (Coopersmith, Chandrasekaran et al. 1997).
Lorsque ce même gène mutant est mis sous le contrôle du promoteur de la villine, qui va
permettre la surexpression du transgène dans les cellules progénitrices intestinales, les
souris vont développer des tumeurs reproduisant tous les stades de la carcinogénèse
humaine dans l’intestin grêle et le colon. Cette surexpression est associée à une activation
des ERKs (Janssen, el-Marjou et al. 2002).
KRASG12V
Plus récemment, les modèles animaux ont cherchés à se rapprocher de la mutation
humaine où le gène KRAS est muté mais pas surexprimé. Ainsi, des souris avec un gène KRAS
muté exprimé sous le contrôle du promoteur de KRAS endogène ont été générées. Grace à
une approche Cre-Lox, il a été possible de contrôler l’expression du gène KRAS mutant avec
une cassette STOP floxée sur le gène. Il sera donc réprimé tant que cette cassette STOP ne
sera pas excisée par la recombinase Cre. Dans ces études, l’expression du mutant KRASG12V
n’induit pas de lésion au niveau de l’intestin murin et aucune activation des ERKs n’a été
constatée (Guerra, Mijimolle et al. 2003) (Sansom, Meniel et al. 2006). Néanmoins, dans un
modèle double mutant APC et KRAS (APC+/F1 ; KRAS +/G12V), l’activation de KRAS conduit à
l’accélération de la formation d’adénomes et à l’augmentation de invasion des cellules
tumorales de façon ERK dépendante. Ces résultats montrent que cette mutation n’est pas
suffisante pour induire la transformation tumorale mais participe à la carcinogénèse colique
(Sansom, Meniel et al. 2006).
9
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
3. La voie p53 :
Le gène TP53 est situé sur le chromosome 17p et est inactivé soit par pertes alléliques
soit par mutations ponctuelles dans 60 à 80% des CRC à instabilité chromosomique (CIN)
(Naccarati, Polakova et al.). La mutation de ce gène est moins fréquente dans les tumeurs
MSI. 30% des mutations touchant ce gène sont situées sur les codons 175, 245, 248, 273 et
282 (Naccarati, Polakova et al.). Les mutations de TP53 sont impliquées dans la transition
adénome-adénocarcinome, elles surviennent donc relativement tardivement au cours de la
séquence adénocarcinomale (Figure 1).
Ce gène code pour la protéine p53 qui
possède un double rôle. D’une part, elle va
bloquer la transition G1/S du cycle cellulaire en
cas de dommage à l’ADN. D’autre part, si les
lésions à l’ADN ne sont pas réparables, elle va
induire
la
transcription
de
gènes
proapoptotiques comme BAX (Bcl-2–Associated
X protein) (Lane 1992). La protéine p53 est
définie comme un « gardien du génome ». Son
altération est donc une étape clé pour la
progression des cancers CIN permettant ainsi de
nombreuses délétions ou amplifications de
gènes participant à ce phénotype.
FIGURE 4 : Fonction de la voie p53 (Lane
1992)
a) Fonction normale
b) Réponse suite à un dommage à l’ADN
c) Réponse suite à un dommage à l’ADN
avec la voie p53 muté.
Dans les tumeurs de type MSI, la voie p53
est différemment altérée. Ces tumeurs
possèdent dans 30 à 50% des cas des décalages
du cadre de lecture sur une séquence répétée
riche en guanine du gène BAX conduisant à
l’extinction de la protéine (Rampino, Yamamoto
et al. 1997).
Modèles animaux :
Plusieurs modèles de souris présentant une invalidation biallélique de P53 ont été
développés. Les souris P53-/- sont viables et présentent une prédisposition aux lymphomes
et sarcomes. Par contre, ces souris ne présentent aucune lésion au niveau du colon, ni
aucune prédisposition aux cancers colorectaux (Donehower, Harvey et al. 1992) (Clarke,
Cummings et al. 1995). De plus, les souris double muté APC et P53 (APC +/min, p53-/-)
présentent le même phénotype que les souris muté APC seul au niveau intestinal. Cela
suggère que P53 n’est pas impliquée dans les stades précoces de la carcinogénèse
colorectale mais qu’elle a un rôle plus tardif (Clarke, Cummings et al. 1995) (Kongkanuntn,
Bubb et al. 1999).
10
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
4. La voie Phosphatidyl Inositol 3 Kinase (PI3K) / AKT :
Cette voie joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions cellulaires tel que la
régulation du métabolisme cellulaire, de la prolifération, de la survie et de la migration
cellulaire. En condition normale, l’induction de cette voie passe par l’activation par exemple
d’un récepteur soit un récepteur à activité tyrosine kinase (RTK) soit un récepteur couplé aux
protéines G (RCPG) après liaison de son ligand. Les Phosphatidyl Inositol 3 Kinases (PI3K) sont
composées d’une sous unité régulatrice et d’une sous unité catalytique. Il existe plusieurs
sous unités catalytiques chez l’homme : la p110α, β, δ et γ. Dans cette partie nous nous
intéresserons principalement à la p110α car aujourd’hui elle est la seule pour laquelle un lien
a été démontré dans la carcinogénèse colorectale. La sous-unité régulatrice associée à la
p110α est la p85.
FIGURE 5 : La voie PI3K / AKT (Vivanco and Sawyers 2002)
L’activation de la PI3K se fera de façon différente en fonction du type de récepteurs.
11
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
Suite à son activation et son autophophorylation, le récepteur TK va lier la sous unité
p85 de la PI3K. Cette liaison va permettre l’activation de la PI3K (Yu, Zhang et al. 1998).
Dans le cas des RCPG, suite à l’activation du récepteur les protéines GRB2 et GAB2
seront recrutées et vont lier RAS. La protéine RAS va par la suite activer directement la sousunité p110 (New and Wong 2007).
La sous unité catalytique p110 de la PI3K permet la génération de
phosphatidylinositol 3,4,5 triphosphate (PIP3) à partir de PIP2. La PIP3 recrute à son tour
deux protéines kinases PDK1 et PDK2 (3-phosphoinositide dependant kinase). La PDK1 se lie
alors à la protéine AKT (ou protéine kinase B (PKB)) et la phosphoryle (Vivanco and Sawyers
2002). Une deuxième phosphorylation se fera via PDK2 ce qui entrainera le détachement
d’AKT de la membrane et son activation (Vanhaesebroeck and Alessi 2000) (Figure 5).
AKT activé va pouvoir réguler la synthèse des protéines par l’intermédiaire de
l’activation du facteur de transcription eIF4E et de la protéine ribosomale p70S6 et de
l’inhibition de 4EBP1 (von Manteuffel, Dennis et al. 1997). eIF4E permet le recrutement de
la petite sous-unité des ribosomes sur l’ARNm et donc peut agir sur le taux global de
transcription de la cellule.
La régulation du cycle cellulaire par AKT se fait par l’intermédiaire de la protéine
GSK3β. Cette protéine, qui a un rôle important dans l’adressage au protéasome des
protéines devant être dégradée, va être phosphorylée donc inactivée. Cette inactivation va
empêcher la destruction de la cycline D1 (Diehl, Cheng et al. 1998). Cela va donc aboutir à
l’accumulation de cette cycline dans la cellule et va induire le cycle cellulaire. La voie
PI3K/AKT joue donc un rôle majeur dans la prolifération cellulaire.
La dernière grande fonction de cette voie est la survie cellulaire. AKT va phosphoryler
et inactiver des facteurs proapoptotiques tels que BAD (Datta, Dudek et al. 1997) et la
caspase 9 (Cardone, Roy et al. 1998).
La régulation de cette voie se fait par l’intermédiaire de la phosphatase PTEN qui va
induire le passage de PIP3 à PIP2, s’opposant ainsi à la voie PI3K/AKT et agissant comme un
gène suppresseur de tumeur.
En ce qui concerne le CRC, le gène PIK3CA codant pour une sous unité catalytique
p110α de la PI3K et retrouvé muté dans environ 15% des cas et est associé à une activation
de la voie PI3K (Ikenoue, Kanai et al. 2005). Ces mutations touchent principalement les
codons 9 (domaine en hélice) et 20 (domaine kinase) du gène. In vitro, toutes ces mutations
ont été décrites comme augmentant l’activité enzymatique de la PI3K (Kang, Bader et al.
2005). D’autre part, une délétion au sein de la sous unité p85α de la PI3K touchant un site
d’autorégulation du complexe aboutit à une protéine PI3K constitutivement active (Philp,
Campbell et al. 2001).
12
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
Ces mutations sont plus fréquemment retrouvées dans le côlon proximal (droit) et se
distribuent de manière égale entre les tumeurs CIN ou MSI (Barault, Veyrie et al. 2008).
Des altérations inactivatrices touchant les exons 7, 8 et 9 du gène PTEN ont été
identifiées. Ces altérations induisent l’expression d’une protéine tronquée qui sera
rapidement dégradée ont été décrites dans 20 à 30% des CRC (Goel, Arnold et al. 2004). La
prévalence des mutations de PTEN est de l’ordre de 18% pour les phénotypes MSI (Guanti,
Resta et al. 2000) et de 2% pour les phénotypes MSS (Wang, Taylor et al. 1998).
Modèles animaux :
Une publication récente a permis de décrire l’effet de l’expression d’une forme
constitutivement active de la PI3KCA dans un modèle murin. La mutation de ce gène est
retrouvée dans les cancers colorectaux humains. Ces souris développent rapidement des
adenocarcinomes invasifs au niveau du colon avec des tumeurs histologiquement
semblables aux tumeurs colorectales humaines (Leystra, Deming et al.).
5. La voie du Transforming Growth Factor β (TGFβ) :
La voie du TGFβ est une voie impliquée dans la croissance et la différenciation
cellulaire, la synthèse de matrice extracellulaire, la réponse immunitaire et l’angiogenèse. La
famille des TGFβ est composée d’un grand nombre de protéines dimériques
structurellement apparentés chez l’homme (entre 30 et 40 protéines).
Il existe deux classes de récepteurs au TGFβ qui sont des récepteurs à activité
sérine/thréonine kinase. Les récepteurs de type I et de type II forment des dimères de
structure similaire. Chaque membre de la famille des TGFβ va se lier à une combinaison
caractéristique de récepteur de type I et II. Ces récepteurs vont donc formés un récepteur
tétramérique TGFβRI/TGFβRII. Le récepteur de type II va ensuite phosphoryler et activer le
récepteur de type I.
Une fois activé le récepteur de type I va se lier à une protéine de la famille des SMAD.
Dans le colon, ce récepteur va se lier aux protéines SMAD 2 ou SMAD 3, cette liaison va
entrainer la phosphorylation de SMAD. Une fois phosphorylé, cette protéine va se détacher
du récepteur et va se lier à SMAD 4 (Co-SMAD) en formant un hétérodimère (Heldin,
Miyazono et al. 1997). Ce complexe va alors être transloqué dans le noyau et va permettre
la transcription de gènes du cycle cellulaire. L’activation de cette voie est associée à
l’inhibition de cyclines et de kinases dépendantes de cyclines ainsi qu’à l’augmentation de
l’expression d’inhibiteurs de ces cyclines (Slingerland, Hengst et al. 1994).
Dans 20 à 30 % des CRC à instabilité chromosomique (CIN), cette voie de signalisation
est affectée par une mutation touchant les codons 133, 440, 445 et 450 de la protéine
SMAD2 aboutissant à une protéine instable ou ne pouvant pas être phosphorylée (Eppert,
Scherer et al. 1996). Cette voie est également touchée dans 60 à 80% des cancers MSI où le
13
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
gène TGFβRII est inactivé (Parsons, Myeroff et al. 1995). Cette mutation est très fréquente
car le gène possède une séquence microsatellite de dix adénines expliquant le décalage dans
le cadre de lecture trouvé dans le récepteur muté le rendant non fonctionnel.
On peut donc observer que cette voie est inactivée dans ces deux types de cancer,
dans les CIN et systématiquement dans les cancers MSI.
6. La voie Notch :
La voie signalisation Notch est une voie très conservée au cours de l’évolution. Elle
est impliquée dans les processus de différenciation cellulaire (Lai 2004) (Borggrefe and
Oswald 2009). Les premières études de cette voie ont eu lieu chez la drosophile où il existe
un seul récepteur Notch et deux ligands (Delta et Serrate). Chez les mammifères, il existe
quatre récepteurs Notch (Notch 1-4) et cinq ligands associés (Delta-like 1, 3, 4 et Jagged 1,
2) (Kopan and Ilagan 2009).
L’interaction entre un récepteur Notch et un de ses ligands va induire un double
clivage de ce récepteur. Son domaine extracellulaire sera clivé par une protéase de la famille
des ADAM (a distengrin and metalloprotease). Son domaine intracellulaire (appelé NICD
pour Notch IntraCellular Domain) sera libéré dans le cytoplasme par un complexe
multiprotéique : la γ-sécrétase. Cette forme de NICD clivé constitue la forme active du
récepteur Notch, elle va ensuite migrer dans le noyau et interagir avec un complexe
transcriptionnel composé du facteur de transcription CSL. L’introduction du NICD dans ce
complexe induit la libération des corépresseurs et le recrutement des coactivateurs
permettant l’activation transcriptionelle dans gène cible de la voie.
Dans le cancer colorectal, un lien a pu être établi entre la voie Notch et la voie Wnt.
Une étude a montré que l’accumulation de β-caténine résultant de la dérégulation de la voie
Wnt, induisait une activation transcriptionnelle de Jagged 1 qui est un ligand des récepteurs
Notch. Cette régulation induisait donc une activation de la voie Notch. De plus, dans cette
étude une délétion d’un allèle de Jagged 1 induisait une réduction de la croissance tumorale
dans des souris APCMin/+, montrant que une partie des effets prolifératif de la voie Wnt/APC
sont dus à l’activation de la voie Notch (Rodilla, Villanueva et al. 2009).
14
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
b) PROCESSUS INITIATEURS DE LA CARCINOGENESE :
Dans son article, Jass (Jass 2007) propose
de classer en 5 groupes distincts les différentes
voies de modifications au niveau de l’ADN
menant au CRC (figure 6). Ces 5 groupes
couvrent l’ensemble des cas de CRC rencontrés.
Le classement s’établit en fonction de
l’instabilité
chromosomique
(CIN),
de
l’instabilité microsatellitaire (MSI-L/MSS ou
MSI-H) et de la méthylation des îlots CpG (CIMPL ou CIMP-H).
FIGURE 6 : Classification des CRC proposés par Jass (Jass
2007).
MSI : Instabilité microsatellitaire
CIMP : méthylation des îlots CPG
H : high / L : low / Neg : negative
L’instabilité microsatellitaire (MSI) se caractérise par la perte de protéines
appartenant au système de réparation des mésappariements de l’ADN (MMR). Les protéines
touchées dans cette voie sont généralement hMLH1 et hMSH2. La finalité de l’instabilité
microsatellitaire et l’apparition de nombreuses mutations aboutissant à la transformation
tumorale. L’instabilité microsatellitaire est associée aux groupes 1 et 5.
La méthylation des îlots CpG (CIMP) est impliquée dans la régulation de la
transcription d’un gène, l’hyperméthylation d’un gène suppresseur de tumeur conduit à
l’extinction de l’expression de la protéine associée. Cette hyperméthylation est retrouvée à
différents niveaux dans les groupes 1, 2 et 3.
Les CRC à instabilité chromosomique (CIN) représente la majorité des cancers
colorectaux est ne présentent pas instabilité microsatellitaire (MSS) ni de méthylation des
îlots CPG (CIMP-Neg) (Groupe 4).
1. L’instabilité chromosomique (CIN) :
L’instabilité chromosomique représente le cas le plus fréquent de CRC, 57% des
cancers colorectaux sont issus de ce groupe (Jass 2007). Il s’agit de la voie classique de
carcinogénèse colorectale qui fut décrite en premier lieu par Fearon et Vogelstein (Fearon
and Vogelstein 1990). L’instabilité chromosomique se traduit par une aneuploïdie ou une
perte d’hétérozygotie résultant d’erreur lors de la mitose (Cahill, Lengauer et al. 1998) (Rao,
Yamada et al. 2009). Les gènes principalement touchés par ce mécanisme sont APC, K-Ras et
TP53.
15
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
FIGURE 7 : Les différents phénomènes responsables de l’instabilité
chromosomique (Holland and Cleveland)
Selon le modèle classique de carcinogénèse colique, l’altération du gène APC semble être un
évènement précoce, sinon initiateur, de la carcinogénèse colique (Powell, Zilz et al. 1992). En effet
les altérations d’APC sont observées dès l’apparition de cryptes aberrantes ou dans les adénomes de
bas grade. Cette mutation généralement constatée sur le chromosome 5q21, est associée à une perte
du second allèle par délétion qui a pour conséquence l’apparition d’un codon stop aboutissant à la
synthèse d’une protéine tronquée. L’apparition de cette protéine tronquée aura des conséquences
importantes sur l’instabilité chromosomique. L’une des conséquences est que la protéine APC ne
pourra plus se lier à la protéine BUB1 (budding uninhibited by benzimidazoles 1). Cette protéine est
une enzyme qui joue un rôle dans la ségrégation des kinétochores et permet une bonne séparation
des chromosomes. La protéine APC est associée aux microtubules et à la protéine BUB1. L’apparition
d’une protéine tronquée favorise donc l’instabilité chromosomique (Fodde, Smits et al. 2001). Un
autre gène a été montré comme favorisant la CIN. En effet l’amplification du gène AURKA (Aurora
Kinase A), une sérine thréonine kinase associée au centrosome est fréquemment observée dans les
CCR (Killian, Di Fiore et al. 2007) et associée au phénotype CIN (Nishida, Nagasaka et al. 2007).
D’autres gènes ont été montrés comme impliqués dans ces phénomènes : SCML1, CSPG6, STAG3,
16
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
MRE11A, FBXW7, ce sont des gènes qui interviennent dans la cohésion des chromatides sœurs lors
de la mitose (Barber, McManus et al. 2008).
La mutation KRAS, proto-oncogène localisé sur la chromosone 12p12.1, est un
phénomène qui survient généralement lors des phases intermédiaires du développement
des adénomes mais qui rarement peut se retrouver dès l’apparition de cryptes aberrantes
(Smith, Stern et al. 1994). Il a été montré que les dysplasies ne se développent que lorsque
la mutation KRAS est associée à d’autres mutations comme celle touchant le gène APC
(Phelps, Chidester et al. 2009).
La mutation du gène suppresseur de tumeur TP53 est un événement plus tardif
intervenant dans les stades les plus avancés de la carcinogénèse colorectale. Des mutations
perte de fonction ont été décrites dans plus de 40% des CRC, avec une augmentation de la
fréquence de mutation aux stades les plus tardifs. Ces mutations touchent dans 95% des cas
le site de fixation de la protéine p53 à l’ADN et diminue très fortement son activité
transcriptionelle (Vousden and Lu 2002). La protéine p53 contrôle de nombreuses fonctions
cellulaires et est définit comme le « gardien du génome », son altération va donc accroitre
l’instabilité chromosomique et participer à de nombreux mécanismes de la tumorigénèse.
2. L’instabilité microsatellitaire (MSI) :
Les microsatellites sont de courtes
séquences d’ADN chromosomiques qui sont
formés par la répétition de séquences de plusieurs
bases. L’instabilité microsatellitaire est caractérisée
par la présence d’une instabilité dans les zones
microsatellites liée à un défaut de réparation des
mésappariements de l'ADN : le système de réparation
MMR.
FIGURE 8 : Les dommages à l’ADN liés à
l’instabilité microsatellitaire (Chung and
Rustgi 2003)
Les tumeurs MSI sont principalement
localisées au niveau du côlon proximal (droit) alors
que 95% des tumeurs du côlon distal (gauche) sont
issues d’une instabilité chromosomique (CIN). Les
catégories CIN et MSI sont mutuellement exclusives.
Les CRC à forte instabilité microsatellitaire (MSI-High) : Contrairement au Syndrome de
Lynch, dans les CRC sporadiques MSI-H, ce défaut de MMR est principalement dû à une
hyperméthylation du promoteur du gène hMLH1 (Kane, Loda et al. 1997). Ce type de tumeur
représente 15% des CRC diagnostiqués et leur détection se fait par la recherche d'une augmentation
ou d'une diminution du nombre de répétitions de plusieurs séquences microsatellites et par l'analyse
comparative de la taille des produits d'amplification de ces séquences provenant de l'ADN extrait du
tissu tumoral et du tissu sain adjacent.
17
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
Contrairement aux tumeurs CIN, ces tumeurs sont diploïdes et les mutations de gènes tels
qu’APC et TP53 sont peu fréquentes (Olschwang, Hamelin et al. 1997). Par contre, le déficit de MMR
entraine de nombreuses mutations touchant les séquences qui possèdent des séquences
microsatellitaires (Chung and Rustgi 2003). Ainsi, de nombreux gènes agissant pour le contrôle du
cycle cellulaire, l’apoptose ou la réparation de l’ADN peuvent être inactivés par la présence de
mutations dans leurs régions codantes répétées. Ainsi, beaucoup d’altérations génomiques ont été
décrites dans les tumeurs MSI-H (MSI-High). L’une des premières mutations décrites fut le gène
codant pour le TGFβRII, la mutation intervient sur le début de la séquence codant pour ce récepteur
composé de dix adénines. Cette altération conduit à la production d’une protéine inactive
(Markowitz, Wang et al. 1995). Le gène proapoptotique BAX est lui aussi fréquemment muté dans
les tumeurs MSI-H (Rampino, Yamamoto et al. 1997). Le facteur de transcription TCF4 est aussi
retrouvé muté dans environ 40% de ce type de tumeur (Duval, Gayet et al. 1999).
Les CRC à faible instabilité microsatellitaire (MSI-Low) : Les tumeurs MSI-L sont difficilement
distinguables histopathologiquement des tumeurs MSS (sans instabilité microsatellitaire) mais ces
tumeurs présentes des défauts dans les régions microsatellitaires. Ces défauts sont dus à un
mécanisme différent des tumeurs MSI-H. L’instabilité est créée par l’hyperméthylation de MGMT
(MéthylGuanine DNA MéthylTranférase), ce qui aboutit à sa perte d’expression. Il résulte de cela une
accumulation de mésappariements G méthylé – T provoquant des erreurs dans la séquence des
gènes conduisant au profil MSI-L (Whitehall, Walsh et al. 2001).
3. L’hyperméthylation des îlots CpG (CIMP) :
Plus récemment, des anomalies
dans la méthylation de l’ADN ont été
observées dans les tumeurs colorectales
(Toyota, Ahuja et al. 1999) (Issa 2004). Ces
anomalies ont permis d’isoler un nouveau
groupe de CRC mais qui n’est pas
indépendant
contrairement
aux
phénotypes CIN et MSI : le phénotype
CIMP. Les îlots CpG sont des régions riches
en cytosine et guanine. Près de 50% des
régions promotrices des gènes humains en
possèdent
et
leurs
méthylations
entrainent des modifications structurales
FIGURE 9 : La méthylation de l’ADN (Issa 2004)
de l’ADN et l’inactivation des gènes
associés. Ces anomalies ont donné le nom de ce groupe : CIMP (CpG Island Methylator Phenotype).
Au cours du processus tumoral, plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs ont ainsi pu être inactivés.
Le gène de la protéine p16, régulatrice du cycle cellulaire, ainsi que la thrombospondine1 (THBS1),
suppresseur de tumeur, ont été montré comme hyperméthylés dans des tumeurs CIMP (Toyota,
Ahuja et al. 1999). Le gène hMLH1 est aussi fréquemment hyperméthylé dans les tumeurs CIMP, ces
tumeurs présentent donc le double phénotype MSI-H et CIMP. La majorité des tumeurs CIMP
présentent ce phénotype. Cette double signature est caractéristique des CRC sporadiques, les CRC
MSI-H et CIMP-Neg qui se développent plutôt dans le cadre de prédisposition du type Syndrome de
Lynch. La méthylation de l’ADN est sous la dépendance d’enzyme, les ADN méthyltransférases
18
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
(DNMT). L’une des DNMT la plus étudiée dans le CRC est la DNMT-1. Un taux d’activité croissant de
cette enzyme a été montré au cours de l’évolution du CRC, montrant une activité 200 fois supérieure
dans le CRC que dans le tissu sain (el-Deiry, Nelkin et al. 1991).
Il n’existe pas à l’heure actuelle de consensus sur les gènes définissant le phénotype CIMP.
Cependant différents groupes au sein de ce phénotype CIMP semblent se dégager en fonction de la
mutation de KRAS et BRAF (Tanaka, Huttenhower et al.) (Minoo, Baker et al. 2006). Les tumeurs
CIMP-H, à forte hyperméthylation, sont fréquemment associées à la mutation BRAF et présentent
une méthylation plus importante de l’ADN. Alors que les tumeurs CIMP-L, à hyperméthylation plus
faible, sont plutôt associées à la mutation KRAS et possèdent moins de gènes méthylés suggérant un
phénomène épigénétique plus localisé (Shen, Toyota et al. 2007). Ce phénotype est plus fréquent
dans les tumeurs du colon proximal (droit) et dans les tumeurs peu différenciées (Ogino, Kawasaki et
al. 2007).
c) HISTOPATHOLOGIE DE LA CARCINOGENESE COLORECTALE :
1. Les foyers de cryptes aberrantes :
FIGURE 10: Foyers de cryptes
aberrantes entourées de muqueuse
normale
(Pretlow, Barrow et al. 1991)
La toute première étape de la carcinogénèse
colorectale est l’apparition d’une hyperprolifération de
l’épithélium colique. Cette prolifération anormale
aboutit à l’apparition de foyers de cryptes aberrantes
(FCA), il s’agit de la première anomalie détectable dans
le CRC (Pretlow, Barrow et al. 1991). Ces cryptes
apparaissent comme élargies, avec un épithélium plus
épais que des cryptes normales. Il existe deux types de
foyers de cryptes aberrantes ; sous la forme d’une
hyperplasie, qui se traduit par une augmentation de la
prolifération cellulaire anormale ou sous la forme d’une
dysplasie, c’est-à-dire une désorganisation des cellules
conduisant à une architecture anormale des glandes.
Les FCA dysplasiques ont été définit comme
étant le premier évènement de la séquence de
carcinogénèse classique FCA / adénomes / adénocarcinomes qui représenterait la voie
classique des CRC (Nascimbeni, Villanacci et al. 1999). Cependant, des articles plus récents
ont montré que ces FCA dysplasiques, qui sont très fréquents chez les patients atteints de
PAF, ne représentent que 5% des foyers de cryptes aberrantes sporadiques (Amos-Landgraf,
Kwong et al. 2007). De plus, ces FCA dysplasiques présentent plus souvent des mutations
KRAS ou une hyperméthylation que des mutations APC. Ces résultats montrent que les FCA
ne sont pas la voie majoritaire du passage à l’adénome (Amos-Landgraf, Kwong et al. 2007).
Les FCA hyperplasiques sont fréquemment associés aux mutations de KRAS au niveau
du codon 12. Ces polypes pourraient constituer les précurseurs de la sous population des
19
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
CRC induite en premier lieu par les mutations de KRAS (Takayama, Ohi et al. 2001). D’autres
FCA hyperplasiques présentent une apparence festonnée (avec la bordure épithéliale en
dent de scie). Ces polypes possèdent plus fréquemment la mutation BRAFV599E que KRAS par
rapport aux autres FCA hyperplasiques (Rosenberg, Yang et al. 2007).
2. Les polypes :
Les polypes colorectaux représentent un ensemble d’entités très variables. Le terme
polype correspond à une excroissance tissulaire formant une protrusion dans la lumière
intestinale. Le terme polype a donc une signification macroscopique.
- Les polypes hyperplasiques (PH) : sont des lésions
sessiles (la base d’implantation du polype est plus large que
celle du polype) de petite taille (inférieur à 1 cm). Ces polypes
ont une apparence histologique festonnée (architecture
glandulaire en dent de scie) (Noffsinger 2009), ces festons
n’occupant généralement que la partie supérieure des cryptes.
L’activité proliférative est essentiellement localisée en fond de
crypte (Torlakovic, Gomez et al. 2008). Ces polypes sont
généralement considérés comme bénins, une analyse des
limites de cette affirmation sera réalisée dans une partie
FIGURE 11: Polypes
hyperplasiques (Noffsinger
ultérieure en introduction du 1er article. En effet, certains sous
2009)
types de PH sont décrits comme des précurseurs de la voie des
tumeurs festonnées qui sera décrit dans une partie suivante (Torlakovic and Snover 1996).
De plus une étude récente dans l’équipe a permis de déterminer une population de PH qui
serait susceptible d’évoluer en adénomes (Do, Bertrand et al.).
- Les polypes juvéniles : siègent principalement au
niveau du rectum, chez le sujet jeune. Ce type de polype
est constitué de glandes tortueuses hyperplasiques
associées à un chorion inflammatoire. Ces polypes
sporadiques semblent ne pas avoir de potentiel de
transformation cancéreuse (Durno 2007).
FIGURE 12: Polypes juvéniles. (Source: Pathologie-Bilddatenbank)
- Les polypes de Peutz-Jehers : se situent principalement dans l’appareil
digestif et dans le sein. Ces polypes possèdent une architecture
caractéristique en arbre avec un revêtement hyperplasique qui peut
être mixte avec un revêtement adénomateux ce qui représente un
risque dans la transformation cancéreuse (Hearle, Schumacher et al.
2006).
FIGURE 13: Polypes de Peutz-Jehers. (Source: Pathologie-Bilddatenbank)
20
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
3. Les différents types d’adénomes du CRC :
Comme décrit précédemment, il existe plusieurs voies dans la carcinogénèse
colorectale. Jass a proposé de réaliser des groupes expliquant ces différentes voies (figure
2). Le tableau suivant se propose de les décomposer :
Caractéristiques
moléculaires, cliniques et
morphologiques
Statut
Mutation
Voies des tumeurs festonnées
Instabilité
chromosomique
Syndrome de
Lynch
Groupe 1
Groupe 2
Groupe 3
Groupe 4
Groupe 5
CIN
-
-
+++
+++
-
MSI
MSI-H
MMS / MSI-L
MMS / MSI-L
MSS
MSI-H
CIMP
CIMP-H
CIMP-H
CIMP-L
-
-
MLH 1
Méthylation
Méthylation
-
-
Mutation
APC
+/-
+/-
+
+++
++
KRAS
-
+
+++
++
++
BRAF
+++
++
-
-
-
D>G
D>G
G>D
D>G
SSA
SSA
G>D
TSA /
Adénome
Adénome
Adénome
Zone (colon droit/gauche)
Précurseur
TABLEAU 1: Classification moléculaire des cancers colorectaux basée sur les mécanismes initiateurs de tumeurs
(d’après Jass 2007)
a) La voie de l’instabilité chromosomique (CIN) : groupe 4
Il existe trois types de lésions adénomateuses issues de la voie classique de
carcinogénèse colique (CIN). Ces lésions présentent un risque croissant de transformations
tumorales : tubuleux, tubulo-villeux et villeux. Ces adénomes sont caractérisés par une
hyperprolifération épithéliale avec des noyaux volumineux, une stratification nucléaire ainsi
qu’une perte de polarité. Ces adénomes sont considérés comme les précurseurs des
adénocarcinomes CIN et ont été décrit avec la voie ACP/β-caténine muté (Jen, Powell et al.
1994).
- Les adénomes tubuleux : sont généralement pédiculés avec au moins 80% des
glandes dysplasiques et moins de 25% de
compartiment villeux. Ce type d’adénome
représente 65 à 85% des adénomes de cette voie.
FIGURE 14: Adénome tubuleux du colon avec
une désorganisation glandulaire.
(Source: Pathologie-Bilddatenbank)
21
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
- Les adénomes tubulo-villeux : ont une architecture mixte entre l’adénome tubuleux
et l’adénome villeux. Il représente 5 à 25% des adénomes.
FIGURE 15: Adénome tubulo-villeux du colon
avec une architecture mixte.
(Source: Pathologie-Bilddatenbank)
- Les adénomes villeux : sont généralement sessiles avec un compartiment villeux
supérieur à 85%. Il représente 5 à 10% des adénomes.
FIGURE 16: Adénome villeux sessile du colon
(Source: Pathologie-Bilddatenbank)
b) Les voies des tumeurs festonnées : groupe 1, 2 et 3
A la voie classique (CIN), une autre voie de la carcinogénèse colorectale a été décrite :
la voie des tumeurs festonnées. Cette voie initialement décrite dans les années 1990 a été
reconnue à partir de 2002 (Sawyer, Cerar et al. 2002). Une nouvelle nomenclature est
rapportée montrant une filiation entre polypes hyperplasiques, adénomes festonnés et
adénocarcinomes (Snover, Jass et al. 2005). Deux types d’adénomes festonnés ont été
décrits les adénomes festonnés sessiles et traditionnels montrant deux voies différentes
aboutissant à l’adénocarcinome.
22
Introduction bibliographique
-
- Le Cancer Colorectal
Les adénomes sessiles festonnés (SSA, sessile serrated ademona) : groupe 1 et 2
Ce sont des lésions larges supérieures à 5 mm
observées principalement dans le colon droit. Ces lésions
sont caractérisées par une dilatation et une élongation de
glandes importantes avec des festons présents à la base des
cryptes. Ce phénotype est responsable d’environ 8% des
CRC (Bettington, Walker et al.).
Des études au niveau moléculaire ont montré que
les adénomes festonnés sessiles présentent une forte
méthylation de leurs ADN mais que l’instabilité
microsatellitaire n’est pas systématique permettant de les
séparer en deux groupes. Dans cette voie, la mutation de
BRAF est présente dans plus de 80% des cancers de ce
groupe (Leggett and Whitehall). La mutation la plus
commune sur ce gène est une substitution d’une valine par
un glutamate sur le codon 599 (V599E) (Kambara, Simms et
FIGURE 17: La voie des adénomes
al. 2004). Cette mutation conduisant à une activation
sessiles festonnés (Leggett and
Whitehall)
constitutive de la voie RAS/RAF/MAPK induisant la
prolifération cellulaire. Le phénotype CIMP permet
d’inhiber par méthylation des gènes responsables du contrôle cellulaire comme p16 INK4a ou
la protéine IGFBP7 (Insulin-like growth factor-binding protein 7) (Leggett and Whitehall).
Pour le groupe 1, MSI-H, la dégénérescence maligne de ces adénomes intervient par
l’hyperméthylation du gène hMLH1 conduisant à un phénotype de tumeurs MSI.
Pour le groupe 2, le processus est encore mal caractérisé, des altérations des voies
Wnt ou p53 sont suspectées d’être à l’origine de la malignité de ce phénotype.
FIGURE 18: Adénome sessile
festonné (SSA) avec des
cryptes festonnées sur
l’ensemble des cellules
épithéliales.
(Source:
Pathologie-Bilddatenbank)
23
Introduction bibliographique
-
- Le Cancer Colorectal
Les adénomes festonnés traditionnels (TSA, traditionnal serrated ademona) :
groupe 3
Ce groupe d’adénomes induit l’apparition de 20% des
cancers colorectaux (Bettington, Walker et al.). Ces
adénomes associent une instabilité microsatellitaire faible ou
nulle (MSI-L ou MMS) avec une faible hyperméthylation
(CIMP-L). De plus, ces TSA ne sont pas associés à une
méthylation de hMLH1 ne les reliant ni au profil MSI ni CIMP.
En effet, ces adénomes se rapprochent de la voie CIN, mais
leur instabilité chromosomique est déclenchée par la
méthylation du promoteur de MGMT (O-6-methylguanineDNA methyltransferase). Cette méthylation est associée à la
mutation de KRAS et à l’apparition de l’instabilité
chromosomique (Ogino, Kawasaki et al. 2007).
FIGURE 19: La voie des adénomes festonnés traditionnels
(Leggett and Whitehall)
FIGURE 20: Adénome festonné traditionnels (TSA)
24
(Source: Pathologie-Bilddatenbank)
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
c) Le syndrome de Lynch : groupe 5
Ce groupe représente 3% des cancers colorectaux et présente des caractéristiques
communes au groupe 1 et au groupe 4 (CIN). Les adénomes issus de ce groupe sont dit
« classiques » (tubulleux, tubullo-villeux ou villeux)
4. Les adénocarcinomes colorectaux :
La majorité des cancers colorectaux possèdent une architecture glandulaire. La taille
et l’architecture des différents adénocarcinomes colorectaux sont variables et dépendantes
des voies qui les ont engendrées. Certaines de ces tumeurs sont associées à des
caractéristiques différentes.
a) - Les adénocarcinomes mucineux :
Ces tumeurs représentent 10% des CRC et se présentent sous la forme de nappe de
mucines qui contient l’épithélium malin. L’épithélium se présente sous forme de structures
glandulaires, de lambeaux cellulaires ou de cellules isolées. Ces tumeurs sont associées au
phénotype MSI-H.
FIGURE 21 : Adénocarcinome
mucineux présentant de larges
nappes de mucines
(Bettington, Walker et al.)
b) - Les carcinomes à cellules en bague à chaton :
Ces tumeurs sont caractérisées
par la présence de plus de 50% de
cellules contenant de la mucine intracytoplasmique. Cette vacuole repousse
le noyau cellulaire en périphérie.
FIGURE 22 : Carcinome médullaire à
cellules en bague à chaton souligné
par les flèches
(Bettington, Walker et al.)
25
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
c) - Les carcinomes médullaires :
Le carcinome médullaire est une lésion rare
caractérisée par des cellules contenant un noyau
vésiculaire avec un nucléole important, un cytoplasme
abondant et une infiltration lymphatique intraépithéliale. Ces carcinomes sont associés au
phénotype MSI-H (Wick, Vitsky et al. 2005).
FIGURE 22 : Carcinome médullaire avec les cellules
tumorales qui s’organisent en cluster
(Wick, Vitsky et al. 2005)
d) CLASSIFICATION DES ADENOCARCINOMES COLORECTAUX :
La classification des cancers colorectaux se fait en fonction de trois critères : la taille et la
profondeur de la tumeur (T), l’envahissement des ganglions périphériques (N), la présence
de métastases dans les organes périphériques (M)
FIGURE 23 : Schéma décrivant l’évolution de l’adénocarcinome
colique en fonction des stades TNM (source
http://www.annistononcology.com)
T
Tx
T0
Tis
T1
T2
T3
T4
Tumeur primitive
Renseignements insuffisants pour classer la tumeur primitive
Pas de signes de tumeur primitive
Carcinome in situ : intra-épithélial ou envahissant la lamina propria
Tumeur envahissant la sous-muqueuse
Tumeur envahissant la musculeuse
Tumeur envahissant la sous-séreuse ou les tissus péricoliques et péri-rectaux non
péritonéalisés
T4a : Tumeur perforant le péritoine viscéral
T4b : Tumeur envahissant directement les autres organes ou structures
26
Introduction bibliographique
N
Nx
N0
N1a
N1b
- Le Cancer Colorectal
N2a
N2b
Adénopathies régionales
Renseignements insuffisants pour classer les adénopathies régionales
Pas de métastase ganglionnaire régionale
Métastase dans 1 ganglion lymphatique régional
Métastase dans 2 à 3 ganglions lymphatiques régionaux
Nodule(s) tumoraux, satellite(s) dans la sous-séreuse, ou dans les tissus non
péritonéalisés péricoliques ou périrectaux sans métastase ganglionnaire régionale
Métastases dans 4-6 ganglions lymphatiques régionaux
Métastases dans 7 ou plus ganglions lymphatiques régionaux
M
Métastases à distance
M0
Pas de métastases à distance
Métastase localisée à un seul organe (foie, poumon, ovaire, ganglion(s)
lymphatique(s), autre que régional
Métastases dans plusieurs organes ou péritonéales
N1c
M1a
M1b
TABLEAU 2 : Classification TNM du cancer colorectal (TNM : Classification des tumeurs malignes 7°éd. 2010)
Stade
Stade 0
Stade I
Stade II A
Stade II B
Stade II C
Stade II IA
Stade III B
Stade III C
Stade IV A
Stade IV B
T
Tis
T1 / T2
T3
T4a
T4b
T1 / T2
T1
T3 / T4a
T2 / T3
T1 / T2
T4a
T3 / T4a
T4b
Tous T
Tous T
N
N0
N0
N0
N0
N0
N1a
N2a
N1
N2a
N2b
N2a
N2b
N1 / N2
Tous N
Tous N
M
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M1a
M1b
TABLEAU 3 : Correspondance entre les stades du cancer colorectal et la classification TNM
(TNM : Classification des tumeurs malignes 7°éd. 2010)
e) LES TRAITEMENTS DU CANCER COLORECTAL :
Le principal traitement du cancer colorectal est la chirurgie. Elle est quasisystématique et des traitements adjuvants sont généralement administrés. Les différentes
stratégies adoptées dépendent du stade de développement tumoral. Les différents cas de
figures ont été décrits dans un rapport de la haute autorité de Santé en Janvier 2012.
Ces recommandations sont valables dans le cas de cancer colique ou du tiers
supérieur du rectum (intra-péritonéal). Dans le cas d’un carcinome intra-épithélial ou intramuqueux (stade 0 / TisN0M0), la polypectomie est le seul traitement recommandé. Pour une
27
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
tumeur envahissant la sous-muqueuse (stade I / T1), la polypectomie est recommandée si
l’exérèse est complète (avec une marge supérieure à 1mm), que le carcinome est bien
différencié et qu’il n’existe pas d’embolies vasculaires. Dans le cas contraire, une colectomie
complémentaire doit être faite. Pour les tumeurs de stade II (T3 / T4), là encore une
colectomie est recommandée suivi d’une étude au cas par cas pour l’administration d’une
chimiothérapie adjuvante. A partir du stade III (N1 / N2), la chirurgie et la chimiothérapie
sont systématiques. Dans le cas de tumeurs de stade IV, une étude au cas par cas est réalisée
afin de déterminer la possibilité d’exérèse et les traitements les plus pertinents à
administrer.
Dans le cas de tumeurs touchant les deux tiers inférieurs du rectum (sous-péritonéal),
la radiothérapie est possible. Ce traitement n’est pas possible dans les cancers du côlon car
la radiothérapie risque d’endommager d’autres organes périphériques au côlon.
Ainsi, au niveau rectal, la radiothérapie est mise en œuvre dans le cas de tumeur de
stade II et III avant l’exérèse chirurgicale car ce traitement permet la réduction du volume
tumoral rendant cette opération moins invasive.
Suite à l’exérèse chirurgicale et dans le cas d’une chimiothérapie, une étude
anatomopathologique et génétique sera réalisée sur la pièce opératoire. Cette étude a pour
but de rechercher une instabilité microsatellitaire et la présence de marqueurs pronostiques
de réponse au traitement chimiothérapeutique (par exemple la recherche de la mutation
KRAS qui prédit une mauvaise réponse aux anti-EGFR).
Traitements systémiques dans le cancer colorectal :
Les indications concernant la chimiothérapie diffèrent en fonction du stade de la
tumeur. Dans le cas d’une tumeur non métastatique, le 5-fluorouracile, l’oxaliplatine,
l’irinotecan, la capécitabine et l’acide folinique constituent les traitements de référence.
Dans le cas d’un cancer métastatique, à ces traitements s’ajoutent le raltitrexed, l’uraciletegafur et des traitements ciblés comme les anticorps monoclonaux que sont le cétuximab,
le panitumumab et le bévacizumab peuvent être envisagés si l’analyse génétique montre un
gain potentiel pour le patient.
-
Chimiothérapies
Le 5-fluorouracile (5-FU) et ses précurseurs :
Le 5-FU a constitué pendant de nombreuses années le traitement référence dans le
cancer colorectal. Le 5-FU est un analogue de l’uracile, il va donc subir les mêmes
transformations. Le 5-FU va agir en bloquant la thymidilate synthase (TS) et en s’incorporant
dans l’ADN et l’ARN. L’effet terminal du 5-FU est le blocage de la méthylation de l’uracile en
thymidine aboutissant à l’inhibition de la synthèse d’ADN. Le 5-FU doit être administré en
28
Introduction bibliographique
- Le Cancer Colorectal
perfusion pour être efficace, cependant des précurseurs du 5-FU ont été développés qui
permettent une action identique au 5-FU en prise orale (Midgley and Kerr 2000).
La capétabiline est un carbamate de fluoropyrimidine qui est un précurseur de
fluorouracile. Ce composé va traverser la barrière intestinale et sera métabolisé par le foie
en deoxy-5-fluorocitidine (5-DFCR) puis en 5-déoxy-5-fluorouridine (5-DFUR) dans le foie
mais aussi les tissus tumoraux (Desmoulin, Gilard et al. 2002). L’étape transformant le 5DFUR en 5-FU se fera ensuite préférentiellement dans les cellules tumorales étant donné
que cette transformation est réalisée par la thymidine phosphorylase qui est surexprimée
en condition tumorale (Schuller, Cassidy et al. 2000).
L’uracile-tégafur est un autre analogue oral du 5-FU. Cette molécule est la
combinaison d’un précurseur du 5-FU, le tégafur et l’uracile qui un substrat de la
Dihydropyrimidine deshydrogenase (DPD). Le tégafur sera métabolisé en 5-FU au niveau
hépatique par le cytochrome P450 CYP2A6, et l’uracile permettra une inhibition compétitive
de la dégradation du 5-FU par la DPD. C’est deux phénomènes vont augmenter la quantité
de 5-FU intracellulaire disponible (Hoff 2000).
L’acide folinique ou leucovorine est une molécule administrée en complément du 5FU et de ces dérivés. Cette molécule favorise l’inhibition de la TS en stabilisant le complexe
5-FU – TS et permet ainsi d’augmenter l’efficacité du 5-FU.
Le raltitrexel est un analogue de l’acide folinique qui possède une activité inhibitrice
sur la thymidilate-synthétase (TS). Il agit par inhibition directe et spécifique sur la TS. Cette
molécule pénètre dans les cellules via un transporteur de l’acide folinique puis subit une
polyglutamatation ce qui rend la molécule active (Van Cutsem 1999).
L’oxaliplatine est devenu un élément important dans le traitement du cancer
colorectal. L’oxaliplatine est un agent alkylant capable de créer des liens anormaux entre
l’adénine et la guanine d’un simple ou d’un double brin d’ADN. Ces liens produisent alors des
torsions empêchant la synthèse et la réplication de l’ADN (O'Connell 2009).
L’oxaliplatine associé avec le 5-FU et l’acide folinique constitue l’un des protocoles
de traitement de 1ère intention de référence dans le cancer colorectal : le FOLFOX.
L’irinotecan doit être converti en son métabolite le SN-38 pour être actif. Ce composé
est un inhibiteur de la topoisomérase I. La topoisomérase I est l’enzyme responsable de
l’ouverture et de la fermeture de l’ADN dans la réplication. Le SN-38 stabilise le lien entre la
topoisomérase I et l’ADN empéchant la fermeture de celui-ci et inhibant donc la réplication
(O'Connell 2009) (Vanhoefer, Harstrick et al. 2001).
L’irinotecan, le 5-FU et l’acide folinique forment le protocole de traitement FOLFIRI.
29
Introduction bibliographique
-
- Le Cancer Colorectal
Les thérapies néo-adjuvantes : les anticorps monoclonaux
Le cétuximab est un anticorps monoclonal murin humanisé dirigé contre l’EGFR
(Epidermal Growth Factor Receptor). Il se lie à ce récepteur et empêche sa dimérisation et
donc l’induction du signal associée à ce récepteur. Ce signal induit l’activation de la voie
Ras/MAPK ainsi que la voie PI3K/AKT. Le cétuximab bloque donc l’activation de ces voies en
empêchant la liaison de l’EGF sur son récepteur, l’EGFR (Arnold and Seufferlein). Un autre
anticorps monoclonal humain anti-EGFR existe, le panitumumab.
Le bevacizumab est un anticorps monoclonal bloquant qui se lie au VEGF (Vascular
Endothelial Growth Factor) et inhibe ainsi sa liaison à ses récepteur Flt-1 (VEGF-1) et KDR
(VEGF-2). Cet anticorps est constitué d’une partie constante d’origine humaine et d’une
partie variable d’origine murine. Il a pour effet de bloquer l’action du VEGF se qui aboutit à
une inhibition de l’angiogénèse (Arnold and Seufferlein).
30
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
B. LE STROMA EN CONDITION PHYSIOLOGIQUE & TUMORAL
Lors de la dernière décennie, des campagnes de détection ont été mises en place
pour essayer de dépister le plus précocement le cancer colorectal. Cependant malgré une
bonne connaissance de la séquence adénocarcinomale, chaque année en France, ce type de
cancer fait en moyenne 16 000 décès et reste la deuxième cause de mortalité par cancer
dans les pays développés. C’est la grande capacité de ce cancer à métastaser qui le rend
fatal.
Ainsi, la compréhension des évènements impliqués lors du processus métastasique
est essentielle pour la lutte contre cette maladie. Le microenvironnement de la tumeur joue
un rôle essentiel dans ce processus. La première théorie sur l’intérêt de la recherche sur le
microenvironnement tumoral a été formulée en 1889 par Stephen Paget, un chirurgien
Anglais, lorsqu’il émit la théorie du « seed and soil » (« la graine et le sol »). Cette théorie est
née de l’observation que chaque type de cancer possède son site de métastase privilégié. Il
établit qu’il doit y avoir une adéquation entre la tumeur (seed) et le tissu (soil) qui doit
recevoir la métastase (Paget 1889). Ce concept est resté en l’état pendant des dizaines
d’années, la recherche en oncologie s’intéressant principalement durant cette période à
l’étude des cellules tumorales épithéliales. L’idée générale était que les cellules épithéliales
tumorales et leurs modifications associées étaient suffisantes pour initier la carcinogénèse
et induire la progression tumorale. Plus récemment, un nombre croissant d’études a appuyé
le concept de la graine et du sol montrant une interaction constante entre la tumeur et son
environnement direct, le microenvironnement tumoral. En effet, la tumeur est entourée
d’un microenvironnement complexe incluant la matrice extracellulaire (MEC), le réseau
vasculaire et le stroma. Le stroma est le tissu conjonctif dont les fonctions principales vis-àvis de l’épithélium sont mécaniques (soutien à l’épithélium) et métabolique (nutrition et
échanges). Une tumeur se développe au sein d’un microenvironnement qui lui est associé
qui est dit stroma tumoral. Le stroma tumoral présente des caractéristiques pathologiques
distinctes. Des phénomènes de synthèse, dégradation ou remaniement interviennent en
permanence et, sous l’influence des cellules cancéreuses, des échanges de signaux régulent
la prolifération, la survie, ou encore l’invasion et la migration cellulaire, et donc le processus
métastatique. On dit de ce stroma qu’il est « activé » par la tumeur.
Ce stroma renferme divers types cellulaires non tumoraux qui sont regroupés au sein
de la matrice extracellulaire. Ces cellules, qui sont dites ‘associées’ à la tumeur, interagissent
avec cette dernière et participent à son évolution. Au sein de ce stroma sont retrouvées les
cellules souches mésenchymateuses (MSC), les cellules endothéliales, les cellules nerveuses,
les cellules immunitaires et majoritairement les fibroblastes.
Dans ce chapitre, les différents types cellulaires et les structures qui composent le
stroma tumoral seront abordés et seront décrits en condition physiologique ainsi qu‘en
condition tumorale. Un prochain chapitre sera ensuite entièrement dédié aux fibroblastes
31
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
associés au cancer (CAF) auxquels je me suis particulièrement intéressé au cours de ma thèse
(page 55).
I. LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES (MSC) :
a) EN CONDITION PHYSIOLOGIQUE :
Les MSC ont été initialement isolées à partir du stroma de la moelle osseuse au cours
des années 1980 et furent appelées Fibroblast Colony Forming Unit (CFU-F). Cette première
dénomination a été donnée suite à l’observation de ces cellules in vitro. En effet, elles ont
pour caractéristiques une apparence fibroblastique (architecture étoilée et noyau
proéminent), une capacité d’adhésion rapide en culture, et celle de former des colonies à
partir d’une seule cellule (Friedenstein 1980). Ces cellules furent par la suite appelée MSC
suite à l’observation de leurs caractères multipotents (Caplan 1991). Bien que la moelle
osseuse soit la principale source de MSC dans le corps, les MSC ont depuis été isolées dans
de très nombreux organes périphériques tels que le tissu adipeux, le système digestif, le
cartilage, les muscles et le système vasculaire (Tuli, Seghatoleslami et al. 2003).
La capacité de prolifération des MSC est une des caractéristiques ayant permis de les
isoler. Cependant, leur capacité d’auto-renouvellement reste un sujet largement débattu. En
effet, elle est difficilement quantifiable et semble influencée par la méthode d’isolation et
l’origine des MSC (Baksh, Song et al. 2004). Il semblerait néanmoins que ces dernières
puissent proliférer jusqu’à 40 générations environ (Pittenger, Mackay et al. 1999).
Un autre critère de sélection des MSC fut leur multipotence. Ce sont des cellules
progénitrices issues originellement du tissu mésodermique embryonnaire. Elles peuvent
donc générer les types cellulaires issus de ce mésoderme que sont : les os, le cartilage, le
muscle lisse, les ligaments, le tissu adipeux et les cellules stromales (Pittenger, Mackay et al.
1999). Les MSC issues d’un organisme adulte ont elles aussi la capacité de générer de
nombreux types cellulaires comme des cardiomyocytes (Orlic, Kajstura et al. 2001), des
fibroblastes, des myofibroblastes (Dicker, Le Blanc et al. 2005), des péricytes (Direkze, Forbes
et al. 2003), différentes cellules neuronales (Long, Olszewski et al. 2005) mais aussi des
cellules épithéliales comme des hépatocytes et des cellules pancréatiques (Chen, Jiang et al.
2004).
L’émergence des études sur les MSC a mis en exergue la nécessité de les isoler
facilement notamment par l’expression de marqueurs de surface. Les premières
caractérisations ont permis de constater que ces cellules expriment des marqueurs
communs avec les cellules matures des lignées hématopoïétiques : ICAM-1 (CD54), ICAM-2
(CD102), VCAM-1 (CD106), CD72, LFA-3 (CD58), ALCAM (CD166) (118). Cependant, des
marqueurs diffèrent entre ces deux populations cellulaires : CD3, CD4, CD11a, CD34 et CD45
ne sont pas présents à la surface des MSC (Majumdar, Keane-Moore et al. 2003) (Pittenger
32
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
and Martin 2004). Le tableau ci-dessous représente les différents marqueurs présents ou
absents de la surface des MSC humaines :
Marqueurs présents à la surface des MSC
Marqueurs absents de la surface des MSC
CD13, CD29, CD44, CD49a,b,c,e,f, CD51,
CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD102,
CD105, CD106, CDw119, CD120a, CD120b,
CD123, CD124, CD126, CD127, CD140a,
CD166, P75, TGFßIR, TGFßIIR, HLA-A,B,C,
SSEA-3, SSEA-4, D7.
CD3, CD4, CD6, CD9, CD10, CD11a, CD14,
CD15, CD18, CD21, CD25, CD31, CD34,
CD36, CD38, CD45, CD49d, CD50,
CD62E,L,S, CD80, CD86, CD95, CD117,
CD133, SSEA-1.
TABLEAU 4 : Marqueurs des MSC humaines
(d’après Pittenger and Martin 2004)
Grâce de leurs fonctions de progéniteurs, les MSC sont décrites comme ayant de
nombreux autres rôles au sein des tissus normaux. Les MSC sont à ce jour considérées
comme les cellules progénitrices majeures des fibroblastes dans le stroma normal (Bianco,
Robey et al. 2008). Elles sont la principale source de collagène I de la matrice extracellulaire
démontrant l’importance de ces cellules dans les processus de cicatrisation et de fibrose
(Wynn 2008).
Les MSC produisent aussi de nombreux facteurs affectant les cellules environnantes.
Une étude a permis de voir que les MSC produisent plusieurs cytokines dont des
interleukines telles que : IL6, IL7, IL8, IL11, IL12, IL14, IL15 ainsi que le Monocyte-Colony
Stimulationg Factor (M-CSF), le Leukemia Inhibitory Factor (LIF), le Flt-3 Ligand (Fms-like
Tyrosine kinase 3), le stem cell factor (SCF) et le Granulocyte-Colony Stimulating Factor (GCSF) (Kim, Yoo et al. 2005). Les facteurs IL6, IL8, IL11 et IL12 ont un effet pro-inflammatoire,
phénomène très important dans les cancers.
Les MSC ont également des effets immunomodulateurs. Il a été démontré que les
MSC induisaient une baisse de la prolifération des lymphocytes T (LT). Cette modulation
serait liée à l’expression de facteurs solubles, notamment le TGFβ1 et l’hepatocyte growth
factor (HGF) par les MSC (Di Nicola, Carlo-Stella et al. 2002). Une autre étude a montré qu’en
présence de MSC, les LT montraient une sécrétion de l’interféron-γ et un niveau de cycline
D2 réduit, bloquant ces cellules en phase G1 (Cines, Pollak et al. 1998).
33
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
b) EN CONDITION TUMORALE :
Le rôle des MSC dans la croissance tumorale est encore débattu à ce jour. Des études
montrant aussi bien un rôle stimulateur qu’un rôle inhibiteur des MSC sur la croissance
tumorale ont été publiées. Par exemple, une étude montre un effet pro-prolifératif lors de
la coinjection de MSC avec des cellules tumorales coliques sur des greffes sous-cutanées.
Dans cette étude les MSC sont décrites comme stimulant la croissance tumorale,
l’angiogenèse et l’apparition de métastases (Zhu, Xu et al. 2006). Ces observations ont été
confirmées par des études in vitro où la coculture de MSC avec des cellules cancéreuses du
sein ont modifié les capacités de prolifération de ces cellules tumorales (Fierro, Sierralta et
al. 2004). Dans ce modèle, ces effets sont dus à la sécrétion de VEGF et d’interleukine 6. Une
autre étude a pu montrer une inhibition de la croissance tumorale en présence de MSC.
Cette inhibition est induite par le facteur DKK-1 produit par les MSCs (Zhu, Sun et al. 2009).
Les effets variables des MSC sur la croissance tumorale sont illustrés par une étude
montrant que le nombre de MSC injectées lors de greffe est déterminant pour la réponse de
celle-ci vis-à-vis de la croissance tumorale. En effet, il a été montré un effet pro-prolifératif
de l’injection de 105 MSC sur une quantité de cellules épithéliales données alors que sur les
mêmes cellules épithéliales, la coinjection de 102 MSC n’avait aucun effet (Djouad, Bony et
al. 2006).
De la même manière, l’influence des MSC sur les capacités métastatiques des
tumeurs est là encore largement contestée. Ainsi, il a été décrit que la coinjection de MSC
pouvait induire une augmentation (Karnoub, Dash et al. 2007) ou une diminution (Maestroni,
Hertens et al. 1999) de l’apparition de métastases.
c) LES MSCS DANS LE CANCER COLORECTAL :
Dans le cancer colorectal, une étude a montré que la co-injection de MSC d’origine
murine avec des cellules tumorales murines induisait une augmentation de la croissance
tumorale dans un modèle de souris BALB/c. Il a été aussi démontré que ces MSCs pouvaient
augmenter l’angiogenèse quand elles ont été stimulées avec de l’inferféron-γ et du TNFα,
ces cellules produisant du VEGF en réponse à cette stimulation (Liu, Han et al.).
Une autre étude montre que la coinjection de MSC avec des cellules tumorales
humaines, dans un modèle de xénogreffes orthotopiques, induit des tumeurs plus grosses.
Ces souris ont une survie inférieure et seul le groupe où des cellules tumorales et des MSC
ont été coinjectées présente des métastases hépatiques (Shinagawa, Kitadai et al.). De façon
intéressante, ces MSCs expriment les marqueurs d’activation fibroblastiques que sont αSMA
et PDGFRβ. Les MSC qui expriment ces marqueurs stimulent la migration et l’invasion des
cellules tumorales (Shinagawa, Kitadai et al.). Ce même groupe de recherche a montré
récemment que la différenciation des MSC en CAFs était dépendante du PDGF, que le
34
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
blocage de la voie du PDGF induisait une diminution des tumeurs et perturbait l’interaction
entre les MSC et les cellules tumorales (Shinagawa, Kitadai et al.).
II. LES CELLULES ENDOTHELIALES :
a) EN CONDITION PHYSIOLOGIQUE :
Les cellules endothéliales font partie intégrante du système sanguin et forme la paroi
interne des vaisseaux (endothélium), ces cellules font parties de l’intima (figure 25).
L’endothélium est une monocouche cellulaire en contact direct avec la circulation
sanguine. Historiquement il était simplement considéré comme une paroi inerte permettant
la séparation entre le sang et le reste de l’organisme. Les connaissances actuelles ont permis
de déterminer que ce tissu intervient en réalité dans de nombreux processus physiologiques
(Cines, Pollak et al. 1998).
FIGURE 25 : Structure des artères
et veines
Le premier rôle de l’endothélium est le maintien de l’hémostase, en modulant la
réponse aux dommages résultant de l’écoulement sanguin (Michiels 2003). La seconde
fonction de ce tissu est l’apport d’oxygène et de nutriments aux organes mais aussi de
faciliter l’élimination des déchets de ces organes. Les cellules endothéliales induisent le
recrutement des cellules immunitaires permettant la défense de l’organisme (Michiels
2003). Ce tissu est aussi impliqué dans la formation de nouveaux vaisseaux par le
phénomène d’angiogénèse. Enfin, il régule le tonus et du flux sanguin via la sécrétion de
facteurs tel que l’endothéline ou le monoxyde d’azote (NO) agissant sur les couches
musculaires adjacentes et régulant leur contraction ou leur relaxation (Michiels 2003).
La perméabilité vasculaire est assurée par des molécules d’adhésion cellulaire. Cette
adhésion est assurée par des facteurs tels que la cadhérine vasculaire endothéliale (VE35
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
Cadhérine), les Platelet-endothelial cell adhesion molecules (PECAMs) mais aussi via la
fixation de l’Angiopoïetine-1 (Ang1) sur son récepteur tyrosine kinase (Tie-2) (Carmeliet and
Jain).
Les péricytes sont localisés sur l’extérieur de la membrane basale. Ces cellules sont
des cellules mesenchymales exprimant αSMA. Leur principale fonction physiologique est
d’assurer la formation et la stabilité des néo-vaisseaux. Ces cellules vont produire l’Ang1 qui
va agir comme un facteur chimiotactique pour les cellules endothéliales puis Ang1 va lier son
récepteur Tie-2 présent à la surface des cellules endothéliales et va ainsi permettre la
stabilisation du néovaisseau (Witzenbichler 1998).
En condition physiologique, la stimulation par un facteur angiogénique provoque une
déstabilisation de ces interactions induisant la dilatation vasculaire. Puis, la fixation de
l’Angiopoïetine-2 sur le récepteur Tie-2 va déplacer l’Angiopoïetine-1 déstabilisant le contact
cellule-cellule de l’endothélium (Maisonpierre, Suri et al. 1997). Suite à ce signal
angiogénique, les cellules endothéliales vont sécréter des protéases comme l’activateur du
plasminogène uPA (Urokinase type Plasminogen Activator) et des métalloprotéases
matricielles (MMP) afin de dégrader la membrane basale et la matrice extracellulaire. Cette
dégradation va permettre la migration des cellules endothéliales et va libérer les facteurs
pro-angiogéniques contenus dans la matrice extracellulaire qui sont nécessaires à la suite du
processus angiogénique (Carmeliet and Jain). La dernière étape sera la migration des cellules
endothéliales et leurs proliférations permettant l’extension du néo-vaisseau. Pour cette
étape, des cellules endothéliales vont se spécialiser, les « tip cells » vont guider le
prolongement en répondant au gradient de concentration des facteurs angiogéniques. Les
cellules basales (stack cell), situées à la base du prolongement, vont proliférer afin de
permettre l’initiation puis l’extension du néo-vaisseau (Gerhardt, Golding et al. 2003). Ce
phénomène est nommé « angiogenèse par bourgeonnement » et constitue le principal
mécanisme d’angiogenèse en condition physiologique (Figure 26).
b) EN CONDITION TUMORALE :
L’angiogenèse tumorale est un phénomène essentiel à la croissance tumorale. En
effet, la croissance tumorale avasculaire est limitée à une taille de 1 à 2 mm3, dans ces
conditions l’apport en oxygène et en nutriment peut se faire par diffusion simple (Folkman,
Merler et al. 1971), mais au-delà de ce volume les cellules tumorales situées au centre de la
tumeur vont être en hypoxie et en condition de stress métabolique. Pour pallier à ce
phénomène, la tumeur va produire, sous l’impulsion du facteur de transcription en réponse
à l’hypoxie HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor 1α), des facteurs pro-angiogéniques (Folkman,
Merler et al. 1971). Ces facteurs vont induire l’angiogénèse tumorale qui va ainsi permettre
à la tumeur de poursuivre son développement.
36
Introduction bibliographique
-
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
Vascularisation tumorale :
Le mécanisme principal mis en jeu lors de la vascularisation tumorale est
l’angiogenèse par bourgeonnement (Figure 26 A) (décrit précédemment). Ce type
d’angiogenèse même s’il est le plus courant n’est pas le seul.
La vasculogenèse : résulte du recrutement par les cellules tumorales de cellules
progénitrices endothéliales issues de la moëlle osseuse. Ces cellules circulantes chez l’adulte
vont être incorporées dans les vaisseaux tumoraux de la même manière que lors de la
vasculogénèse embryonnaire (Figure 26 B) (Duda, Cohen et al. 2006). Ce phénomène est
cependant marginal étant donné le faible nombre de ces cellules progénitrices chez l’adulte
(Asahara, Murohara et al. 1997).
L’angiogénèse par intussusception : est le fait qu’un vaisseau tumoral est capable de
se scinder en deux vaisseaux sanguins (figure 26 C). Ce phénomène n’est possible qu’en
présence d’un vaisseau « primaire » mais permet l’augmentation de la densité et de la
complexité du réseau vasculaire tumoral (Carmeliet and Jain).
La cooptation vasculaire : est l’utilisation de vaisseaux sanguins existants par les
cellules tumorales. En effet, celles-ci vont proliférer à proximité de ce vaisseau et de ce fait
vont exercer une pression physique sur l’organe normal adjacent à ce vaisseau. Cette
pression va ainsi entrainer le recul de l’organe. Le vaisseau ainsi isolé sera incorporé au sein
de la tumeur (figure 26 D). Ce type de vascularisation tumorale est principalement rencontré
au cours des premières phases de développement tumoral (Holash, Maisonpierre et al.
1999).
L’imitation vasculaire : est le phénomène où les cellules épithéliales tumorales
acquièrent des propriétés de cellules endothéliales (Maniotis, Folberg et al. 1999). Celles-ci
vont exprimer des protéines associées aux phénotypes mésenchymateux et vont s’intégrer
aux vaisseaux sanguins afin de les allonger (figure 26 E) (Hendrix, Seftor et al. 2003).
La différenciation des cellules souches tumorales en cellules endothéliales : a été
observée en premier lieu dans le glioblastome (Wang, Lehuede et al.) montrant la possibilité
de différenciation des cellules souches cancéreuses en cellules endothéliales (figure 26 F).
37
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
FIGURE 26 : Les types de vascularisation tumorale (d’après Carmeliet, 2011)
-
Morphologie des vaisseaux tumoraux :
La structure des vaisseaux tumoraux diffère fortement des vaisseaux normaux. Alors
que les vaisseaux sanguins normaux ont une architecture organisée et fonctionnelle
(Carmeliet and Jain 2000) les vaisseaux sanguins tumoraux ont une architecture
désorganisée, sinueuse avec de nombreuses ramifications et des fuites hémorragiques (Jain
2005). Ces vaisseaux sont principalement formés par une couche de cellules endothéliales
défectueuse et non homogène. Ces cellules sont parfois superposées et ont des jonctions
lâches à l’origine des fuites hémorragiques. De plus, elles n’ont généralement pas de cellules
murales de soutien (Tong, Boucher et al. 2004) et sont recouvertes de quelques péricytes
anormaux (Morikawa, Baluk et al. 2002).
L’ensemble de ces anomalies aboutit à une perfusion sanguine chaotique de la
tumeur et conduit à un maintien de l’hypoxie de certaines zones tumorales qui va donc
38
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
continuer à sécréter des facteurs angiogéniques induisant un remaniement perpétuel de la
vascularisation tumorale (Hashizume, Baluk et al. 2000).
-
Acteurs cellulaires de l’angiogénèse tumorale :
La membrane basale se situe entre les cellules endothéliales et les péricytes et sert
de support à ces cellules. Outre ces fonctions structurelles, elle sert aussi de substrat pour la
migration des cellules endothéliales, et son clivage va permettre la libération de facteurs
pro-angiogéniques tels que le VEGF A.
Les péricytes sont recrutées par les cellules endothéliales lors de la maturation des
vaisseaux sanguins. En condition tumorale, ces cellules murales sont capables de renforcer
le signal angiogénique en sécrétant du VEGF A par exemple et ainsi stimuler la croissance
des cellules endothéliales (Reinmuth, Liu et al. 2001). Les péricytes ont aussi été décrits
comme pouvant restreindre le signal angiogénique (Hellstrom, Gerhardt et al. 2001).
Les cellules endothéliales ont un rôle évident dans le processus angiogénique.
Cependant, une étude a montré que ces cellules pouvaient également moduler la formation
de métastases via l’expression d’un récepteur membranaire aux chemokines Duffy Antigen
Receptor for Chemokine (DARC) (Bandyopadhyay, Zhan et al. 2006).
Le tableau suivant mentionne les facteurs pro-angiogéniques produits par les autres
cellules du microenvironnement :
Type cellulaire
Cancer associated fibroblasts
(CAFs)
Cellules dendritiques
Macrophages
Mastocytes
Facteurs proangiogéniques
VEGFs
MMPs
IL8
FGF2
TNFα
TGFβ
GM-CSF
VEGFs
TNFα
FGF 2
MMP2 / 7 / 9 / 12
VEGFs
FGF-2
IL-8
TGFβ
39
Référence
(Kalluri and Zeisberg 2006)
(Sato, Maehara et al. 2004)
(Su, Sung et al.)
(Sozzani, Rusnati et al. 2007)
(Lamagna, Aurrand-Lions et al.
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(Lewis and Pollard
2006)
(Crivellato, Nico et al. 2008)
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
c) MODULATION DU VEGF DANS LE CANCER COLORECTAL :
Dans le cancer colorectal, le VEGF A est le facteur le plus décrit dans l’angiogenèse
tumorale. L’expression de cette protéine et de son récepteur est corrélée avec le degré de
vascularisation des tumeurs (Takahashi, Kitadai et al. 1995) (Warren, Yuan et al. 1995). Son
expression a été décrite comme un marqueur pronostic du cancer colorectal métastatique
(Weidner 1995). L’expression du VEGF a été observée dans la muqueuse colique normale,
dans les cellules tumorales, dans les métastases coliques et dans les lignées cellulaires (Ellis,
Takahashi et al. 2000). Néanmoins, l’expression de ce facteur est corrélée avec l’apparition
de métastases à 5 ans (Ellis, Takahashi et al. 2000). De plus, le taux de VEGF est un marqueur
de la progression tumorale colorectal et de la présence de métastases (Tokunaga, Oshika et
al. 1998) (Kumar, Heer et al. 1998).
Un anticorps bloquant anti-VEGF, le bevacizumab a été développé et est utilisé dans
le cadre des CRC métastasés. Cet anticorps augmente la survie des patients lorsqu’il est
associé au fluorouracile (Kabbinavar 2005) (Kabbinavar, Hurwitz et al. 2008).
III. LES CELLULES NERVEUSES :
Au niveau digestif, le rôle principal des
cellules nerveuses est d’assurer la régulation de
la motricité du système digestif. Ces cellules sont
divisées en trois entités : le système nerveux
entérique ou intrinsèque (SNE), le système
nerveux extrinsèque sympathique et le système
nerveux extrinsèque parasympatique.
FIGURE 26 : Le système nerveux entérique
(GERSHON Michael D « The second brain »)
La majorité des fonctions du système digestif est assurée par le système nerveux
entérique (SNE), il est décrit comme « un petit cerveau » qui coordonne l’activité gastrointestinale (Yokoyama and North 1983). Ce système nerveux est formé de plexus.
Le plexus myentérique (ou d’Auerbach) est le plus volumineux, situé entre les
couches musculaires longitudinales et circulaires, il est responsable du contrôle moteur de
l’appareil digestif. Le plexus sous-muqueux (ou de Meissner) est quant à lui impliqué dans la
régulation des sécrétions gastro-intestinales et le débit sanguin local (Timmermans,
Scheuermann et al. 1992). Le couplage entre le système nerveux intrinsèque et les fibres
lisses est assuré par les cellules de Cajal. Ces cellules, d’origine mésenchymateuses, doivent
assurer la fonction de « pacemaker » et l’automatisme du tube digestif. Pour cela, elles
jouent sur la dépolarisation des cellules musculaires lisses en ouvrant leurs canaux calciques
voltage-dépendant. Ce phénomène est à l’origine des ondes lentes de l’intestin en
40
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
déterminant le rythme électrique de base qui est variable en fonction des différents
segments du tube digestif (Brookes, Dinning et al. 2009).
Le système nerveux parasympatique (PS) a un rôle prédominant sur l’estomac et sur
la partie proximale de l’intestin. Ce système régule la relaxation de l’estomac lors de prises
alimentaires et permet la diminution des contractions de l’estomac. Ce système est aussi
relié au plexus entérique et peut déclencher la motilité intestinale (Macrae, Furness et al.
1986).
Le système nerveux sympathique (S) est inhibiteur et est impliqué dans de nombreux
reflexes d’inhibitions digestives. Les fibres sympathiques ont aussi un rôle inhibiteur en
position présynaptique des fibres parasympathiques (Olsson, Costa et al. 2004).
IV.LA CRYPTE INTESTINALE ET LE SYSTEME IMMUNITAIRE :
a) EN CONDITION PHYSIOLOGIQUE :
L’épithélium intestinal représente la plus grande surface exposée à des substances
environnementales (Lotz, Menard et al. 2007). La particularité du tube digestif est que cette
surface très importante est exposée à une diversité et une densité bactérienne immense. Il
y a dans le tube digestif entre 500 et 1000 espèces bactériennes différentes avec une densité
allant de 100 organismes/mL de contenu dans l’estomac à 1000 organismes/mL dans le
colon. De plus, les relations entre l’organisme humain et les micro-organismes sont de nature
symbiotique (Wells, Loonen et al.). Cela met en exergue la nécessité de trouver un équilibre
entre la défense contre les infections et la survie du microbiote intestinal. Cette partie a pour
objectif de dresser un aperçu rapide des types cellulaires responsable de l’immunité
digestive et des stratégies mises en place pour le maintien de l’équilibre entre défense de
l’organisme et survie du microbiote.
FIGURE 27 : Coupe d’une crypte intestinale
(Lotz, Menard et al. 2007)
Les entérocytes constituent la
première
barrière
de
l’organisme.
L’architecture de ces cellules (microvillosités)
et les jonctions serrées qu’elles créent avec
les cellules adjacentes constituent une
première barrière physique entre les
bactéries et l’organisme. De plus, ces
entérocytes
sécrètent
de
manière
systémique des protéines antibactériennes
destinées à empêcher la prolifération de ces
organismes à proximité des entérocytes
(Lotz, Menard et al. 2007).
41
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
Les cellules souches, localisées au fond des cryptes intestinales, assurent le
renouvellement permanent de l’épithélium. Ces cellules étant très sensibles à la présence
de bactéries, les cellules de Paneth situées à proximité des cellules souches vont produire
des substances antimicrobiennes afin de protéger les cellules souches (Duerkop, Vaishnava
et al. 2009). Les cellules de Paneth ne sont présentes qu’au niveau de l’intestin grêle et
absentes du colon. Ceci explique la différence de densité bactérienne entre ces deux organes
(Lotz, Menard et al. 2007).
Les cellules caliciformes sont les cellules responsables de la sécrétion de mucus. Ce
mucus va aussi servir à la protection de l’organisme et à la modulation des interactions avec
le microbiote intestinal. La couche de mucus est constituée de deux compartiments distincts.
La couche externe sera colonisée par les bactéries mais la couche interne par sa viscosité va
retenir les peptides antibactériens produits par les entérocytes et les cellules de Paneth
(Duerkop, Vaishnava et al. 2009).
Les plaques de Peyer représentent la première réponse immunitaire et permettent
la présentation des antigènes. Dans ces plaques se trouvent des cellules M, ces cellules
possèdent une activité d’endocytose. Les cellules M vont donc se lier à l’antigène et le
transmettre aux cellules dendritiques présentes et interagir avec les lymphocytes T (LT) naïfs
présents dans les plaques de Peyer (Coombes and Maloy 2007). Les cellules présentatrices
d’antigènes vont aussi migrer dans les ganglions mésentériques lymphoïdes où ces cellules
vont pouvoir activer les cellules T et B naïves et induire la réponse immunitaire adaptative.
Les réponses immunitaires innées et adaptatives sont très différentes. La réponse
innée permettra une réponse rapide et aspécifique alors que la réponse adaptative est plus
lente mais plus ciblée.
-
La réponse immunitaire innée :
Des micro-organismes plus résistants aux peptides antimicrobiens peuvent atteindre
les cellules épithéliales constituant la paroi intestinale (Medzhitov 2007). Dans ce cas, des
molécules appelées PAMP (Pathogen Associated Molecular Patterns) communes à ces
micro-organismes vont être reconnues par des récepteurs PRR (Pattern Recognition
Receptors) qui vont faire la différence entre le soi et le non-soi. Ils pourront ainsi contrôler
la différenciation des cellules présentatrices d’antigènes et vont permettre d’adapter la
réponse immunitaire.
La stimulation des PRR va activer des facteurs de transcription dont NfkB, CREB et
STAT, qui vont permettre l’expression de gènes codant pour des chemokines et cytokines
pro et/ou anti-inflammatoires. La spécificité de la réponse immunitaire sera dépendante du
type de PRR activé (Wells, Loonen et al.). L’une des conséquences de l’activation de NfkB et
des chemokines est de provoquer la libération de défensines antibactériennes et l’attraction
des phagocytes.
42
Introduction bibliographique
-
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
La réponse immunitaire adaptative :
Les
cellules
présentatrices
d’antigènes (CPA) vont reconnaitre les
micro-organismes de façon spécifique et
vont les présenter aux lymphocytes
allant mettre en place la réponse
immunitaire
adaptée
(Duerkop,
Vaishnava et al. 2009). Ces cellules sont
des monocytes, des lymphocytes B ou
des cellules dendritiques.
La fonction de ces cellules va être
régulée en fonction de l’homéostasie
intestinale. Par exemple, à l’état
stationnaire,
l’expression
de
l’interleukine 12 produite par ces cellules
FIGURE 28 : Réponse immunitaire adaptative
est régulée négativement si le micro(Sanz and De Palma 2009)
organisme reconnu est considéré comme
bénéfique à l’organisme. Ce phénomène est important pour éviter la mise en place
d’inflammation chronique en réponse aux bactéries présentes physiologiquement dans le
système digestif (Sansonetti 2004).
Il existe deux types de lymphocytes B (LB mémoire et plasmocyte). Ils ont la capacité
de produire des récepteurs spécifiques à un antigène particulier. Suite à la reconnaissance
de l’antigène, les LB se différencient en plasmocytes et vont sécréter des anticorps. Les LB
sont responsables de la production de 70 à 90% des immunoglobulines de type A (IgA). Ces
cellules sont localisées au niveau des ganglions mésentériques et dans les plaques de Peyer.
Les lymphocytes T (LT) vont avoir de nombreux rôles en fonction de leurs types. Les
LT CD8+ exercent une activité cytotoxique envers les pathogènes. Les LT CD4+ sont divisés
en plusieurs classes. Les lymphocytes Th1 vont produire l’interféron-γ et l’IL2 (Duerkop,
Vaishnava et al. 2009) et sont impliqués dans les réactions inflammatoires et dans
l’élimination des pathogènes intracellulaires (Sanz and De Palma 2009). Les lymphocytes Th2
vont participer à la différenciation des LB en plasmocytes (Rescigno and Di Sabatino 2009).
Les lymphocytes Th17 produisent de l’IL17, des facteurs de croissance et des chemokines.
Ces LT vont permettre le recrutement des neutrophiles et d’augmenter l’inflammation
(Rescigno and Di Sabatino 2009). Les LT régulateurs vont empêcher l’activation des LT naïfs
empêchant l’induction de réponses immunitaires inappropriées (Barnes and Powrie 2009).
43
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
b) EN CONDITION TUMORALE :
Ce chapitre n’a pas vocation à traiter l’ensemble des processus immunitaires en
réponse au cancer mais cherchera plutôt à décrire les phénomènes d’échappement au
système immunitaire mis en place par la tumeur colorectal au cours de la carcinogénèse ainsi
que de dresser un aperçu des interactions entre les cellules de l’immunité et les autres types
cellulaires présents au sein du stroma tumoral colique notamment.
-
Le concept d’ « immunoediting » :
Ce concept repose sur le rapport de force qu’il existe entre la tumeur et le système
immunitaire au cours de la carcinogénèse. Il comprend trois phases : l’élimination, l’équilibre
et l’échappement.
L’élimination est la première phase durant laquelle la tumeur est reconnue par le
système immunitaire et va être combattue par celui-ci. A l’issue de cette phase, la tumeur
peut soit être éliminée, soit entré dans une phase d’équilibre entre le renouvellement
tumoral et l’élimination immunitaire.
L’équilibre correspond à une période durant laquelle le système immunitaire exerce
une forte pression de sélection sur les cellules tumorales qui résistent à cette pression de
par leurs capacités prolifératives et leurs instabilités génétiques. L’un des exemples les plus
concrets de cette phase d’équilibre est le cas d’une personne atteinte d’un mélanome invasif
qui fut opérée et en rémission pendant 15 ans de ce cancer. Les deux reins de cette personne
ont été prélevés suite à son décès et greffés chez une autre personne. Cette personne
développa deux tumeurs aux deux reins greffés extrêmement rapidement après la greffe car
deux tumeurs secondaires en phase d’équilibre se trouvaient dans les reins greffés et en
raison des traitements immunosuppresseurs, ces tumeurs ont pu se développer (MacKie,
Reid et al. 2003). On peut donc dire qu’une sélection s’opère lors de la phase d’équilibre
entre plusieurs variants tumoraux qui sont éliminés ou qui possèdent un avantage sélectif
leur permettant de mieux résister au système immunitaire. Ce mécanisme va donc
sélectionner les tumeurs avec une immunogénicité faible qui va donc induire une réponse
immunitaire présente mais atténuée et donc tolérée.
Dans cette partie correspondant à la phase d’échappement au système immunitaire,
je traiterais en particulier du mécanisme principal d’échappement du cancer colorectal.
44
Introduction bibliographique
-
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
Rôle des lymphocytes T dans l’échappement au système immunitaire colique :
L’une des étapes clés dans l’échappement au
contrôle immunitaire est la régulation des
populations de LT CD8+ (cytotoxiques). En effet, une
étude sur 131 patients montre un effet positif de
cette population cellulaire par rapport à la survie des
patients (Naito, Saito et al. 1998). De plus, une étude
plus récente sur 959 patients montre que l’activation
de ces lymphocytes induit une diminution des
métastases (Pages, Berger et al. 2005).
L’apparition et la prolifération d’une classe de
lymphocytes T régulateurs (CD4+) va permettre un
échappement à la réponse immunitaire des LT CD8+
FIGURE 29 : Rôle des différents
(Waldner, Schimanski et al. 2006). Il s’agit de la
lymphocytes T dans le cancer colorectal
(Waldner, Schimanski et al. 2006)
population de LT CD4+ CD25+ qui est décrite comme
abondante dans le stroma tumoral et participant à ce mécanisme (Yu and Fu 2006) (Pardoll
and Topalian 1998). Ces lymphocytes sont activés par le TGFβ produit par les LT CD4+ qui va
permettre leur prolifération via l’induction du facteur de transcription FOXP3, ces LT
régulateurs vont ainsi pouvoir inhiber les LT CD4+ effecteurs et les LT CD8+ (figure 29). De
plus ces LT CD4+ / CD25+ vont provoquer la diminution de sécrétion d’IL6 produite par les
LT CD4+ (effecteurs) conduisant à l’expression de FOXP3 dans ces lymphocytes (Becker,
Fantini et al. 2006). Cela permettra une réponse immunitaire plus faible de l’ensemble des
lymphocytes T.
-
Les macrophages associés aux cancers (TAM : Tumour Associated Macrophage) :
Les TAM représentent une part importante des cellules immunitaires du
microenvironnement tumoral (Pollard 2004). Ces macrophages dérivent de monocytes
circulant, issus de la moelle osseuse, qui sont recrutés à proximité de la tumeur. Les tumeurs
vont sécréter des facteurs permettant le recrutement et l’accumulation des TAM sur le site
de la tumeur (Bottazzi, Polentarutti et al. 1983). Les facteurs principaux qui vont permettre
le recrutement des TAMs sont :
- La chemokine CCL2/MCP1 (monocyte chemoattractant protein 1) est une
chemokine exprimée dans de nombreux cancers (ovaires, sein et gliomes) (Pollard 2004).
Cette protéine induit le recrutement des TAM. En effet, dans le cancer du sein la production
de CCL2 est associée à la densité de TAM au sein de la tumeur. De plus, il a été décrit que
dans des souris KO CCL2 le recrutement des macrophages est inhibé (Ueno, Toi et al. 2000).
- Le facteur de croissance M-CSF/CSF-1 (Colony Stimulation Factor) est un facteur très
important pour la survie, la prolifération et la différenciation des macrophages. Il a été décrit
45
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
que les TAM s’accumulent préférentiellement dans les zones hypoxiques (Onita, Ji et al.
2002) et nécrotiques (Leek, Landers et al. 1999).
- Le VEGF produit en abondance dans ces zones est également un facteur
chemoattractant puissant de ces macrophages (Barleon, Sozzani et al. 1996).
Les rôles des TAM dans la progression tumorale sont multiples. Les TAM ont un rôle
important dans l’angiogenèse. Ces cellules ont été décrites comme produisant de nombreux
facteurs proangiogéniques comme CXCL8/IL8, VEGF, FGF2 et PDGF-B (Lamagna, AurrandLions et al. 2006). Ces facteurs préférentiellement dans les zones hypoxiques vont
permettent le développement vasculaire et ainsi la progression tumorale. Ainsi un niveau
élevé de TAM dans la tumeur est corrélé à une augmentation de l’angiogénèse (Pollard
2004).
Le second rôle de ces cellules dans la carcinogénèse est de permettre une inhibition
de la réponse immunitaire contre la tumeur. En effet, les TAM ont été montrés comme
produisant de l’IL10, du TGFβ et la PGE2 (prostaglandine E2), ces facteurs vont participer à
l’établissement d’un microenvironnement immunosuppresseur qui va se révéler néfaste
pour l’activité des LT CD8+ (Sica, Saccani et al. 2000) (Baxevanis, Reclos et al. 1993).
V. LES FIBROBLASTES / MYOFIBROBLASTES :
FIGURE 30 : Fibroblastes humains en
immunofluorescence (Source :
www.olympusmicro.com)
Les fibroblastes sont des cellules
mésenchymateuses
qui
constituent
la
composante cellulaire de base du tissu conjonctif
et contribuent au maintien de son intégrité. Les
fibroblastes ont été décrits comme des cellules
étoilées dotées de longs prolongements
(Takahashi-Iwanaga 1991). Ils possèdent un
réticulum endoplasmique granuleux et un
appareil de Golgi développé caractéristiques des
cellules à haute activité synthétique (Sappino,
Schurch et al. 1990).
Les fibroblastes ont pour origine embryonnaire le mésoderme qui constitue l’origine
de tout tissus mésenchymateux (Xouri and Christian). Ils ont un rôle capital dans le
remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) étant donné qu’ils sécrètent la majorité des
composants comme le collagène, la laminine ou la fibronectine. Ils peuvent aussi dégrader
la matrice en sécrétant des métalloprotéases matricielles (MMP). Ce type cellulaire possède
un index prolifératif très faible et un faible métabolisme en condition normale. Les deux
fonctions principales des fibroblastes en condition physiologique sont d’intervenir au cours
de la cicatrisation et des processus d’inflammation (Xouri and Christian). Des études de
microscopies électroniques ont permis de voir une prolifération rapide des fibroblastes en
46
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
réponse aux dommages environnants et une migration de ces cellules à proximité du site
(Desmouliere, Darby et al. 2003). Une autre étude a montré que des fibroblastes de la moelle
osseuse étaient recrutés à proximité des dommages (Phillips, Burdick et al. 2004). Les cellules
épithéliales peuvent aussi subir l’EMT et devenir mésenchymateuses. Les cellules
épithéliales vont ainsi perdre leur polarité et l’adhésion avec les autres cellules du tissu. En
effet, l’expression de protéines impliquées dans l’adhésion cellule-cellule, comme la ECadhérine, l’occludine et la tight jonction 1, vont être inhibées, cela va favoriser la mobilité
cellulaire (Avizienyte, Brunton et al. 2005). Dans le même temps, les cellules épithéliales
acquièrent des caractéristiques mésenchymateuses et se mettent à exprimer des marqueurs
mésenchymateux comme la N-Cadhérine, la vimentine, la fibronectine et des MMPs (Lee,
Dedhar et al. 2006).
Suite au recrutement des fibroblastes, ils seront « activés » devenant des
myofibroblastes (aussi appelés dans les cancers, les fibroblastes associés au cancer – CAFs).
Les myofibroblastes ont des caractéristiques communes avec les fibroblastes et les
fibres musculaires lisses (Sappino, Schurch et al. 1990). La différenciation des
myofibroblastes reste mal comprise, cependant le TGFβ semble avoir un rôle central dans
l’activation des fibroblastes. Ce facteur de croissance augmente l’expression de l’α-Smooth
Muscle Actin (αSMA) qui est l’un des marqueurs de référence des myofibroblastes (Evans,
Tian et al. 2003). De plus, la stimulation au TGFβ induit l’expression d’αSMA dans les
fibrocytes qui sont recrutés sur le site de l’inflammation (Schmidt, Sun et al. 2003).
Le TGFβ joue aussi un rôle important dans les phénomènes de migration des
moyfibroblastes en attirant les cellules du mésenchyme et les leucocytes sur le site des
dommages (Flanders, Major et al. 2003). La migration des fibroblastes est aussi dépendante
de la matrice environnante induisant une réorganisation des intégrines de ces derniers
(Paine and Ward 1999).
La capacité de mitose des myofibroblastes est importante une fois que ces cellules
ont migré sur le site. Deux facteurs induisent une augmentation de la mitose de ces cellules :
le TGFβ et le PDGF. Cependant, le TGFβ a un effet paradoxal sur la prolifération des
myofibroblastes. Il inhibe la prolifération des fibroblastes à haute concentration alors qu’il
la stimule à concentration plus faible (Kovacs and DiPietro 1994). Le PDGF induit la
prolifération des cellules mésenchymateuses, une fois que cette stimulation est faite une
boucle autocrine permet d’entretenir ce signal (Kovacs and DiPietro 1994).
La dernière fonction des myofibroblastes sera la sécrétion de la matrice
extracellulaire (MEC). Cette notion sera traitée dans la partie suivante.
Les fibroblastes associés aux cancers seront décrits dans un chapitre suivant, ces
cellules occupant une place très importante dans mes travaux de thèse.
47
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
VI.COMPOSANTE MATRICIELLE :
a) COMPOSITION ET ROLE DE LA MATRICE EN CONDITION PHYSIOLOGIQUE :
La matrice extracellulaire (MEC) est un réseau dense, tridimensionnel de
macromolécules organisées autour des cellules. Bien que la MEC ait été considéré comme
n’ayant qu’une fonction structurale, on sait maintenant qu’elle assure de nombreuses autres
fonctions. Elle permet l’isolation des compartiments cellulaires, elle assure la résistance
mécanique des tissus et sert de support pour la migration des cellules environnantes. La
composition de la matrice diffère en fonction de sa localisation et de sa fonction (Adams and
Watt 1993). Elle est constituée principalement de trois types de molécules : le collagène,
l’élastine et des glycoprotéines assurant l’adhérence cellulaire. Les polysaccharides
représentent les molécules de ‘remplissage’ de la matrice.
Le collagène est une glycoprotéine fibreuse dont le rôle peut être associé à une
armature. Le collagène est l’assemblage protéique le plus abondant chez les vertébrés
constituant 30 % des protéines chez les mammifères. Une unité de collagènes est composée
de trois chaines α (figure 31) (Ricard-Blum and Ruggiero 2005). Il existe 34 chaines α
différentes composées de 1000 répétitions d’acides aminés environ. Cette répétition est de
la forme Glycine-X-Y, la glycine étant requise en position 1 car sa petite taille permet le
repliement de la triple hélice. La proline occupe généralement la position X et l’hydroproline
est en position Y (Ricard-Blum and Ruggiero 2005). Le collagène va ensuite se structurer,
trois chaines α vont former une hélice formant la molécule de tropocollagène (Shoulders and
Raines 2009). Les molécules de tropocollagène vont s’assembler, les lysines en N-Terminal
sont alors pontées aux lysines en C-Terminal d’une autre fibre via la lysyl oxydase. Ces fibres
s’assemblent et forment des fibrilles de 500 nm de diamètre qui s’agrègeront en fibres de
collagène de 1 à 10 µm de diamètre (Shoulders and Raines 2009).
48
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
FIGURE 31 : Structure secondaire et tertiaire du collagène (Shoulders and Raines 2009)
L’élastine est une molécule synthétisée et sécrétée dans l’espace extracellulaire par
les fibroblastes. Elle est composée de fibres de tropoélastine, cet assemblage constituant
des fibres élastiques. Ces fibres sont présentes dans la plupart des tissus conjonctifs.
L’élastine est une protéine insoluble, hydrophobe et très résistante au stress chimique ou
mécanique. L’hydrophobicité, facteur déterminant des propriétés élastiques de ces fibres,
est due à une forte proportion de résidus apolaires (Vrhovski and Weiss 1998). Plusieurs
possibilités d’assemblage de l’élastine ont été proposées et sont récapitulées dans la figure
32 :
FIGURE 32 : Possibilités d’assemblages de
l’élastine (Vrhovski and Weiss 1998)
49
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
La fibronectine est une protéine sécrétée par les cellules endothéliales et par les
fibroblastes. Les différentes formes de fibronectine sont obtenues par épissage alternatif à
partir d’un ARNm issu d’un seul gène. Deux monomères de fibronectine s’assemblent pour
former un dimère relié par deux ponts disulfures situés sur leurs parties C-Terminale. Les
dimères de fibronectine s’assemblent en polymères et forment des agrégats fibrillaires
(Peters, Sporn et al. 1990). Cette protéine joue un rôle clé dans les processus d’adhésion
cellulaire et de migration cellulaire. Elle se lie aux autres composantes de la matrice cellulaire
(collagène et glycoprotéines) ainsi qu’aux intégrines présentes sur les cellules. Elle participe
à l’organisation de la matrice par la formation de réseaux fibrillaire favorisant l’adhérence et
l’agencement des protéines matricielles entre elles. La fibronectine est retrouvée dans la
lame basale et les tissus conjonctifs lâches.
La laminine est une glycoprotéine hétérotrimérique composée de trois chaines : α, β
et γ. Il existe 5 chaines α, 4 chaines β et 3 chaines γ composant la laminine (Hamill, Langbein
et al. 2009). La laminine 1 (α1, β1, γ1) s’organise en réseau avec le collagène IV au sein de la
lame basale. La lamine 5 (α3, β3, γ2), 6 (α3, β1, γ1) et 7 (α3, β2, γ1) sont des molécules
d’adhésion entre les cellules et la lame basale (Aumailley and Gayraud 1998). Dans le colon
au sein de la lame basale, les laminines 1 et 5 sont majoritaires.
Les protéoglycans sont une famille hétérogène de macromolécules qui sont
composées d’une chaine protéique et sur laquelle est greffée une chaine glycanique. La
chaine protéique de cette molécule peut varier entre 1 et plus de 500 kDa. La chaine
glycanique définit le type de protéoglycans, il en existe plusieurs sous types (figure 32) : le
hyaluronate, l’héparine, le dermatane sulfate, le kératane sulfate et le chondroitine sulfate.
FIGURE 33 : Les différents types de chaines glycaniques retrouvés au sein des protéoglycans
(Source : Biochemistry, A short Course)
50
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
La diversité des protéoglycans est due à la composition de la chaine protéique comme
aux différentes chaines glycaniques latérales. Sur cette chaine, des motifs de sulfatations
variables sont aussi responsables des activités diverses des protéoglycans. Ainsi la succession
des chaines glycosides ainsi que la sulfatation variable des chaines glycaniques permettent
la liaison avec des facteurs de croissance, des cytokines et des chemokines (Delehedde,
Deudon et al. 1996). Certains protéoglycans permettent l’immobilisation des facteurs de
croissance au niveau du stroma créant des réserves qui pourront être libérées en cas de
remodelage de la matrice (Ohtani, Nakamura et al. 1993). Ces molécules peuvent aussi avoir
un rôle de protections de ces facteurs contre une dégradation protéolytique (Tardieu,
Gamby et al. 1992).
La matrice extracellulaire colorectale est composée majoritairement de collagène de
type I, de type III et de fibronectine (Hilska, Collan et al. 1998). La membrane basale
colorectale est quant à elle composé principalement de collagène de type IV et de laminine
(Oka, Naito et al. 2002). La dégradation de la lame basale est nécessaire à l’invasion tumorale
(Oka, Naito et al. 2002). De plus, la perte du collagène de type IV est associée aux tumeurs
faiblement différenciées (Zeng, Cohen et al. 1999).
b) INTERACTION ENTRE LA MATRICE ET LES CELLULES TUMORALES :
L’interaction entre la matrice et les
cellules se fait via des molécules d’adhésion
comme les intégrines. Les protéoglycans et
les fibres composant la matrice
extracellulaires vont interagir avec ces
molécules d’adhésion.
Les intégrines sont des glycoprotéines
FIGURE 34 : Possibilités d’assemblages des chaines capables à la fois de réguler l’adhésion
α et β des intégrines (Luo, Carman et al. 2007) cellulaire et jouent le rôle de récepteurs
pouvant transduire un signal entre la cellule et la MEC. Cette famille de molécules est
ubiquitaire. Les intégrines sont formées de deux sous-unités α et β liées de façon non
covalente (Hynes 1992). A ce jour, 18 sous-unités α et 8 sous-unités β ont été identifiées
(Luo, Carman et al. 2007). La diversité d’assemblage de ces sous-unités (figure 33) permet
aux intégrines de lier un large spectre de ligands de la MEC et des cellules.
La signalisation des intégrines de l’extérieur de la cellule vers l’intérieur se fait par
l’intermédiaire de la chaine β. Cette signalisation intervient entre autres dans la
réorganisation du cytosquelette, l’adhésion et la survie cellulaire (Hood and Cheresh 2002).
Elle est capable de réguler le cycle cellulaire (Guadagno, Ohtsubo et al. 1993).
Il existe de nombreuses anomalies d’expression des intégrines dans de nombreux
cancers (Woodhouse, Chuaqui et al. 1997). L’intégrine αvβ3 est un récepteur des protéines
51
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
extracellulaires contenant une séquence RGD (Arg-Gly-Asp) que peuvent reconnaitre la
fibronectine, la vitronectine, la laminine, le fibrinogène et le collagène dénaturé. Cette
intégrine est peu exprimée dans les cellules en condition physiologique mais son expression
est fortement augmentée lors de l’angiogenèse par les cellules endothéliales. Cette intégrine
est considérée comme un marqueur des mélanomes invasifs (Albelda, Mette et al. 1990)
(Hieken, Farolan et al. 1996) et son expression dans les cellules endothéliales a été montrée
comme augmentant le potentiel métastasique des cellules tumorales (Brooks, Montgomery
et al. 1994). La surexpression de l’intégrine β4 induit une inhibition de la prolifération en
provoquant l’arrêt du cycle cellulaire via l’augmentation des Cyclin dependant kinases (Cdk)
(Clarke, Lotz et al. 1995). Il a également été démontré que l’expression de l’intégrine α2β1
induisait un arrêt de la croissance cellulaire et la réversibilité du phénotype tumoral (Zutter,
Santoro et al. 1995). L’inhibition des interactions entre les intégrines et leurs ligands inhibe
la croissance cellulaire tumorale et peuvent induire l’apoptose (Montgomery, Reisfeld et al.
1994) (Brooks, Clark et al. 1994).
La surexpression de la lamine-5γ2 dans le cancer colorectal été constaté au niveau du
front invasif la tumeur (Garcia-Solano, Conesa-Zamora et al.). De plus, l’expression de la
laminine α3β3γ2 dans le cancer colorectal est un facteur de mauvais pronostique (Guess,
Lafleur et al. 2009).
Les changements conformationnels induit par des signaux intracellulaires peuvent
aussi avoir des conséquences sur le comportement cellulaire par rapport à son
environnement dont la matrice extracellulaire (MEC). La conséquence de la modulation de
ces signaux va aboutir à des modifications de la migration et l’invasion (Brown and Hogg
1996). Cette modification de comportements cellulaires va aboutir à l’expression et la
sécrétion de protéases qui agiront sur la MEC.
52
Introduction bibliographique
- Le stroma en condition physiologique & tumoral
c) LES METALLOPROTEASES MATRICIELLES (MMP) :
Les MMPs sont une famille d’enzyme calcium et zinc dépendantes capables de
dégrader toutes les composantes de la matrice (Egeblad and Werb 2002) (Vu and Werb
2000). Un niveau augmenté de MMPs corrèle avec une baisse de la survie des patients dans
de nombreux types de cancers (Hilska, Roberts et al. 2007) (Pellikainen, Ropponen et al.
2004). Le tableau suivant nomme les différentes MMPs et leurs substrats associés :
Enzymes
MMP
Substrats
MMP-1
MMP-8
MMP-13
MMP-18
Collagènes I, II, III, VII, X, gélatines
Collagènes I, II, III
Aggrécan, collagènes I, II, III, gélatines
Collagène I
Collagénases
Collagénase-1 (intersticielle)
Collagénase-2 (neutrophile)
Collagénase-3
Collagénase-4
Gélatinases
Gélatinases A
MMP-2
Gélatinases B
MMP-9
Gélatines, collagène I, IV, V, VII, X, fibronectine,
élastine
Gélatines, collagène IV, V, élastine
Stromélysines
Stromélysine-1
MMP-3
Stromélysine-2
MMP-10
Stromélysine-3
MMP-11
Matrilysine
MMP-7
Métalloélastase
MMP-12
Protéoglycans, laminine, gélatines, collagènes
III, IV, V, IX, fibronectine, entactine, SPARC,
collagénase-1
Protéoglycans, laminine, gélatines, collagènes
III, IV, V, IX, fibronectine
Aucun substrat de la matrice n’est défini
Protéoglycans,
laminine,
fibronectine,
gélatines, collagènes, élastine, entactine
Elastine, fibrinogène, fibronectine
Métalloprotéinases membranaires
MT1-MMP
MMP-14
MT2-MMP
MT3-MMP
MT4-MMP
MMP-15
MMP-16
MMP-17
Collagènes I, II, III, fibronectine, vitronectine,
protéoglycans, pro-gélatinase A
Pro-gélatinase A
Pro-gélatinase A
53
Introduction bibliographique
-
d) REMODELAGE DE LA MATRICE ET MMPS DANS LE CANCER COLORECTAL :
La réaction desmoplasique induite par les fibroblastes est importante dans la
carcinogenèse colorectale. Ce remodelage matriciel est capital à plusieurs titres, il permet la
libération de facteurs pro-tumoraux emprisonnés dans la matrice et permet une meilleure
chimiorésistance car la tumeur prise dans une matrice de collagène dense sera moins
accessible. Cette matrice, riche en collagènes fibrillaires (de type I et III), est un indicateur de
mauvais pronostic dans le CRC (Sis, Sarioglu et al. 2005) (Crispino, De Toma et al. 2008). De
plus, l’expression des intégrines αvβ5 et αvβ3 augmente la survie cellulaire (Conti, Kendall
et al. 2008). Dans cette étude, l’inhibition de ces intégrines induit une chute de la
prolifération cellulaire.
Le degré d’expression et l’activité des MMPs ont une influence sur tous les processus
oncogéniques. Le tableau suivant récapitule les différentes MMPs impliquées dans le CRC
ainsi que leurs effets associés :
Effets
Expression en corrélation
avec le stade tumoral
Invasion
Métastases
Angiogenèse
Survie diminuée
Transition adénome adénocarcinome
MMPs
impliquées
1
2
3
7
9
2
9
1
2
7
9
2
9
9
13
2
7
9
54
Références
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Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
C. LES FIBROBLASTES ASSOCIES AUX CANCERS : CAFS
Pendant de nombreuses années, la recherche en cancérologie a cherché à élucider
les mécanismes qui induisaient la tumeur elle-même. Ainsi, cette recherche s’est focalisée
sur les cellules tumorales épithéliales en considérant que c’était la seule transformation
cellulaire qui s’opérait dans le tissu cancéreux. Cependant, de plus en plus de groupe de
recherche s’intéresse aujourd’hui aux fibroblastes associés aux cancers : les CAFs. Ce type
cellulaire est le plus abondant au sein du stroma de nombreux cancers solides comme le
cancer du sein, du pancréas, de la prostate et notamment du colon.
Ce chapitre a pour vocation de décrire les fibroblastes associés aux cancers de leurs
découvertes jusqu’à leurs rôles de plus en plus importants dans la carcinogénèse.
I. DECOUVERTE :
Les CAFs ont d’abord été définis comme des myofibroblastes. En effet, ces deux types
cellulaires partagent de nombreuses caractéristiques. Ces fibroblastes tumoraux furent
décrits aux cours des années 1970 comme des fibroblastes ayant une morphologie
approchant les cellules musculaires, avec une abondance de microfilaments leurs conférant
un phénotype contractile. Plus tard, l’expression d’αSMA par ces cellules est devenue un
marqueur de ces fibroblastes activés par le cancer. Les fibroblastes associés aux cancers sont
très proches des fibroblastes « activés » en réponse à l’inflammation, il est souvent décrit
que le cancer est une inflammation qui ne guérit pas (Kalluri and Zeisberg 2006).
II. ORIGINE :
L’origine des CAFs est aujourd’hui un sujet débattu, cette absence de consensus est
dû au fait que ces cellules ont vraisemblablement plusieurs origines (Ostman and Augsten
2009). La première hypothèse est qu’ils dérivent des fibroblastes déjà présents au sein du
tissu. La seconde est qu’ils proviennent de précurseurs de la moelle osseuse, ces cellules
circulantes étant recrutées par la tumeur. Enfin, la dernière hypothèse est que les cellules
environnantes (cellules épithéliales, endothéliales, péricytes ou adipocytes) pourraient se
dédifférencier en CAFs.
-
Activation des fibroblastes résidents :
L’activation et la prolifération des fibroblastes résidents semblent être aujourd’hui la
majeure source de CAFs. Les premiers facteurs décrits comme pouvant activer les
fibroblastes résidents des composés issus de la famille des PDGF et TGFβ (Kalluri and
Zeisberg 2006). Une analyse des CAFs issus de métastases hépatiques d’un cancer colorectal
a pu déterminer que les fibroblastes de cette métastase présentaient des marqueurs
similaires (Thy, αSMA, vimentine) et une morphologie semblable aux fibroblastes hépatiques
résidants et donc provenaient de cet organe (Mueller, Goumas et al. 2007).
55
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
FIGURE 36 : Les principales origines des CAFs (Ostman and Augsten 2009)
-
CAFs issus de précurseurs de la moelle osseuse :
Une publication a montré que des cellules souches de la moelle osseuse exposées à
du milieu conditionné de cellules épithéliales tumorales acquéraient un phénotype
fibroblastique et exprimaient des marqueurs de ce type cellulaire tel que αSMA, FSP-1 et
SDF-1 (Mishra, Humeniuk et al. 2008). De plus, dans un modèle murin où des cellules de
moelle osseuse tagguées GFP ont été transplantées, ces dernières se sont différenciées et
ont contribué à l’augmentation de la population des CAFs (Direkze, Hodivala-Dilke et al.
2004) (Ishii, Sangai et al. 2003).
Cependant, le ratio de CAFs provenant de ce compartiment cellulaire est très variable
et relativement faible. Dans un modèle murin, suite à l’injection de cellules de la moelle
osseuse marquées, les CAFs dérivant de ce compartiment ne représentaient que 20% des
cellules αSMA positive (Quante, Tu et al.). Le même type d’étude dans un insulinome
pancréatique a montré que environ 25% des CAFs proviennent de ce compartiment cellulaire
(Direkze, Hodivala-Dilke et al. 2004). Le taux de CAFs provenant de ce compartiment est dans
tous les cas assez faible dans les autres modèles (Ishii, Sangai et al. 2005).
56
Introduction bibliographique
-
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
Les CAFs dérivent des autres types cellulaires :
Les cellules épithéliales ayant subi la transition épithélio-mesenchymateuse (TEM)
peuvent représenter une source de CAFs (Kalluri and Zeisberg 2006) (Radisky, Kenny et al.
2007). Les cellules épithéliales ayant subi la TEM présentent les marqueurs d’activations
fibroblastiques comme la vimentine, la N-Cadhérine, α-SMA, FAPα et FSP-1 (Giannoni, Parri
et al.).
Les cellules endothéliales ont été montrées plus récemment comme une source
potentielle de CAFs (Zeisberg, Potenta et al. 2007). Une étude a permis de démontrer
l’existence de cellules présentant à la fois des marqueurs endothéliaux (CD31) et des
marqueurs fibroblastiques (αSMA et FSP1). L’expression de FSP1 dans les cellules
endothéliales a aussi été montrée en réponse à une stimulation par le TGFβ.
Les péricytes ont été décrits comme source de CAFs. Il a été montré que dans un
modèle de souris transgénique surexprimant ADAM12, que des cellules perivasculaires
ADAM 12 positive subissent une transformation jusqu’à devenir des myofibroblastes dans le
cas d’un processus inflammatoire (Dulauroy, Di Carlo et al.). Une autre étude montre le
même phénomène dans un modèle de fibrose rénale (Humphreys, Lin et al.).
Les adipocytes, à cause de leurs origines mésenchymateuses, ont été étudiés comme
source potentielle de fibroblastes associés aux cancers. Dans un modèle de cancer du sein,
les adipocytes résidents se différencient et représentent 27% des cellules αSMA positive
(Kidd, Spaeth et al.). Une autre étude montre que des progéniteurs adipocytaires peuvent
se différencier en fibroblastes exprimant αSMA et qui possèdent des caractéristiques des
CAFs comme un effet profibrotique ou l’augmentation de la migration et des capacités
invasives des cellules tumorales associées (Wang, Lehuede et al.).
III. ACTIVATION DES CAFS :
La principale difficulté dans l’étude des CAFs réside dans l’isolation de la ‘bonne’
population cellulaire. En effet, l’hétérogénéité de cette population cellulaire est très
dépendante de l’organe d’isolement et de l’origine multiple de ces cellules. Un fibroblaste
associé aux cancers est surtout définit comme tel s’il possède des propriétés pro-tumorales.
Néanmoins, de nombreuses études ont cherché à définir une « signature » de ce type de
fibroblastes.
Les CAFs sont le plus souvent isolés sur la base de leur expression de l’alpha-smooth
muscle actin (αSMA). D’autres marqueurs sont couramment employés comme : la
vimentine, le platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFR-α), le platelet-derived
growth factor receptor beta (PDGFR-β), la fibroblast specific protein (FSP-1) ou la fibroblast
activation protein alpha (FAPα) (Anderberg, Li et al. 2009) (Sugimoto, Mundel et al. 2006)
57
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
(Paulsson, Sjoblom et al. 2009). Cependant aucun de ces marqueurs n’est réellement
spécifique des CAFs et n’est exprimé par aucun autre type cellulaire.
FSP-1 (ou S100A4) est une protéine exprimée dans les fibroblastes. Elle a été décrite
comme régulant le cycle cellulaire et comme modulant le cytosquelette. Cette protéine a
ainsi été montrée comme augmentant la croissance tumorale et facilitant les métastases
(Sherbet 2009).
FIGURE 36 : Activation des CAFs
FAPα est une gélatinase qui est exprimée spécifiquement par les péricytes et les
fibroblastes activés au cours de la cicatrisation ou de la carcinogénèse (Mathew, Scanlan et
al. 1995). La surexpression de cette protéine a été constatée dans les fibroblastes de plus de
90 % des carcinomes humains (O'Brien and O'Connor 2008). Une analyse plus approfondie
des fonctions de cette protéine sera développée en introduction du premier manuscrit dans
lequel je rapporte que la présence de cette protéine dans des polypes hyperplasiques
coliques pouvait prédire l’apparition d’un adénome dans les 10 ans suivant l’ablation de ce
polype.
Les mécanismes d’activation des CAFs sont encore largement débattus néanmoins
deux facteurs semblent important dans l’activation des fibroblastes : le TGFβ1 et le PDGF.
-
Le Transforming Growth Factor beta 1 (TGFß1):
Le rôle du TGFβ1 en carcinogénèse est multiple. En effet, ce facteur peut avoir selon
les conditions un effet anti ou pro-tumoral. Le TGFβ1 est décrit comme un inhibiteur de la
prolifération épithéliale via la répréssion de c-Myc et des cdk (Massague, Blain et al. 2000)
(Feng and Derynck 2005) (ten Dijke and Arthur 2007). Néanmoins un effet pro-tumoral de
cette protéine a été décrit (Oft, Heider et al. 1998). Ce double rôle a été étudié dans la
littérature et les causes de cette double action commencent à être élucidées.
58
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
Le TGFβ est en amont de la voie SMAD, qui induit les effets anti-prolifératifs du TGFβ
sur les cellules épithéliales. Cette voie va induire les effets anti-prolifératifs de la voie TGFβ.
Dans le cas de cancers, la voie du TGFβ dans les cellules épithéliales est inhibée, soit par
mutation (comme vu dans le CRC), soit par méthylation des gènes codant pour les récepteurs
du TGFβ. La répression de cette voie dans les cellules épithéliales explique que les effets antitumoraux du TGFβ ne sont pas retrouvés dans le cancer.
Les effets pro-tumoraux du TGFβ sont explicables par l’action de ce facteur sur les
cellules du stroma tumoral notamment les CAFs. Il a été montré que ce facteur induisait la
différenciation et l’activation des fibroblastes in vitro et in vivo (Sime, Xing et al. 1997)
notamment via l’expression du marqueur d’activation αSMA (Hu, Wu et al. 2003). Suite à
leurs activations, les CAFs vont eux-mêmes produire du TGFβ et ainsi entretenir leurs états
d’activations et permettre la génération d’autres CAFs.
-
Le platelet-derived growth factor (PDGF) :
La surexpression des récepteurs aux PDGF α et β a été décrite dans 90% des CAFs
(Micke and Ostman 2004) ainsi que dans plusieurs types de cancers (sein, poumon) dont les
CRC. Leurs surexpressions entrainent la progression tumorale (Coltrera, Wang et al. 1995)
(Sundberg, Branting et al. 1997). Ces récepteurs induisent la prolifération, la migration,
l’invasion et l’angiogénèse (Andrae, Gallini et al. 2008). Il a été décrit que le PDGF avait aussi
un rôle dans le recrutement et l’activation fibroblastique. Plusieurs études ont permis de
montrer que le PDGF-B et -C permettait la différenciation de fibroblastes en myofibroblastes
(Rhee and Grinnell 2006) (Jinnin, Ihn et al. 2005). Une étude récente a pu mettre en exergue
le rôle du PDGF-D dans le recrutement et la migration des fibroblastes dans un modèle de
cholangiocarcinome (Cadamuro, Nardo et al.).
IV.ALTERATIONS GENETIQUES DES CAFS :
Il est aujourd’hui admis que le cancer a pour origine des altérations génétiques.
Initialement les CAFs ont été décrits comme un type cellulaire issu de la différenciation des
fibroblastes en réponse aux facteurs des cellules tumorales épithéliales. Cependant, les CAFs
ont eux aussi dans certains cas des altérations génétiques qui leurs permettent de maintenir
leurs caractéristiques pro-tumorales sans signaux des cellules épithéliales (Littlepage,
Egeblad et al. 2005).
En effet, plusieurs études ont pu démontrer des altérations dans des zones à hautes
fréquences d’altérations génétiques, des pertes d’hétérozygoties (LOH) et des copies des
oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs dans les CAFs de différents cancers. Dans
le cancer du sein, des mutations des gènes TP53 et PTEN sont fréquemment observées dans
les cellules épithéliales tumorales. La mutation de ces gènes est indispensable pour la
progression de ce type de cancer (Mayo, Dixon et al. 2002). Ces deux gènes sont aussi
retrouvés mutés dans les CAFs situés à proximité de la tumeur (Kurose, Gilley et al. 2002).
59
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
Dans le cancer de la prostate, la mutation de TP53 dans les CAFs est induite par une pression
de sélection exercée par les cellules épithéliales sur les CAFs qui va privilégier les CAFs TP53
mutés (Hill, Song et al. 2005). De plus, des pertes d’hétérozygoties (LOH) ont été détectées
dans 17 à 61% des CAFs issus de cancer du sein invasif (Kurose, Hoshaw-Woodard et al.
2001). Dans ce même type de cancer, la fréquence de LOH des CAFs est associée au grade
de la tumeur adjacente (Fukino, Shen et al. 2007).
Une autre étude a montré que la transplantation de cellules de cancer prostatique
humaines dans des souris nude induisait l’apparition de sarcomes d’origine murine (Pathak,
Nemeth et al. 1997) confirmant le lien entre les cellules tumorales et l’apparition
d’altérations génétiques dans les CAFs. Une autre étude dans le même type de cancer n’a
pas permis de définir des points de mutations précis (Walter, Omura et al. 2008). De la même
manière, une étude par une technique de puce d’hybridation génomique comparative n’a
pas pu définir des mutations ou d’altérations génomiques répétées sur des biopsies de
cancer mammaire (Allinen, Beroukhim et al. 2004).
Ces résultats discordants mettent en évidence le fait que l’altération génétique n’est
à ce jour pas considérée comme un phénomène majeur de l’apparition des CAFs. Et que les
CAFs présentant ces altérations génétiques peuvent être issus de cellules épithéliales
tumorales ayant subi la TEM.
V. PARTICIPATION DES CAFS A LA CARCINOGENESE :
Les CAFs ont de nombreux rôles au sein du tissu tumoral. Un dialogue entre ces
cellules et tous les autres types cellulaires va se mettre en place au court de la carcinogénèse.
Ces interactions vont générer de nombreux effets sur les phénomènes les plus importants
de la carcinogenèse comme la prolifération, la survie cellulaire, l’angiogenèse et la formation
de métastases. L’influence des CAFs sur les autres cellules va passer par la sécrétion de
facteurs tels que des facteurs de croissance, des cytokines, des protéases ou des enzymes.
a) FACTEURS DE CROISSANCE INDUITS PAR LES CAFS :
Le facteur Hepatocyte Growth Factor (HGF) est un facteur de croissance identifié
comme stimulant la prolifération des hépatocytes (Stoker and Perryman 1985). Cette
protéine est le ligand du récepteur c-Met (Benvenuti and Comoglio 2007) et la surexpression
de cette voie induit la prolifération, l’invasion et l’apparition de métastases (Peruzzi and
Bottaro 2006). Une étude a montré que des CAFs primaires issus d’un cancer pulmonaire
produisaient de l’HGF induisant l’activation de la voie pro-oncogénique c-Met dans les
cellules épithéliales. Cette production d’HGF induisait une meilleure résistance des cellules
tumorales à un inhibiteur du récepteur à l’EGF (Epidermal growth Factor) qui est utilisé en
traitement dans ce type de cancer (Wang, Li et al. 2009). Dans un modèle de cancer du sein,
la production de HGF par les CAFs a été démontrée ainsi que l’induction de la voie c-Met.
60
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
Cette étude a montré qu’un inhibiteur de c-Met (SU11274) induit une baisse de l’invasion
des cellules épithéliales (Jedeszko, Victor et al. 2009).
Le Connective Tissue Growth Factor (CTGF) module l’adhésion, la migration et
l’invasion cellulaire. Ce facteur de croissance est surexprimé dans le stroma tumoral des
cancers du sein et du pancréas (Frazier and Grotendorst 1997) (Wenger, Ellenrieder et al.
1999). Une étude a démontré la production de CTGF par le stroma tumoral associé induit
une augmentation de l’angiogenèse et de la croissance tumorale. Cette augmentation de la
production de CTGF étant induit par une stimulation aux TGFβ (Grotendorst, Okochi et al.
1996). Une autre étude a pu montrer qu’un traitement de fibroblastes normaux par le TGFβ
induisait une augmentation du CTGF et que ces cellules possédaient des activités protumorales (Yang, Tuxhorn et al. 2005).
Une étude sur des modèles murins de cancer mammaire a montré que l’expression
du Fibroblasts Growth Factor b (FGFb) par les CAFs issus de tumeurs avancées induisait la
prolifération des cellules épithéliales (Giulianelli, Cerliani et al. 2008). Dans un modèle de
carcinome du col de l’utérus, l’induction de FGFb et de FGF7 dans les CAFs suite à leur
activation par du PDGF a été démontrée. Ces facteurs de croissances induisent par la suite
la prolifération et l’angiogénèse tumorale dans ce modèle (Pietras, Pahler et al. 2008).
b) LES CYTOKINES : PRINCIPAUX MEDIATEURS DE L’ACTION DES CAFS
Les cytokines ont, dans un contexte physiologique, un rôle dans la signalisation
cellulaire et sont essentielles à la réponse inflammatoire. Cette famille de protéines
comprend les interleukines (IL), les interférons (IFN) et les tumor necrosis factor (TNF). Ces
facteurs solubles sont produits par les cellules stromales ou épithéliales.
Dans le cancer pancréatique, la surexpression de la cytokine orpheline CXCL14 par les
CAFs a été décrite (Augsten, Hagglof et al. 2009). Cette étude a pu montrer que CXCL14
induisait la prolifération et augmentait la migration des CAFs qui pourront à leur tour induire
la croissance tumorale, l’angiogénèse et l’infiltration immunitaire. Dans ce même cancer, la
sécrétion concomitante de CXCL12 (SDF-1, stromal cell-derived factor 1) par les CAFs et la
production d’IL8 (CXCL8) par les cellules tumorales a été décrite. SDF-1 ayant un rôle dans la
migration des cellules épithéliales et il a un rôle dans la réponse angiogénique (Matsuo, Ochi
et al. 2009).
Dans le carcinome des cellules squameuses (SCC), une augmentation de la migration
des cellules tumorales en présence de CAFs a été constatée. Cette migration nécessite
l’expression de CCL7 par les fibroblastes et d’IL-1α par les cellules épithéliales (Jung, Che et
al.). La présence de ces deux facteurs a par ailleurs été confirmée sur des coupes de
carcinome squameux humain (Jung, Che et al.).
Une autre étude a pu montrer qu’à des stades précoces de cancer de la peau, les
CAFs possédaient une « signature » pro-inflammatoire par l’expression de facteur comme la
61
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
cyclo-oxygénase 2 (Cox-2), CXCL 1 et 2, IL-1β et 6. Cette « signature » est induite dans ces
cellules par l’IL-1β sécrété par les cellules immunitaires qui va induire l’activation de la voie
NF-κB et permettre la production de ces facteurs pro-inflammatoires. Cette production va
induire le recrutement de macrophages qui vont s’activés et devenir des TAMs et vont avoir
un rôle important dans l’angiogenèse (Erez, Truitt et al.).
c) LES PROTEASES : ACTEURS DANS LE REMODELAGE DE L’ENVIRONNEMENT DES CAFS
Les protéases sont des molécules extrêmement importantes pour la progression
tumorale. La famille de protéase la plus importante dans le cancer est la famille des
métalloprotéases matricielles (MMP). Les MMPs sont exprimés principalement par les
cellules tumorales et les CAFs et ont de nombreux rôles dans la tumorigénèse (Mueller and
Fusenig 2004). Ces facteurs sont capables de cliver la matrice extracellulaire (MEC) ce qui va
permettre de faciliter la migration des cellules tumorales relâchant au sein de la tumeur la
pression induite par sa croissance et va aussi permettre la libération des facteurs de
croissance et chimiotactiques emprisonnés au sein de la matrice.
Il a ainsi pu être montré que l’expression de MMP-1, -2 et -14 par les cellules
tumorales et de MMP-9, -13 et -14 par les CAFs sont associés à la progression et à la
formation de métastases dans le carcinome de cellules squameuses (SCC) (Vosseler, Lederle
et al. 2009). Dans un modèle de xénogreffe, une autre étude a pu montrer que la sécrétion
de MMP-13 par les CAFs permettait, lors du remodelage matriciel, la libération de VEGF de
la matrice et induisait l’angiogenèse, ce phénomène favorisant la formation de métastases
dans ce modèle (Lederle, Hartenstein et al.). Dans le mélanome, MMP-13 produite par les
CAFs est requise pour l’invasion, l’angiogenèse et la formation de métastases (Zigrino, Kuhn
et al. 2009). D’autres études ont pu montrer que les fibroblastes péri-tumoraux des
mélanomes sécrètent MMP1 (Wandel, Grasshoff et al. 2000). MMP1 qui est reconnu comme
un marqueur prédictif de l’évolution d’un cancer mammaire (Poola, DeWitty et al. 2005), et
que l’expression de MMP1 dans ce type de cancer induit la prolifération et l’invasion
tumorale via le clivage du protease-activated receptor-1 (PAR1) à la surface des cellules
tumorales. Il a été démontré que dans un modèle de souris KO MMP1, l’extinction de ce
facteur induit le blocage de la migration de ces cellules tumorales métastatiques (Sternlicht
and Werb 2001).
Le plasminogène est une forme active de la plasmine qui à pour fonction la
fibrinolyse. Son activation est régulée par l’urokinase-type plasminogen activator (uPA) (Blasi
and Sidenius). La surexpression d’uPA et de son récepteur uPAR a été décrite dans de
nombreux cancers et participe à la prolifération, migration et l’invasion. De plus, un niveau
élevé de uPA et uPAR est associé à un mauvais pronostique (Dano, Behrendt et al. 2005).
Une étude a montré que l’expression de uPA dans les fibroblastes était induit par la
production par des cellules épithéliales ovariennes du Fibroblast Growth Factor b (FGFb) et
de l’Epidermal Growth Factor (EGF) (Noskova, Ahmadi et al. 2009).
62
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
d) MODIFICATION DU METABOLISME ENERGETIQUE DES CAFS :
Il est aujourd’hui établi que les cellules tumorales produisent l’énergie nécessaire à
leurs croissances via des processus oxydatifs et non par glycolyse aérobie. Cela est dû à
l’absence d’oxygène à proximité des tumeurs comme à la nécessité de produire beaucoup
d’énergie pour poursuivre le développement tumoral en dépit du manque d’oxygène et de
nutriment. Ce phénomène fut découvert dans les années 1920 par Otto Warburg et se
nomme donc l’effet Warburg (Warburg 1956).
Dans le cancer du sein, la sous-expression de la caveolin-1 (Cav-1) dans les CAFs a été
décrites (Mercier, Casimiro et al. 2008). Ces CAFs Cav-1- présentent une hyperprolifération,
une activation accru de la voie TGFβ et une aptitude à la contraction supérieure (Sotgia, Del
Galdo et al. 2009). De plus, ces cellules surexpriment les marqueurs d’activations
fibroblastiques ainsi que des enzymes glycolytiques (LDH-A, PKM-2, enolase et fructosebisphosphate aldolase A) (Pavlides, Whitaker-Menezes et al. 2009). Ces facteurs montrent
que l’effet Warburg se produit dans les CAFs. Pour confirmer ce phénomène, il a été confirmé
que les CAFs Cav-1- surexprimaient un marqueur de dysfonctionnement mitochondrial
(BNIP3L) et un marqueur reflétant la production et la sécrétion de L-lactate
(MonoCarboxylate Transporter 4, MCT4) (Whitaker-Menezes, Martinez-Outschoorn et al.).
La surexpression de ces enzymes glycolytiques été constatée dans les CAFs mais pas dans les
cellules tumorales adjacentes montrant que les cellules épithéliales utilisent les CAFs comme
source énergétique (Pavlides, Whitaker-Menezes et al. 2009).
Ainsi les cellules épithéliales ont un rôle de parasite cellulaire envers les CAFs qui
assurent leurs approvisionnements en L-lactate afin que la tumeur puisse continuer à se
développer.
VI.LE STROMA TUMORAL, NOUVELLE CIBLE THERAPEUTIQUE ?
Comme décrit précédemment, les CAFs ont de multiples rôles dans la carcinogenèse.
Ainsi, le ciblage des CAFs ou l’inhibition de leurs effets devient une priorité au même titre
que la lutte contre la prolifération épithéliale. La mise en évidence du rôle du stroma étant
plus récente que la recherche sur la tumeur elle-même, de nombreuses molécules sont
encore en phase de test clinique. Néanmoins, il existe aujourd’hui quelques thérapies ciblant
ces fibroblastes activés en cancérologie.
Un inhibiteur du récepteur aux PGDF a été décrit comme réduisant la progression et
la croissance tumorale dans un modèle de cancer utérin murin (Pietras, Pahler et al. 2008)
(Jain, Lahdenranta et al. 2008). De plus, cet inhibiteur induit une meilleure réponse de la
tumeur à la chimiothérapie (Pietras, Rubin et al. 2002). Un antagoniste du PDGFR, le Glivec,
est aussi décrit comme réduisant le volume tumoral chez des patients atteints de
dermatofibrosarcome (Apperley, Gardembas et al. 2002) (Maki, Awan et al. 2002) (Pietras,
Sjoblom et al. 2003).
63
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
De nombreuses stratégies sont en cours de développement afin de cibler le couple
CXCL12 (SDF-1) / CXCR4, des antagonistes, des anticorps bloquants, des inhibiteurs ou des
siRNA (small interfering RNA) (Wong and Korz 2008). Les différentes études concernant le
blocage de l’interaction entre ces deux molécules ont pu montrer que cette inhibition
conduisait à l’inhibition de la formation des métastases (Kim, Lee et al. 2008) (Kajiyama,
Shibata et al. 2008) (Yoon, Liang et al. 2007) (Chen, Kelly et al. 2003). La majorité de ces
approches sont passées de la recherche fondamentale aux essais cliniques.
Le ciblage du couple HGF / Met est une autre stratégie employée. L’utilisation de
l’isoforme tronqué de HGF ou d’anticorps neutralisant contre l’une de ces deux protéines
ont tous montrés une inhibition de la prolifération tumorale (Cecchi, Rabe et al.).
L’inhibition des MMPs semble une priorité dans le traitement des cancers tant ces
molécules sont importantes dans tous les domaines en cancérologie. Cependant, les
différentes thérapies ciblant ces molécules n’ont pas apportées les résultats escomptés
(Egeblad and Werb 2002). La spécificité des MMPs et de chaque environnement tumoral
peut notamment expliquer ces résultats décevants (Bergers, Javaherian et al. 1999).
VII. ROLE DES CAFS DANS LA CARCINOGENESE COLORECTALE :
Dans cette partie seront abordés les CAFs dans la carcinogenèse colorectale et les
effets spécifiques de ces cellules sur ce type de tumeur. Comme dit précédemment les CAFs
représentent la fraction cellulaire majoritaire au sein du stroma colorectal (Kalluri and
Zeisberg 2006). Les CAFs de ce type de cancer possèdent les mêmes marqueurs d’activation
que les CAFs des autres organes à savoir : αSMA, FAPα, FSP-1 ou PDGFR-β (Ostman and
Augsten 2009).
Les CAFs associées aux CRC proviendraient majoritairement de fibroblastes résidents
adjacents aux tumeurs. Une étude a montré que les CAFs associés à une métastase
hépatique issue d’un CRC provenaient majoritairement de fibroblastes du foie environnant
(Mueller, Goumas et al. 2007). Cependant, il a été décrit dans un modèle murin que les
cellules souches de la moelle osseuse peuvent se différencier en CAFs (Direkze, HodivalaDilke et al. 2004).
Une étude récente a montré que l’activation des CAFs dans le CRC était induite par le
TGF-β. Cette protéine va induire sa propre sécrétion dans les CAFs colorectaux (Hawinkels,
Paauwe et al.).
Dans le CRC, les CAFs ont été montré comme impliqués dans tous les stades de la
carcinogenèse.
64
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
a) LES CAFS ONT UN ROLE DANS LA DEREGULATION DE LA VOIE APC / Β-CATENINE :
La voie APC / β-caténine est une voie du signal majeure dans le CRC, l’activation de
cette voie est due à une mutation d’APC ou de la β-caténine (Fodde, Kuipers et al. 2001). Le
microenvironnement a été décrit comme pouvant agir sur la modulation de cette voie du
signal.
Dans le cancer colorectal, les CAFs ont été montrés comme induisant l’activation de
la voie APC (Le, Franken et al. 2008). En effet, le PDGF et la PGE2 produit par les CAFs peuvent
activer cette voie (Eisinger, Nadauld et al. 2006) (Eisinger, Prescott et al. 2007) (Wang, Mann
et al. 2004). Une autre étude a montré que la sécrétion de l’HGF par les CAFs induisait une
activation de la voie APC dans les cellules épithéliales (Vermeulen, De Sousa et al.).
b) LES CAFS INDUISENT LA CROISSANCE DES TUMEURS COLORECTALES :
Les CAFs ont été décrits comme une source très importante de facteurs de croissance
telle que l’Epidermal Growth Factor (EGF), l’Insulin-like Growth Factor (IGF), l’Hepatocyte
Growth Factor (HGF) ou les Fibroblasts Growth Factor (FGF) (Kalluri and Zeisberg 2006). Ces
cellules ont été montrées comme stimulant la prolifération d’une lignée de cellules
tumorales colorectales humaines (Nakagawa, Liyanarachchi et al. 2004). De plus, les
chemokines sécrétées par les CAFs comme SDF-1 (Orimo, Gupta et al. 2005) ou CXCL 14
(Ostman and Augsten 2009) induisent le recrutement de cellules souches de la moelle
osseuse, des macrophages et des autres cellules immunitaires permettant la croissance
tumorale.
Une étude récente a montré une interaction plus forte entre les cellules tumorales
colorectales CD133+ et les CAFs. Or les cellules tumorales CD133+ ont été décrites comme
des cellules souches cancéreuses. Il a été démontré que ces cellules tumorales, qui sont donc
plus tumorigènes que les CD133-, présentaient une surexpression de CXCR4 et du FGFR 2.
Les CAFs étant connus pour produire les ligands de ces récepteurs (SDF-1 et FGFs) induisent
dans ces cellules tumorales, une prolifération en suspension augmentée et une meilleure
capacité à produire des clones en suspension (Chao, Carmical et al.). Ainsi, ces cellules
épithéliales seront plus à même de proliférer et de survivre sans le support de la lame basale
au cours des processus invasifs.
c) INFLUENCE DES CAFS DANS L’ANGIOGENESE COLORECTALE :
L’interleukine 8 a été montrée comme étant surexprimée dans les CAFs colorectaux
et comme participant à l’angiogenèse tumorale (Dolznig, Rupp et al.). Une autre étude sur
des métastases de CRC dans le foie a montré une surexpression d’IL8 via l’expression de
TNFα par les cellules métastatiques (Mueller, Goumas et al. 2007). De plus, le profil
d’expression des CAFs a été comparé à celui des fibroblastes normaux. Les CAFs colorectaux
ont une surexpression du VEGF, CTGF et du FGF-1 (Nakagawa, Liyanarachchi et al. 2004).
65
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
d) ROLE DES CAFS DANS LES PROCESSUS METASTATIQUES :
Il a été démontré que des fibroblastes normaux peuvent être activés par du milieu
conditionné de cellules épithéliales tumorales coliques et que ces fibroblastes activés
induisaient une migration et une invasion supérieures des cellules épithéliales. Ces effets
sont dus, à l’expression par les fibroblastes du FGF-1 et du FGFR 3 par les cellules tumorales
(Henriksson, Edin et al.).
Les CAFs issus de métastases hépatiques recréent un environnement inflammatoire
protumoral via la sécrétion d’IL6 et de MCP-1 (Mueller, Seggern et al.). De plus, l’exposition
de fibroblastes colorectaux à du TNFα, qui est produit dans le CRC par les cellules
immunitaires, induit l’expression de MMP-3 par les fibroblastes (Yoo, Rodriguez Perez et al.).
L’exposition de fibroblastes au TNFα peut aussi induire l’expression de la cyclooxygénase-2
(COX-2) (Rodriguez Perez, Nie et al.).
La surexpression de MMP3 a été décrite dans le CRC, cette surexpression permet la
maturation de la pro-MMP9 en MMP9 et induit la progression tumorale (Inuzuka, Ogata et
al. 2000).
FIGURE 37 : Facteurs induits par les CAFs
dans le cancer colique.
e) VALEURS PRONOSTIQUES / DIAGNOSTIQUES DES CAFS DANS LE CANCER COLIQUE :
La présence de CAFs au sein du stroma tumoral est déjà un marqueur de mauvais
diagnostique dans le CRC, de nombreuses molécules produites par les CAFs sont elles aussi
assimilées comme des marqueurs diagnostiques ou pronostiques dans ce type de cancer.
L’expression de αSMA, marqueur d’activation fibroblastique, est un facteur
indépendant de mauvais pronostique dans le CRC et identifie qu’un groupe de patients avec
un nombre supérieur de fibroblastes exprimant αSMA à la moyenne des 192 patients ont un
risque important de récidiver (Tsujino, Seshimo et al. 2007). L’expression par les CAFs
66
Introduction bibliographique
- Les fibroblastes associés aux cancers : CAFs
colorectaux de FAPα est aussi associée à une récurrence et une dissémination tumorale
augmentées (Henry, Lee et al. 2007).
Le taux de MMP est dans de nombreux cas corrélé à une survie diminuée et à
l’apparition des métastases dans le CRC. De plus, MMP1 est aussi associé à un mauvais
pronostique indépendamment du stade tumoral (Shiozawa, Ito et al. 2000). Le ratio
MMP2/proMMP2 est augmenté dans le CRC (Parsons, Watson et al. 1998) (Waas, Lomme et
al. 2002) induisant une survie réduite (Inuzuka, Ogata et al. 2000). La surexpression de la
MMP9 induit une récurrence plus rapide du CRC et une survie diminuée (Zucker, Lysik et al.
1995). De la même manière, la surexpression de MMP13 est corrélée avec une survie moins
longue chez les patients atteints de cancer colorectal (Leeman, McKay et al. 2002).
Cependant, la surexpression de MMP n’est pas toujours synonyme de mauvais pronostique
dans ce type de cancer, la surexpression de MMP12 est quant à elle associée avec une survie
plus longue et une angiogenèse diminuée (Yang, Arii et al. 2001).
Ainsi, les altérations du stroma et l’activation des CAFs en particulier sont maintenant
des évènements reconnus pour être impliqués dans le processus tumoral.
Au cours de mes travaux de thèse, je me suis intéressé en premier lieu au rôle de la
progastrine, une hormone digestive uniquement exprimée en condition tumorale par les
cellules épithéliales colorectales, dans l’activation des fibroblastes normaux et dans le
dialogue épithélio-stromal du CRC.
De plus, l’activation des fibroblastes pouvant apparaitre très précocement dans le
processsus tumoral, par des approches immunohistochimiques permettant de détecter
l’expression de FAPa, j’ai recherché si cette activation était détectable dans les polypes
hyperplasiques dont des études récentes, dont celle de notre équipe, ont montré qu’ils
pouvaient correspondre à des évènements pré-néoplasiques. Dans un second temps, j’ai
déterminé le potentiel rôle de FAPα en tant que marqueur prédictif du risque de néoplasie
chez les patients atteints de polypes hyperplasiques.
67
-
RESULTATS
68
Résultats
- 1er article
A. 1ER ARTICLE
I. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au dialogue épithélio-stromal dans le
cancer colorectal, et en particulier au rôle de la progastrine dans l’activation des fibroblastes
normaux colorectaux. Mais qu’est-ce que la progastrine et pourquoi penser qu’elle puisse
être impliquée dans ce processus ?
a) LA PROGASTRINE :
La progastrine (PG) est un précurseur de synthèse de la gastrine, une hormone
digestive peptidique.
1. Expression de la progastrine :
En condition physiologique, le gène de la gastrine est principalement exprimé au
niveau de l’estomac et du duodénum proximal. La gastrine régule la sécrétion acide
gastrique en induisant la libération d’ions H+ au niveau de l’estomac pendant la digestion.
Elle agit en particulier sur deux types cellulaires. Les cellules pariétales vont libérer
directement les ions H+ et les cellules enterochromaffin-like (ECL) vont alors produire de
l’histamine allant agir sur les cellules pariétales en induisant la sécrétion de H + dans la
lumière de l’estomac.
La gastrine est synthétisée par les cellules endocrines de l’antre gastrique sous forme
de préprogastrine (Boel, Vuust et al. 1983). Cette prohormone de 101 acides aminés va
ensuite subir, entre le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi, un premier clivage de
son peptide signal de 21 acides aminés situé en N-Terminal devenant la progastrine. La suite
du processus de maturation fait intervenir une famille d’endopeptidases : les prohormones
convertases et la carboxypeptidase E qui vont clivées plusieurs fois la prohormone
aboutissant à des précurseurs non amidés de la gastrine possédant une glycine carboxyterminale : la G34-gly et G17-Gly. Ces proformes seront maturés par la PAM (Peptidyl-glycine
α-Amidating Monooxygenase) qui va induire la forme mature de la gastrine amidé sur sa
partie C-Terminale (Figure 38) (Rehfeld 1998). Ainsi, les formes de gastrines amidés (G34NH2 et G17-NH2) sont quasiment les seules formes sécrétées par les cellules endocrines de
l’estomac. Les formes précurseurs de la gastrine (progastrine et gastrine non amidé) ne sont
retrouvées qu’en très faible concentration dans l’estomac ou le sang (Rehfeld 1998). Cette
quantité négligeable de progastrine produite par les cellules normales fait que cette
proforme ne semble pas impliquée dans des processus biologiques en condition
physiologique. Le gène de la gastrine n’est pas exprimé au niveau du côlon chez les individus
sains adultes.
69
Résultats
- 1er article
En condition tumorale, l’expression du gène de la gastrine a été constatée dans le
colon. Au cours de la carcinogénèse colique, des altérations génétiques apparaissent très
précocement et touchent notamment le gène suppresseur de tumeur APC (Adenomatosis
Polyposis Coli) et l’oncogène K-Ras (Kirsten rat sarcoma). Ces altérations ont pour
conséquence l’activation de la transcription de gènes cibles dont celui de la gastrine. En effet,
la mutation APC, retrouvée dans près de 80% des cancers colorectaux, conduit à une
activation constitutive de la voie Wnt. Or, le gène de la gastrine possède plusieurs éléments
de liaison du complexe β-Caténine/TCF-4 appartenant à cette voie (Koh, Bulitta et al. 2000).
Le gène K-Ras, muté dans près de 50% des cancers colorectaux, peut activer la voie du signal
des MAPKs (Mitogen-activated protein kinases). Or, le gène de la gastrine est une cible de
cette voie (Nakata, Wang et al. 1998). De plus, une coopération entre Ras et la β-Caténine a
été décrit aboutissant à une expression encore plus importante de progastrine (Chakladar,
Dubeykovskiy et al. 2005).
La dernière voie impliquée dans l’activation du gène de la progastrine est la voie de
l’EGF. Les cellules tumorales coliques contrôlées par la boucle autocrine TNFα/EGF ont une
expression du gène de la PG due à la présence d’un élément de réponse à l’EGF dans son
promoteur (Watson, Robinson et al. 2000).
Ainsi en raison d’un défaut de maturation dans les cellules tumorales coliques dû à
un déficit en matériel enzymatique et en co-facteurs nécessaires à une biosynthèse efficace
conduisant à la forme peptidique gastrine de 17 acides aminées amidées, cette
70
Résultats
- 1er article
surexpression du gène aboutit à la sécrétion des formes non matures de la gastrine et en
particulier, la progastrine.
Ainsi, la progastrine est retrouvée en forte concentration dans les tumeurs
colorectales et dans le sang des patients atteints par ce type de cancer (Siddheshwar, Gray
et al. 2001). Elle représente la forme principale de peptides gastriniques produites dans les
CRC (Nemeth, Taylor et al. 1993) (Singh, Xu et al. 1994) (Smith and Watson 2000). Suite à
l’exérèse tumorale, la chute du taux de progastrine retrouvé dans le sang met en exergue le
lien entre la tumeur et la prohormone.
2. Rôle de la progastrine dans la carcinogenèse :
Il est maintenant établi que la progastrine est un facteur de croissance pour les
cellules épithéliales colorectales (Baldwin, Hollande et al. 2001) (Brown, Yallampalli et al.
2003) (Singh, Lu et al. 2003). L’inhibition de cette prohormone par une approche de siARN
ou de shARN a montré une inhibition de la prolifération des cellules tumorales in vitro (Singh,
Owlia et al. 1996) (Grabowska, Hughes et al. 2007) ainsi qu’une diminution de la
tumorigénicité de ces cellules après xénogreffes sur des souris immunodéficientes
(Pannequin, Delaunay et al. 2007). Ces effets prolifératifs ont été démontrés in vivo par la
génération des souris transgéniques hGAS. Chez ces souris, un transgène codant pour la
préprogastrine humaine est ciblé au niveau du foie et du pancréas. La maturation incomplète
de la prohormone par les hépatocytes fait que ces souris ont un taux élevé de progastrine
circulante alors que le taux de gastrine est normal. De façon intéressante, le seul phénotype
réel constaté chez ces animaux est au niveau colique. En effet, ces souris ont une muqueuse
colique hyperplasique ayant un index prolifératif plus élevé que celui observé chez les souris
sauvage (Wang, Koh et al. 1996). De plus, après une exposition à des rayonnements gamma,
ces souris ont un taux de mitose plus important (Ottewell, Watson et al. 2003). Ces souris
ont aussi un taux d’apparition de lésions néoplasiques et d’ADK plus important après
traitement avec un carcinogène colique, l’azoxyméthane (Singh, Velasco et al. 2000). Un
phénotype similaire est retrouvé dans un autre modèle murin surexprimant la progastrine
dans lequel le transgène est sous le contrôle du promoteur de la FABP (fatty acid binding
protein) ciblant son expression au niveau colique (Cobb, Wood et al. 2004).
La progastrine a aussi un effet anti-apoptotique, elle diminue la fragmentation de
l’ADN des cellules épithéliales coliques en réponse à la camptothécine qui est un inhibiteur
de la topoisomérase-1 qui provoquent l’apoptose via les caspases 3 et 9 (Wu, Owlia et al.
2003). Cela a été retrouvé in vivo puisque les souris hGAS, après traitement à
l’azoxyméthane, présentent un index apoptotique inférieur aux souris sauvage (Umar, Sarkar
et al. 2009).
La PG est aussi impliquée dans les processus d’adhésion et de migration des cellules
épithéliales colorectales via la modulation des jonctions serrés (ZO-1, occludine) et
adhérentes (β-Caténine et E-Cadhérine). En effet, l’inhibition de la PG induit une
71
Résultats
- 1er article
augmentation de l’expression et de la localisation membranaire de ZO-1, de l’occludine et
de l’E-Cadhérine. Le traitement à la PG de ces cellules réverse ces effets et induit une
dissociation du complexe β-Caténine/E-Cadhérine. Ainsi, il a été montré que la PG induisait
une diminution de d’adhésion cellule-cellule et augmentait la mobilité cellulaire (Hollande,
Lee et al. 2003). Une autre étude où la progastrine endogène a été éteinte (par siRNA), cette
extinction induit l’expression d’ICAT qui est un inhibiteur de la ß-Caténine et du Tcf-4. Ainsi
dans cette étude, la déplétion de la progastrine induit une inhibition des effets prooncogéniques induit par l’altération de la voie APC (Pannequin, Delaunay et al. 2007). La
progastrine a également un rôle dans le maintien de caractéristiques souches de ces cellules.
Une étude a montré que dans une lignée épithéliale tumorale, une partie de ces cellules
exprimait des marqueurs souches tels que CD133, CD44 et LGR5. L’inhibition de l’expression
de la PG, conduisait dans ces cellules à une perte d’expression de ces marqueurs. De plus,
ces cellules n’étaient plus capables d’induire des tumeurs après xénogreffe. Le changement
morphologique associé à la perte d’expression de la prohormone peut refléter un
changement de l’état de différenciation de ces cellules (Ferrand, Sandrin et al. 2009). Plus
récemment, une étude a montré que l’inhibition de la progastrine induit l’inhibition de la
voie Notch par l’inhibition de la transcription de Jagged-1 qui est un ligand de la voie Notch
(Pannequin, Bonnans et al. 2009).
3. Impact de la progastrine sur les CAFs :
Une étude consacrée aux effets de la progastrine sur les fibroblastes a été publiée il
y a quelques mois. Elle montre que dans le modèle de souris hGAS, souris surexprimant la
PG, un nombre de fibroblastes exprimant αSMA (marqueur d’activation fibroblastique) plus
important a été observé dans la muqueuse colorectale en comparaison à ce qui est observé
chez les souris sauvages. De plus, la PG induit la prolifération de fibroblastes normaux
humains via les voies PKC et PI3K. Il a également été démontré que le milieu conditionné de
ces fibroblastes stimulés à la progastrine induisait la prolifération d’une lignée de cellules
humaines tumorales coliques (HT29) et que ce phénomène passait par la sécrétion de
l’insulin growth factor 2 (IGF-2) (Duckworth, Clyde et al.) par les fibroblastes.
72
Résultats
- 1er article
II. ARTICLE 1 :
De nos jours, des campagnes de détection ont été mises en place pour essayer de
dépister le plus précocement ce type de cancer afin de réduire son taux de mortalité. En
effet, ce cancer a une grande capacité à métastaser. Si le diagnostic est posé assez tôt, c’està-dire tant que la tumeur se cantonne à la muqueuse colorectale seule, et avant qu’elle ne
devienne invasive et développe des métastases ganglionnaires puis hépatiques ou
pulmonaires, la résection de la tumeur primaire in situ par chirurgie suffit bien souvent à
traiter, voire soigner définitivement, le patient. Ainsi, la compréhension des évènements
impliqués lors du processus métastatique est essentielle pour la lutte contre cette maladie.
Or, il est maintenant établi que la progastrine est un facteur de croissance pour les cellules
épithéliales tumorales colorectales, et favorise leur migration et l’invasion des tissus
environnant la tumeur. Au cours de ma thèse, j’ai recherché si la progastrine sécrétée par
les cellules épithéliales tumorales colorectales contribue à l’activation des fibroblastes situés
dans le stroma à proximité, et si cette activation pouvait réguler les capacités invasives des
cellules tumorales épithéliales colorectales.
73
Résultats
- 1er article
Progastrin promotes the myofibroblastic differentiation of normal resident
colon fibroblast and participates to the dialogue between fibroblasts and
tumour epithelial cells via SDF-1 and IL-8.
Nicolas FENIE1, Aurélien LACOMBE1, Claudine BERTRAND1, Corinne BOUSQUET1, Constance
BRIGNATZ2, Timothy C. WANG3, Christine TOULAS1,4, Elizabeth COHEN-JONATHANMOYAL1,4, Audrey FERRAND1¤.
1
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale UMR.1037 - Cancer Research Center of
Toulouse (CRCT), Université Paul Sabatier Toulouse III, Toulouse, France. 2 CNRS UMR5237, University
of Montpellier 1 and 2, CRBM, 34000 Montpellier, France. 3Division of Digestive and Liver Diseases,
Department of Medicine, Irving Cancer Research Center, Columbia University, New York, New York.
4 Institut
Claudius Régaud, Toulouse, France.
¤
Correspondence to: Audrey FERRAND
INSERM UMR.1037 - Cancer Research Center of Toulouse (CRCT), Université Paul Sabatier Toulouse
III, Institut Claudius Régaud, 20-24 rue du pont saint-Pierre, 31052 Toulouse cedex, France.
[email protected] Phone: +33567222721
Supported by: This work was supported by grants from INSERM, Association pour la Recherche
contre le Cancer (ARC N° A09/4/5033, ARC SFI 20111203828) and the BQR grant from Toulouse III
Paul Sabatier University (France).
Running title:
Disclosure of Potential Conflicts of Interest: No potential conflicts of interests were disclosed.
Acknowledgments
74
Résultats
- 1er article
Introduction
Colorectal cancer (CRC) has a reputation of curable disease. However, despite colorectal cancer
screening campaigns, despite a good knowledge of its adenocarcinoma sequence and a thorough
characterization of the mutations involved along its tumour process, colorectal cancer remains the
second most common cause of cancer-related death worldwide1-4.
CRC has a high invasive and metastatic potential that makes it fatal. Indeed, the appearance of
metastasis generally reflects the entrance of the disease into its terminal phase. Thus, it is of
particular interest to understand the events involved in the metastatic process.
The role of the microenvironment in the cancer process is important 5, 6. Indeed, the interactions
between the tumour itself and its surrounding stroma appear to be essential to the tumour
development and invasive capacity. Cancer cells are immersed in a complex microenvironment
network comprising numerous cells. One of the key cellular components in the microsystem of the
tumour reactive stroma is the myofibroblast or cancer-associated fibroblast (CAF). CAFs,
corresponding to fibroblasts present in the tissue stroma that are activated by signals induced by the
tumour, represent the main cell population within the stroma7. They are involved in carcinogenesis
by regulating, for example, the proliferation and survival of epithelial cells or contribute to their
dedifferentiation in vivo6, 8. They also promote angiogenesis 9, 10. Moreover, they are found in high
number in the invasive and metastatic cancers contributing to the metastatic potential of tumours.
Indeed, they are involved in matrix remodelling and formation of tracks for cancer cells, promoting
their motility and aggressiveness6. Regarding more specifically the role of CAFs in CRC, they
contribute to tumour growth and progression9, 11, and to the tumour survival in hypoxic
environment11. Moreover, they greatly increase the metastatic potential of the primary tumour9.
Finally, the presence of CAFs in the colonic tumour stroma is associated with a poor prognosis for the
patient 12.
Whereas the role of tumour-stroma crosstalk in carcinoma development and progression are
increasingly documented, how “normal” resident fibroblasts are converted into tumour-activated,
pro-invasive CAFs and how CAFs modulate this dialogue remains an open question. Malignant cells
themselves promote carcinogenesis through cytokines and growth factors secretion that influence
stroma cells behaviour, which in turn favour carcinoma cell invasion and malignancy. Uncovering
molecules and signalling pathways that govern stromal fibroblasts and carcinoma cells dialogue
during invasion could lead to the identification of therapeutic target for the invasive and aggressive
states of the cancer process.
Progastrin is a precursor of the digestive peptide hormone Gastrin13. Gastrin is mainly produced in
the stomach and is responsible for gastric acid secretion. Under physiological condition, its gene is
not expressed in the colon in adults. However, during colorectal carcinogenesis, genetic alterations
affecting the tumour suppressor gene APC (Adenomatosis Polyposis Coli) and K-Ras (Kirsten rat
sarcoma) oncogene occur very early. Indeed, APC mutation, found in 80% of colorectal cancers, leads
to constitutive activation of the Wnt pathway. The gastrin gene has several response elements to
the β-Catenin/TCF-4 complex, downstream effectors of this pathway 14. K-Ras, mutated in about 50%
of colorectal cancers, activates the MAPKs (mitogen-activated protein kinases) signalling pathway.
However, the gastrin gene is a target of this pathway 15. In addition, cooperation between Ras and βcatenin has been shown to lead to an even greater expression of progastrin 16. The EGF pathway is
75
Résultats
- 1er article
also involved in the activation of the gastrin gene. The colon tumour cells that are under the control
of the TNF/ EGF autocrine loop, display an expression of the gene due to the presence of EGF
response elements on its promoter 17. As a consequence of these different alterations, gastrin gene
turns to be expressed in tumour colorectal epithelial cells. However, these cells do not have the
enzymes and co-factors necessary for a proper maturation of the hormone and thus mainly produce
its pro-hormone, progastrin 18-21. Progastrin controls the proliferation and survival of colon epithelial
cells. This was demonstrated on cell lines and on the epithelial cells of the colon mucosa of the
progastrin-overexpressing transgenic mice, the hGAS mice22, 23. These animals exhibit hyperplasia and
hyperproliferation of the colonic mucosa, aberrant crypt foci and an increased susceptibility to
develop tumour when treated with azoxymethane, a colon carcinogen24, 25. Moreover, progastrin has
recently been shown to control the differentiation status of colon epithelial cells and to be crucial to
the tumour capacity of CD133+ colorectal cancer cells26.
In humans, the involvement of progastrin in CRC is suggested by several clinical observations. Its
serum concentration, unlike that of mature gastrin, is increased in patients with CRC 27 whereas
progastrin is not detected in the blood of healthy subjects. Progastrin is detected in 80% to 90% of
human colon cancers 28. On the other hand, a study shows that tumour resection induces a decrease
in serum progastrin, but not mature gastrin 29 demonstrating a direct link between the tumour and
the gastrin precursor.
Recently, Duckworth et al. reported that progastrin stimulates myofibroblast proliferation and
indirectly controls colonic epithelial proliferation via the secretion of Insulin-like growth factor 2 by
colonic myofibroblasts 30. Here, we investigated whether progastrin participates to the conversion of
the normal resident fibroblasts into pro-invasive CAFs and how it modulates the dialogue between
these CAFs and the colorectal tumour epithelial cells.
76
Résultats
- 1er article
Material and Methods
Animals
hGAS (in a FVB/N background) and control FVB/N mice used in this study have been previously
described22. Animals were reared in routine animal facility and maintained on a 12:12 hours lightdark cycle. All the experiments were performed during the daytime. At least 4 hGAS mice and 4
corresponding control FVB/N littermate mice (22–24 weeks) were used. All procedures were
approved by animal facility care committee.
Immunohistochemistry on colon tissues
For immunohistochemistry on the formaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissues, heat-induced
epitope retrieval was done in citrate buffer and primary antibodies were applied overnight. For αSMA
and FAPα staining, detection was done using the Polyview kit (Vector laboratories). For SDF-1 and IL8
staining, the DakoCytomation Envision+ system-HRP was used for detection. Antibodies: αSMA
(Abcam, ab21027); FAPα (Abcam, ab53066); IL-8 (Sigma-Aldrich, WH0003576M5); SDF-1 (R&D
systems, MAB350).
Cell culture
The human colon cancer cell line HCT116 and the human normal fibroblasts cell line CCD18Co were
grown in DMEM 4,5g/L glucose (HCT116) or DMEM-F12 (CCD18Co) supplemented with 10% FCS at
37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2. In all experiments, cells were serum-starved for
24 hours prior progastrin stimulation or being put in presence of the HCT-116 cells. When needed,
cells were counted using a Coulter electronic counter. When indicated, CCD18CO fibroblasts were
stimulated with a synthetic progastrin peptide (polypeptide) at 10-8 M or pre-treated with the
pharmacological PI3K inhibitor LY294002 (Calbiochem, 154447-36-6) at 10M as indicated.
Western-blot analysis
Cells were washed once with PBS and then with buffer A (50 mM HEPES, pH 7.5, containing 150 mM
NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4). Cells were homogenized in lysis
buffer (buffer A containing 1% Nonidet P 40, 0.5 mM PMSF, 20 M leupeptin, 10 g/ml aprotinin) for
15 min at 4°C. Protein concentrations were obtained using the BCA assay (Calbiochem). Proteins were
separated by SDS–PAGE and transferred to nitrocellulose membranes. Proteins were resolved on
10% polyacrylamide gels and transferred to PVDF membrane. Membranes were blocked in non-fat
dry milk or BSA according to the antibody manufacturer recommendations, incubated overnight at
4°C in primary antibody, followed by secondary antibody (Pierce). Signal was detected with
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific). Antibodies: αSMA (Abcam,
ab7817); FAPα (Abcam, ab53066); GAPDH (Santa-Cruz, sc-25778).
HCT116-ShPG and HCT116-ShLuc generation
The shRNA sequences directed against PG (GAAGAAGCCTATGGATGGA) or Luciferase (shLuc)
(clontech) as a negative control were cloned in the pSiren-retroQ. shRNA were transduced in HCT116
cells by retroviral infection as described in Sirvent et al. selected in a polyclonal background with
1µg/ml puromycin 31.
Migration Test
For cell migration assays, CCD18Co fibroblasts were plated on the bottom chamber at 5 x 105 cells/ml
in triplicate in 12-well plates. Cells were put under serum-free condition during 24 h before the
77
Résultats
- 1er article
transwell apparatus containing the epithelial cells was put in contact. Epithelial cells were seeded in
transwell apparatus (8.0 µm pores) at 5 x 106 cells per insert. Cells were allowed to adhere for 4h
before the transwell was added on the wells containing the fibroblasts. After 4 hours, epithelial cells
were put in serum-free media and then allowed to migrate for 20 hours before fixation with 4%
paraformaldehyde. Epithelial cells were stained with crystal violet. Pictures were taken with a Nikon
E400 microscope coupled with a Sony DXC 950 camera and reconstitution was done using Morpho
Mosaic software. Quantification was performed with Morpho Expert software. Cells were then
quantified.
Generation of Conditioned Media From HCT116 Cells to treat CCD18Co cells
ShLuc- or shPG- HCT116 cells were plated (500 000cells/ml), grown for 24 hours and media was
replaced with serum-free media. 20 hours later, media was collected and centrifuged at 1000 rpm
for 5 minutes. Conditioned media for CCD18Co cells was done by mixing 1:1 serum-free DMEM-F12
to the supernatant obtained after the above mentioned centrifugation.
RNA extraction, reverse transcription, Real-Time Quantitative RT-PCR:
Total RNA was isolated from cells by using the RNeasy RNA Isolation Kit (Qiagen, Valencia, CA). After
pretreating RNA with DNase (Invitrogen, Carlsbad, CA), cDNA was produced from 1 µg of total RNA
using the Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). mRNA
expression was determined via real-time PCR, using fluorescent SYBR green dye (Applied
Biosystems, Framingham, MA) to allow semi quantitative analysis of gene expression levels.
Amplification was conducted using ABI-Stepone + Detection System (Applied Biosystems,
Framingham, MA). Relative fold changes were determined using the 2ΔΔDDCT method, in which
ACTB gene was used for normalization. Forward and reverse primers used : SDF-1, forwardTGCCAGAGCCAACGTCAA,
reverse-GCTACAATCTGAAGGGCACAGTT
;
IL-8,
forwardCTGGCCGTGGCTCTCTTG,
reverse-CTTGGCAAAACTGCACCTTCA
;
ACTB,
forwardGCGCGGCTACAGCTTCA,
reverse-CTTAATGTCACGCACGATTTCC;
GAS,
forwardTCCATCCATCCATAGGCTTC, reverse-CCACACCTCGTGGCAGAC.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA):
Cells were plated in 100mm dishes. After 24 hours, the supernatants were collected. Supernatants
were concentrated (Centricon, Millipore) and were analyzed for SDF-1 and IL-8 using ELISA system
from R&D system according to manufacturer’s instructions. Results were normalized by counting the
cells in each well.
Generation of Conditioned Media From CCD18Co to treat shLuc- or shPG- HCT116
CCD18Co cells were plated (100 000cells/ml), grown for 24 hours and media was replaced with
serum-free media. 20 hours later, media was collected and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes.
Conditioned media for both HCT116 cell lines was done by 1:1 mixing serum-free DMEM to the
supernatant obtained from the above centrifugation.
Statistical analysis
Means (± SEM) were calculated and Students’ t-tests were performed using GraphPad Prism
(GraphPad, San Diego, CA, USA). The statistical significance is indicated by the following symbols:
***, P < 0.001; **, 0.001 < P < 0.01; *, 0.01 < P < 0.05; ns: P > 0.05.
78
Résultats
- 1er article
Results
Progastrin activates normal colon fibroblasts
We first aimed to elucidate whether progastrin may participate to the conversion of normal resident
colon fibroblasts into activated fibroblasts, we thus investigated the activation status of colonic
mucosa fibroblasts in hGAS mice. FAPFibroblast Activation Protein is a serine protease
expressed in more than 90% of epithelial cancers and specific to the activation status of the
fibroblasts. In epithelial-derived tumours, it is expressed by CAFs but not by the cancer epithelial
cells, and represents a marker of the activation of the surrounding fibroblasts by the tumour 32, 33.
FAPα expression was analysed on colonic tissue sections by immunohistochemistry methods using a
FAPα specific antibody. As shown in figure 1A, tissues derived from hGAS mice displayed an
expression of FAPα within the stroma while no FAP staining was observed in tissue from control
FVB/N mice suggesting that progastrin induces colonic fibroblast activation. A similar analysis was
performed for the expression of alpha-smooth muscle actin (SMA). Indeed, expression of the alphasmooth muscle actin by fibroblasts distinguishes fibroblasts that are activated and have acquired a
CAF phenotype from normal fibroblasts34. As recently described by Duckworth et al. in the hGAS
model on a C57BL/6 background30, we observed in hGAS mice on the FVB/N backgroung an
expression of SMA in tissue section of the transgenic mice while, unlike Duckworth et al. who
detected a weak expression in their control mice, no staining was detected in colon sections from
the control FVB/N animals (Figure 1A).
We then confirmed on the human normal colonic fibroblast cell line CCD18Co, the direct role of
progastrin on fibroblast activation. Progastrin-induced FAP and SMA expressions were
investigated by western-blot analysis performed on protein lysates from progastrin-stimulated
CCD18Co cells (Figure 1B). Both FAP and SMA expressions were significantly increased
(respectively mean ± SEM; 3.10 fold ± 0.28; P=0.0088; n=4 and 2.84 fold ± 0.34; P=0.022; n=3) after
20 hours of treatment with the progastrin (Figure 1B).
Progastrin-overactivated fibroblasts promote tumour epithelial cell migration
Fibroblast activation participates to the regulation of epithelial tumour cell migration. In CRC,
progastrin is produced by the epithelial tumour cells and then secreted into the surrounding tissue.
Thus, in order to investigate the relevance of the fibroblast activation induced by the secreted
progastrin on epithelial tumour cell migration, we used the human tumour cell line HCT116 which
produces and secretes progastrin20. After transduction with retrovirus containing either shRNA
sequences directed against progastrin (ShPG) or Luciferase (shLuc), we generated the HCT116-ShPG
cells that displayed a 60% ± 1.2 (P=0,00035 ; n=3) decrease of gastrin gene expression and HCT116ShLuc cells, used as control, in which gastrin gene expression was not affected (See Supplementary
figure).
HCT116-ShPG and HCT116-ShLuc migration in presence or absence of fibroblasts was
evaluated using a transwell apparatus. Serum starved HCT116 cells, plated on the upper chamber,
were allowed to migrate for 20 hours in presence or not of CCD18Co fibroblasts plated on the bottom
chamber of the apparatus. As shown in Figure 2, no difference in epithelial cell migration was
79
Résultats
- 1er article
observed in absence of fibroblasts. However, in presence of CCD18Co fibroblasts, an increased
migration of 3.34 fold ± 0.35 (P=0.0037; n=5) was observed for HCT116-ShPG cells and of 4.69 fold ±
0.26 (P=0.00012; n=5) for HCT116-ShLuc cells, indicating that fibroblasts are necessary for the
migration of the HCT116 cells. Moreover, a significant difference in migration (p=0.001) was found
between the progastrin-expressing cells and the ones transduced with the retrovirus containing the
ShRNA sequences directed against progastrin suggesting that the peptide, secreted by the tumour
epithelial cells, over-activates colon fibroblasts and in turns, favors tumour epithelial cell migration.
In order to confirm that, we assessed HCT116-ShPG migration after pre-conditioning of the
fibroblasts for 20 hours with either the HCT116-ShPG or HCT116-ShLuc cells. Briefly, same conditions
as above were used to pre-condition the fibroblasts, but after 20 hours, transwells containing the
epithelial cells were replaced by transwells containing HCT116-ShPG cells as described in Figure 2.
Progastrin-induced overactivation of the fibroblasts and its effect on tumour epithelial cell migration
was confirmed since a significant 2,66 fold ± 0.43 (P=0.0079; n=3) increase was observed in HCT116ShPG migration when the fibroblasts were first put in presence of HCT116-ShLuc in the upper
chamber.
Progastrin-overactivated fibroblasts produce and secrete the stromal-derived factor-1 (SDF-1)
To better understand the molecular mechanisms involved by progastrin to favour fibroblastpromoted tumour epithelial cell migration, we aim to identify factors secreted by fibroblasts in
response to progastrin that could induce epithelial cell migration.
SDF-1 (also called CXCL12) is part of the family of CXC ligands due to the position of its two
N-terminal cysteines. SDF-1 mediates its effect via a G protein-coupled receptor, CXCR435. In CRC,
SDF-1 has been shown to play an important role in the metastatic process and because of its
involvement in tumour growth, dissemination and angiogenesis, CXCR4 represents an interesting
putative therapeutic target in gastrointestinal cancers35, 36.
We first quantified the expression of the SDF-1 mRNA by CCD18Co fibroblasts when
cultivated during 20 hours in HCT116-ShPG or HCT116-ShLuc conditioned medium (CM). As shown in
Figure 3A, SDF-1 mRNA expression is significantly increased by 1.91 fold ± 0.21 (P=0.0029; n=3) under
HCT116-ShLuc CM as compared to HCT116-ShPG CM. We then tested the direct effect of progastrin
on this expression. When CCD18Co were directly stimulated by the progastrin peptide, we observed
a significant increased SDF-1 mRNA expression (2.249 fold ± 0.34; P=0.040; n=3) in response to a 20
hours stimulation (Figure 3B).
Using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), we then found that SDF-1 secretion in
the cell culture medium was 2.09 fold ± 0.19 (P=0.032; n=3) higher in response to a 20 hour treatment
with progastrin (Figure 3C). These results confirm that progastrin induces SDF-1 expression and
secretion by colonic fibroblasts. Interestingly, SDF-1 expression was also found increased in the colon
mucosa of the hGAS mice as compared to the control FVB/N mice (Figure 3D).
Progastrin-overactivated fibroblasts produce and secrete the interleukin-8 (IL-8)
Similar analyses were performed regarding the chemokine IL8. As SDF-1, interleukin-8 (or
CXCL8) is part of CXC-ligands. This cytokine is able to bind two G protein receptors: CXCR1 and CXCR2.
80
Résultats
- 1er article
Under normal conditions, IL-8 is mainly involved in the regulation of the immune system during
inflammatory processes. In CRC, high level of IL-8 in the microenvironment has been shown
responsible of a higher peri-tumoural angiogenesis and a greater metastatic capacity 37. Moreover,
IL8 has been reported to be overexpressed in CRC CAFs 38. In CRC, IL-8 is believe to represent a
putative therapeutic target39.
The expression of the SDF-1 mRNA by CCD18Co fibroblasts was quantified after 20 hours of
culture in HCT116-ShPG or HCT116-ShLuc conditioned medium (CM). IL-8 mRNA expression is
significantly increased by 2.14 fold ± 0.20 (P=0.017; n=3) under HCT116-ShLuc CM as compared to
HCT116-ShPG CM (Figure 4A). When CCD18Co were directly stimulated by the progastrin peptide,
we observed a significant increased IL-8 mRNA expression (1.42 fold ± 0.09; P=0.040; n=3) in response
to a 20 hours stimulation (Figure 4B).
Using ELISA, IL-8 secretion in the cell culture medium was found 1.18 fold ± 0.03 (P=0.0043;
n=4) higher in response to a 20 hour treatment with progastrin (Figure 4C). These results confirm
that progastrin induces IL-8 expression and secretion by colonic fibroblasts. As for SDF-1, IL-8
expression was also found increased in the colon mucosa of the hGAS mice as compared to the
control FVB/N mice (Figure 4D).
Both SDF-1 and IL-8 secreted by progastrin-overactivated fibroblasts promote the migration of the
epithelial tumour cells HCT116
The involvement of both SDF-1 or IL-8 in progastrin-overactivated fibroblats effect on
HCT116 migration was tested using similar migration test as above; however, either SDF-1 or IL-8
neutralizing antibodies were added in the culture media of the normal human colon fibroblasts
CCD18Co when the fibroblasts were put in presence of the transwells containing the HCT116
epithelial cells (ShPG or ShLuc). As shown Figure 5A, no significant differences was found for the
HCT116-ShPG cells since their migration rate in presence of one or the other neutralizing antibody
stayed similar to the condition without antibody treatment. However, both SDF-1 and IL-8
neutralizing antibodies totally repressed (P values are respectively of 0.047 and 0.022) the effect of
the progastrin-overactivated fibroblats on HCT116-ShLuc migration confirming that both chemokines
participate to progastrin-induced fibroblast pro-migratory effect on tumour epithelial cells.
After demonstrating that progastrin-induced activation of colonic fibroblasts regulates the migration
of the HCT116 cells via SDF-1 and IL-8, we decided to investigate whether this activation can impact
on the expression of the receptors for SDF-1 and IL-8 by tumour epithelial colorectal cells. In order
to do so, we analysed the level of mRNA expression for these receptors in HCT116-ShLuc and HCT116ShPG in presence of conditioned medium from fibroblasts stimulated for 20h with progastrin (CM
PG-AF) or not (CM N-AF), or in DMEM, their regular culture medium (-CM) (Figure 5B, C and D). No
difference in the basal level of expression of the different receptors was observed between the
HCT116-ShLuc and HCT116-ShPG. Regarding CXCR4 mRNA expression in HCT116-ShLuc, a significant
increase of 4.23fold ± 0.20 (P=0.003; n=3) and of 5.13 fold ± 0.64 (P=0.023; n=3) was observed
respectively in presence of CM N-AF and of CM PG-AF; however, no significant difference was found
between the two conditions in fibroblast CM. Morever, in HCT116-ShPG, although we could observed
a tendency to overexpressed the receptor mRNA in CM PG-AF, no significant value was found
between the conditions (Figure 5B). CXCR1 mRNA expression in HCT116-ShLuc, was significantly
increased of 1.90 fold ± 0.23 (P=0.046; n=3) and of 1.55 fold ± 0.035 (P=0.003; n=3) respectively in
81
Résultats
- 1er article
presence of CM N-AF and of CM PG-AF; however, no significant difference was found between the
two conditions with fibroblast CM. Similarly, in HCT116-ShPG, fibroblast CM induced an
overexpression of CXCR1mRNA (CM N-AF: 1.07 fold ± 0.09 (P=0.015; n=3) and CM PG-AF: 2.19 fold ±
0.16 (P=0.013; n=3)). Interestingly, in these epithelial cells that express lower level of progastrin,
putting them under CM PG-AF condition significantly increases CXCR1 expression compared to cells
under CM N-AF. Il-8 can also mediates its action via CXCR2. Contrary to CXCR1, no CXCR2 mRNA
expression regulation could be measured unless for HCT116-ShLuc cells under CM PG-AF condition
(1.52 fold ± 0.07 (P=0.016; n=3). Thus, progastrin-overactivation of the fibroblasts seems to be able
to increase the expression of the SDF-1 receptor, CXCR4, but also CXCR1 one of the IL-8 receptor in
tumour epithelial cells able to express progastrin.
The PI3K/Akt pathway regulates SDF-1 and IL-8 secretions as well as tumour epithelial cell
migration induced by progastrin-overactivated fibroblasts
We previously described that progastrin is able to induce the PI3K/Akt pathway in colonic epithelial
cells 23 and more recently this pathway was shown to regulate the proliferation of CCD18Co cells 30.
Moreover, the literature reports the involvement of the PI3K/Akt signalling pathway in the regulation
of SDF-1 and IL8 expressions 40-42.
We first checked the activation of the PI3K/Akt pathway by progastrin in CCD18Co fibroblasts by
Western blot analysis using specific anti-total Akt antibody and anti-phosphorylated Akt (Ser473) on
cell lysates from Co-CCD18 fibroblasts stimulated by progastrin (10-8M). We observed an increase in
the level of phosphorylated Akt from 3 minutes up to 4h after stimulation with progastrin. Thus,
progastrin induces a sustained activation of the PI3K/Akt pathway in colorectal normal fibroblasts
(Figure 6A).
To test the involvement of this pathway in the secretion of IL-8 and SDF-1, we then measured these
proteins by ELISA in the culture medium of fibroblasts in response to progastrin, with or without 1h
pre-treatment with LY294002 prior to the adding of the peptide. As shown Figure 7B and 7C, both
SDF1 (Figure 6B) and IL-8 (Figure 6C) secretions were dramatically decreased when fibroblasts were
pre-treated with LY294002 before being stimulated by progastrin peptide confirming the role of the
PI3K/Akt pathway in progastrin-induced SDF-1 and IL-8 secretion by colonic fibroblasts.
Finally, we investigated whether this pathway is involved in SDF-1 and IL-8 pro-migratory effects after
their secretion by fibroblasts in response to the peptide (Figure 6D). Prior to being put in presence of
either the HCT116-ShLuc or HCT116-ShPG in the transwell apparatus, fibroblasts were treated for 1h
with the PI3K inhibitor. The migration of the epithelial cells was analysed has described above. We
observed that the pre-treatment of the fibroblasts with LY294002 totally inhibits the migration
induced by the progastrin-overactivated fibroblasts. This suggests that blocking PI3K/Akt signalling
inhibits the secretion of chemokines such as SDF-1 or Il-8 by the fibroblasts and, in turns, abolishes
progastrin-overactivated fibroblast effects on tumour epithelial cell migration.
Discussion
Our understanding of the tumour stroma and the relationship between epithelial tumour tissue and
its associated stroma is still limited. The tumour produces factors that affect the stromal
compartment. Cancer-associated fibroblasts (CAFs) correspond mainly to the fibroblasts present in
the stroma of the tumour tissue that are activated by the signals induced by the tumour and in turns
82
Résultats
- 1er article
deployed a specific cell-biological reprograming leading to a myofibroblastic differentiation43, 44. They
represent the major cell population in the stroma. The CAFs are actively involved in tumour process
by stimulating proliferation, dedifferentiation of epithelial cells and tumour metastasis. Colorectal
cancer is particularly invasive which explains its second rank in terms of mortality. In this cancer, CAFs
contribute to the growth and colon tumour progression, and their presence in the colon tumour
stroma is synonymous with poor prognosis for the patient.
Progastrin, already established as a growth factor for colorectal epithelial cells, is capable of acting
on the surrounding stroma. Duckworth et al. recently reported that progastrin regulates the
proliferation of colonic epithelial cells via the secretion of Insulin-Like Growth Factor 2 from colonic
fibroblast30. Here, our first hypothesis was that progastrin can activate the resident colonic
fibroblasts. This was demonstrated by the FAP and SMA stainings detected in the fibroblasts of
the colon mucosa of the transgenic progastrin over-expressing hGAS mice in a FVB/N background
(Figure 1A). Actually, SMA expression was already reported by Duckworth in their murine model in
a C57BL/6 background, and they assimilated this staining to an increased number of myofibroblasts
while they report that less that 1% of SMA- (or vimentin-) positive cells display Ki67, a proliferation
marker. It is important to note that in normal tissue, resident fibroblast do not express SMA and
the expression of the alpha-smooth muscle actin by fibroblasts is the most significant hallmark to
distinguish CAFs from normal fibroblasts 34. Duckworth et al. reported an approximate 5.3% of SMAand in vimentin-positive cells their wild-type control mice compared to an approximate 7.7% in their
hGAS mice, but they did not comment on that SMA expression in wild-type mice. In our hands, in
the mice on the FVB/N background that we used, we did not observed any SMA expression in the
resident colonic fibroblasts of the control FVB/N mice as expected in normal tissue (Figure 1A). The
non-activated status of the resident fibroblasts in these mice was confirmed by the absence of FAP
expression. However, both fibroblast-activation markers were found expressed by the fibroblasts of
the transgenic progastrin-overexpressing mice clearly showing that progastrin is able to induce the
myofibroblastic differentiation in vivo and thus transform the normal resident fibroblasts into cells
displaying a CAF phenotype. FAP and SMA increased expression in response to direct progastrin
stimulation was also observed in the human normal colonic fibroblast cell line, CCD18Co. In these
cells, however, we could detect a basal level of both markers suggesting that culture conditions lightly
altered the basal activation status of this cell line.
The presence of activated fibroblasts in CRC is associated to a bad prognostic for the patient. This is
certainly due to the fact these fibroblasts actively promote tumour cell migration and thus favor the
metastatic process. Here, we investigated whether progastrin, expressed by tumour epithelial cells,
regulates the activation status of normal colon fibroblast, and whether this activation can induce
signals from the fibroblasts that in turns, positively regulates epithelial cell migration. Our data clearly
indicate that the overactivation of fibroblast by progastrin secreted by the tumour epithelial cells
favors migration (Figure 2). Moreover, we identified the chemokines SDF-1 and IL-8 as mediators of
this process. Both chemokines have previously been shown involved in colorectal cancer and
mediating the migration process. Indeed, SDF-1 is known to enhance both migration and invasion
process45. Moreover, Wang et al. have previously demonstrated in human colon tumour cells that
SDF-1 destabilized the E-cadherin/beta-catenin complex, promoting the migration of these cells47.
Recently, a study reported that CD133+/CXCR4+ colon cancer cells exhibit higher metastatic potential
and correlate to a poor prognostic for the patients. We previoulsy descrived that in the heterogenous
population of colon cancer cells, the one expressing progastrin peptides correspond to
83
Résultats
- 1er article
CD133+/CD44+ stem cell-like population. Here, we show that human colon cancer cell that do
express good level of progastrin display an increased CXCR4 expression on presence of fbroblast
medium, but more interestingly, we observed that the medium from progastrin-overactivated
fibroblasts is able to induce an overexpression of the SDF-1 receptor even in the cells that only
express low level of the peptide (Figure 5B). That suggests that in the colon tissue, once epithelial
tumour cells that secretes progastrin and then activate the resident fibroblasts turning them into
CAFs, factors secreted by these CAFs can, not only, regulate the tumour cells, but also could act on
the adjacent normal cells (by-stander effect) and potentially induce a dedifferentiated phenotype,
introducing them into the tumour process. Il-8 has also been described in the regulation of migration
and invasion of colon tumour cells46. Although no remarkable alteration of CXCR2 expression has
been noticed (Figure 5D), similarly to what observed for SDF-1, we could found regulations of CXCR1
expression in response to fibroblast conditioned medium, this being even more increased when cells
only express low level of progastrin (Figure C). These data again suggest a bystander effect of
progastrin-overactivated fibroblast involving Il-8.
Colorectal cancer is highly metastatic and progastrin seems to contribute to this capacity not only by
acting on the epithelial cell but also by activating the tumour surrounding stroma. A main interest in
invasive cancers is to find therapeutic targets in advanced stages of the pathology such as the
metastasis process, and ideally specific to the pathology. Progastrin is a good candidate. Indeed, it is
not synthesized in normal colorectal tissues, and the presence of this prohormone is specific to the
colorectal neoplastic status. More specifically, it is the colorectal tumour epithelial cells that secrete
this growth factor following APC and K-Ras mutations appearing at the earliest stages of the disease.
Here, we showed that this hormone precursor could induce the activation of resident stromal
fibroblasts colorectal, turning them into CAFs. It therefore intervenes in the remodeling of the
tumour-associated stroma, thereby promoting the formation of metastases. Our results show that
progastrin via activation of fibroblast migration increases the power of colorectal epithelial tumour
cells.
Thus, considering its effect on the tumour cells themselves, but also on the tumour
microenvironment, progastrin is an attractive therapeutic target in colorectal cancer.
84
Résultats
- 1er article
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87
Résultats
- 1er article
Figure Legends
Figure 1: Progastrin induce fibroblast activation in hGAS mice model.
A: Immunohistochemistry images of FAPα and αSMA in the colonic mucosa of FVB/N and hGAS mice
(Magnification x400)
B/C : Western blot showing FAPα (B) and αSMA (C) expression in CCD18Co after stimulation with the
synthetic progastrin peptide (PG) or or not (C).
Figure 2: Migration of HCT-116 shPG or shLuc cells en presence of CCD18Co fibroblasts.
HCT116 epithelial cell migration is enhanced in presence of fibroblasts and even more when the
epithelial cells express progastrin. Same effect was observed with conditioned fibroblasts by shLuc
epithelial cells.
Figure 3: Expression of SDF-1 in progastrin-stimulated fibroblasts.
A/B: Quantitative real-time PCR analysis of relative SDF-1 mRNA level stimulated by HCT-116conditionned media (A) or by rhPG(1-80) (B).
C: Protein secretion level of progastrin stimulated fibroblasts by ELISA.
D: Immunohistochemistry against SDF-1 in FVB/N and hGAS mice. Magnification x400.
Figure 4: Expression of IL-8 in progastrin stimulated fibroblasts.
A/B: Quantitative real-time PCR analysis of relative IL-8 mRNA level stimulated by HCT-116conditionned media (A) or by rhPG(1-80) (B).
C: Protein secretion level of progastrin stimulated fibroblasts by ELISA.
D: Immunohistochemistry against IL8 in FVB/N and hGAS mice. Magnification x400
Figure 5: Impact of neutralizing antibodies against IL-8 and SDF-1 on epithelial cell migration.
A: Down regulation of SDF-1 or IL-8 induces a decreased migration of shLuc cells which migrate like
shPG cells.
B/C/D: Regulation of the mRNA expressions of SDF-1 and Il-8 receptors.
Figure 6: Impact of the PI3K pathway on progastrin-overactivated fibroblasts.
A: Progastrin stimulation induces PI3K pathway activation in fibroblasts.
B/C: Inhibition of PI3K decreases SDF-1 (B) and IL-8 secretion (C). ELISA analysis of SDF-1 and IL8
sercretion by CCD18Co with (PG) or without rhPG (N) (1-80) and treated by DMSO or PI3K inhibitior
(LY294002).
D: Inhibition of PI3K in fibroblasts decreases epithelial cells migration. Fibroblasts were treated by
DMSO or PI3K inhibitor (LY294002) before contact with epithelial cells. LY treatment induces
decrease of epithelial cells migration.
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Résultats
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Résultats
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III. CONCLUSION DE L’ARTICLE 1 :
Dans cette étude, j’ai cherché à déterminer le rôle que pouvait avoir la progastrine
sur les fibroblastes et dans le dialogue qui s’instaure entre ces cellules et les cellules
tumorales.
La progastrine, proforme de la gastrine, n’est exprimée qu’en condition tumorale par
les cellules épithéliales. Cette prohormone va induire l’activation de voie pro-oncogéniques
dans les cellules épithéliales induisant leur prolifération et leur migration.
Or au cours de la carcinogenèse colorectal, une coopération entre les cellules
épithéliales et les fibroblastes va se mettre en place afin de permettre le developpement
tumoral et sa dissémination. J’ai donc cherché à voir si la progastrine produite par ces cellules
pouvait avoir une action sur les fibroblastes adjacents. Ainsi, dans le modèle murin de
surexpression de la progastrine (souris hGAS), j’ai pu constater une activation des
fibroblastes alors que très peu de fibroblastes expriment les marqueurs d’activation αSMA
et FAPα. Par la suite, j’ai confirmé ces observations dans un modèle de fibroblastes normaux
humains (CCD18Co). Sur ce même modèle, j’ai démontré l’impact de la progastrine sur la
voie PI3K, l’expression de chemokines (SDF-1 et IL-8) ainsi que sur la migration épithéliale.
Ainsi, l’expression de la progastrine dans les cellules tumorales coliques, qui est
décrite comme précoce dans la carcinogenèse colorectale (dès la mutation de la voie APC),
va permettre l’activation des fibroblastes adjacents et ce dès l’apparition de cryptes
aberrantes. Suite à cela, les fibroblastes vont pouvoir soutenir l’évolution et la croissance
tumorale jusqu’au processus migratoires qui sont décrit dans mon étude.
BILAN DE L’ARTICLE 1 : Impact de la progastrine dans le dialogue épithélio-mésenchymateux
97
Résultats
-
En perspective à cette étude, de nombreuses pistes pourront être explorées. Tout
d’abord, une étude plus large sur les protéines induites par la stimulation à la progastrine
qui permettra de définir précisément l’effet global de la PG sur les fibroblastes. Une
approche in vivo devra aussi être développée via l’injection orthotopique d’un mélange de
cellules épithéliales exprimant ou non la progastrine avec des fibroblastes. Cela permettra
de déterminer l’impact des fibroblastes et de la progastrine sur la prise tumorale, sur la
prolifération cellulaire et éventuellement sur l’apparition de métastases. Enfin, le blocage de
la progastrine, via l’utilisation d’anticorps bloquants, permettrait non seulement d’avoir un
impact sur les cellules épithéliales mais aussi sur les fibroblastes.
Cette étude montre que la progastrine représente un intérêt supplémentaire comme
cible thérapeutique dans le cancer colorectal puisque l’inhibition de son action permettrait
non seulement d’agir sur les cellules tumorales elles-mêmes mais également moduler
l’activation des CAFs colorectaux.
98
Résultats
- 2nd article
B. 2ND ARTICLE
I. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
Une étude au sein de l’équipe à montrer qu’une forte expression de progastrine dans
les polypes hyperplasiques coliques était corrélée avec une récidive plus fréquente. Suite à
l’analyse de l’expression de FAPα dans ces mêmes polypes nous avons pu constater que
l’expression de FAPα et de la progastrine pouvait avoir un lien. En effet, si une analyse de
corrélation directe entre les deux expressions n’est pas significative (p=0.056), nous avons
pu déterminer que les polypes exprimant fortement la progastrine (plus de 40% de
marquages dans les cellules épithéliales) ont une expression de FAPα supérieure (p=0.032).
Ainsi, l’étude de l’expression de FAPα dans ces polypes nous a paru pertinente afin de
constater si ce marqueur pouvait être un bon marqueur de récidive chez les patients atteints
de polypes hyperplasiques.
Ainsi, mon second travail de thèse a consisté en l’étude de l’expression du marqueur
d’activation fibroblastique FAPα (Fibroblast Activation Protein α) dans les polypes
hyperplasiques. Pour cette étude, nous avons eu accès à la banque de polypes
hyperplasiques colorectaux du service d’anatomopathologie du CHU Rangueil. Cette étude
rétrospective, effectuée sur des polypes réséqués à l’hôpital de Rangueil au cours des années
2000 et 2001, a permis de montrer que les patients dont les polypes hyperplasiques
expriment fortement FAPα présentent un risque de néoplasie supérieur à ceux dont les
polypes expriment peu ou pas le marqueur d’activation fibroblastique.
En introduction de cet article sont abordé une définition des polypes hyperplasiques
colorectaux ainsi qu’une introduction sur la protéine FAPα.
a) LES POLYPES HYPERPLASIQUES DANS LE CRC :
Les polypes hyperplasiques (PH) représentent une entité assez mal définie car leur
position est controversée dans la séquence adénocarcinomale colorectale. Néanmoins, cette
partie cherchera à définir au mieux ce groupe et à mettre en lumière les difficultés de
classification de ce groupe de lésion.
1. Epidémiologie des polypes hyperplasiques :
Des études reposant sur de larges cohortes ont été réalisées et ont permis de définir
la prévalence de ce type de lésion. En effet, sur des cohortes de patients asymptomatiques
de plus de 50 ans, la prévalence des PH est de l’ordre de 10 % au sein des populations
occidentales (Imperiale, Wagner et al. 2000) (Lieberman, Prindiville et al. 2003). Les polypes
hyperplasiques apparaissent généralement à un âge moins élevés que les adénomes. Une
étude menée suite à des autopsies sur des sujets européens a permis de définir que 23 %
des personnes entre 20 et 54 ans présentaient des PH quand seulement 11 % d’entre eux
99
Résultats
- 2nd article
avaient des adénomes (Clark, Collan et al. 1985). Une autre étude a pu montrer que,
contrairement aux adénomes, la présence de PH n’est pas associée à l’âge (Clark, Collan et
al. 1985) (Morimoto, Newcomb et al. 2002).
Les facteurs de risque environnementaux des polypes hyperplasiques sont similaires
à ceux du CRC à savoir l’alcool, le tabac et l’obésité (Martinez, McPherson et al. 1997)
(Morimoto, Newcomb et al. 2002).
2. Histologie des polypes hyperplasiques :
Les polypes hyperplasiques appartiennent aux groupes des lésions festonnées et
présentent donc leurs caractéristiques morphologiques, en particulier leurs architectures
glandulaires en dent de scie. Ce sont de lésions sessiles (aplaties) qui dépassent très
rarement 1 cm. Les festons ne sont présents que sur la moitié supérieure de la crypte et
l’activité proliférative de ces lésions se situe seulement en fond de crypte contrairement aux
adénomes ou la prolifération n’a pas lieu qu’en fond de crypte (Torlakovic, Gomez et al.
2008).
La classification de l’OMS de ce type de lésions distingue trois types de polypes
hyperplasiques classés en fonction des cellules à mucine :
Les polypes hyperplasiques riches en
cellules caliciformes ont des festons peu marqués.
Ce type de polype est retrouvé dans 70% des cas au
niveau du colon distal (O'Brien, Yang et al. 2006).
Les
polypes
hyperplasiques
microvésiculaires sont caractérisés par des festons
proéminents et des vacuoles de mucines. Ces
lésions sont retrouvées aussi bien dans le colon
proximal que distal (O'Brien, Yang et al. 2006).
Les polypes hyperplasiques pauvre en
mucine sont des lésions extrèmement rares et sont
à ce jour mal caractérisés.
100
Résultats
- 2nd article
3. Caractéristiques moléculaires des polypes hyperplasiques :
a) Méthylation des îlots CpG (phénotype CIMP) :
La méthylation des îlots CpG est l’altération la plus fréquente survenant dans les
polypes hyperplasiques. 64 % des PH ont ce phénotype, et parmi eux 65 % sont CIMP-high
ce qui correspond à 42 % sur l’ensemble des PH (O'Brien, Yang et al. 2004). Le phénotype
CIMP-high est 5 fois plus fréquent dans les PH microvésiculaires que dans ceux à cellules
calciformes et sont plutôt associées à une localisation proximale. Les gènes méthylés sont
par ordre de fréquence : MINT2, hMLH1, MINT1, p16 et MGMT (O'Brien, Yang et al. 2006).
b) Instabilité microsatellitaire (phénotype MSI) :
La méthylation de MLH1 et MGMT est retrouvée dans certains polypes
hyperplasiques mais elle n’est que partielle, de plus la perte d’expression de ces marqueurs
n’a pas été constatée dans les PH. Ainsi, le statut MSI n’est pas associé à ce type de lésions
(O'Brien, Yang et al. 2004) (O'Brien, Yang et al. 2006).
c) Les voies du signal impliquées dans les polypes hyperplasiques :
La voie APC / β-Caténine, qui est une des voies principales du CRC, n’est pas associés
aux PH. L’activation de cette voie n’est pas constatée dans ces lésions (Fogt, Brien et al. 2002)
(Wu, Montgomery et al. 2008).
La voie BRAF / KRAS est une voie fréquemment mutée dans le CRC. Les mutations de
ces gènes sont mutuellement exclusives (Chan, Zhao et al. 2003) (Lee, Choi et al. 2005) et
l’une ou l’autre de ces altérations est retrouvée dans la majorité des PH. La mutation BRAF
est retrouvée dans 36 à 61 % des PH et la mutation KRAS dans 18 à 22 % des cas (Chan, Zhao
et al. 2003) (O'Brien, Yang et al. 2006). Cette voie du signal pourrait être la voie d’initiation
du développement des lésions hyperplasiques (Huang, Wang et al. 2004). La mutation BRAF
est associée aux PH microvésiculaires, alors que la mutation KRAS l’est aux PH à cellules
caliciformes (O'Brien, Yang et al. 2004).
4. Les polypes hyperplasiques dans la carcinogenèse colorectale :
Le potentiel malin des PH a longtemps été ignoré, mais il est aujourd’hui mis en
évidence notamment par la présence de mutations et d’altérations génétiques prooncogéniques. Une étude sur les polypes mixtes (hyperplasiques et adénomateux) a permis
de définir une évolution des polypes hyperplasiques en polypes adénomateux (Iino, Jass et
al. 1999). Ainsi l’émergence de la voie des tumeurs festonnées en plus de la voie classique
corrobore le rôle des PH comme des précurseurs néoplasiques (Snover). En effet, certaines
études décrivent les PH comme des zones où l’accumulation de mutations et d’altérations
génétiques n’induiraient pas l’apoptose ou la mort cellulaire (Jass, Whitehall et al. 2002)
conduisant ainsi à ces anomalies tissulaires.
101
Résultats
- 2nd article
Cependant, ces hypothèses sont à confronter avec la prévalence des HP et celle des
adénomes et adénocarcinomes (ADK). Si l’on compare ces prévalences, très peu de PH vont
évoluer en adénomes. L’identification de populations de polypes hyperplasiques à risque est
essentielle pour permettre un suivi médical pertinent et ainsi éviter des examens trop
contraignants qui ne serviraient à rien pour la majorité des patients atteints de PH.
5. Présence de polypes
adénomateuses :
hyperplasiques
et
apparition
de
lésions
L’association entre PH et l’apparition de lésions adénomateuses ultérieures est
encore mal définie.
En effet, chez des patients atteints de HP, sans facteurs de risque personnel ou
familiaux, le risque d’adénome est multiplié par 2,4 fois par rapport à des patients sans HP
(Croizet, Moreau et al. 1997). Une autre étude a permis de démontrer que la présence de
PH était un facteur prédictif d’adénome 4,3 ans après résection du polype (Huang, O'Brien
M et al. 2004). Cependant, une étude prospective de 158 patients sans risque particulier de
CRC n’a pu démontrer une association entre HP et la survenue d’adénomes (Rex, Cummings
et al. 1996).
Ainsi, partant du constat que très peu de PH évoluent vers des lésions néoplasiques,
les recommandations médicales, en absence d’antécédents personnels ou familiaux, pour
un patient atteint de HP sont qu’aucun suivi médical particulier n’est préconisé. Cette
absence de suivi est explicable par le fait que le test hemoccult n’est pas une solution fiable
dans ce cas et que la coloscopie présente des risques pour le patient. Ainsi la balance
bénéfice / risque de ce genre d’examen pour tous les patients atteints de HP n’est pas en
faveur d’un examen systématique.
Il devient donc nécessaire d’identifier un groupe de patients présentant des PH
susceptibles d’engendrer des adénomes afin de les faire bénéficier d’un suivi permettant de
prévenir tout risque d’adénomes. L’étude présentée dans cette partie a pour but de définir
ce groupe de patients.
b) FAPΑ (FIBROBLAST ACTIVATION PROTEIN ALPHA) :
1. Caractérisation :
FAPα est une sérine protéase membranaire qui peut cliver les peptides entre une
proline et un autre acide aminé. Cette protéine fait donc partie des post-prolyl peptidases
(Chen, Kelly et al. 2003). FAPα appartient à la famille des dipeptidyl-peptidases (DPP) et
possède des domaines identiques avec la DPPIV. Elles présentent des homologies dans 50
% de leurs séquences et 70 % de leurs domaines catalytiques (Cheng, Valianou et al. 2005)
(Pineiro-Sanchez, Goldstein et al. 1997). Ces deux protéines sont issues d’une duplication de
gêne et possèdent une activité dipeptidyl-peptidase similaire (Irwin 2002). Néanmoins, FAPα
102
Résultats
- 2nd article
possède une activité d’endopeptidase qui lui est propre lui permettant de cliver la gélatine
et le collagène de type I (Park, Lenter et al. 1999) (Pineiro-Sanchez, Goldstein et al. 1997). La
dimérisation de FAPα et sa glycosylation (Sun, Albright et al. 2002) sont nécessaires pour son
activité protéolytique. La forme glycosylée de FAPα fait 97 kDa et le dimère fait 170 kDa
(Pineiro-Sanchez, Goldstein et al. 1997). FAPα peut aussi s’oligodimériser avec le DPPIV ou
l’intégrine β1 et former un complexe actif (Ghersi, Dong et al. 2002) (Ghersi, Zhao et al. 2006)
(Artym, Kindzelskii et al. 2002).
2. Effet de FAPα dans la carcinogenèse :
Une étude de 1989 a identifié des invadopodes, une protrusion membranaire des
cellules invasives, qui rentre en contact et dégrade la matrice extracellulaire. Ce même
groupe a pu montrer que dans ces invadopodes sont exprimés MMP-2, MT1-MMP et TIMP2 (Chen and Wang 1999) ainsi que FAPα (Chen, Lee et al. 1994). Il a ainsi pu être montré que
le complexe FAP-DDPIV était responsable du phénotype invasif des fibroblastes et des
cellules endothéliales dans un gel de collagène de type I (Ghersi, Dong et al. 2002) (Ghersi,
Zhao et al. 2006) (Kennedy, Dong et al. 2009).
L’effet de FAPα sur la matrice extracellulaire a une grande importance dans la
carcinogenèse (Lee, Mullins et al.) (Santos, Jung et al. 2009). Il a ainsi été montré que
l’expression de FAPα aboutissait à une matrice riche en collagène de type I et en fibronectine
qui favorisera la migration (Lee, Mullins et al.).
Le rôle de FAPα dans l’angiogenèse a également été étudié. FAPα est exprimée dans
les cellules endothéliales humaines (Aimes, Zijlstra et al. 2003). Un autre groupe a confirmé
sa surexpression dans les cellules endothéliales issues de carcinome ovarien (Ghilardi,
Chiorino et al. 2008). Il a aussi été rapporté que l’expression de FAPα dans un modèle murin
de cancer du sein abouti à une augmentation de la densité de micro-vaisseaux (Huang, Wang
et al. 2004). Enfin, l’inhibition de FAPα induisait une baisse de la prolifération tumorale et de
la densité micro-vasculaire dans un modèle de cancer du poumon murin (Santos, Jung et al.
2009).
3. FAPα, cible thérapeutique :
Les rôles de FAPα dans la carcinogenèse ont motivé des approches cherchant à cibler
cette protéine dans des thérapies anti-cancéreuses.
Une étude analysant l’expression de FAPα au cours de la carcinogenèse colorectale
montre la forte expression de cette protéine dans les adénocarcinomes de stade I puis son
expression diminue au cours des stades les plus avancés. Néanmoins, dans cette même
étude ils ont décrits dans des xénogreffes orthotopiques que une expression de FAPα
supérieure a été constaté dans les tumeurs étendues et que cette protéine est associé à une
survie inférieure des souris (Henry, Lee et al. 2007). Ainsi, mon étude va démontrer
l’expression de FAPα à des stades encore plus précoces et va déterminer l’impact de
103
Résultats
- 2nd article
l’expression de cette protéine sur la survenue d’un adénome. De plus, une étude de phase II
a été réalisée en utilisant le Val-boroPro un inhibiteur enzymatique de cette protéine (Narra,
Mullins et al. 2007). Cette étude a été suspendue suite à l’inhibition incomplète de l’activité
enzymatique de FAPα et au peu d’impact clinique constaté dans les cancers colorectaux. Une
autre étude de phase II, pour le cancer du poumon non à petites cellules, où le Val-boroPro
était administré en combinaison avec le docetaxel et l’étude a été arrêté car le docetaxel
seul avait le même effet (Eager, Cunningham et al. 2009). Les mêmes résultats ont été
constatés dans le cadre d’un mélanome en association à l’oxaliplatine (Eager, Cunningham
et al. 2009). Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer cette absence d’effet. A
pH physiologique, le Val-boroPro aurait tendance se cycliser et ainsi devenir inefficace sur le
site de la tumeur. L’autre hypothèse est qu’une compensation se fait suite à l’inhibition de
FAPα.
Un anticorps bloquant humanisé issu d’un anticorps murin a été développé. Cette
anticorps n’est pas toxique et cible bien en majorité les tumeurs (Scott, Wiseman et al. 2003).
L’étude pharmacocinétique a déterminé que le poids de l’individu affecte la distribution de
l’anticorps (Kloft, Graefe et al. 2004). L’étude de phase II sur des cancers colorectaux
métastatiques n’a pas montré de bénéfice clinique de cet anticorps et l’étude a été arrêtée
(Hofheinz, al-Batran et al. 2003).
Le manque de réussite des thérapies énoncées précédemment a conduit à la
stratégie de ciblage des cellules FAPα+ afin de délivrer des thérapies sur le site tumoral
(LeBeau, Brennen et al. 2009). L’utilisation d’une toxine de venin d’abeille, la mélittine,
ciblant les cellules exprimant FAPα permet la destruction de ces cellules dans des modèles
murins de xénogreffes de cancer prostatique et du sein (LeBeau, Brennen et al. 2009). Cette
étude montre que les thérapies ciblant les cellules FAPα+ sont prometteuses mais l’approche
de cette étude nécessitant l’injection intratumoral du traitement rend difficile la
transposition de cette approche chez les patients.
La dernière approche consiste en l’élaboration d’une prodrogue du Val-boroPro
comme cette molécule cyclise à pH physiologique ce qui résulte en une diminution de 100
fois de son activité. Ces prodrogues ont cependant montré une meilleure tolérance de
l’organisme receveur et une inhibition plus longue (Poplawski, Lai et al.). Par conséquent,
cette stratégie est en cours de développement.
104
Résultats
- 2nd article
II. ARTICLE 2 :
Ainsi, comme précisé lors de cette introduction, la nécessité d’identifier un groupe
de patients atteints de polypes hyperplasiques est importante. Une proportion importante
de la population occidentale aura un polype hyperplasique au cours de leur vie. Il est donc
important d’identifier des groupes de patients avec un suivi médical différent afin d’adapter
au mieux les examens et le suivi médical. Jusqu’alors les marqueurs étudiés comme étant
des marqueurs pronostiques ou diagnostiques ne sont que des marqueurs épithéliaux dans
le CRC. Or, l’expression de FAPα est décrite comme synonyme de cancers colorectaux
agressifs. Il est donc possible que l’expression de cette protéine dans les HP puisse prédire
la survenue de lésions plus agressives qui récidiveraient plus fréquemment. C’est l’objet de
l’étude suivante.
105
Résultats
- 2nd article
FAP expression level and the risk of colonic neoplasia in patients presenting
with hyperplastic polyps
Nicolas FENIE1#, Catherine DO1#, Claudine BERTRAND1, Julien PALASSE2, Céline GUILBEAUFRUGIER2,3, Marie-Bernadette DELISLE1,2, Catherine SEVA1, Christine TOULAS1,4, Elizabeth
COHEN-JONATHAN-MOYAL1,4, Audrey FERRAND1¤.
1
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale UMR.1037 - Cancer Research Center of
Toulouse (CRCT), Université Paul Sabatier Toulouse III, Toulouse, France. 2 Service d’Anatomie
Pathologique et Histologie Cytologie, CHU Rangueil and Faculté de Médecine Rangueil, Toulouse,
France. 3 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale UMR.1048 – Institut des Maladies
Métabolique et Cardiovasculaire (I2MC), Université Paul Sabatier Toulouse III, Toulouse, France. 4
Institut Claudius Régaud, Toulouse, France.
#: These two authors contributed equally to this study.
¤
Correspondence to: Audrey FERRAND
INSERM UMR.1037 - Cancer Research Center of Toulouse (CRCT), Université Paul Sabatier Toulouse
III, Institut Claudius Régaud, 20-24 rue du pont saint-Pierre, 31052 Toulouse cedex, France.
[email protected] Phone: +33567222721
Supported by: This work was supported by grants from INSERM, Association pour la Recherche
contre le Cancer (ARC N° A09/4/5033, ARC SFI 20111203828) and the BQR grant from Toulouse III
Paul Sabatier University (France).
Running title: FAP, a putative biomarker for the prediction of colonic neoplasia risk
Disclosure of Potential Conflicts of Interest: No potential conflicts of interests were disclosed.
Acknowledgments
The authors thank Dr Nazem Taoubi, Dr Sophie Le guellec for their help in this project and Serge
Estaque for his technical assistance.
106
Résultats
- 2nd article
Abstract
Background: Cancer-associated fibroblasts (CAFs), but not cancer epithelial cells, expressed FAPα
(Fibroblast Activation Protein-α) in more than 90% of epithelial cancers. In a 10-year retrospective
study we analyzed FAPα expression in fibroblasts of colon hyperplastic polyps (HP) and investigated
whether it could help determining the eventual risk of colon neoplasia.
Methods: The number of FAPα stained fibroblasts was immunohistochemically studied in colon
sections from 64 patients presenting with HP, low grade adenomas, high grade adenomas or
adenocarcinomas, but also on normal tissue sections from resected noncomplicated diverticula. Its
expression was recorded as ‘no/low’ or ‘high’ based on the number of stained fibroblasts counted in
twenty randomly chosen fields of the polyp section counted by microscope field at X1000
magnification. Based on the ROC analysis, the optimal specificity/sensibility couple was found to
correspond to a threshold of 9 stained fibroblasts.
Results: A high FAPα expression was observed in 44% [95% confidence interval (CI): 27-60] of the
colon HP. We found a significant association between FAPα expression and shortened neoplasm-free
survival (NFS). The 5-year NFS for patients with high expression was of 41% [95% CI, 19–63] compared
to 91% [95% CI, 68-98] for patients with no/low expression. Moreover, patients with high expression
had a median NFS of 5 years, whereas during the 10-year following period, the median survival was
not reached by patients with no/low expression.
Conclusion: FAPα expression in colon HP is associated with an increased risk of colonic neoplasia
suggesting that these patients could benefit from an adapted follow-up.
Keywords: Colon, hyperplastic polyps, FAPrisk factor, neoplasia
107
Résultats
- 2nd article
Introduction
Colorectal cancer (CRC) is the third most frequent cancer and the fourth in terms of mortality
(Globocan 2008: Cancer Incidence and Mortality Worldwide, IARC CancerBase No. 10, Edited by J
Ferlay, HR Shin, F Bray, D Forman, C Mathers and DM Parkin). Its adenocarcinoma sequence is well
established, however confusion remains regarding the colonic neoplasia outcome of patients
presenting with hyperplastic polyps (HP). With a prevalence of 10% to 35%, HP are the most frequent
colorectal lesions (1). Contrary to adenomatous polyps that have long been considered as
preneoplastic lesions leading to a colonoscopy follow-up for these patients, no recommendation
exists for patients presenting with HP at their first colonoscopy if the polyps are less than 1cm, if less
than 5 of them have been detected or if there is no HP family history (2, 3). The malignant potential
of HP has long been unknown, but recent molecular characterizations have provided arguments in
favor of a neoplastic potential, highlighting several prooncogenic alterations such as CpG Methylation
or microsatellite instability (4, 5). In addition, analysis of mixed polyps by Iino et al. (6) showed a
clonal relationship between the two epithelial components, hyperplastic and adenomatous, of these
polyps suggesting that mixed polyps are not due to a fusion of hyperplastic and adenomatous lesions
and supporting the hypothesis of a continuum between PH and adenomas. Recent studies, including
ours, actually report that they could represent precursor lesions of some sporadic colorectal cancers
(7-12).
Tumor microenvironment is now known to play a critical role in the tumoral process. Cancerassociated stroma is a complex element where a variety of interactions between the tumor and host
tissue cells take place. The tumor produces factors that will modify the stroma compartment
including the stroma cells. Cancer-Associated Fibroblasts (CAFs), corresponding to fibroblasts present
in the tissue stroma that are activated by signals induced by the tumor, represent the main cell
population within the stroma.
FAPFibroblast Activation Protein is a serine protease expressed in more than 90% of
epithelial cancers. In epithelial-derived tumors, it is expressed by CAFs and not by the cancer
epithelial cells, and represents a marker of the activation of the surrounding fibroblasts by the tumor
(13, 14). A previous study, conducted on stage I to stage IV colon cancer patients, described an
inversed correlation between FAP expression and tumor stage but also with tumor size suggesting
an implication of the protease in early steps of the disease (15). Thus FAP could represent an early
biomarker for CRC.
Here, FAP expression in HP was examined in a 10-year retrospective study on a
characterized HP patient cohort (12). We investigated whether or not FAP expression in colon
fibroblasts could help predicting the risk of colonic neoplasia in patients presenting with colonic HP.
Patients and Methods
Study design
We conducted a single centre historical cohort study.
108
Résultats
- 2nd article
Sample size, patients and data collection
The FAP staining has been done on colon tissue sections from 64 patients (39 had colon HP, 6 had
low grade adenomas, 4 presented with high grade adenomas and 5 displayed adenocarcinomas) and
also examined on normal tissue sections from 10 patients with resected non complicated diverticula.
The characteristic of the 39 patients presenting with HP have been previously published (12). These
39 patients were diagnosed for HP in the Pathology department of Rangueil Hospital in 2000 and
2001. None of these patients had preceding colorectal adenocarcinoma or adenoma, familial
colorectal adenocarcinoma history, hyperplastic polyposis, chronic inflammatory bowel disease,
insufficient colon site information or follow-up data. None of the patients included in the study
showed evidence of colonic adenoma at the initial colonoscopy. Available colonoscopy follow-up
data allowed us to investigate the correlation between the neoplasm-free survival and FAP staining
in HP. Follow up colonoscopies have been done for surveillance purpose without particular colorectal
pathology. Approval of an institutional research ethics committee was obtained in accordance with
the precepts of the Helsinki Declaration.
Immunohistochemistry
The resected tissues were formaldehyde-fixed and paraffin embedded. Citrate buffer was used for
epitope retrieval. The antibodies were applied overnight. Detection was done using the PolyVue
PlusTM HRP/DAB detection system (DBS). The anti-FAPα antibody (Abcam, ab53066) was used at a
1:200 dilution.
Statistical analysis
FAP expression was recorded as ‘no/low’ or ‘high’ expression based on the number of stained
fibroblasts counted in twenty randomly chosen microscope fields of the polyp section at X1000
magnification. Analyses were performed in a double blinded fashion under pathologist supervision.
Because the inter-rater agreement was excellent (ICC=0.93), percentages were reported as the
average between the two readers. For patients with several polyps, the polyp with the wider
hyperplastic area was retained for evaluation. Based on the receiver operating characteristic analysis,
we found that the optimal specificity/sensibility couple corresponds to a threshold of 9 FAP-stained
fibroblasts. Thus, we established that the overexpression threshold corresponds to a number of
stained fibroblasts in hyperplastic polyp equal or higher than 9. The association between FAPα
expression and occurrence of a new colorectal event was performed by Kaplan-Meier curves and log
rank test. The time to event was defined as the time interval between the diagnosis of hyperplastic
polyp and the occurrence of metachronous colorectal adenoma in the same site as the first
hyperplastic polyp. The log-rank test was also used to assess significance of clinical characteristics.
Quantitative variables were recorded into two-class variables using the median. To demonstrate that
FAPα was a prognostic factor independent from other clinical factors, we performed a cox
proportional-hazards model to test the simultaneous influence on disease free survival of all
covariate with a p-value<0,20 in the univariate analysis. After a backward-stepwise selection, only
significant variables (p<0.05) were kept in the final cox model. In our study, all tests were two-sided
and statistical significance was set at a P value of 0.05. Analyses were performed using STATA v11.
109
Résultats
- 2nd article
Results
FAP expression in normal colon, hyperplastic polyps, adenomas and adenocarcinomas
Representative pictures of FAP staining obtained with an anti-FAP antibody on colon
tissues corresponding to normal tissue, hyperplastic polyps (HP), adenoma and adenocarcinoma, are
shown in figures 1 and 2.
The number of FAP-positive fibroblasts in normal colon, HP, adenomas, and
adenocarcinomas are reported in figure 3. In the whole cohort, the number of FAP expressing
fibroblast is 10.33±1.394 (n=64). The average number of FAP-positive fibroblasts in normal colon
from noncomplicated diverticula (2.750± 0.588, n=10) was significantly different from the number in
HP (7.885±1.056, n=39, p=0.0195), low grade adenoma (11.92±1.044, n=6, p<0.0001), high grade
adenoma (24.50±9.515, n=4, p=0.0025) and adenocarcinoma (31.30±7.782, n=5, p<0.0001). A
significant difference was found between HP and high grade adenoma (p=0.0004) or adenocarcinoma
(p<0.0001) while none was observed between HP and low grade adenoma.
Correlation study of FAP expression and neoplasm-free survival in patient with hyperplastic
polyps
To determine whether FAP expression by fibroblasts could help predicting the risk of colonic
neoplasia in patients presenting with HP, we then focused our study on these colonic lesions.
To assess whether a predictive test using FAP expression could predict the neoplasm
occurrence after developing a first HP, we performed a receiver operating characteristic analysis for
the number of FAP-positive fibroblasts. The evaluation of the area under the curve (AUC) gave a
predictive performance of FAP value of 0.8658 (95% CI, 0.75–0.98). The ROC analysis showed that
the optimal specificity-sensibility couple (i.e., with a 81.25 % sensitivity to detect the patients at risk
to develop an adenoma and an optimal specificity corresponding to 87.93%) was obtained with a
threshold of 9 stained fibroblasts (Figure 4). Thus, we hypothesized that patients could be at no/low
or high risk of metachronous neoplastic events when the number of stained fibroblasts was
respectively inferior or equal/superior at 9. As the average number of FAP-positive fibroblasts was
7.885±1.056 in our sample, we also considered 9 stained fibroblasts as a threshold for no/low or a
high expression of the protease in HP. Thus, FAP expression was recorded as ‘no/low expression’
or ‘high expression’ based on the number of stained fibroblasts. In this cohort of patients displaying
HP, 56% (95%CI: 39-72) had no/low expression of the protease while in 44% (95%CI: 27-60) displayed
a high FAP expression (Table 1).
As previously reported (12), survival analysis was performed using data from patients who
had at least one colonoscopy during their follow up. Only occurrence of metachronous adenoma at
the same general area of the colon (proximal or distal colon) was considered as a recurrence event.
Based on this criteria, 41% (95%CI: 26-59) of the patients presenting with HP developed
metachronous adenoma (Table 1). Univariate analysis (Table 2) showed a significant association
between FAP overexpression and shortened neoplasm-free survival (p= 0.0012). The 5 year
neoplasm-free survival for patients with no/low expression of the protease was 91% (95%CI: 68-98)
while it only reaches 41% (95%CI: 19-63) for patients with high expression (Figure 5 and Table 2).
Patients with high FAP expression had a median neoplasm-free survival of 5 years, whereas during
the 10 years following period, the median survival was not reached by patients with no/low
expression of FAP (Table 2, Figure 5). To demonstrate that the association between FAP staining
110
Résultats
- 2nd article
and neoplasm-free survival was independent from the subject’s age, we performed multivariate
analysis (table 2). After adjustment, FAP expression was still significantly associated with adenoma
occurrences (p=0.022).
Taken together, these results show that FAP staining in HP is an independent prognostic
factor and the threshold of 9 FAP-stained fibroblasts represents the optimal specificity-sensitivity
couple giving a predictive threshold.
Discussion
We show for the first time that stromal fibroblasts in hyperplastic polyps express FAP. In
the late 80’s, Rettig et al. identified FAP as a membrane glycoprotein selectively expressed in
activated stromal fibroblasts of epithelial cancers such as breast, ovarian, bladder, lung and
colorectal adenocarcinomas (16, 17). In non-malignant tissues, so far FAP has been shown to be
expressed in reactive fibroblasts of rheumatoid arthritis, wound healing, cirrhosis, pulmonary
fibrosis, and transiently in foetal mesenchyme tissue (17-22). Thus FAP expression is restricted to
reactive/activated fibroblasts in tissues. Our study suggests that an alteration of the stroma
compartment is present in non-malignant hyperplastic polyps.
Since reports from Torlakovic and Snover in the 90’s, a subset of the initially called HP has
been identified as adenoma precursor lesions and are now called sessile serrated adenoma (SSA)(23).
The non-SSA hyperplastic polyps, now simply called HP, are the most frequently occurring lesions in
the colon. Until recently, they were considered as lesions with no malignant potential while
adenomatous polyps were recognized as neoplastic precursor lesions for colorectal
adenocarcinomas (1). So far, the guidelines from the French National Agency for Accreditation and
Evaluation in Healthcare or the American College of Gastroenterology only recommended
colonoscopy follow up when the number of HP is higher than 5 or if the HP is larger than 1cm (2, 3).
Up to now, only these criteria are clearly associated with colorectal adenoma or adenocarcinoma.
However, the identification of pro-oncogenic molecular alterations suggest that there is
heterogeneity within these HP and that some of these benign lesions may represent precursors or at
least be a reflection of land at risk of neoplastic lesions. Indeed recent works, including ours, suggest
that HP may represent precursor lesions for sporadic colorectal cancers (8, 12, 23-26). We recently
identified the digestive hormone progastrin as an epithelial biomarker allowing the prediction of the
risk of neoplasia in patient presenting with initial HP. In the current study, the observation of FAP
expression in the stromal compartment of HP led us to investigate whether or not this expression
could help to determine the risk of neoplasia in patients displaying these colon lesions.
Indeed, it is now recognized that the role of the microenvironment in cancer initiating stages
and along the cancer process is important (27-29). The interactions between the tumor itself and its
surrounding stroma are essential to the development, spreading and recurrence of the tumor. Three
main cell types are present within the stroma: immune cells, endothelial cells and fibroblasts. In
response to newly secreted factors, such as cytokines, chemokines or growth factors, produced by
the tumor epithelial cells, stromal cells become reactive to the tumor. The fibroblasts present in the
tumor surrounding stroma are called Cancer-Associated Fibroblasts (CAFs). They represent the
largest cell population in the tumor microenvironment. CAFs are involved in tumorigenesis by
regulating, for example, the proliferation and survival of epithelial cells. They also favor the
dedifferentiation of epithelial cells in vivo (30, 31). Moreover, they are present in great number in
111
Résultats
- 2nd article
metastatic and invasive cancers and contribute to the metastatic potential of tumors by promoting
angiogenesis (32, 33). In colorectal cancer, CAFs have been shown to contribute to tumor growth and
progression, to be involved in tumor survival in hypoxic condition and to greatly increase the
metastatic potential of the primary tumor (29, 34). As a consequence, their presence in the colon
adenocarcinoma stroma has been associated to a poor prognosis for the patient. However, very little
is known about the fibroblast activation status in preneoplastic lesion. Henry et al. analysed
FAPexpression on stage I to stage IV colon cancer patients (15). They reported an inversed
correlation between FAP expression and tumor stage but also with tumor size suggesting an
implication of the protease in early steps of the disease. We did not observe such a correlation in our
study. This could be explained by the small number of tissues corresponding to adenoma and
adenocarcinoma we investigated since we focused our study on hyperplastic polyps. We set up the
FAP expression threshold between a ‘no/low’ and ‘high’ expression at 9-stained fibroblasts within
20 randomly picked sections of the HP, 9 corresponding to the optimal specificity/sensitivity coupIe
(81.25% of sensitivity and 87.93 % of specificity). Based on these criteria, misclassification rate to
determine the risk of developing a metachronous neoplasm was only of 13.51% and the number of
false negative of 10.25%. Moreover, the multivariate analysis showed that the association between
FAP staining and neoplasm-free survival is independent from the subject’s age.
Thus we demonstrated that the number of FAP-expressing fibroblasts in HP could be an
efficient tool to detect patients with higher risk of metachronous neoplasms who would benefit from
a colonoscopy follow-up, and that FAP expression level can give an idea of the risk of neoplasia in
patient presenting with initial hyperplastic polyps.
112
Résultats
- 2nd article
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114
Résultats
- 2nd article
FIGURES LEGENDS
Figure 1: FAPα expression in colon normal, adenoma and adenocarcinoma tissues
Representative pictures for FAPα staining in normal colon (A, x400; B, x1000), adenoma (C, x400; D,
x1000), and adenocarcinoma (E, x400; F, x1000). In normal tissue some granulocytes present a nonspecific staining while only few fibroblasts stained for FAP. An increased number of FAP-positive
fibroblasts was observed around colon villi in adenoma. Adenocarcinoma tissues display FAPpositive fibroblast around the villi but also in the interstitial stroma. Commercially available antiFAP antibody (Abcam - ab53066) was used for all experiments.
Figure 2: FAPα staining in hyperplastic polyps.
Representatives pictures for no- (A, x400; B, x1000), low- (C, x400; D, x1000) and high-FAPα staining
(E, x400; F, x1000) in HP. Commercially available anti-FAP antibody (Abcam - ab53066) was used for
all experiments. The arrows indicate FAP-stained fibroblasts.
Figure 3: FAP-expression in normal, HP, low-grade dysplasia tubular adenoma (TA), high-grade
dysplasia TA, and adenocarcinoma
Number of FAPα-positive fibroblats in normal colon, hyperplastic polyps (HP), low-grade dysplasia
tubular adenoma (TA), high-grade dysplasia TA, and adenocarcinoma (ADC). A Wilcoxon Cuzick trend
test was performed to compare the number of FAPα-positive fibroblasts between the different types
of colon tissues.
Figure 4: A predictive test for recurrence - Receiver Operating Characteristic (ROC) curves for FAPα
staining
‘a’, corresponding to the number of 9 or more FAP-stained fibroblasts in HP, had a sensitivity of
81.25% and a specificity of 87.93% that represents the optimal sensitivity and specificity couple. Se,
sensitivity; Spe, specificity.
Figure 5: Kaplan-Meier survival estimate based on the number of FAP expression in HP patients
Neoplasm-free survival among patients with colonoscopy follow-up according to FAPα expression. Pvalue corresponds to logrank univariate analysis.
115
Résultats
- 2nd article
Table 1. Clinical and immunohistological features
Patients with coloscopic follow up (ref 12)
n=39
Variables
percentage [95%CI]
Age (y.o)
Median
Range
Sex
Male
Female
Number of polyps
1
2-4
Size of polyps (largest diameter, mm)
Median
Range
Localisation
Proximal colon
Distal colon
Occurrence of metachronous adenoma
Expression of FAP
Low / No expression (<9 stained fibroblasts)
64
33-89
59% [42-74]
41% [26-58]
62% [45-77]
38% [23-55]
3
1-5
18% [8-34]
82% [66-82]
41% [26-59]
56% [39-72]
44% [27-60]
High expression (9 stained fibroblasts)
NOTE: FAP expression was recorded as ‘No/low’ expression or ’high’ expression based on the number
of stained fibroblasts counted in 20 randomly picked microscope fields at X1000 magnification. The
threshold of FAP expression in HP was determined to be 9 stained fibroblasts, 9 corresponding to the
optimal specificity/sensibility couple based on the ROC analysis,
95% CI: Bionomial exact 95% confidence index was calculated for each percentage.
116
Résultats
- 2nd article
Table 2. Neoplasm-free survival according to clinical and immunohistological features
Neoplasm-free Survival
Variables
Univariate analysis
Multivariate analysis *
Hazard Ratio
(HR)
Median (y)
5 y.S - [95% CI]
Age (y.o)
p-value
[95%CI]
<0.0001
0.001
<64 y.o
10
95% [72-99]
-
≥64 y.o.
5
26% [7-51]
14.5 [12.9-72.5]
Sex
0.4658 #
Male
NR
77% [54-90]
Female
10
51% [23-73]
Number of polyps
0.4064
1
10
74% [51-87]
2-4
7
56% [27-78]
Size of polyps (largest diameter, mm)
0.0637 #
0.895 #
<3mm
NR
76% [47-90]
-
3-6mm
7
60% [35-78]
1.1 [0.4-3.2] #
Localisation
0.1378 #
0.660 #
Proximal colon
5
43% [10-73]
-
Distal colon
10
74% [54-86]
1.3 [0.4-4.1] #
Expression of FAP
Low/no expression (<9)
high expression (9)
p-value
0.0012
0.022
NR
91% [68-98]
-
5
41% [19-63]
4.5 [1.2-16.8]
NOTE: Neoplam-Free Survival among patients with colonic hyperplastic polyps who had a
colonoscopic follow-up. Multivariate analysis was conducted using a Cox model including all variables
with a P value <0.20 in the univariate analysis.
* The initial Cox model included the age, the size, the localisation of the polyps and FAP expression.
Final model was obtained after backward stepwise selection, keeping only the variables with a P value
<0.05 (i.e. age and FAP95% CI was calculated for all 5-year survival values.
# HR and p-values from the initial model was provided for information for non-significant covariates.
117
Résultats
Figure 1
A
X400
X1000
X400
X1000
X400
X1000
B
C
118
- 2nd article
Résultats
- 2nd article
Figure 2
A
X400
X1000
X400
X1000
X400
X1000
B
C
119
Résultats
Figure 3
*
p = 0,0195
60
Number of activated fibroblasts
***
**
***
p < 0,0001 p = 0,0025
p < 0,0001
40
20
0
Normal
colon
HP
Low Grade High Grade
TA
TA
ADC
Figure 4
1.00
a
Sensitivity
0.75
0.50
0.25
a : FAPα  9 : Se = 81.25% Spe = 87.93%
Area under ROC curve = 0,8658
0.00
0.00
0.25
0.50
0.75
Specificity
120
1.00
- 2nd article
Résultats
- 2nd article
Figure 5
Kaplan-Meier survival estimate – FAPexpression
Neoplam Free Survival
1.00
No / Low expression
0.75
0.50
Strong expression
0.25
p = 0.0012
0.00
Number of patients at risk
No/low expression (<9)
Strong expression ( 9)
0
2
23
16
23
16
121
4
6
Time (years)
8
10
20
12
13
5
1
1
16
8
Résultats
- 2nd article
III. CONCLUSION DE L’ARTICLE 2 :
Comme évoqué en introduction de cet article, la majorité des polypes hyperplasiques
ne sont, à ce jour, pas considéré comme potentiellement malin. Ainsi les patients atteints de
polypes hyperplasiques qui n’ont pas d’antécédents familiaux ne bénéficient d’aucun suivi
médical particulier. Les conclusions des études cherchant à démontrer un lien entre les PH
et un risque augmenté de lésions néoplasiques n’ont pas pu établir de corrélation claire
entre ces deux évènements (Rex, Cummings et al. 1996). Ces résultats sont peu surprenants
si l’on compare la prévalence des PH à celle des lésions néoplasiques. Ainsi à l’heure actuelle
le suivi coloscopique des patients atteints de PH est inenvisageable étant donné le caractère
invasif et les risques associés à ce genre d’examen.
L’étude que nous avons menée se justifie par la nécessité de déterminer un groupe
de patients porteurs de PH ayant un risque accru de développer des lésions néoplasiques.
Cette étude est la première étude montrant une activation fibroblastique si précoce dès le
stade pénéoplasique. L’activation du stroma dans des lésions si peu avancées peut expliquer
que ce groupe de patients ait un risque de récidive supérieur.
Cependant, les limites de cette étude ne permettent pas de statuer définitivement
sur ce groupe de patients exprimant FAPα. En particulier, la taille de l’échantillon devra être
augmentée afin de confirmer ces observations. La faible taille d’échantillon de cette étude
se justifie pour plusieurs raisons. Tout d’abord, comme dit précédemment, les patients
atteints de HP n’ont normalement pas de suivi médical. Pour notre étude nous avons dû
trouver un groupe de patients qui ont pu bénéficier d’un suivi malgré les recommandations
habituelles. De plus, afin de bâtir une cohorte non biaisée, de nombreux patients n’ont pas
pu être inclus. Les principaux facteurs de confusion ont été déterminés à savoir les patients
présentant des antécédents personnels ou familiaux de polypes ou tumeurs colorectales ou
de pathologies inflammatoires chroniques.
Le fait que cette étude soit rétrospective est aussi une limitation. Ce type d’étude a
des conséquences sur la qualité des données recueillies : donnés manquantes, fiabilité des
données recueillis. Ainsi une étude multicentrique prospective devra être menée sur un plus
grand nombre de patients afin de confirmer les conclusions de cette étude.
Cette étude représente un argument supplémentaire en faveur du suivi d’une partie
des patients atteints de PH. L’activation fibroblastique dans ce type de lésions est pour la
première fois décrite. L’importance croissante de ce type cellulaire en cancérologie renforce
l’hypothèse qu’une partie des PH sont des évènements à inclure dans la carcinogenèse
colorectale.
122
CONCLUSIONS &
PERSPECTIVES
123
Les CAFs prennent une importance croissante dans la carcinogenèse. Ainsi la tumeur
ne résulte pas seulement de mutations de cellules épithéliales mais est aussi issue de
l’environnement qui l’entoure.
La progastrine, prohormone digestive, n’est exprimée dans le colon uniquement dans
un contexte tumoral. Ce facteur a été déjà décrit comme induisant des effets protumoraux
sur les cellules épithéliales essentiellement.
Au cours de mes travaux, j’ai pu montrer que la progastrine avait un impact sur les
fibroblastes environnants. J’ai ainsi démontré que la progastrine participait à l’activation des
fibroblastes dans un modèle de souris et dans une lignée de fibroblastes normaux coliques
humains. Suite à cela, j’ai cherché un impact « fonctionnel » de cette activation. J’ai ainsi pu
constater une augmentation de la migration des cellules épithéliales en présence de
fibroblastes mais surtout une potentialisation de cette migration avec des fibroblastes qui
auront pu être activé par la progastrine. Par la suite, j’ai cherché à comprendre comment cet
effet pouvait se produire. J’ai donc réalisé une analyse des voies du signal induit dans les
fibroblastes par la progastrine et j’ai pu mettre en évidence une forte induction de la voie
PI3K en réponse à la prohormone, cette voie régulant la sécrétion des chemokines IL-8 et
SDF-1 en réponse à la suractivation des fibroblastes colorectaux par la progastrine.
L’inhibition de ces facteurs ou de cette voie diminue la potentialisation de la migration par
la progastrine constatée précédemment. Ainsi la progastrine permet l’activation des
fibroblastes très précocement dans la pathologie mais peut aussi réguler des évènements
plus tardifs comme la migration épithéliale.
D’autre part, en utilisant une banque de polypes hyperplasiques humains, j’ai montré
que l’expression de FAPα par des fibroblastes pouvait représenter un marqueur d’évaluation
du risque de néoplasie colorectale. De plus, l’expression du marqueur FAPα semble avoir un
lien avec l’expression de la progastrine par les cellules épithéliales.
Alors que les premiers traitements ciblant l’environnement tumoral commencent à
être mis en application, de nombreuses choses restent encore à éclaircir. Alors que la
coopération entre les CAFs et les cellules tumorales semblent de plus en plus évidentes. Leur
interaction avec les autres acteurs du microenvironnement reste largement à élucider.
De plus, l’hétérogénéité entre les CAFs de différentes origines (entre les différents
tissus ou entre les différentes cellules potentiellement sources de CAFs) a été décrites mais
jusqu’alors aucun consensus clair n’émerge pour définir ces différentes populations ainsi que
leurs rôles respectifs.
La fonction des CAFs dans les étapes tardives (migration, invasion) est la plus décrite.
Néanmoins ma seconde étude décrit une possible activation très précoce des fibroblastes
dans les pathologies colorectales. Ainsi le rôle de ces CAFs à ces stades n’est que très peu
124
décrit. Il reste encore à comprendre comment à des stades aussi précoces cette activation
survient.
Dans le CRC j’ai donc pu décrire une activation précoce du microenvironnement
induit par la présence de la progastrine. Plus tardivement dans le processus tumoral, cette
activation peut engendrer une augmentation de la migration des cellules épithéliales. Ainsi,
en considérant son action sur les cellules épithéliales mais aussi sur les fibroblastes, la
progastrine représente une cible thérapeutique intéressante dans le cancer colorectal. Ainsi,
on pourrait envisager des approches de ciblage de l’hormone par des anticorps monoclonaux
ou des aptamères qui lui seraient spécifiques, ces molécules pouvant être administrées en
combinaison avec les chimiothérapies conventionnelles du cancer colorectal.
125
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Title : Activation of fibroblasts regulation in colorectal mucosa, involvement in
colorectal cancer.
Colon cancer is the second of cancer related death in western countries. The first cause of
this mortality is its highly invasive and metastatic phenotype. Understanding of microenvironment
role becomes, these last years, a high stake in pathology fighting. Indeed, tumour and stroma
interaction is essential for development, recurrence and tumoral invasion. In this cell compartment,
CAF (Cancer associated fibroblasts), majority cellular fraction, are described like regulator of tumoral
cell proliferation and survival. These activated fibroblasts are abundant in invasive and metastatic
cancer and have an important role in tumoral spreading.
Progastrin, digestive prohormone is express in 80 to 90 % of colorectal cancer. It’s detects in
polyps, tumour and metastases while it’s absent in healthy tissue. It’s a growth factor for tumoral
cells and promotes migration and invasion.
During my PhD training, I investigated the role of FAPα, as a putative predictive marker of
neoplasia risk in patients presenting with initial hyperplastic polyps. I performed a 10-year
retrospective study on patients suffering from hyperplastic polyps. An immunohistochemistry
analysis against FAPα (Fibroblast Activation Protein α), a fibroblasts activation marker, was done. I
demonstrated that the number of FAPα expressing fibroblasts allows predicting the colorectal
neoplasia risk. Indeed, to date, patients with hyperplastic polyp don’t benefit of a medical followup. Thus this study can allow discriminating patients that have a neoplasia risk from patients with
no risk, and in consequence to identify patients that would benefit from a medical follow-up.
Moreover, I studied the role of Progastrin and influences on epithelio-mesenchymal
dialogue.
Using immunohistochemical and biochemical approaches we found that progastrin induces
the expression of fibroblast activation markers (αSMA, FAPα) in the normal colon mucosa of
progastrin-overexpressing mice as well as in the human colon fibroblast cell line CCD18Co. To
investigate the role of progastrin-induced fibroblast activation, we compared the migration of colon
epithelial cancer cells expressing or not the hormone in presence or absence of fibroblasts in Boyden
chamber. Progastrin-expressing epithelial cells have increased migration capacities in presence of
fibroblasts while not difference between the two epithelial cell lines was observed in absence of
fibroblasts. Moreover, we identified the implication different chemokines in this process. Thus, here
we demonstrate that progastrin, secreted by tumour epithelial cells, contributes to the activation of
the fibroblasts present in the cancer-associated stroma and participates to the epithelial-stroma
dialogue.
AUTEUR : FENIE Nicolas
TITRE : Régulation de l’activation des fibroblastes dans la muqueuse colorectale,
implication dans le cancer colorectal
DIRECTEUR DE THESE :
Docteur KOWALSKI-CHAUVEL Aline
Docteur FERRAND Audrey
LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : 18 Novembre 2013 à Toulouse
RESUME :
Le cancer colorectal est le deuxième cancer en termes de mortalité dans les pays industrialisés. La
principale raison de cette forte mortalité est son caractère hautement invasif et métastasique. La compréhension
du rôle du microenvironnement dans ce cancer devient, ces dernières années, un enjeu principal dans la lutte
contre cette pathologie. En effet, l’interaction entre la tumeur et le stroma est essentielle au développement, à
la récurrence et à l’invasion tumorale. Dans ce compartiment cellulaire, les CAFs (Cancer Activated Fibroblasts),
fraction cellulaire majoritaire du stroma tumoral, ont été décrits comme régulant la prolifération et la survie des
cellules tumorales. Ces fibroblastes activés sont très nombreux dans les cancers invasifs et ont un rôle très
important dans la dissémination des cellules épithéliales tumorales.
La progastrine, prohormone digestive peptidique, est présente dans 80 à 90% des cancers colorectaux.
Elle est exprimée au niveau des polypes et des tumeurs alors qu’elle est absente du tissu sain. Elle est un facteur
de croissance pour les cellules épithéliales tumorales coliques, et favorise leurs migrations et leurs invasions.
Nous avons tout d’abord réalisé une étude pré-clinique sur le rôle de FAPα comme potentiel marqueur
prédictif de la récurrence tumorale dans les polypes hyperplasiques. Ainsi, les patients présentant des polypes
hyperplasiques ne bénéficient pas de suivi particulier actuellement, cette étude identifie un marqueur, FAPα,
permettant de discriminer des patients à risque néoplasique des patients sans risque, et donc d’identifier les
patients qui pourraient bénéficier d’un suivi médical.
D’autre part, nous avons étudié le rôle de la progastrine dans le dialogue épithélio – mésenchymateux,
montrant que la progastrine induit l'expression des marqueurs d'activation des fibroblastes (αSMA, FAPα) dans
des fibroblastes colorectaux normaux. Les cellules exprimant la progastrine montrent une augmentation de leur
capacité migratoire en présence des fibroblastes. De plus, nous avons identifié l'implication de différentes
chimiokines dans ce processus. Ainsi, nous montrons ici que la progastrine, sécrétée par les cellules épithéliales
tumorales, contribue à l'activation des fibroblastes présents dans le stroma associé au cancer et participe au
dialogue épithélio-stromal.
MOTS-CLES : CAFs, fibroblastes, progastrine, FAPα
DISCIPLINE ADMISTRATIVE : Cancérologie
INSERM UMR 1037, Centre de recherche en cancérologie de Toulouse
Institut Claudius Régaud
Equipe 11 : Radioresistance tumorale, des voies de signalisation à l’essai clinique
20-24 rue du pont St Pierre
31052 Toulouse